NGHIÊN cứu NUÔI cấy LACTOBACILLUS SPOROGENES để tạo NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TÔ NGỌC SẮC NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY Lactobacillus sporogenes ĐỂ TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI TÔ NGỌC SẮC NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY Lactobacillus sporogenes ĐỂ TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CNDP&BC MÃ SỐ 60.72.04.02 Người hướng dẫn khoa học: TS Đàm Thanh Xuân HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới cô giáo TS Đàm Thanh Xuân hết lòng hướng dẫn, truyền đạt kiến thức quý báu, dành nhiều thời gian, tận tâm bảo giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Khắc Tiệp, DS Lê Ngọc Khánh cho học giá trị, nhiệt tình dạy bảo giúp đỡ từ ngày đầu nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp dược nhiệt tình bảo tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học thầy cô, cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu trường Cuối cùng, cho gửi lời biết ơn tới gia đình, bạn bè động viên, khích lệ giúp đỡ mặt để có kết ngày hôm Hà Nội, tháng năm 2016 Học viên Tô Ngọc Sắc MỤC LỤC Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng, biểu Danh mục hình vẽ, đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng probiotic 1.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng probiotic giới Việt Nam 1.3 Lactobacillus sporogenes 1.3.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, điều kiện nuôi cấy 1.3.2 Vai trò Lactobacillus sporogenes 1.3.3 Một số chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus sporogenes thị trường… … 10 1.3.4 1.4 Một số nghiên cứu L sporogenes giới Việt Nam 11 Đại cƣơng sinh trƣởng phát triển vi sinh vật 13 1.4.1 Đường cong sinh trưởng 13 1.4.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển vi sinh vật 14 1.5 Nguyên liệu probiotic dạng bột đông khô 16 1.5.1 Khái niệm phương pháp đông khô 16 1.5.2 Các giai đoạn trình đông khô 17 1.5.3 Ưu nhược điểm phương pháp đông khô 17 1.5.4 Ứng dụng phương pháp đông khô 18 1.5.5 Một số tá dược thường dùng đông khô vi sinh vật 18 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 22 2.1.1 Nguyên vật liệu 22 2.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu 22 2.1.3 Thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Phương pháp giữ giống thạch nghiêng 24 2.2.2 Phương pháp nhân giống bình nón 25 2.2.3 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật 25 2.2.4 Phương pháp nhuộm màu quan sát bào tử (phương pháp Ogietska) 28 2.2.5 Phương pháp tạo bào tử xử lý nhiệt theo Pasteur 29 2.2.6 Phương pháp định tính ion lactat dịch nuôi cấy 29 2.2.7 Phương pháp định tính vi sinh vật đến mức loài kit API 50CH 30 2.2.8 Phương pháp tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes 32 2.2.9 Phương pháp xử lý số liệu 32 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Nhận dạng số đặc tính sinh học Lactobacillus sporogenes 33 3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào vi sinh vật 33 3.1.2 Định tính khuẩn lạc thu kit Api 50CH 35 3.1.3 Khảo sát điều kiện hô hấp Lactobacillus sporogenes 35 3.1.4 Đánh giá khả sinh acid lactic theo thời gian khả tạo bào tử Lactobacillus sporogenes 37 3.1.5 Xây dựng phương trình tương quan tuyến tính mật độ quang OD (mật độ quang) mật độ tế bào 40 3.1.6 Xây dựng đường cong sinh trưởng Lactobacillus sporogenes 42 3.2 Lựa chọn điều kiện nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để tạo nguyên liệu probiotic 45 3.2.1 Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp để nuôi cấy Lactobacillus sporogenes 45 3.2.2 Khảo sát tốc độ lắc trình nuôi cấy 51 3.2.3 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy trình nuôi cấy 53 3.3 Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes đánh giá số tiêu chất lƣợng nguyên liệu tạo thành 58 3.3.1 Xử lí sinh khối để tạo nguyên liệu probiotic phương pháp đông khô 58 3.3.2 Đánh giá số tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành 61 Chƣơng BÀN LUẬN 64 4.1 Về Lactobacillus sporogenes số đặc tính sinh học 64 4.1.1 Về định tính Lactobacillus sporogenes mẫu 64 4.1.2 Về số đặc tính sinh học Lactobacillus sporogenes 65 4.1.3 Về điều kiện hô hấp Lactobacillus sporogenes 65 4.1.4 Về đường cong sinh trưởng Lactobacillus sporogenes 66 4.2 Về điều kiện nuôi cấy thích hợp Lactobacillus sporogenes 67 4.2.1 Về môi trường dinh dưỡng thích hợp để nuôi cấy Lactobacillus sporogenes 67 4.2.2 Về ảnh hưởng tốc độ cấp khí lên sinh trưởng phát triển Lactobacillus sporogenes 69 4.2.3 Về nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho trình nuôi cấy Lactobacillus sporogenes 70 4.3 Về tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes 71 4.3.1 Về vấn đê xử lí sinh khối để tạo nguyên liệu probiotic phương pháp đông khô 71 4.3.2 Về độ ổn định mẫu đông khô probiotic Lactobacillus sporogenes tạo thành 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt ADN Acid deoxyribo nucleic API 50CH Kit định danh loài Bacillus, Enterobacteriacaea, Vibrioacaea loài Lactobacillus ATP Adenosin triphosphat B clausii Bacillus clausii BCP Môi trường nuôi cấy B subtilis Bacillus subtilis C butyricum Clostridium butyricum Cfu (Colony – Forming Units) Số đơn vị khuẩn lạc CPA Cryoprotectant FAO (Food and Agriculture Organization) Tổ chức Nông lương giới GYE Glucose – cao nấm men HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl–coenzyme A MT Môi trường L acidophilus Lactobacillus acidophilus L kefir Lactobacillus kefir L sporogenes Lactobacillus sporogenes MRS (de Man, Rogosa and Sharpe) Môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic OD (optical density) Mật độ quang vòng/phút (revolutions per minute) Vòng phút VSV Vi sinh vật WHO (WorldHealth Organization) Tổ chức Y tế giới ID Identification Danh mục bảng, biểu Bảng 1.1 So sánh đặc tính Lactobacillus sporogenes với chi Bacillus Lactobacillus Bảng 1.2 Một số chế phẩm probiotic chứa Lactobacillus sporogenes thị trường 10 Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng đề tài 22 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng đề tài 24 Bảng 2.3 Mật độ quang OD số lượng VSV theo phương pháp đếm số khuẩn lạc đĩa thạch mẫu khác 28 Bảng 3.1 Lượng sinh khối thu nuôi cấy L sporogenes điều kiện cấp khí khác 36 Bảng 3.2 Giá trị pH dịch nuôi cấy L sporogenes môi trường MRS thời điểm khảo sát 39 Bảng 3.3 Kết xác định mật độ vi sinh vật hỗn dịch phương pháp đo quang đếm đĩa thạch 41 Bảng 3.4 Mật độ quang dịch nuôi cấy L sporogenes thời điểm khảo sát 43 Bảng 3.5 Lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes môi trường khác 46 Bảng 3.6 Lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes môi trường MRS có bổ sung loại đường khác 48 Bảng 3.7 Lượng sinh khối thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes môi trường dinh dưỡng MRS có nồng độ glucose khác 50 Bảng 3.8 Sự phát triển vi sinh vật hai tốc độ cấp khí khác 52 Bảng 3.9: Lượng sinh khối ướt thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes 30oC 37oC 54 Bảng 3.10: Lượng sinh khối thu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes 37oC 45oC 56 Bảng 3.11 Mật độ vi sinh vật mẫu đông khô chứa L sporogenes tạo thành với lượng hỗn dịch vi sinh vật sử dụng khác 59 Bảng 3.12 Mật độ vi sinh vật mẫu đông khô chứa L sporogenes tạo thành với thời gian nuôi cấy khác 60 Bảng 3.13 Biến thiên mật độ VSV hàm ẩm mẫu đông khô theo thời gian 62 (sau tuần số lượng VSV mẫu 1.62×109 cfu/g, sau tuần 1.49×109 cfu/g, sau tuần 2.01×109 cfu/g) Có thể giải thích mẫu đông khô tạo thành hàm ẩm, thấp (2.86%), chưa kể điều kiện bảo quản mẫu đông khô có khả hút ẩm tăng hàm ẩm Hàm ẩm cao khả sống sót vi sinh vật theo thời gian giảm Bởi điều kiện có ẩm, làm vi sinh vật trở lại trạng thái hoạt động tiếp tục sinh trưởng, phát triển, già hóa chết [25], [47] So sánh với nghiên cứu Lactobacillus acidophilus năm 2014, bảo quản pellet probiotic lọ thủy tinh nút cao su kín nhiệt độ 4– 6oC kết có tương đồng mà số lượng VSV sống giảm nhiều tuần bảo quản, giảm chậm dần tuần [10] Cả nghiên cứu tác dụng bảo vệ VSV sữa gầy trình đông khô trình bảo quản Bởi thành phần lactose có sữa gầy số disaccharide khác thấm qua thành tế bào, sau chúng hình thành liên kết hydro đường - protein Các liên kết giúp trì cấu trúc protein màng nước bị loại Protein giúp hình thành trạng thái glass xung quanh bên tế bào tạo môi trường đủ nhớt bên tế bào giúp ngăn cản biến đổi tế bào mức thấp Theo nghiên cứu khác protein sữa gầy tạo thành lớp áo bảo vệ thành tế bào, đồng thời sữa gầy cung cấp chất đệm tan nước (muối phosphate, muối citrat) giúp ổn định pH trình đông khô [44], [45] 73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận Sau thời gian thực đề tài, nghiên cứu đạt số kết sau: Từ mẫu vi khuẩn Lactobacillus sporogenes (Bacillus coagulans) tiến hành định danh đạt kết %ID 85,3% (đạt yêu cầu) test với kit API 50CH khảo sát số đặc tính sinh học Lactobacillus sporogenes nghiên cứu đề tài:  Có hình dáng khuẩn lạc bề mặt môi trường MRS thạch đĩa petri dạng lồi, trơn, bóng sáng, viền có cưa Tế bào sinh dưỡng hình que, mọc đơn dính thành chuỗi ngắn  Là vi khuẩn sinh bào tử, bào tử bắt đầu quan sát thời điểm 48 giờ, chiếm đa số thời điểm 96  Có khả sinh acid lactic trình nuôi cấy, thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí không bắt buộc Đề tài lựa chọn số điều kiện nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để thu lượng sinh khối lớn nhất: nuôi cấy môi trường MRS lỏng (glucose 2%), tốc độ lắc 200 vòng/phút (tỉ lệ thể tích: 100 ml dịch bình 250 ml), nhiệt độ 37oC Đã tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes với mật độ vi sinh vật đạt 4.10×109 cfu/g hàm ẩm 2.86% đánh giá số tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành Số lượng VSV sống mẫu đông khô điều kiện bảo quản giảm nhiều tuần (còn 2.31×109 cfu/g) ổn định dần tuần (còn 2.01×109 cfu sau tuần) 74  Kiến nghị Để tiếp tục hướng nghiên cứu đề tài, xin đưa đề xuất sau: o Nghiên cứu nuôi cấy thu bào tử tinh Lactobacillus sporogenes o Nghiên cứu tạo dạng nguyên liệu probiotic khác có chứa Lactobacillus sporogenes đạt tiêu mật độ vi sinh vật 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Bộ Y tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học Bộ Y Tế (2008), Vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục Vũ Thị Minh Đức (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nhà xuất đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Lân Dũng cộng (2011), Vi sinh vật học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp, Nguyễn Văn Vinh (2009), Bàn khả sống sót vi sinh vật sản phẩm probiotics, Tạp chí dược học, pp 4-7 Nguyễn Thị Bích Ngọc (2012), Khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Baccillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội Đặng Thị Hoàng Oanh (2008), Giáo trình vi sinh đại cương, Trường Đại học Cần Thơ khoa Thủy Sản Lê Xuân Phương (2008), Vi sinh vật học môi trường, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng 10 Tô Ngọc Sắc (2014), Đánh giá khả sống sót Lactobacillus acidophilus trình tạo pellet probiotics, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại Học Dược Hà Nội 11 Trần Hạnh Triết (2005), Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng phát triển vi khuẩn Lactobacillus sporogenes, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh Tiếng Anh 12 Ali O Büyükkileci Sebnem Harsa (2004), "Batch production of L (+) lactic acid from whey by Lactobacillus casei", Journal of Chemical Technology and Biotechnology, Vol 79(9), pp 1036 – 1040 13 Amaha Mikio, Ordal Z John, Touba Ali (1956), "Sporulation requirements of Bacillus coagulans var thermoacidurans in complex media", Journal of bacteriology, 72(1), pp 34 14 Anderson Robert E (1984), "Growth and corresponding elevation of tomato juice pH by Bacillus coagulans", Journal of Food Science, 49(2), pp 647-647 15 Apajalahti J H A L K Sarkilabti B R E Maki, J P Heikkinen, P H Nurminen and W E Holben (1998), "Effective recovery of bacteria DNA and percent-guanine-plus-cytosin-based analysis community structure in the gastrointestinal tract of broiler chickens", Appl Environ Microbiol, 64, pp 4084 - 4088 16 B De Giulio, P Orlando, G Barba, R Coppola, M De Rosa, A Sada, P P De Prisco, F Nazzaro (2005), "Use of alginate and cryo-protective sugars to improve the viability of lactic acid bacteria after freezing and freeze-drying", World Journal of Microbiology & Biotechnology, 21, pp 739 - 746 17 Barry J Fuller (2004), "Cryoprotectants: The essential antifreezes to protect life in the frozen state", CryoLetters, 25(6), pp 375-388 18 Batra Navneet, Singh Jagtar, Banerjee Uttam C, Patnaik Pratap R, Sobti Ranbir C (2002), "Production and characterization of a thermostable β‐galactosidase from Bacillus coagulans RCS3", Biotechnology and applied biochemistry, 36(1), pp 1-6 19 BioMerieux, Inc (2006), API 50 CH and API 20E Medium, France 20 BucHANAN RoE, Gibbons NE (1974), "Bergey’s manual of determinative bacteriology., The Williams and Wilkins Co", Baltimore, Md, pp 489-491 21 C A Morgan, N Herman, P A White, G Vesey (2006), "Preservation of micro-organisms by drying", Journal Microbiol Methods, 66(2), pp 183-193 22 Cosentino S, Mulargia AF, Pisano B, Tuveri P, Palmas F (1997), "Incidence and biochemical characteristics of Bacillus flora in Sardinian dairy products", International journal of food microbiology, 38(2), pp 235-238 23 De Clerck Elke, Rodriguez-Diaz Marina, Forsyth Gillian, Lebbe Liesbeth, Logan Niall A, DeVos Paul (2004), "Polyphasic characterization of Bacillus coagulans strains, illustrating heterogeneity within this species, and emended description of the species", Systematic and applied microbiology, 27(1), pp 5060 24 De Vecchi E., Drago L (2006), "Lactobacillus sporogenes or Bacillus coagulans: misidentification or mislabeling?", International Journal of Probiotics and Prebiotics, Vol 1, No 1, pp pp 3-10, 2006 25 Dimitris Charalampopoulos Robert A Rastall (2009), "Prebiotics and Probiotics Science and Technology", pp 2658 26 FAO/WHO (2002), "Guidelines for the evaluation of probiotics in food Joint FAO/WHO working group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food, London, Ontario, Canada" 27 FAO/WHO (2001), Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properites of Probiotic in Food Including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria, Cordoba, Argentina 28 Filomena Nazzaro Florinda Fratianni Raffaele Coppola, Alfonso Sada, Pierangelo Orlando (2009), "Fermentative ability of alginat-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions", Journal of Functional Food 1, pp 319-323 29 Gandhi, A.B (1998 ), "Lactobacillus sporogenes, an advancement in Lactobacillus therapy", The Eastern Pharmacist, pp 41-43 30 Gombotz Wayne R., Wee Siow Fong (2012), "Protein release from alginate matrices", Advanced Drug Delivery Reviews, 64, pp 194-205 31 Gong J Forster R J Yu H, Chamber J R, Sabour P M, Wheatcroft R and Chen S (2002), "Diversity and phylogenetic analysis of bacteria in the muscosa of chicken ceca and comparison with bacteria in the cecal lumen", FEMS Microbiol Lett, 208, pp 1-7 32 Guthrie Christine, Fink Gerald R (2002), Guide to yeast genetics and molecular and cell Biology: Part C, Gulf Professional Publishing 33 Hammer B W (1915), "Bacteriological studies on the coagulation of evaporated milk", Agricultural experiment station Iowa state college of agriculture and mechanic arts, Research Bulletin No 19, pp 119 – 132 34 Hyronimus B, Le Marrec C, Urdaci MC (1998), "Coagulin, a bacteriocin-likeinhibitory substance produced by Bacillus coagulans I4", Journal of applied microbiology, 85(1), pp 42-50 35 Julie S Jurenka MT (2012), "Bacillus coagulans", Alternative Medicine Review, Vol 17, No.1, pp 76 – 81 36 L Drago E De Vecchi (2009), "Should Lactobacillus sporogenes and Bacillus coagulans Have a Future", Journal of Chemotherapy, Vol 21, No.4, pp 371 – 377 37 L Drago E De Vecchi (2006), "Lactobacillus sporogenes or Bacillus coagulans: Misidentification or mislabeling?", International Journal of Probiotic and Prebiotics Vol 1, No 1, pp 3-10 38 Lim Chi Ming, Raha Abd Rahim, Ho Yin Wan, Arbakariya B Ariff (2009), "Formulation of Protective Agents for Improvement of Lactobacillus salivarius I 24 Survival Rate Subjected to Freeze Drying for Production of Live Cells in Powderized Form", Food Bioprocess Technol, 2, pp 431-436 39 Louis Rey, Joan C May (2007), "Freeze-Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products", Drugs and the pharmaceutical sciences, America 40 M Patterson J A and Burkholder K (2003), "Application of prebiotics and probiotics in poultry production", J Animal Science, 82, pp 627-631 41 Macfarlane George T, Cummings John H (1999), "Probiotics and prebiotics: can regulating the activities of intestinal bacteria benefit health?", Western journal of medicine, 171(3), pp 187 42 Majeed M Prakash L (1998), "Lactospore: The Effective Probiotic", Piscataway, NJ: NutriScience Publishers, Inc 43 Marshall Rosemarie, Beers RJ (1967), "Growth of Bacillus coagulans in chemically defined media", Journal of bacteriology, 94(3), pp 517-521 44 Ming Lim Chi, Rahim Raha Abd, Wan Ho Yin, Ariff Arbakariya B (2009), "Formulation of protective agents for improvement of Lactobacillus salivarius I 24 survival rate subjected to freeze drying for production of live cells in powderized form", Food and bioprocess technology, 2(4), pp 431-436 45 Morgan C., Vesey G (2009), "Freeze-Drying of Microorganisms", Elsevier, Australia 46 Nations World Gastroenterology Organisation Food and Agriculture Orgarnization Of The United (2006), "Probiotics in food: Health and nutritional properties and guidelines for eveluation" 47 Nei T Souru H., Araki (1996), "Effect of residual moisrure content on the survival of freeze-dried bacteria during storage under various conditions", Cryobiology, 2(5), pp 276-279 48 Netherwood T Gilbert H J Parker D S and O'Donnell A G (1999), "probiotics shown to change bacterial community structure in the avian gastrointetinal tract", Appl Environ Microbiol, 65, pp 5134 - 5138 49 Olajuyigbe Folasade M, Ehiosun Kevin I (2013), "Production of thermostable and organic solvent-tolerant alkaline protease from Bacillus coagulans PSB-07 under different submerged fermentation conditions", African Journal Of Biotechnology, 12(21), pp 3341-3350 50 Organisation World Gastroenterology (2008), "Probiotics and prebiotics", World Gastroenterology Organisation Practice Guiline 51 Payot T, Chemaly Z, Fick M, (1999), "Lactic acid production by Bacillus coagulans—kinetic studies and optimization of culture medium for batch and continuous fermentations", Enzyme and Microbial Technology, 24(3), pp 191199 52 R Gibson G R and Fuller (2000), "Aspect of in vitro and in vivo research approaches directed toward identifying probiotics and prebiotics for human use", J Nut, 130, pp 391-395 53 Rhee Mun Su, Moritz Brélan E, Xie Gary, del Rio T Glavina, Dalin Eileen, Tice Hope, Bruce David, Goodwin Lynne, Chertkov Olga, Brettin Thomas (2011), "Complete Genome Sequence of a thermotolerant sporogenic lactic acid bacterium, Bacillus coagulans strain 36D1", Standards in genomic sciences, 5(3), pp 331-340 54 Robert S Breed, E G D Murray, Nathan R Smith (1957), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, pp 282, 506, 541, 543-552 55 Saad N Delattre C Urdaci M., Schmitter J M., Bressollier P (2013), "An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field", LWT - Food Science and Technology, 50(1), pp 1-16 56 Sari FN, Dizdar EA, Oguz S, Erdeve O, Uras N, Dilmen U (2011), "Oral probiotics: Lactobacillus sporogenes for prevention of necrotizing enterocolitis in very low-birth weight infants: a randomized, controlled trial", European Journal of Clinical Nutrition, 65(4), pp 434-439 57 Thorne Research Inc All Right Reserved (2002), "Lactobacillus sporogenes Monograph", Alternative Medicine Review, Vol 7, No 4, pp 340 – 342 58 Vivek K B (2013), "Use of encapsulated Probiotics in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences ISSN: 2277209X, (1), pp 188-199 59 Widdel Friedrich (2010), "Theory and Measurement of Bacterial Growth", Grundpraktikum Mikrobiologie, Sem (B.Sc.), Universität Bremen, pp 4-11 60 Widdel Friedrich (2010), "Theory and Measurement of Bacterial Growth", Grundpraktikum Mikrobiologie, Sem (B.Sc.), Universität Bremen, pp 4-11 61 Yoon Ho-Geun, Lee Kyung-Han, Kim Hee-Yun, Kim Hye-Kyung, Shin DongHoon, Hong Bum-Shik, Cho Hong-Yon (2002), "Gene cloning and biochemical analysis of thermostable chitosanase (TCH-2) from Bacillus coagulans CK108", Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 66(5), pp 986-995 PHỤ LỤC Phụ lục Phiếu kiểm nghiệm Phụ lục Hồ sơ kiểm nghiệm trang Phụ lục Hồ sơ kiểm nghiệm trang Phụ lục Định tính vi sinh vật đến mức loài kit Api 50CH trang Phụ lục Định tính vi sinh vật đến mức loài kit Api 50CH trang [...]... đầu được nghiên cứu trong những năm gần đây Tuy nhiên, số lượng nghiên cứu chưa nhiều và tập trung chủ yếu vào nhóm ngành thực phẩm và thú y Xuất phát từ những lý do trên, đề tài Nghiên cứu nuôi cấy Lactobacillus sporogenes để tạo nguyên liệu probiotic được thực hiện với các mục tiêu: 1 Nhận dạng một số đặc tính sinh học của Lactobacillus sporogenes 2 Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu được Lactobacillus. .. nhiều nghiên cứu được thực hiện để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Bacillus coagulans như nghiên cứu của Rosemarie Marshall and R J Beers, năm 1967 [43], tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Bacillus coagulans để thu được bào tử như nghiên cứu của Amaha Mikio, Ordal Z John, Touba Ali năm 1956 [13] hay sinh acid lactic như nghiên cứu của T Payot, Z Chemaly, and M Fick năm 1999 [51] Ở Việt Nam, các nghiên cứu về... kiện nuôi cấy tối ưu được Lactobacillus sporogenes thu sinh khối 3 Tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus sporogenes và đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu tạo thành 1 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng về probiotic Thuật ngữ probiotics có nguồn gốc từ Hy Lạp Theo nghĩa gốc, ―biotic‖ hay ―biosis‖ từ chữ ―life‖ là đời sống, và ―pro‖ là thân thiện, nên probiotics có thể hiểu theo nghĩa là... trưởng của Lactobacillus sporogenes khi nuôi cấy trong môi trường MRS ở 37oC, 110 vòng/phút 43 Hình 3.9 Ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của Lactobacillus sporogenes 46 Hình 3.10 Ảnh hưởng của loại đường sử dụng lên sự phát triển của Lactobacillus sporogenes 48 Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sự phát triển của Lactobacillus sporogenes. .. các vi sinh vật rất nhỏ nên việc nghiên cứu ở một cá thể là rất khó, vì vậy, khi nghiên cứu về sinh trưởng, người ta thường xét sự biến đổi về số lượng của cả quần thể vi sinh vật [2], [4] 1.4.1 Đƣờng cong sinh trƣởng Khi nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ, nghĩa là nuôi cấy trong thiết bị kín, không bổ sung thêm chất dinh dưỡng trong quá trình nuôi cấy thì vi sinh vật sinh trưởng... sinh khối ướt thu được khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes ở hai tốc độ cấp khí khác nhau 52 Hình 3.13 Kết quả thống kê trên S-plus so sánh lượng sinh khối ở 2 tốc độ lắc 53 Hình 3.14 Đồ thị so sánh lượng sinh khối thu được khi nuôi cấy Lactobacillus sporogenes ở 30oC và 37oC 55 Hình 3.15 Kết quả thống kê trên S-plus so sánh lượng sinh khối khi nuôi cấy ở 30oC và 37oC ... tình trạng nhiễm toan chuyển hóa cho cơ thể [12] Lactobacillus sporogenes có các đặc tính chung của cả hai chi Lactobacillus và Bacillus, bảng dưới đây so sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với hai chi này Bảng 1.1 So sánh các đặc tính cơ bản của Lactobacillus sporogenes với các chi Bacillus và Lactobacillus [37] Đặc tính L sporogenes Lactobacillus Bacillus Catalase + - + Oxidase -... nhau Điều này làm cho tính chất của alginat biến đổi trong một dải rộng [16], [30] 21 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên vật liệu  Chủng giống Lactobacillus sporogenes do Bộ môn Công Nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp  Nguyên liệu sử dụng trong đề tài Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong đề tài Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc Glucose... Đặc điểm hình thái:  Lactobacillus sporogenes được mô tả là trực khuẩn Gram dương, hình que, kích thước 0,5 – 0,7µm × 1,6 – 7,1 µm, có khả năng di động, có khả năng sinh bào tử [33], [37] 5  Tế bào Lactobacillus sporogenes có xu hướng mọc đơn hoặc hiếm khi ở dạng chuỗi ngắn [33],[37] Hình 1.1 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào vi khuẩn Lactobacillus sporogenes  Điều kiện nuôi cấy:  L sporogenes là vi khuẩn... cũng được đề xuất như là chất bổ trợ để điều trị kháng sinh của phản ứng miễn dịch Một số sản phẩm chứa Lactobacillus sporogenes được liệt kê trong bảng sau: Bảng 1.2 Một số chế phẩm probiotic chứa Lactobacillus sporogenes trên thị trường STT Tên thƣơng mại Thành phần Dạng bào chế Nhà sản xuất Estromineral L sporogenes Viên nén Rottapharm | Madaus (Italia) Biobaby L sporogenes, B subtilis, C butyricum