Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa bacillus clausii dạng bào tử

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC1.1.1. Định nghĩaTheo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Theo nghĩa gốc, biotic hay biosis từ chữ life là đời sống, và pro là thân thiện, nên probiotic có thể hiểu theo nghĩa cái gì thân thiện với đời sống con người. Hiểu sát nghĩa hơn, đó là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích 27, 40.Năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Côdắc ởBulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908). Có thểnói Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học vềprobiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic. Định nghĩa vềprobiotic phát triển theo thời gian. Lily và Stillwell đã mô tả probiotic như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác 41. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 70 bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển vi sinh vật. Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ 41. Vì vậy, khái niệm “Probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”. Định nghĩa chung này sau đó được làm chính xác hơn bởi Fuller vào năm 1989, theo ông “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” 35.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHÙNG THỊ NGỌC HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO NGUYÊN LIỆU CHỨA Bacillus clausii DẠNG BÀO TỬ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Đàm Thanh Xuân DS. Nguyễn Thị Thu Phương Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được khóa luận này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của gia đình, thầy cô, bạn bè. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Đàm Thanh Xuân và DS. Nguyễn Thị Thu Phương là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên của bộ môn Công Nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm và giúp đỡ em trong suốt thời gian làm thực nghiệm. Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô cùng cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, quan tâm em trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã luôn động viên khích lệ em trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Sinh viên Phùng Thị Ngọc Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 2 1.1.1. Định nghĩa 2 1.1.2. Vai trò 3 1.1.3. Probiotic từ bào tử 4 1.2. KHÁI QUÁT VỀ Bacillus clausii 5 1.2.1. Đặc điểm hình thái 6 1.2.2. Cấu trúc bộ gen 6 1.2.3. Đặc điểm sinh hóa 7 1.2.4. Đặc điểm sinh thái 7 1.2.5. Điều kiện nuôi cấy 7 1.2.6. Ứng dụng của B. clausii 7 1.2.7. Một số nghiên cứu lên quan tới B. clausii 8 1.3. BÀO TỬ VI KHUẨN 8 1.3.1. Quá trình hình thành bào tử 11 1.3.2. Tính chất của bào tử vi khuẩn và ứng dụng 11 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 13 2.1.1. Nguyên vật liệu 13 2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 14 2.1.3. Thiết bị 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu lượng bào tử lớn nhất 15 2.2.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1. Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina 15 2.3.2. Phương pháp nhân giống trong môi trường lỏng 15 2.3.3. Phương pháp đo quang đánh giá sự sinh trưởng của vi sinh vật 15 2.3.4. Phương pháp thu sinh khối 16 2.3.5. Phương pháp xử lý sinh khối bằng lysozym thu bào tử 16 2.3.6. Phương pháp đông khô 17 2.3.7. Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ogietska 17 2.3.8. Xác định số lượng VSV sống sót theo phương pháp pha loãng liên tục…………………………………………………………………………… 18 2.3.9. Định lượng đường dư theo phương pháp Schoorl – Regenbogen 19 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất 21 3.1.1. Xác định thời điểm lượng sinh khối và bào tử hình thành nhiều nhất 21 3.1.2. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn khi bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy 23 3.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản 26 3.2.1. Xác định phương pháp xử lý mẫu nuôi cấy 26 3.2.2. Lựa chọn phương pháp bảo quản B. clausii 30 3.2.3. Theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu bảo quản trong NaCl 0,9% 33 3.2.4. Xác định lượng bào tử từ sinh khối thu được, tính toán số lượng ống sản phẩm tạo thành 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid Ribonucleic ATCC : American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì) B. cereus : Bacillus cereus B. clausii : Bacillus clausii B. subtilis : Bacillus subtilis Cfu : Colony - Forming Units (số đơn vị khuẩn lạc) DSM : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen Gmbh (Kí hiệu chủng giống thuộc bộ sưu tập vi sinh vật và tế bào của Đức) FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lâm thế giới) MT1 : Môi trường canh thang OD : Optical Density (mật độ quang) TB : Tế bào V / P : Vòng/phút VSV : Vi sinh vật WHO : World Health Organization (Tổ chức y tế thế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG STT TÊN BẢNG Trang 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 13 2.2 Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 14 3.1 Khả năng sinh trưởng của B. clausii thể hiện qua giá trị mật độ quang và hình ảnh sau nhuộm Ogietska 22 3.2 Giá trị mật độ quang và lượng đường tiêu thụ của B. clausii trong 100ml môi trường nuôi cấy khi bổ sung các nồng độ glucose khác nhau 24 3.3 Mật độ quang và số lượng VSV sống sót trong các mẫu sau khi xử lý 27 3.4 Hình thái B. clausii trên tiêu bản nhuộm Ogietska 28 3.5 Tình trạng B. clausii trong mẫu nguyên liệu khi nhuộm Ogietska sau các khoảng thời gian bảo quản 31 3.6 Giá trị mật độ quang của các mẫu nguyên liệu chứa bào tử sau 1 tháng bảo quản 32 3.7 Số lượng B. clausii sống sót tại các thời điểm trong quá trình bảo quản 34 3.8 Mật độ quang và số lượng bào tử B. clausii trong ống chuẩn ở các nồng độ pha loãng 36 DANH MỤC CÁC HÌNH STT TÊN HÌNH Trang 1.1 Sản phẩm chứa B. clausii 5 1.2 Vi khuẩn B. clausii 6 1.3 Cấu tạo bào tử vi khuẩn 10 1.4 Sự hình thành bào tử 11 2.1 Xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục 16 3.1 Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang và lượng glucose tiêu thụ của B. clausii theo nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy 24 3.2 Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót và mật độ quang của các mẫu sau khi xử lý bằng các phương pháp khác nhau 28 3.3 Hình ảnh B. clausii nhuộm Ogietska dưới kính hiển vi vật kính 100 (mẫu bảo quản trong NaCl sau 3 tháng) 32 3.4 Biểu đồ biểu diễn sự biến thiên số lượng VSV sau các khoảng thời gian bảo quản 34 3.5 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn xác định số lượng bào tử B. clausii 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay trên thế giới xu hướng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên phục vụ cuộc sống đang phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là các sản phẩm men vi sinh (probiotic). Các chủng probiotic được sử dụng rất đa dạng. Các loài được nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis bởi các ưu điểm riêng biệt của nó. Đó là khả năng sinh bào tử, bào tử vi khuẩn được sinh ra trong tự nhiên để chúng có thể tồn tại lâu dài trong các điều kiện khắc nghiệt, mà ở điều kiện đó vi khuẩn trưởng thành sẽ bị giết chết [28]. Chế phẩm Enterogermina là một chế phẩm chứa Bacillus clausii dưới dạng bào tử đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường. Nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy, khi ở dạng bào tử, lợi khuẩn B. clausii có thể an toàn vượt qua môi trường acid khắc nghiệt của dịch dạ dày và đến được ruột với tỷ lệ sống cao hơn hẳn các loại lợi khuẩn thông thường khác. Men vi sinh dạng bào tử lợi khuẩn B. clausii sẽ giúp bổ sung các vi khuẩn có lợi lập lại sự cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột, giúp phòng ngừa và điều trị hiệu quả các rối loạn tiêu hóa. Trên thực tế, việc sản xuất ra nguyên liệu chứa bào tử gặp rất nhiều vấn đề. Đó là phải thu được lượng bào tử tối đa và tinh khiết không còn lẫn tế bào chất hay xác tế bào từ sinh khối thu được sau khi nuôi cấy. Do đó, đề tài “Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử” được thực hiện để giải quyết vấn đề trên với 2 mục tiêu sau: 1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất. 2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản. 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Định nghĩa Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Theo nghĩa gốc, "biotic" hay "biosis" từ chữ "life" là đời sống, và "pro" là thân thiện, nên probiotic có thể hiểu theo nghĩa cái gì thân thiện với đời sống con người. Hiểu sát nghĩa hơn, đó là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích [27], [40]. Năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dắc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908). Có thể nói Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic. Định nghĩa về probiotic phát triển theo thời gian. Lily và Stillwell đã mô tả probiotic như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác [41]. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 70 bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển vi sinh vật. Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ [41]. Vì vậy, khái niệm “Probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”. Định nghĩa chung này sau đó được làm chính xác hơn bởi Fuller vào năm 1989, theo ông “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” [35]. Theo định nghĩa của FAO và WHO năm 2002 “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức [...]... khả năng tạo bào tử thông thường thuộc hai chi là Bacillus và chi Clostridia kỵ khí bắt buộc, mặc dù nhiều chi khác ít được biết đến hơn cũng có những vi khuẩn tạo bào tử 10 Hình 1.3 Cấu tạo bào tử vi khuẩn [11] Cấu trúc của bào tử là hệ thống nhiều lớp vỏ bền vững bao quanh vùng lõi chứa ADN, ADN nằm trong thể bào tử chất trong cùng, màng bào tử bao ngoài bào tử chất, tiếp đến là thành bào tử, tiếp... [6] 2.3.7 Phương pháp nhuộm màu bào tử: theo Ogietska Nguyên tắc: Màng bào tử: dày, chắc, chứa nhiều lipid khó bắt màu nên phải xử lý để tế bào chất của bào tử dễ bắt màu với nhiệt và acid Nhuộm màu cả tế bào chất của tế bào và bào tử bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh Tẩy màu tế bào chất của tế bào đi nhuộm bằng thuốc nhuộm màu Nhờ đó tế bào chất bào tử và tế bào chất tế bào có màu phân biệt [5] 18... năng bảo vệ bào tử trước các điều kiện bất lợi [7], [18] Bào tử chất và vùng nhân bào tử tạo thành một khối tế bào đồng nhất Trong các bào tử tự do không tồn tại sự trao đổi chất vì vậy có thể giữ trạng thái tiềm sinh trong nhiều năm [7] Lõi của bào tử chứa một lượng nước rất thấp cùng với Ca – DPA [4], [11] 11 1.3.1 Quá trình hình thành bào tử Hình 1.4 Sự hình thành bào tử Pha 1: Trong tế bào sinh dưỡng,... sản phẩm probiotic Bacillus đã được cấp phép làm thực phẩm chức năng Các loài được nghiên cứu rộng rãi nhất là Bacillus subtilis, Bacillus clausii, Bacillus cereus, Bacillus coagulans và Bacillus licheniformis Sản phẩm đầu tiên chứa bào tử của vi khuẩn B clausii là Enterogermina được sản xuất tại Ý (năm 1958) [21] Các ưu điểm của probiotic từ bào tử: + Sản phẩm probiotic dạng bào tử có thể được bảo... lượng bào tử tinh khiết và lớn [1] 1.3 BÀO TỬ VI KHUẨN Bào tử (nha bào – spore – endospore): một số vi khuẩn vào cuối thời kì sinh trưởng khi điều kiện phát triển không thuận lợi sẽ sinh ra bên trong tế bào một thể nghỉ có dạng hình cầu hay elipsoic, có bề mặt tích điện âm và hơi kỵ nước, được gọi là bào tử Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một bào tử Khi điều kiện thuận lợi bào tử nảy mầm phát triển thành tế bào. .. chromosome riêng biệt Pha 2: Màng tế bào chất lấn sâu vào phân chia tế bào để hình thành 2 phần không đều nhau Pha 3: Phần nhân bào tử mang ADN lún sâu vào tế bào chất Pha 4: Vỏ bào tử được hình thành Pha 5: Áo bào tử được hình thành Pha 6: Tế bào mẹ ly giải để giải phóng bào tử Quá trình hình thành bào tử mất khoảng 6 – 8 tiếng, là quá trình tương đối phức tạp để tạo ra được cấu trúc vững bền, chịu... biệt là Bacillus clausii trong chế phẩm Enterogermina) [30], [37] + Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm probiotic từ bào tử vi khuẩn, các loại vi khuẩn hay được sử dụng là: B clausii, B subtilis, B cereus, B licheniformis với nhiều dạng bào chế và số lượng bào tử khác nhau Hình 1.1 Sản phẩm chứa B clausii 1.2 KHÁI QUÁT VỀ Bacillus clausii Theo khóa phân loại của Bergey (1994) B clausii thuộc:... trở thành tế bào sinh dưỡng [11] Do những đặc điểm nổi trội đó mà ngày nay rất nhiều sản phẩm probiotic được sản xuất từ bào tử vi khuẩn như: Progemila, Probacin, Bazivic, Anabio… 13 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1 Nguyên vật liệu  Chủng vi sinh vật: Bacillus clausii Nguồn gốc: Chế phẩm Enterogermina của công ty Sanofi-Aventis  Nguyên liệu: Bảng 2.1... tiếp theo là vỏ bào tử, rồi đến áo bào tử hai lớp và áo ngoài Các lớp bao bọc chiếm 50% thể tích của nha bào, bao bọc bào tử chất và nhân [11] Màng bào tử rất mỏng nhưng không thấm nước, cấu tạo chủ yếu là lipoprotein Vỏ bào tử có nhiều lớp, bề mặt các lớp này xù xì, thành phần hóa học của các lớp vỏ bao là protein, hydratcacbon, lipid, peptidoglycan và calci dipicolinat (Ca – DPA), không chứa acid teichoic... thành sợi dài, chưa tế bào chứa bào tử bào tử thấy sự xuất hiện của bên trong bào tử Ogietska dưới kính hiển vi vật kính 100 Nhận xét: Các số liệu và hình ảnh ở bảng 3.1 cho thấy: + Lượng sinh khối đạt cực đại sau 4 ngày nuôi cấy (giá trị mật độ quang sau khi pha loãng đạt mức 0,554), sau đó giảm nhẹ còn 0,498 vào ngày thứ 7 + Ngày thứ 1, bào tử chưa xuất hiện, đến ngày thứ 4 bào tử xuất hiện với lượng . đề tài Nghiên cứu tạo nguyên liệu chứa Bacillus clausii dạng bào tử được thực hiện để giải quyết vấn đề trên với 2 mục tiêu sau: 1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn. màng bào tử bao ngoài bào tử chất, tiếp đến là thành bào tử, tiếp theo là vỏ bào tử, rồi đến áo bào tử hai lớp và áo ngoài. Các lớp bao bọc chiếm 50% thể tích của nha bào, bao bọc bào tử chất. Enterogermina là một chế phẩm chứa Bacillus clausii dưới dạng bào tử đang được sử dụng rộng rãi trên thị trường. Nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy, khi ở dạng bào tử, lợi khuẩn B. clausii có thể an toàn