Ứng dụng phương pháp đẩy qua màng trong nghiên cứu tạo liposom doxorubicin kích cỡ nano

BỘ Y TẾ Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ TRỌNG TOÀN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐẨY QUA MÀNG TRONG NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM-DOXORUBICIN KÍCHCỠ NANO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ TRỌNG TOÀN ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐẨY QUA MÀNG TRONG NGHIÊN CỨU TẠO LIPOSOM-DOXORUBICIN KÍCH CỠ NANO KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ Người hướng dẫn: 1.TS Nguyễn Thị Lập 2.ThS Bùi Bá Minh Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa sinh Bộ môn Bào chế Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin biết bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS Nguyễn Thị Lập Cơ tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt trình nghiên cứu thực đề tài Cô động viên cho hướng giải vấn đề, để tơi hồn thành mục tiêu đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Bùi Bá Minh, thầy cho lời Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi khuyên bổ ích q trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn PGS.TS Lê Quang Huấn, ThS Lê Thị Thùy Dương cán cơng tác phòng Cơng nghệ tế bào động vật – Viện công nghệ sinh học, người nhiệt tình giúp đỡ để tơi hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn thầy cô anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh, Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ trình nghiên cứu Tơi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người ln động viên giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài Hà Nội, 21/05/2013 Sinh viên Hồ Trọng Tồn MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………… .1 CHƯƠNG : TỔNG QUAN………………………………………………… 1.1 Đại cương liposom .2 1.2 Nguyên liệu .3 1.2.1 Doxorubicin hydroclorid………………………………………………… 1.2.2 Phospholipid …………………………………………………………… .5 1.2.3 Cholesterol……………………………………………………………………… 1.2.4 Các thành phần khác …………………………………………………………… 1.3 Các phương pháp chế tạo liposom……………………………………………… 1.3.1 Phương pháp Bangham………………………………………………………… 1.3.2 Phương pháp bốc pha đảo (REV)…………………………………………….9 1.4 Các phương pháp làm nhỏ kích thước đồng hóa tiểu phân liposom 1.4.1 Tầm quan trọng việc làm nhỏ kích thước tiểu phân………………………….9 1.4.2 Phương pháp siêu âm……………………………………………………………10 1.4.3 Phương pháp đẩy qua màng (Membrane extrusion)…………………… 11 1.5 Các phương pháp liposom hóa doxorubicin………………………………… 15 1.5.1 Cơ chế thụ động…………………………………………………………………15 1.5.2 Cơ chế chủ động……………………………………………………… 15 CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………… 18 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị………………………………………………… 18 2.1.1 Nguyên liệu…………………………………………………………………… 18 2.1.2 Hóa chất…………………………………………………………………………18 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm………………………………………………………………18 2.2 Nội dung nghiên cứu…………………………………………………… 18 2.2.1 Chế tạo liposom DOX kích cỡ nano…………………………………… 18 2.2.2 So sánh đặc điểm tính chất tiểu phân liposom thu sau đồng hóa phương pháp đẩy qua màng với phương pháp siêu âm .19 2.3 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………………… 19 2.3.1 Phương pháp chế tạo liposom DOX…………………………………………… 19 2.3.2 Phương pháp đánh giá liposom tạo thành……………………………… 23 CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN …………………………………… 26 3.1 Kết quả……………………………………………………………………………26 3.1.1 Nghiên cứu ứng dụng phương pháp đẩy qua màng giảm kích thước đồng hóa tiểu phân liposom……………………………………………………………26 3.1.2 Hiệu suất liposom hóa doxorubicin…………………………………… 34 3.2 Bàn luận 37 3.2.1 Chế tạo liposom không mang dược chất……………………………………… 37 3.2.2 Giảm kích thước đồng hóa tiểu phân liposom ……………………… 38 3.2.2 Liposom hóa DOX loại DOX tự bên liposom…………………… 41 Kết luận đề xuất………………………………………………………… 43 Tài liệu tham khảo DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DSPC 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DPPC 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine DMPC 1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi EPC Egg phosphatidylcholin HEPC Hydrogenated Egg phosphatidylcholin SPC Soy phosphatidylcholin HSPC Hydrogenated soy phosphatidylcholin LUV Large unilamellar vesicle MLV Multilamellar large vesicle PBS Phosphate buffered saline PDI Polydispersity index PEG Polyethylene glycol PEG-PE Polyethylene glycol - phosphatidylethanolamin RES Reticulo endothelial system REV Rehydration evaporation vesicle TEM Transmission electron microscopy DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nguyên liệu chế tạo liposom DOX Bảng 3.1 Các thông số đánh giá tiểu phân liposom thu sau lần đẩy qua màng 400nm Bảng 3.2 Các thông số đánh giá tiểu phân liposom thu sau lần đẩy qua màng 80nm Bảng 3.3 Kích thước tiểu phân, số đa phân tán hệliposom sau giảm kích thước đồng hóa theo hai phương pháp: đẩy qua màng siêu âm đầu dò Bảng 3.4 Phân bố kích thước tiểu phân theo thể tích Bảng 3.5 Mật độ quang dung dịch DOX nồng độ khác Bảng 3.6 Kết định lượng DOX Bảng 3.7 Hiệu suất liposom hóa DOX thu từ phương pháp đồng hóa giảm kích thước tiểu phân lên hiệu suất liposom hóa DOX : đẩy qua màng siêu âm đầu dò DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu tạo liposom Hình 1.2 Cơ chế hình thành liposom theo phương pháp Bangham Hình 1.3 Cơ chế giảm kích thước liposom phương pháp đẩy qua màng Hình 1.4 Ảnh hưởng số lần đẩy qua màng lên kích thước tiểu phân liposom Hình 1.5 Thể tích lõi nước liposom thu sau đồng hóa theo phương pháp: kết hợp đông chảy đẩy qua màng ; đẩy qua màng Hình 1.6 Cơ chế liposom hóa DOX kỹ thuật gradient amoni Hình 2.1 Sơ đồ chế tạo liposom DOX Hình 3.1 Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 400nm Hình 3.2 Biểu đồ phân bố kích thước theo % thể tích qua lần đẩy phân tử kích thước nhỏ Hình 3.3 Biểu đồ phân bố kích thướctheo % thể tích qua lần đẩy phân tử kích thước lớn Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Hình 3.4 Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 80nm Hình 3.5 Kích thước tiểu phân liposom qua lần đẩy qua màng 80nm Hình 3.6 Ảnh chụp TEM liposom (độ phóng đại 20000 lần) Hình 3.7 Mối tương quan mật độ quang nồng độ DOX ĐẶT VẤN ĐỀ Liposom hệ mang thuốc nhận nhiều quan tâm nhà khoa học giới nhờ có nhiều ưu điểm khả mang thuốc, kiểm sốt giải phóng khả đưa thuốc tới đích tác dụng Nhằm bắt kịp tiến khoa học công nghệ lĩnh vực y dược học giới, năm gần đây, trường đại học Dược Hà Nội tiến hành nhiều đề tài khoa học để đánh giá khả sử dụng liposom vận chuyển thuốc Trong liposom doxorubicin nghiên cứu nhiều thu số kết đáng khích lệ Tuy nhiên quy trình chế tạo liposom chưa hồn thiện, đặc biệt giai đoạn giảm kích thước đồng hóa liposom Đề tài “Ứng dụng phương pháp đẩy qua màng nghiên cứu tạo liposom-doxorubicin kích cỡ nano” tiến hành nhằm áp dụng phương pháp mới- phương pháp đẩy qua màng vào giai đoạn giảm kích thước tiểu phân, với mục đích hồn thiện quy trình chế tạo liposom Đề tài thực với mục tiêu :  Nghiên cứu ứng dụng phương pháp đẩy qua màng để giảm kích thước tiểu phân liposom  So sánh ưu nhược điểm phương pháp đẩy qua màng với phương pháp siêu âm sử dụng nghiên cứu trước CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1 Đại cương liposom Liposom có cấu tạo bao gồm nhân nước bao bọc hay nhiều lớp phospholipid kép, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [5] Cấu tạo liposom minh họa hình 1.1 Liposom cấu tạo từ thành phần: phospholipid (PL) cholesterol Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Hình 1.1 Cấu tạo liposom Trong dược học, liposom ứng dụng làm hệ mang thuốc có nhiều ưu điểm Liposom có khả mang thuốc đa dạng phân tử thuốc, protein, nucleotid, chí plasmid [26] 1.2 Nguyên liệu 1.2.1 Doxorubicin hydroclorid (DOX) 1.2.1.1 Cơng thức Biểu đồ hình 3.2 cho thấy, vùng tiểu phân kích thước nhỏ, % phân bố theo thể tích tăng có giá trị lớn lần đẩy thứ (42.6%) Tuy nhiên, từ lần đẩy tiếp theo, % phân bố theo thể tích lại giảm kích thước liposom giảm qua lần đẩy khơng đáng kể Biểu đồ hình 3.3 cho thấy, vùng tiểu phân kích thước lớn, % phân bố theo thể tích giảm có giá trị thấp lần đẩy thứ 57.4 % Tuy nhiên, từ lần đẩy tiếp theo, % phân bố theo thể tích lại tăng lên giảm kích thước liposom qua lần đẩy khơng đáng kể Mục đích q trình đẩy qua màng 400nm làm tăng % phân bố theo thể tích tiểu phân kích thước nhỏ giảm % phân bố theo thể tích tiểu phân kích thước lớn Kết thu từ biểu đồ hình 3.2 3.3 cho thấy từ sau lần đẩy thứ 4, tiểu phân liposom có kích thước phân bố dần trở nên ổn định hệ số PDI thấp lần đẩy thứ (hình 3.1) Do lựa chọn số lần đẩy qua màng 400nm lần cho nghiên cứu  Mẫu chứa tiểu phân liposom thu sau đẩy lần qua màng 400nm trên, tiếp tục đẩy 14 lần qua màng có kích thước lỗ 80nm Kết thông số đánh giá thu kích thước tiểu phân, số đa phân tán hệ liposome sau lần đẩy qua màng 80nm thể bảng 3.2 Bảng 3.2 Các thông số đánh giá tiểu phân liposom thu sau lần đẩy qua màng 80nm Số thứ tự lần đẩy Chỉ số đa phân tán Kích thước trung Phân bố kích thước (PDI) bình theo đường theo % thể tích kính (nm) 0.126 137 100 0.092 114.6 100 0.084 108.9 100 0.079 107 100 11 0.065 103 100 12 0.058 99.87 100 14 0.053 98.24 100 Kết bảng 3.2 cho thấy PDI hệ liposom sau lần đẩy qua màng 80nm Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi nhỏ, kích thước liposom phân bố tập trung khoảng 140-100nm chiếm 100% thể tích mẫu Sự thay đổi PDI kích thước tiểu phân liposom qua lần đẩy thể rõ thông qua biểu diễn đồ thị hình 3.4 hình 3.5 tương ứng Hình 3.4 Đồ thị biến thiên PDI theo số lần đẩy qua màng 80nm Hình 3.5 Kích thước tiểu phân qua lần đẩy qua màng 80nm Trên đồ thị hình 3.4 cho thấy, qua lần đẩy qua màng 80nm, PDI giảm dần 0, chứng tỏ hệ phân tán trở nên đồng nhất.Đồ thị hình 3.5 cho thấy kích thước tiểu phân giảm dần theo tăng số lần đẩy qua màng Sau lần đẩy thứ 11 kích thước liposom 103 nm, nhiên sau lần đẩy thứ 12, kích thước liposom 99.87nm, kích thước nằm ngồi khoảng kích thước tối ưu cho tác dụng hệ liposom-DOX Vì mục tiêu trình thu hệ hệ lipsom đồng tối đa có kích thước tiểu phân phù hợp, lựa chọn số lần đẩy qua màng 80nm 11 lần cho nghiên cứu 3.1.1.2 So sánh phương pháp giảm kích thước tiểu phân : đẩy qua màng siêu âm đầu dò Liposom khơng mang dược chất chế tạo theo phương pháp Bangham.Hỗn dịch liposom đa lớp thu sau hydrat hóa làm nhỏ kích thước đồng hóa theo phương pháp : đẩy qua màng siêu âm đầu dò, bước tiến hành cụ thể trình bày mục 2.3.1.2, 2.3.1.3.Liposom thu sau đồng hóa theo phương pháp trên, đánh giá thơng quacác số : kích thước tiểu phân, số đa phân tán, phân bố kích thước theo % thể tích.Kết trình bày bảng 3.3 3.4 Bảng 3.3 Kích thước tiểu phân, số đa phân tán hệ liposom đồng hóa theo hai phương pháp: đẩy qua màng siêu âm đầu dò Phương pháp Kích thước tiểu phân Chỉ số đa phân tán (PDI) trung bình theo đường kính (nm) Đẩy qua màng 108.8 0.072 Siêu âm đầu dò 73.45 0.133 Bảng 3.3 cho thấy phương pháp đẩy qua màng cho tiểu phân liposom có kích thước lớn PDI nhỏ gần 1/2 so với phương pháp siêu âm đầu dò.PDI nhỏ chứng tỏ hệ liposom thu theo phương pháp đẩy qua màng có độ đồng cao hẳn so với hệ liposom thu theo phương pháp siêu âm Bảng 3.4 Phân bố kích thước tiểu phân theo thể tích Phương pháp đẩy qua màng Phương pháp siêu âm Kích thước % Phân bố Kích thước % Phân bố 50.75 1.4 37.84 10 58.77 6.6 43.82 16.4 68.06 14.2 50.75 18.6 78.82 19.1 58.77 16.8 91.28 19.2 78.82 8.8 105.7 15.8 91.23 5.3 122.4 11.1 105.7 2.3 141.8 6.8 122.4 1.7 164.2 3.6 141 1.5 190.1 1.6 164 0.1 220.2 0.5 255 0.1 Phân bố kích thước liposom theo thể tích mẫu liposom thể cụ thể bàng 3.4 Kết cho thấy phân bố kích thước tiểu phân liposom thu sau đẩy qua màng có phân bố kích thước lớn hơn, tập trung từ 70-120 nm chiếm 79.4% thể tích mẫu, hệ liposom thu sau siêu âm có phân bố kích thước nhỏ hơn, tập trung từ 40-70nm chiếm 70% thể tích mẫu Như vậy, sử dụng phương pháp đẩy qua màng giảm kích thước đồng hóa giúp tạo hệ liposom có nhiều ưu điểm: kích thước lớn hơn, độ đồng cao hẳn so với liposom thu theo phương pháp siêu âm đầu dò 3.1.1.3 Sơ hình thái, kích thước liposom Liposom sau chế tạo theo phương pháp Bangham, làm nhỏ kích thước theo phương pháp đẩy qua màng Liposom hóa DOX phương pháp gradient amonisulfat, loại DOX tự xác định hình thái, kích thước sơ kỹ thuật chụp hiển vi điển tử truyền qua (TEM) Kết thu được trình bày hình 3.6 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Hình 3.6 Ảnh chụp TEM liposom (độ phóng đại 20000 lần) Ảnh chụp thu độ phóng đại 20000 lần cho thấy : Hệ liposom phân tán tương đối đều, khơng có tượng kế t tụ Liposom tạo có dạng hình cầu, tương đối đồng nhất, kích thước nằm khoảng 108- 120 nm 3.1.2 Hiệu suất liposom hóa doxorubicin 3.1.2.1 Kết xây dựng đường chuẩn doxorubicin hydroclorid Pha dung dịch chuẩn DOX nồng độ 0.2, 0.3, 0.4, 0.6, 0.8, 1.2 µmol/ml Tiến hành xác định mật độ quang theo phương pháp trình bày phần a mục 2.3.2.3 Kết mối tương quan mật độ quang nồng độ DOX cho bảng 3.5 hình 3.7 Bảng 3.5 Mật độ quang dung dịch DOX nồng độ khác Nồng độ 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.2 0.304 0.388 0.608 0.78 1.217 (µmol/ml) Mật độ 0.184 quang Hình 3.7 Mối tương quan mật độ quang nồng độ DOX Đường chuẩn thu có dạng đường thẳng, phương trình hồi quy tuyến tính y = 1.019x - 0.014, hệ số tương quan R2 =0.998 ≈ Như khoảng nồng độ khảo sát – 1.2 µmol/ml , có tuyến tính mật độ quang nồng độ DOX dung dịch Do ta sử dụng đường chuẩn trên, kết hợp với phương pháp đo quang 480nm để xác định nồng độ DOX dung dịch 3.1.2.2 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ủ thuốc lên hiệu suất liposom hóa doxorubicin Liposom chế tạo theo phương pháp Bangham, làm kích thước nhỏ đồng hóa theo phương pháp đẩy qua màng, sau tạo gradient amonisulfat Tiến hành ủ thuốc với mẫu liposom, mẫu 2ml, đánh số thứ tự mẫu M1, M2, M3 Liposom hóa DOX theo tỷ lệ 2mg DOX/1ml liposom Ủ thuốc theo bước mục 2.3.1.3.Các mẫu M1, M2, M3 ủ với thời gian: 30 phút, giờ, Sau ủ, xác định hiệu suất liposom hóa mẫu theo quy trình mục 2.3.2.4 Kết trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết định lượng DOX Trước loại DOX tự STT Độ hấp thụ Nồng quang Sau loại DOX tự độ Độ hấp thụ (µmol/ml) Nồng Hiệu suất độ (µmol/ml) liposom hóa DOX (%) M1 0.779 0.780 0.257 0.248 31.8 M2 0.784 0.785 0.709 0.709 90.3 M3 0.786 0.787 0.686 0.684 87 Kết từ bảng 3.6 cho thấy 30 phút, q trình liposom hóa DOX chưa xảy hồn Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi tồn, có hiệu suất thấp 31.7% Sau ủ, hiệu suất liposom hóa DOX giảm so với mẫu ủ 1giờ Thực nghiệm cho thấy ủ thuốc thời gian cho hiệu suất liposom hóa DOX cao 90.3% Vì chúng tơi lựa chọn thời gian ủ thuốc cho nghiên cứu 3.1.2.3 Ảnh hưởng phương pháp đồng hóa giảm kích thước tiểu phân lên hiệu suất liposom hóa doxorubicin Liposom sau chế tạo theo phương pháp Bangham, giảm kích thước đồng hóa theo phương pháp: đẩy qua màng siêu âm đầu dò Sau q trình giảm kích thước đồng nhất, tiến hành liposom hóa DOX theo phương pháp gradient amonisulfat điều kiện: thể tích mẫu, tỷ lệ thuốc nạp, nhiệt độ thời gian Thời gian lựa chọn theo kết khảo sát Sau ủ thuốc, xác định hiệu suất liposom hóa DOX mẫu liposom Kết trình bày bảng 3.7 Kết cho thấy phương pháp đẩy qua màng cho mẫu liposom có hiệu suất liposom hóa DOX (90.3% ) cao hẳn so với phương pháp siêu âm (70%) Bảng 3.7 Hiệu suất liposom hóa DOX thu từ phương pháp đồng hóa giảm kích thước tiểu phân lên hiệu suất liposom hóa DOX : đẩy qua màng siêu âm đầu dò Phương pháp Hiệu suất liposom hóa DOX Đẩy qua màng 90.3% Siêu âm đầu dò 70% 3.2 BÀN LUẬN Nghiên cứu nối tiếp kết đạt chế tạo liposom doxorubicin nghiên cứu trước đồng thời khắc phụ số nhược điểm tồn tại, trình giảm kích thước, đồng hóa liposom chưa mong muốn, tỷ lệ nạp thuốc /lipid thấp Nhằm cải thiện quy trình chế tạo liposom doxorubicin, tạo liposom doxorubicin có đặc tính gần với chế phẩm liposom doxorubicin sử dụng lâm sàng Trên cở sở kết đạt được, nghiên cứu lựa chọn công thức chế tạo liposom doxorubicin theo bảng 2.1 đưa quy trình bào chế gồm giai đoạn Giai đoạn : Chế tạo liposom khơng mang dược chất Giai đoạn 2: Giảm kích thước đồng hóa tiểu phân liposom Giai đoạn 3: Liposom hóa DOX loại DOX tự bên ngồi liposom 3.2.1 Chế tạo liposom không mang dược chất Giai đoạn gồm cơng việc : chuẩn bị nguyên liệu, tạo lớp film lipid hydrat hóa lớp film để tạo hỗn dịch liposom đa lớp Nguyên liệu sử dụng bao gồm phospholipid cholesterol Phospholipid lòng đỏ trứng hydrogen hóa thay cho phospholipid lòng đỏ trứng chưa hydrogen hóa sử dụng nghiên cứu trước Sự bão hòa dây nối đôi hai chuỗi hydrocarbon làm tăng nhiệt độ chuyển pha phospholipid, giảm khả bị oxy hóa, giảm tính thấm lớp màng kép Choslesterol sử dụng cơng thức có vai trò điểu chỉnh tính lỏng, kiểm sốt tốc độ giải phóng chất thân nước vi nang hóa, tăng độ ổn định môi trường in vitro, in vivo Nghiên cứu sử dụng cholesterol tỷ lệ 30% mol công thức chứng minh làm tăng nhiệt độ chuyển pha lớp màng kép [13] Tỷ lệ tượng tự tỷ lệ cholesterol sử dụng nghiên cứu trước tác giả Nguyễn Văn Lâm [4] tác giả Nguyễn Thị Huê [3] Vai trò của thành phần cơng thức ngun liệu có tính định đến giai đoạn sau chúng định nhiệt độ chuyển pha lớp màng kép Nguyên liệu sử dụng phospholipid lòng đỏ trứng hydrogen hóa, sản phẩm nghiên cứu trước [6] có số iod 4.86 Theo nghiên cứu Johanna Lang cộng cho thấy HEPC có số iod từ1 - 10 có nhiệt độ chuyển pha nằm khoảng 46 oC - 52 oC[15] Vì q trình tạo lớp film lipid, hydrat hóa, giảm kích thước đơng liposom, liposom hóa DOX phải tiến hành nhiệt độ chuyển pha lớp mang kép 5-10 oC [7,10,16] nghiên cứu chọn nhiệt độ cho giai đoạn 55oC Trong nghiên cứu trước [3, 4] bào chế liposom DOX, nhiệt độ sử dụng 40oC, khác biệt nghiên cứu trước sử dụng phospholipid lòng đỏ trứng chưa hydrogen hóa, có nhiệt độ chuyển pha thấp 3.2.2 Giảm kích thước đồng hóa tiểu phân liposom Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Kích thước tiểu phân yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu lực phân phối thuốc đến khối u Kích thước tiểu phân ảnh hưởng đến: thời gian thuốc lưu thông máu, giải phóng thuốc khỏi liposom, tích lũy liposom khối u Kích thước tiểu phân ảnh hưởng đến tác dụng điểu trị độc tính hệ liposomthuốc [22] Các tế bào thành mạch máu vùng mô khỏe mạnh liên kết với chặt chẽ thành huyết quản khối ung thư xuất kẽ hở khoảng 400nm Như liposom DOX có kích thước nhỏ 400nm xuyên qua kẽ hở thành mạch khối u vào mô ung thư mà không phân bố đến mô lành Trong phân tử DOX sử dụng chế phẩm dạng tự xuyên qua thành huyết quản mơ lành mơ bệnh gây độc tính cao [3] Tuy nhiên kết nhiều nghiên cứu cho thấy kích thước phù hợp để liposom phân bố tập trung khối u từ 100- 200nm[4, 7] Do chế tạo liposom có kích thước 100-200nm mục tiêu nghiên cứu Hiện đa số phương pháp chế tạo liposom, chưa có phương pháp tạo liposom có kích thước độ đồng mong muốn Do tại, q trình giảm kích thước đồng liposom bước bắt buộc quy trình chế tạo liposom Có nhiều phương pháp để giảm kích thước đồng hóa liposom Trong nghiên cứu sử dụng phương pháp đẩy qua màng, phương pháp có nhiều ưu điểm áp dụng rộng rãi giới Hỗn dịch liposom thu sau hydrat hóa, đẩy nhiểu lần qua màng polycarbonat có kích thước lỗ giảm dần đến thu kích thước độ đồng mong muốn Phương pháp có nhiều ưu điểm hẳn so với phương pháp sử dụng sóng siêu âm để giảm kích thước đồng hóa sử dụng nghiên cứu trước Phương pháp đẩy qua màng dễ thao tác, tiến hành lượng mẫu lớn, tốn thời gian dễ dàng kiểm sốt điểu kiện thí nghiệm đặc biệt nhiệt độ Toàn hệ bao gồm mẫu liposom thiết bị ngâm bể điểu nhiệt, trình đẩy khơng sinh nhiệt nhiệt độ tồn q trình đẩy ln định dễ dàng kiểm sốt Đặc biệt, việc sử dụng khí trở (N2) q trình đẩy khơng gây nhiễm tạp cho sản phẩm giúp loại bỏ oxy khỏi mẫu liposom làm cho liposom ổn định Trong sử dụng phương pháp siêu âm để giảm kích thước tiến hành với lượng mẫu nhỏ, tốn thời gian khơng kiểm sốt nhiệt độ q trình siêu âm Nhiệt lượng lớn sinh trính siêu âm yếu tố gây nguy biến tính lipid dược chất Sử dụng thiết bị siêu âm đầu dò, sau q trình siêu âm, mẫu bị nhiễm bẩn tạp kim loại từ đầu siêu âm [23,30] Trong nghiên cứu này, mẫu liposom thơ tích 25ml đẩy lần qua màng 400 nm tiếp tục đẩy 11 lần qua màng 80 nm, trình đẩy diễn 15 phút thu mẫu liposom có kích thước trung bình 108.8 nm, PDI 0.072 chứng tỏ hệ liposom tương đối đồng nhất, kích thước nắm khoảng 100 -200nm Trong nghiên cứu tác giả Nguyễn Văn Lâm [4] liposom làm giảm kích thước phương pháp siêu âm đầu dò, tiến hành với mẫu 10ml 10 phút, mẫu liposom thu có kích thước trung bình 79.7 nm PDI tương đối cao 0.260 Tác giả Nguyễn thị Huê [3] nghiên cứu làm giảm kích thước liposom phương pháp siêu âm đầu dò, tiến hành với mẫu 5ml 20 phút, mẫu liposom thu có PDI 0.127 Trong nghiên cứu này,kết bảng 3.3 cho thấy, phương pháp đẩy qua màng cho tiểu phân liposom có kích thước phù hợp (100-200 nm ) đồng hẳn thể hiển qua số PDI bé gần 1/2 so với phương pháp siêu âm đầu dò Kết nghiên cứu thu tương đồng với kết thu sử dụng phương pháp đẩy qua màng giảm kích thước tiểu phân liposom nghiên cứu thếgiới Năm 2010 Felicitas Lewrick and Regine Peschka Süss [16] tiến hành nghiên cứu chế tạo liposom DOX phương pháp Bangham, hỗn dịch liposom thu sau hydrat hóa đẩy qua màng polycarbonat áp suất 12 bar Sau đẩy qua màng có kích thước lỗ 200nm lần 11 lần qua màng 80nm, thu hệ liposom có kích thước 105 ± 10nm, PDI bé 0.08 Antonella Accardi cộng (2012) nghiên cứu bào chế liposom doxorubicin có gắn thụ thể hướng đích Liposom bào chế phương pháp bốc pha đảo với màng lipid có thành phần DSPC, làm giảm kích thước liposom cách nén nhiều lần qua màng polycarbonat 100 nm Kết thu liposom có kích thước 145 -165nm, PDI < 0.20 [8] Những so sánh giúp thấy rõ ưu điểm phương pháp đẩy qua màng so với phương pháp giảm kích thước đồng hóa liposom khác cần áp dụng vào quy trình chế tạo liposom Nhược điểm phương pháp giá thành thiết bị cao 3.2.3 Liposom hóa DOX loại DOX tự bên ngồi liposom Liposom hóa DOX q trình nạp DOX vào khoang nước liposom Căn vào kết đạt tác giả Nguyễn Thị Huê [3] , lựa chọn kỹ thuật gradient amonisulfat để nạp doxorubicin vào liposom, tỷ lệ nạp thuốc 2mg DOX/ml liposom, hiệu suất nạp thuốc 90.3% Tác giả Nguyễn Văn Lâm [4] nghiên cứu liposom hóa DOX theo kỹ Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi thuật gradient pH, tỷ lệ nạp nạp thuốc 2mg DOX/ml liposom hiệu suất thu 85% Có khác hiệu suất liposom hóa nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp giảm kích thước tiểu phân liposom mà nghiên cứu áp dụng Nguyễn văn Lâm sử dụng phương pháp siêu âm đầu dò để giảm kích thước liposom, liposom thu có kích thước nhỏ (79.7nm ) dẫn đến thể tích khoang nước nhỏ nên mẫu liposom có độ đồng dẫn đến hiệu suất liposom hóa chưa cao Tác giả Nguyễn Thị Huê [3] tiến hành liposom hóa DOX theo kỹ thuật gradient amonisulfat, hiệu suất thu cao 96.2% Tuy nhiên tỷ lệ nạp thuốc 0.85mg DOX/ml liposom Trong nghiên cứu sử dụng tỷ lệ nạp thuốc cao 2ml DOX/ ml với mục đích chế tạo liposom DOX gần giống với chế phẩm liposom-DOX sử dụng lâm sàng, chế phẩm có hàm lượng thuốc 2mg/ml Felicitas Lewrick and Regine Peschka Süss [16] tiến hành nghiên cứu chế tạo liposom DOX phương pháp Bangham Công thức liposom SPC cholesterol theo tỷ lệ mol 7:3 Giảm kích thước tiểu phân liposom đồng hóa phương pháp đẩy qua màng, liposom hóa DOX kỹ thuật gradient pH Hiệu suất liposom hóa đạt 95 % Hiệu suất liposom hóa nghiên cứu chưa cao chưa tối ưu hóa tỷ lệ nạp thuốc q trình loại DOX tự nhiều nhược điểm Lượng lipid ban đầu bị hao hụt trình chế tạo cần định lượng hàm lượng lipid xác định tỷ lệ nạp thuốc dựa hàm lượng lipid có mẫu Q trình loại DOX tự sử dụng kỹ thuật thẩm tách, thời gian kéo dài,tiến hành nhiệt độ phòng nên thuốc liposom hóa có nguy rò rỉ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Trong khn khổ khóa luận tốt nghiệp với đề tài:‘‘ Ứng dụng phương pháp đẩy qua màng nghiên cứu tạo liposom-doxorubicin kích cỡ nano’’, chúng tơi thu kết sau : - Đã nghiên cứu xây dựng áp dụng thành công phương pháp đẩy qua màng giảm kích thước tiểu phân liposom Kết cho thấy, đẩy hỗn dịch liposom thô lần qua màng 400 nm tiếp tục đẩy 11 lần qua màng 80nm thu hệ liposom có kích thước trung bình 108 nm PDI 072 - Nghiên cứu chứng minh ưu điểm phương pháp đẩy qua màng so với phương pháp siêu âm đầu dò giảm kích thước tiểu phân liposom Phương pháp đẩy qua màng cho hệ phân tán liposom có kích thước phù hợp (100 -200 nm) đồng so với phương pháp siêu âm Đề xuất Do thời gian điều kiện tiến hành nghiên cứu hạn chế, để nâng cao hiệu suất liposom hóa doxorubicin tiến tới đưa việc chế tạo liposom-doxorubicin gần đến quy mơ sản xuất, chúng tơi có đề xuất sau: - Nghiên cứu phương pháp định lượng phospholipid để xác định tỷ lệ nạp thuốc phù hợp, nâng cao hiệu suất liposom hóa DOX - Đánh giá độ ổn định liposom-DOX tạo thành môi trường in vitro invivo Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi - Bổ sung vào công thức chế tạo liposom thành phần nhằm kéo dài thời gian bán thải tăng tính hướng đích liposom PEG-DSPE , folic acid… TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bộ y tế (2002), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội 2.Trương Duy Hiệu (2011), Nghiên cứu phương pháp tạo tiểu phân liposom-doxorubicin kích thước cỡ nano, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Thị Huê (2012), Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật tạo liposome doxorubicin từ phospholipid lòng đỏ trứng, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Văn Lâm (2012), Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin đánh giá tác dụng khối u động vật, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội Võ Xuân Minh (2006), Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc, NXB Y học Nguyễn Thị Thu Trang (2012), Nghiên cứu chiết xuất, cải tiến công thức phospholipid từ lòng đỏ trứng phù hợp làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm dạng liposome, Trường ĐH Dược Hà Nội, Hà Nội TÀI LIỆU TIẾNG ANH A Abraham Sheela, Dawn N Waterhouse, Lawrence D Mayer, Pieter R Cullis, Thomas D Madden, Marcel B Bally (2005), “ The Liposomal Formulation of Doxorubicin ” , Methods in enzymology, 391, 71-97 Antonella Accardo et al ( 2012), “Peptide-modified liposomes for selective targeting of bombesin receptors overexpressed by cancer cells: a potential theranostic agent”, International Journal of Nanomedicine ,7, 2007–2017 Abolfazl Akbarzadeh, Rogaie Rezaei-Sadabady, Soodabeh Davaran, Sang Woo Joo, Nosratollah Zarghami,Younes Hanifehpour, Mohammad Samiei, Mohammad Kouhi ,Kazem Nejati-Koshki (2013), “Liposome: classification, preparation, and Applications”, Nanoscale Research Letters, 8-102 10 Barenholz Yechezkel (2007), “Amphipathic Weak Base Loading into Preformed Liposomes Having a Transmembrane Ammonium Ion Gradient: From the Bench to Approved Doxil”, Liposome Technology Third Edition Volume II Entrapment of Drugs and Other Materials into Liposomes, 1-22 11 British Pharmacopoeia (2012) Volume III 12 Daryl C Drummond, Oliver Mayer, Keelung Hong, Dmitri B.Kirpotin, Demetrios Papahajopouslos (1999), “Optimizing Liposomes for Delivery of Chemotherapeutic Agents to Solid Tumors”, Pharmacological Review, 51( 4), 691-743 13 Katrin K Halling (2004), “Membrane properties of plant sterols in phospholipid bilayers as determined by differential scanning calorimetry, resonance energy transfer and detergentinduced solubilization”, Biochimica et Biophysica Acta, 1664, 161– 171 14 Mohan Kale, Pravin Suruse, Ramandeep Singh, Geena Malhotra, Preeti Raut (2012), “Effect of size reduction techniques on doxorubicin hydrochloride loaded liposomes”, International Journal of Biological & Pharmaceutical Research, 3(3), 308-316 15 Johanna Lang, Carmen Vigo-Pelfrey, Francis Martin (1990), “Liposomes composed of partially hydrogenated egg phosphatidylcholines: fatty acid composition, thermal phase behavior and oxidative stability”, Chemistry and Physics of Lipids,53, 91- 101 16 Felicitas Lewrick ,Regine Peschka Süss , “Remote Loading of Anthracyclines into Liposomes”, Liposomes Methods and Protocols , 1, 139-145 17 Li XueMing, LiYan Ding, Yuanlong Xu, YongluWang, QiNeng Ping (2009), “Targeted delivery of doxorubicin using stealth liposomes modified with transferrin” , International Journal of Pharmaceutics, 373, 116–123 18 Martindale 35 19 Mayer Lawrence D., Marcel B Bally, Michael J Hope and Pieter R Cullis (1985) , Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi “Uptake of antineoplastic agents into large unilameilar vesicles in response to a membrane potential” , Biochimica et Biophysica Acta, (816) , 294-302 20 Mayer L.D., M.J Hope, P.R Cullis (1986) , “Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure”, Biochimica et Biophysics Acta, 858, 161-168 21 Mui Barbara, Michael J Hope (2007) , “Formation of Large Unilamellar Vesicles by Extrusion”, Liposome Technology Third Edition Volume I : Liposome Preparation and Related Techniques , 55-64 22 Nagayasu, K Uchiyama, H Kiwada (1999), “The size of liposomes: a factor which affects their targetingefficiency to tumors and therapeutic activity of liposomal antitumor drugs”, Advanced Drug Delivery Reviews, 40, 75–87 23 Nayar R, Hope MJ, Cullis PR ( 1989), “Generation of large unilamellar vesicles from long chain saturated phosphatidylcholine by extrusion techniques”, Biochim Biophys Acta, 986, 200– 206 24 Ray A (2012),”Liposome in Drug delivery system” , Asian J Res Pharm Sci, 2, 41-44 25 Rojanapanthu Pleumchitt, Narong Sarisuta, Korakot Chaturon, Krisana Kraisintu (2003) , “Physicochemical properties of amphotericin B liposomes prepared by reverse-phase evaporation method”, Drug Dev Ind Pharm, 29(1), 31-72 26 Samad Abdus, Y Sultana and M Aqil (2007) “ Liposomal Drug Delivery Systems: An Update Review”, Current Drug Delivery,4, 297-305 27 Sen Kacoli , Mahitosh Mandal (2013), “Second generation liposomal cancer therapeutics: Transition from laboratory to clinic”, International Journal of Pharmaceutics, 448, 28–43 28 Shri Singh (2000), “Phase transitions in liquid”, Physics Reports, 324, 107-269 29 USP29-NF24 30 Vladimir Torchilin, Volkmar Weissig (2003), “Liposome a practical approach Second edition ”, Oxford university press, New York 31 Xiaoming Xu, Diane J.Burgess (2012), “Liposomes as Carriers for Controlled Drug Delivery” , Long Acting Injections and Implants, 195-220 ... hóa liposom Đề tài Ứng dụng phương pháp đẩy qua màng nghiên cứu tạo liposom- doxorubicin kích cỡ nano tiến hành nhằm áp dụng phương pháp mới- phương pháp đẩy qua màng vào giai đoạn giảm kích. .. sử dụng riêng phương pháp đẩy qua màng dù đẩy qua màng kích thước lỗ Nghiên cứu cho thấy hiệu suất nạp thuốc liposom sử dụng kết hợp hai phương pháp tốt liposom sử dụng phương pháp đẩy qua màng. .. Nội dung nghiên cứu 2.2.1 Chế tạo liposom DOX kích cỡ nano - Nghiên cứu chế tạo liposom DOX kích thước cỡ nano, ứng dụng phương pháp đẩy qua màng giảm kích thước đồng hóa tiểu phân liposom -