NGHIÊN cứu tạo NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA bào tử BACILLUS CLAUSII

B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC DC H NI NGUYN TH THU PHNG NGHIấN CU TO NGUYấN LIU PROBIOTIC CHA BO T Bacillus Clausii LUN VN THC S DC HC H NI 2016 B GIO DC V O TO B Y T TRNG I HC DC H NI NGUYN TH THU PHNG NGHIấN CU TO NGUYấN LIU PROBIOTIC CHA BO T Bacillus Clausii LUN VN THC S DC HC CHUYấN NGNH: CễNG NGH DC PHM V BO CH Mó 60720402 Ngi hng dn khoa hc: TS m Thanh Xuõn B mụn Cụng nghip dc Trng i hc Dc H Ni H NI 2016 LI CM N Li u tiờn, tụi xin by t lũng bit n chõn thnh v sõu sc nht ti cụ giỏo TS m Thanh Xuõn ó ht lũng hng dn, truyn t nhng kin thc quý bỏu, dnh nhiu thi gian, tn tõm ch bo v giỳp tụi hon thnh lun ny Tụi xin chõn thnh cm n ThS Nguyn Khc Tip, DS Lờ Ngc Khỏnh ó cho tụi nhng bi hc giỏ tr, nhit tỡnh dy bo v giỳp tụi t nhng ngy u nghiờn cu cho ti Tụi xin chõn thnh cm n cỏc thy cụ giỏo v cỏc k thut viờn B mụn Cụng nghip dc ó nhit tỡnh ch bo v to iu kin thun li cho tụi hon thnh lun ny Tụi xin chõn thnh cm n Ban giỏm hiu, phũng Sau i hc cựng cỏc thy cụ, cỏn b nhõn viờn trng i hc Dc H Ni ó to iu kin giỳp tụi sut quỏ trỡnh hc v nghiờn cu ti trng Cui cựng cho tụi gi li bit n ti gia ỡnh, bn bố ó ng viờn, khớch l v giỳp tụi mi mt cú kt qu nh ngy hụm H Ni, thỏng nm 2016 Hc viờn Nguyn Th Thu Phng MC LC Mc lc Danh mc cỏc ký hiu, cỏc ch vit tt Danh mc cỏc bng Danh mc cỏc hỡnh T VN Chng 1: TNG QUAN 1 Probiotics 1.1 i cng v probiotics 1.2 Bo t Bacillus clausii 2.1 c im sinh lý hỡnh thỏi ca Bacillus clausii 2.2 ng dng ca Bacillus clausii 11 Tỡnh hỡnh nghiờn cu v sn xut cỏc ch phm cha Bacillus 13 3.1 Trờn th gii 13 3.2 Ti Vit Nam 14 Chng I TNG V PHNG PHP NGHIấN CU 16 2.1 i tng nghiờn cu 16 2.2 Nguyờn vt liu v thit b 16 2.3 Phng phỏp nghiờn cu 18 2.3.1 Hot húa v nhõn ging 18 2.3.2 Phng phỏp thu sinh 18 2.3.3 Xỏc nh s lng vi sinh vt theo phng phỏp pha loóng liờn tc 20 2.3.4 Phng phỏp cõn trng lng sinh 21 2.3.5 Phng phỏp o quang ỏnh giỏ s sinh trng ca vi sinh vt 21 2.3.6 Phng phỏp nhum mu theo Ogietska quan sỏt t bo sinh dng v bo t 22 2.3.7 Phng phỏp xỏc nh nng Glucose cũn li dch lờn men 23 2.3.8 Phng phỏp xỏc nh hm m ca bt ụng khụ 25 Chng KT QU NGHIấN CU 24 3.1 La chn iu kin nuụi cy v phng phỏp x lý sinh thu c nguyờn liu bo t Bacillus clausii 25 3.1.1 iu kin nuụi cy thu lng sinh nhiu nht 25 3.1.2 La chn phng phỏp x lý sinh 33 3.2 ỏnh giỏ mt s ch tiờu cht lng v n nh ca nguyờn liu dng bt ụng khụ v dng hn dch 38 3.2.1 Bo qun nguyờn liu dng hn dch 39 3.2.2 Bo qun mu B clausii dng hn dch nc mui sinh lý 36 3.2.3 Bo qun nguyờn liu B clausii dng bt ụng khụ43 Chng BN LUN 45 4.1 La chn iu kin nuụi cy thu sinh v bo t B clausii 45 4.2 La chn phng phỏp x lý sinh 43 4.3 n inh v cỏc ch tiờu cht lng ca hai dng bo qun dng hn dch v dng bt ụng khụ.52 KT LUN V KIN NGH TI LIU THAM KHO DANH MC CC K HIU, CH VIT TT ADN Acid Deoxyribo Nucleic ARN Acid Ribonucleic ATCC American Type Culture Collection (Bo tng ging chun vi sinh vt Hoa Kỡ) DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen Gmbh (Kớ hiu chng ging thuc b su vi sinh vt v t bo ca c) VSV Vi sinh vt MT1 Mụi trng canh thang OD Optical Density (mt quang) V/p Vũng/Phỳt CFU Colony Forming Unit SD Standard Deviation K ụng khụ FAO Food and Argiculture Organization WHO World Heath Organization K Khi im KT Kt thỳc DANH MC CC BNG STT TấN BNG Trang Bng 1.1 Mt s ch phm probiotic cha Bacillus clausii 12 Bng 2.1 Cỏc húa cht s dng nghiờn cu 16 Bng 2.2 Cỏc thit b dựng nghiờn cu 17 Bng 3.1 Kh nng sinh trng v sinh bo t ca B clausii theo thi 26 gian nuụi cy Bng 3.2 Gớa tr mt quang v lng ng tiờu th ca B clausii 29 100ml mụi trng canh thang cú b sung glucose Bng 3.3 Gớa tr mt quang v s lng VSV b sung Mangan 31 vo mụi trng nuụi cy Bng 3.4 Mt quang v s lng VSV cỏc mu sau x lý sinh 34 Bng 3.5 Mt quang v s lng VSV cỏc mu sau x lý 37 dựng lyzozym Bng 3.6 Hỡnh thỏi B clausii trờn tiờu bn nhum Ogietska 38 10 Bng 3.7 Mt quang v s lng VSV sng sút cỏc mu hn 39 dch ti thi im ban u 11 Bng 3.8 Tỡnh trang B clausii mu nguyờn liu sau cỏc khong 39 thi gian bo qun 12 Bng 3.9 Gớa tr mt quang ca cỏc mu sau thỏng bo qun 40 13 Bng 3.10 S lng B clausii sng sút ti cỏc thi im qua 41 trỡnh bo qun 14 Bng 3.11 Gớa tr hm m v s lng VSV sau cỏc thi gian bo qun ca mu ụng khụ 43 DANH MC CC HèNH STT TấN HèNH Trang Hỡnh 1.1 S hỡnh thnh bo t vi khun Hỡnh 1.2 Cu to bo t vi khun Hỡnh 1.3 Vi khun Bacillus clausii 10 Hỡnh 1.4 Bo t vi khun B clausii di kớnh hin vi ( phúng i 10 100 ln) Hỡnh 1.5 Kh nng khỏng khỏng sinh ca chng Bacillus clausii 11 Hỡnh 2.1 Xỏc nh s lng vi sinh vt bng phng phỏp o c 22 Hỡnh 3.1 th lng sinh v bo t B clausii thu c theo 27 thi gian Hỡnh 3.2 Hỡnh nh nhum Ogietska ca B clausii di kớnh hin vi 27 ( phúng i 100 ln) Hỡnh 3.3 th bin thiờn mt quang v lng glucose tiờu th ca 30 B clausii theo nng glucose Hỡnh 3.4 th giỏ tr mt quang v s lng VSV theo nng 32 Mangan b sung vo mụi trng 10 Hỡnh 3.5 th s lng VSV v mt quang theo phng phỏp x 35 lý sinh 11 Hỡnh 3.6 Hỡnh nh t bo v bo t B clausii sau x lý sinh 36 bng cỏc phng phỏp 12 Hỡnh 3.7 th biu din s bin thiờn s lng VSV sau cỏc khong 42 thi gian bo qun 13 Hỡnh 3.8 th bin thiờn hm m v lng VSV sau cỏc thi gian bo qun 43 T VN ng rut cha mt lng rt ln h vi sinh vt vi khong hn 100 t vi khun, bao gm c vi sinh vt cú li (nh cỏc loi thuc chi Lactobacillus, Bifidobacteria) v vi sinh vt cú hi (nh Clostridium, Staphylococcus) H vi sinh vt ng rut thng xuyờn chu tỏc ng bi cỏc yu t nh ch n, s lóo húa, dựng khỏng sinh, lm mt cõn bng gia vi khun cú hi v vi khun cú li, to iu kin cho vi khun cú hi ln ỏt v gõy bnh, in hỡnh l bnh tiờu chy Vỡ vy vic trỡ s cõn bng ca h vi sinh ng rut l vụ cựng quan trng vic h tr cỏc chc nng v tiờu húa cng nh dch Sn phm cha vi sinh vt cú li probiotic nhm cõn bng h vi sinh ng rut, phũng v tr bnh c s dng khỏ ph bin v ngy cng cú xu hng gia tng c v s lng v dng bo ch Tuy nhiờn, theo cỏc bỏo cỏo gn õy, khong 50% sn phm probiotic trờn th trng Vit Nam khụng v s lng vi sinh vt cũn sng, thm khụng cú vi sinh vt sng S bt cp ny xy cú l l cỏc nghiờn cu nc v quy trỡnh nuụi cy to nguyờn liu probiotic cung cp cho sn xut thuc cũn hn ch Trong cỏc ch phm probiotic, mt sn phm hin ang rt c a s dng l Enterogermina cha Bacillus clausii dng bo t (ng ký Italy nm 1958) Tuy nhiờn rt khú tỡm thy cỏc ti liu cụng b v quy trỡnh sn xut v x lý sinh thu c bo t Bacillus clausii tinh sch cao gii quyt ny chỳng tụi thc hin ti: Nghiờn cu to nguyờn liu probiotic cha bo t Bacillus clausii, vi cỏc mc tiờu sau: - Xỏc nh c iu kin nuụi cy v phng phỏp x lý sinh thu c nguyờn liu bo t Bacillus clausii - ỏnh giỏ c mt s ch tiờu cht lng v n nh ca nguyờn liu dng bt ụng khụ v dng hn dch Chng TNG QUAN Probiotics 1.1 i cng v probiotics 1.1.1 Khỏi nim Probiotics l thut ng bt ngun t ting Hy Lp cú ngha l dnh cho s sng, dựng ch cỏc loi vi sinh vt mang li nhng tỏc ng cú li cho ngi v cho vt ch Nm 1989, Fuller ó a nh ngha v probiotics: Probiotics l hn hp vi khun sng m cung cp cho c th vt ch s em li hiu qu cú li thụng qua s cõn bng h vi sinh ng tiờu húa 37 Probiotics t lõu ó c phỏt hin v s dng lm thc phm cho ngi Nhúm cỏc vi khun sinh lactic c Elie Metchnikoff (1845 1916) phỏt hin ụng nghiờn cu mi liờn quan gia ch n cú s dng sa lờn men vi s khe mnh v kộo di tui th ca ngi dõn Bulgary 37 Cựng thi gian ú, ln u tiờn Bifidobacterium cng c tỡm thy phõn ca nhng tr s sinh bỳ m bi bỏc s ngi Phỏp Henry Tissier 37 Vi vai trũ quan trng i vi sc khe ngi, t lõu probiotics ó c s dng rng rói v a dng chng vi sinh vt Chim thnh phn ụng o nht s cỏc probiotics c s dng l cỏc vi khun thuc chi Bifidobacterium v Lactobacillus Ngoi ra, cỏc i din ca chi Bacillus hay cỏc chng Escherichia coli cng c s dng lm probiotics Cỏc loi Bacillus ó c s dng nh probiotics cỏch õy ớt nht 55 nm vỡ ch phm Enterogerminađ ó c ng ký t nm 1958 Italia Trong s vi khun chi Bacillus tng c s dng lm probiotics, cỏc loi ó c nghiờn cu sõu rng nht l Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans v Bacillus licheniformis V tn sut xut hin cỏc ch phm trờn th trng, Lactobacillus acidophilus hin din khong 79.2% s sn phm probiotic thuc nhúm tham gia nghiờn cu Nguyờn nhõn cú th l loi vi khun ny cú tớnh chng chu cao v cú th bo qun nhiu mangan hn cho s hỡnh thnh bo t khỏng nhit Cỏc nghiờn cu ó tin hnh trờn B sutilis v Bacillus SG-1, SG-1W, mụi trng cú b sung mangan cho kt qu sau t 3-4 ngy 95% bo t to thnh 50 Khi b sung mangan vo mụi trng nuụi cy, Bacillus clausii s tng trng mnh hn v to nhiu bo t hn C ch hỡnh thnh bo t c De Vrind J P M a l Mn2+ mụi trng b oxy húa to MnO2 bỏm lờn b mt bo t 26 Bỏo cỏo ca Mikio Amaha v cng s v loi Bacillus coalugans, sau ngy nuụi cy mụi trng cú mangan, bo t hỡnh thnh gn nh hon ton 16 Cỏc t bo khụng to c bo t vỡ nng mangan thp, nu c thờm Mn2+ nng 10-5 M thỡ s to bo t s xy iu ny lý gii tỏc ng trc tip ca Mn2+ lm tng ỏng k t l hot ng ca cỏc h thng kờnh kali, tng nng kali ni bo kớch thớch s tng hp protein 34 Ronson R A v Nealson K H ch rng, nng mangan c àM cn thit cho s hỡnh thnh bo t, cũn to lng ln bo t khỏng nhit, lng mangan cú th ti 50 àM hoc hn 50 Bỏo cỏo ca Aoki H v Slepecky R A nghiờn cu v Bacillus fastidious, cng ó ch vi iu kin nuụi cy l acid uric hoc allantoin, K2HPO4, agar 2% mụi trng nc, 70-90% bo t to thnh vũng 96 h, nhng nu b sung Mn2+, thỡ ch sau 48 h ó cú ti 99% bo t c to thnh 17 Kt lun: Nh vy nng Mn2+ thớch hp c la chn l 10-5M, lng bo t ca Bacillus clausii mụi trng canh thang b sung 2% glucose t cao nht sau ngy nuụi cy 4.2 Phng phỏp x lý sinh Sau ngy nuụi cy mc dự lng sinh t mc cao (1151.6 mg sinh t/100ml) v bo t hỡnh thnh nhiu nhng cũn t bo cha chuyn sang dng bo t Vỡ vy x lý sinh cho ch cũn dng bo t tinh sch rt quan trng Cỏc phng phỏp x lý khỏc cho cỏc kt qu khỏc 4.2.1 X lý ụng khụ 48 Vi phng phỏp ụng khụ sinh thu c t bỡnh lờn men, bt ụng khụ cũn ln t bo B clausii, lng VSV thu c l (19.17 0.33)ì108 Mc dự ụng khụ hin l phng phỏp bo v t bo VSV hiu qu nht hin nay, nhng quỏ trỡnh tin ụng -800C, lnh cao lm t bo nhanh chúng c ụng lnh v khụng kp chuyn sang dng bo t Mt khỏc, ụng khụ bo v t bo cỏc iu kin bt li, cỏc cht bo v c b sung ng thi li l ngun dinh dng thớch hp cho dng sinh dng phỏt trin v dng bo t ny mm Phng phỏp ụng khụ khụng ti u s dng cho mc ớch thu c bo t tinh khit ụng khụ khụng phự hp to dng bo ch l hn dch ung m thớch hp hn vi cỏc dng bt ung, cm hoc viờn nang Trong quỏ trỡnh ụng khụ nghiờn cu ca nhiu tỏc gi a quy trỡnh kt hp cỏc tỏc nhõn bo v probiotic Theo Garber v cng s, ụng khụ vi s hin din ca sucrose n l kh nng tn ti l 13% sau ụng khụ Tuy nhiờn, t l sng VSV b gim xung di 4% sau tun lu tr Sa gy cung cp t l sng 22.4% sau ụng khụ v trỡ c t l sng VSV quỏ trỡnh bo qun Trehalose cho t l sng sút l 34% s dng n l Trehalose, sucrose v sa gn kem c coi l cỏch bo v hiu qu nht, cho mt t l sng ti 83-85% thi gian bo qun 38 Cng nghiờn cu ny Garber ch rng cỏc t bo khụ (0.0% m) b gim s lng VSV sng ti 44% sau tun lu tr ti nhit phũng cho thy sy khụ gõy hi cho s sng cũn ca VSV m ti u cho vic lu tr cỏc Lactobacillus salivarius ụng khụ dao ng t khong 2.8-5.6% 38 Vỡ vy iu kin nghiờn cu ó chn sa gy lm cht bo v quỏ trỡnh ụng khụ vi nng 20% 4.2.2 X lý lysozym V phng phỏp x lý bng lysozym, phng phỏp ny cú u im l ch thi gian ngn ó loi ht v t bo v thu ton bo t Tuy nhiờn, nhc im 49 ca phng phỏp ny l tri qua nhiu giai on (phỏ v v t bo, loi b v t bo, ra) sau mi ln lng sinh b trụi theo nc rt nhiu v lng t bo vi khun cha chuyn sang bo t cng b loi i nờn s lng bo t cũn li gim ỏng k Hn na quỏ trỡnh thao tỏc cn lp i lp li nhiu ln cng d gõy nhim khun vo sn phm S lng VSV sau phng phỏp x lý bng lysozym ch cũn (28.19 0.26) ì 108cfu/ml Vi phng phỏp x lý nhit sau ngy nuụi cy chuyn dng sinh dng sang dng bo t, sau ú dựng lysozym loi v t bo kt qu cho s lng VSV l (32.29 0.172) ì 108 cfu/ml cao hn so vi phng phỏp ch s dng lysozym Mt khỏc, phng phỏp ny s dng nhiu loi húa cht khỏc nhau, cỏch tin hnh phc v giỏ thnh lysozym rt cao dn n chi phớ tng cao Sinh thu c cú th cũn cha lng nh lysozym s nh hng n cht lng nguyờn liu thi gian bo qun v s dng 4.2.3 X lý nhit Theo Alfredo Palop v cng s 14, x lý nhit l thc hin cỳ sc nhit dn n s hỡnh thnh ca protein sc nhit (HSPs) HSPs l mt phn ng sinh lý vi sinh vt tip xỳc nhit trờn iu kin ti u cho tng trng Mc ớch ca HSPs l sa cha tỏc ng cú hi ca nhit cho t bo HSPs cú th c hỡnh thnh vi khun quỏ trỡnh tng trng, nhng cng cú giai on hỡnh thnh bo t Khi s dng phng phỏp nhit, HSPs c phỏt hin t bo cht bo t v lm tng cng kh nng chu nhit Lng bo t thu c phng phỏp cú x lý nhit u cao hn so vi phng phỏp x lý lysozym v phng phỏp ụng khụ Cỏch x lý nhit, ụng khụ, hoc nhit v ụng khụ cho ta sn phm l bo t v t bo sinh dng ó cht, nhiờn lng vi sinh vt thu c cng thp Bờn cnh ú quỏ trỡnh bo qun cng cn theo dừi cht ch s thm m tr li gõy nh hng ti s lng vi sinh vt 50 4.3 n nh v ch tiờu cht lng ca hai dng bo qun dng hn dch v dng bt ụng khụ Trờn th trng hin dng dựng ca Bacillus clausii ch yu l dng hn dch cha bo t B clausii v dng bt ụng khụ Vỡ vy ỏnh giỏ n dnh v a ch tiờu cht lng ca hai dng bo qun ny rt quan trng 4.2.1 Dng hn dch Bo qun sinh mụi trng nc mui sinh lý hoc nc ct va n gin va thu c lng vi sinh vt n nh hn c sau thỏng bo qun s lng VSV t (105.6 3.78) ì108cfu/ml Khi bo qun sinh nc mui sinh lớ cho thy cú u im hn so vi nc ct Cú th gii thớch nc mui sinh lớ l mụi trng ng trng so vi t bo vi khun, to iu kin thun li hn cho t bo vi khun Nc ct cú mụi trng nhc trng so vi t bo vi khun, nờn nc t ng khuch tỏn t bờn ngoi vo bờn t bo vi khun theo c ch thm thu, dn ti hin tng trng nc ca t bo [14] Trong mụi trng nhc trng, t bo vi khun cú th b phỏ v, lm gim lng bo t hỡnh thnh sau ny Bờn cnh ú, dng VSV em bo qun hn dch nờn l dng bo t tinh sch ch phm thu c s n nh hn Dng bo t nu cũn ln t bo sinh dng, quỏ trỡnh bo qun cú s cht i, s phõn hy t bo sinh dng s tr thnh mụi trng thun li cho bo t ny mm tr li, lm gim s lng VSV Kt lun: Vi dng nguyờn liu l hn dch ta cú th dựng mụi trng nc mui sinh lý bo qun sinh dng bo t iu kin bo qun cn trỏnh oxy, ỏnh sỏng, nhim khun v nhit cao, cú th thờm cht chng oxy húa, cht c ch s phỏt trin ca vi sinh vt Ch phm ng bao bỡ polyme ớt thm khớ hoc thy tinh kớn Bo qun iu kin chõn khụng, lnh thp 4-50C hoc tt hn l -200C 51 4.2.2 Dng ụng khụ Trong quỏ trỡnh ụng khụ, vi khun gp iu kin bt li, c bit giai on tin ụng Mt s nghiờn cu cho rng bin di quỏ trỡnh chuyn nc thnh bng gõy tn thng cho t bo Mt s thỡ cho rng nc kt tinh v nhit thp lm bin tớnh protein v tn thng mng t bo, lm cho vi khun gim kh nng tn ti, nhy cao hn vi khụng khớ hi m 43 ngn chn hoc gim thiu tỏc dng ny ngi ta ó s dng tỏ dc bo v quỏ trỡnh ụng khụ Bờn cnh ú bao bỡ ng dng bt khụ cng cn hn ch ti a s xõm nhp ca m Theo Garber v cng s, ụng khụ s dng mụi trng nc m khụng cú cht bo v thỡ t l sng rt thp (4%) sau ụng khụ v b gim ti 99% hoc nhiu hn sau tun lu tr 38 Kt lun: i vi nguyờn liu dng ụng khụ, ta cú th dựng sinh ó qua x lý nhit em ụng khụ vi s lng VSV l (33.44 0.16) ì108 cfu/g, kt hp thờm cỏc tỏ dc bo v quỏ trỡnh ụng khụ iu kin bo qun l cn trỏnh oxy, ỏnh sỏng, ụ nhim v nhit cao, cú th thờm cht chng oxy húa, cht c ch s phỏt trin ca vi sinh vt Ch phm ng bao bỡ polymer ớt thm khớ hoc thy tinh kớn Bo qun iu kin chõn khụng, lnh thp 4-50C hoc tt hn l -200C Kt lun chung: Cú hai phng phỏp bo qun dng nguyờn liu B.clausii l dng hn dch v dng bt ụng khụ - Bo qun theo dng hn dch: phng phỏp x lý khỏ n gin, r tin, hn ch nh hng ca thao tỏc gõy nhim khun nguyờn liu nhiờn li tn kộm v bao gúi v chuyn Trong quỏ trỡnh bo qun cn theo dừi cht ch cm quan v c, mu sc ca dch bo qun, nh k nh lng s lng VSV mu nguyờn liu 52 - Bo qun theo dng ụng khụ: phng phỏp ny khỏ tn kộm v mt thit b, dng ụng khụ cng d hỳt m nhiờn rt thun tin cho vic bao gúi v bo ch cỏc dng s dng khỏc Vi dang ụng khụ thỡ theo dừi cht hm m ca bt ụng khụ, nh k nh lng s lng VSV mu nguyờn liu 53 KT LUN V KIN NGH Kt lun: Sau thi gian thc hin ti ó i n mt s kt lun sau: V iu kin nuụi cy thớch hp thu sinh v bo t Bacillus clausii Nuụi cy B clausii trong100ml mụi trng canh thang, mỏy lc 370C, tc lc l 110 vũng/phỳt Dung tớch bỡnh nuụi cy 250ml Thi gian nuụi cy cho lng sinh ln nht l sau ngy, t 1316.3 mg sinh t Thi gian cho lng bo t ln nht l sau ngy nuụi cy t 591,2 mg bo t t La chn c nng glucose b sung l 2% to iu kin cho s tng trng sinh tt hn c La chn c nng Mangan b sung vo mụi trng nuụi cy kớch thớch Bacillus clausii sinh trng to bo t l 10-5M La chn phng phỏp x lý v dng bo qun thớch hp cho nguyờn liu Bacillus clausii S dng mụi trng nc mui sinh lý cho dng bo qun hn dch Bacillus clausii Dựng sinh sau thi gian nuụi cy bo qun.Thi im ban u lng VSV l (93.2 2.72) ì 108 cfu/ml, sau thỏng bo qun lng VSV t (105.6 3.78) ì 108 cfu/ml La chn phng phỏp x lý nhit kt hp ụng khụ cho dng dựng l bt ụng khụ Dựng sinh sau x lý nhit 1000C thi gian l 1h, em ụng khụ mụi trng sa gy 20%, s lng VSV thi im ban u (33.440.16) ì 108 cfu/g vi hm m sau ụng khụ l 1.97 Sau 12 tun bo qun 40C, s lng VSV l (15.1 2.41) ì 108 cfu/g, hm m l 3.56 54 Xõy dng c tiờu chun nguyờn liu Dng hn dch: - Hm lng vi sinh vt 108-109 cfu/ml - Bo t cú mu trng ng, lng ỏy, phn nc trờn sut, khụng mu, khụng mựi - iu kin bo qun nhit thng - Khụng b nhim VSV khỏc Dng bt ụng khụ: - Hm lng vi sinh vt 108-109 cfu/g - m nguyờn liu [...]... sinh kéo dài 46 Bảng 1.1 Một số chế phẩm probiotic chứa Bacillus clausii STT Chế Thành phần Dạng dùng Bào tử Bacillus clausii Bột, Phẩm 1 Sporana dạng hốn dịch trong nước 2 Ginkid Bào tử Bacillus clausii Hỗn dịch trong dịch trong nước 3 Spobio CL Bào tử Bacillus clausii Hỗn nước 4 Bioimucan Bào tử Bacillus subtilis, Bào tử Bacillus Cốm vi sinh clausii, Bào tử Bacillus coagulans, betaglucan, taurin,... enterobella Bào tử Bacillus clausii 6 Insotac Viên nang cứng Bào tử Bacillus coagulans, Bào tử Gói bột Bacillus clausii, Fructo Oligosacharide, B1, B5, B6, Mủ trôm 7 Bio Wat Bào tử bacillus clausii 8 Bazivic Bacillus clausii, Bacilus subtilis, Bacillus Gói bột licheniformis, Vitamin, taurin, lysine, calci  Sản xuất enzym 12 Hỗn dịch uống + Một số chủng Bacillus clausii ví dụ: Bacills clausii KSM-K16... Bacillus clausii, cũng đã có một số nghiên cứu trong nước đề cập đến thời điểm Bacillus clausii hình thành bào tử nhiều nhất 3 Một số nghiên cứu 14 khác thì lựa chọn phương pháp xử lý sinh khối Bacillus clausii để thu được lượng bào tử tinh khiết 1 Tuy nhiên các nghiên cứu này chưa thực sự cụ thể và đầy đủ 15 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Giống Bacillus clausii. .. thành bào tử của Bacillus polyfermenticus SCD Các nhà nghiên cứu đã tìm và đưa ra môi trường nuôi cấy thích hợp cho lượng bào tử nhiều hơn cả 42 Một số nghiên cứu khác về điều kiện hình thành bào tử của Bacillus subtilis cũng đi tìm nguồn dinh dưỡng thích hợp để có thể cho lượng bào tử tối đa Sự có 13 mặt của ion Ca2+ và Mn2+ làm tăng khả năng kháng nhiệt của bào tử tạo thành 29 32 Nghiên cứu về... tử này thường mất khoảng 6 – 8 tiếng, tạo ra bào tử tự do có cấu trúc vững bền, chịu được các điều kiện khắc nghiệt Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử lại nảy mầm tạo tế bào sinh dưỡng 31 1.2.2 Cấu tạo của bào tử: Bào tử gồm nhiều lớp bền vững bao quanh vùng lõi chứa ADN Lớp áo ngoài, lớp áo trong, vỏ bào tử, lõi 6 Hình 1.2: Cấu tạo bào tử vi khuẩn Bào tử có các lớp bao bọc, bề mặt các lớp này xù... thể cảm ứng tạo bào tử Sự tạo bào tử được cảm ứng sau pha tăng trưởng do nồng độ dinh dưỡng bị cạn kiệt, đặc biệt là việc thiếu nguồn carbon, nito, hoặc phospho 2 Với Bacillus subtilis, một số nghiên cứu chỉ ra pH thích hợp để tạo lượng bào tử nhiều nhất là từ khoảng 6 – 8 25 Mangan được cho là yếu tố kích thích quá trình tạo bào tử ở một số vi khuẩn Trong quá trình hình thành bào tử, ion mangan... trình hình thành bào tử tương tự nhau Hình 1.1 Sự hình thành bào tử vi khuẩn Qúa trình hình thành bắt đầu với tế bào sinh dưỡng, ADN được phân chia thành chromosome riêng biệt Màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành 2 phần không đều Phần nhân bào tử mang ADN lún sâu vào tế bào chất Vỏ bào tử được hình thành Áo bào tử được hình thành Tế bào mẹ ly giải để giải phóng bào tử 5 Ba enzyme... 13 2 Bacillus clausii 2.1 Đặc điểm sinh lý hình thái của Bacillus clausii  Phân loại: Theo khóa phân loại của Bergey (1994) Bacillus clausii thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Chi: Bacillus Loài: Bacillus clausii  Phân bố: Bacillus clausii phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất vườn hoặc đất (Bacillus clausii ATCC 31084, Bacillus clausii DSM 8716…) 26 Ngoài ra có thể tìm thấy Bacillus. .. Bacillus clausii ở trong nước, trong bùn (Bacillus clausii MB9 được phân lập từ mẫu nước vùng ven biển phía đông Ấn Độ) 26 9  Hình thái: Tế bào Bacillus clausii hình que đứng đơn lẻ hoặc kết lại thành chuỗi, là vi khuẩn Gram dương, có khả năng di động, hình thành bào tử hình bầu dục Bacillus clausii có kích thước 1-2 µm × 5 µm Hình 1.3: Vi khuẩn Bacillus clausii Hình 1.4: Bào tử vi khuẩn Bacillus clausii. .. thích hợp chủng Bacillus subtilis DC5 có khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào cao bao gồm: pepton 1%; cao thịt 0.3%; NaCl 0.5%; lactose 0.25%, pH nuôi cấy là 5, nhiệt độ nuôi cấy 350C trong 24h 7 Một số tác giả lại quan tâm nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử của Bacillus subtilis 8 hoặc dùng bào tử tái tổ hợp Bacillus subtilis làm nguyên liệu thuốc 5 Lê Thị Loan đã nghiên cứu và kết