Mục tiêu:
Xác định được phương pháp nhằm bảo quản nguồn bào tử trong thời gian dài mà không bị mất đi hoạt tính.
Tiến hành:
Sinh khối sau khi thu được ở mục 3.2.1.a, 3.2.1.b và 3.2.1.d tiến hành bảo quản trong nước cất và nước muối sinh lí. Theo dõi khả năng chuyển dạng bào tử của các mẫu trong các khoảng thời gian khác nhau theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.7.
Bảng 3.5. Tình trạng B. clausii trong mẫu nguyên liệu khi nhuộm Ogietska sau các khoảng thời gian bảo quản
Mẫu Bảo quản trong NaCl 0,9 %
Bảo quản trong nước cất
Xử lý lysozym, bảo quản trong NaCl
0,9 %
1 tuần TB xanh + bào tử đỏ TB xanh + bào tử đỏ Bào tử đỏ 2 tuần TB xanh + bào tử đỏ TB xanh + bào tử đỏ Bào tử đỏ
3 tuần TB xanh ít đi, lượng bào tử đỏ chiếm chủ yếu
TB xanh ít đi, bào tử
chiếm chủ yếu Bào tử đỏ
4 tuần Bào tử đỏ Chủ yếu bào tử đỏ, thỉnh
thoảng có TB xanh Bào tử đỏ
5 tuần Bào tử đỏ Bào tử đỏ Bào tử đỏ
2 tháng Bào tử đỏ Bào tử đỏ Bào tử đỏ
3 tháng Bào tử đỏ Bào tử đỏ Bào tử đỏ
Nhận xét:
Sau 4 tuần, mẫu nguyên liệu bảo quản trong NaCl chuyển hết thành bào tử, còn mẫu bảo quản trong nước cất vẫn còn lẫn tế bào. Đến tuần thứ 5, mẫu bảo quản trong nước cất đã chuyển hết sang dạng bào tử. Sau 3 tháng, tất cả 3 mẫu bảo quản vẫn giữ được dạng bào tử.
Hình 3.3. Hình ảnh B. clausii nhuộm Ogietska dưới kính hiển vi vật kính 100 (mẫu bảo quản trong NaCl sau 3 tháng)
Bảng 3.6. Giá trị mật độ quang của các mẫu nguyên liệu chứa bào tử sau 1 tháng bảo quản
Mẫu Bảo quản trong nước cất
Bảo quản trong NaCl 0,9%
Xử lý bằng lysozym
OD (10-1) 0,431 0,440 0,158
% so với bảo quản
trong NaCl 0,9% 97,8% 100% 36%
Nhận xét:
Khi bảo quản trong nước muối sinh lí và nước cất (không qua bước xử lý lysozym), lượng sinh khối không bị mất đi nhiều. So với sinh khối khi bảo quản trong nước muối, lượng sinh khối bảo quản trong nước cất đạt 97,8% và sinh khối sau khi xử lý bằng lysozym chỉ đạt 36%.
Bàn luận:
+ Phương pháp bảo quản sinh khối ngay trong nước muối sinh lí và nước cất đơn giản, dễ làm, chi phí thấp và bào tử thu được với lượng lớn, tinh khiết hơn so với
phương pháp xử lý bằng lysozym. Tuy nhiên phương pháp này cần một khoảng thời gian (1 tháng) để tế bào sinh dưỡng chuyển hết thành dạng bào tử.
+ Khi bảo quản sinh khối trong nước muối sinh lí cho thấy có ưu điểm hơn so với nước cất. Có thể giải thích do nước muối sinh lí là môi trường đẳng trương so với tế bào vi khuẩn, tạo điều kiện thuận lợi hơn cho tế bào vi khuẩn. Nước cất có môi trường nhược trương so với tế bào vi khuẩn, nên nước tự động khuếch tán từ bên ngoài vào bên trong tế bào vi khuẩn theo cơ chế thẩm thấu, dẫn tới hiện tượng trương nước của tế bào [10]. Trong môi trường nhược trương, tế bào vi khuẩn có thể bị phá vỡ, làm giảm lượng bào tử hình thành sau này.
+ Mẫu được xử lý bằng lysozym sau khi bảo quản bằng nước muối sinh lí vẫn giữ nguyên dạng bào tử cho thấy tính ưu việt khi sử dụng nước muối sinh lí để bảo quản.
Từ các nhận định trên có thể thấy, để thu được bào tử tinh khiết với lượng lớn nhất thì phương pháp bảo quản ngay sinh khối VSV trong NaCl 0,9% mà không qua các bước xử lý là phương pháp tối ưu nhất. Mẫu sinh khối bảo quản ngay trong NaCl 0,9% được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.