Nguyên lý:
Thuốc thử Schoorl A (CuSO4) và thuốc thử Schoorl B (Kali natri tactrat) cho phức hợp màu xanh của Cu2+ bị nhóm chức ceton hay aldehyd khử thành Cu trong môi trường kiềm, lượng Cu2+ dư trong dung dịch tác dụng với 1 lượng KI trong môi trường acid sẽ giải phóng I2. Định lượng I2 giải phóng bằng Na2S2O3 0,1N. Tiến hành song song với mẫu trắng. Hiệu số dung dịch Na2S2O3 0,1N tiêu thụ trong mẫu trắng (V0) và mẫu thử (Vt) cho ta số chênh lệch ml Na2S2O3 0,1N. Tra bảng tính được lượng đường có trong mẫu thử [8].
Tiến hành:
Định lượng đường trong môi trường canh thang với 2 mẫu là: mẫu khởi điểm
(mẫu chưa có vi sinh vật) và mẫu kết thúc (mẫu sau khi nuôi cấy vi sinh vật) [8]. Dịch khởi điểm và kết thúc được tiến hành như sau:
+ Thêm chính xác 10,0ml Schoorl A, 10,0ml Schoorl B. + Thêm nước cất vừa đủ 50ml, đun sôi cách bếp 2 phút.
+ Làm nguội về nhiệt độ phòng, thêm 3,0g KI, lắc tan hoàn toàn. + Thêm 10ml H2SO4 25%.
+ Định lượng I2 giải phóng ra bằng Na2S2O3 0,1N.
Mẫu trắng: 30ml nước cất + 10,0ml Schoorl A + 10,0ml Schoorl B.
Kết quả thu được:
+ Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu trắng là: Vt
+ Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu khởi điểm là: Vkđ + Thể tích Na2S2O3 cần thiết để định lượng mẫu kết thúc là: Vkt
Lượng đường được tính như sau:
Nồng độ đường ở dịch khởi điểm (KĐ): ∆ Vkđ = Vt - Vkđ = a ml, tra bảng được pmg. → Nồng độ đường ở dịch khởi điểm là pmg/ml.
Nồng độ đường ở dịch kết thúc (KT): ∆ Vkt = Vt - Vkt = b ml, tra bảng được qmg.
→ Nồng độ đường ở dịch kết thúc là qmg/ml.
Lượng đường đã tiêu thụ: X (mg/ml) = p – q.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất
Nhờ sức đề kháng cao với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường nên các chế phẩm probiotic chứa bào tử ít chịu ảnh hưởng do điều kiện môi trường trong quá trình lưu hành và bảo quản. Do đó, chế phẩm có độ ổn định cao, hơn nữa bào tử vi khuẩn probiotic có thể tới được dạ dày và ruột đạt mức nguyên vẹn ở ruột non.
Vì vậy, tìm ra điều kiện nuôi cấy để thu được lượng bào tử lớn nhất có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo ra nguyên liệu dưới dạng bào tử. Các thí nghiệm dưới đây nhằm giải quyết vấn đề trên.
3.1.1. Xác định thời điểm lượng sinh khối và bào tử hình thành nhiều nhất
Mục tiêu:
Xác định và lựa chọn thời điểm thích hợp thu lấy sinh khối B. clausii từ môi trường nuôi cấy.
Tiến hành:
Nuôi cấy B. clausii trong môi trường canh thang theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2. Sau các thời gian nuôi cấy 1, 4, 7 ngày (dựa trên kết quả công bố của Ds. Nguyễn Thị Hiền) [5], tiến hành ly tâm thu sinh khối các bình nuôi cấy theo phương pháp đã nêu trong mục 2.3.4. Pha loãng sinh khối trong vừa đủ 100ml NaCl 0,9%. Sau đó:
+ Lấy mẫu từ hỗn dịch pha loãng trên tiếp tục pha loãng 10 lần và tiến hành đo quang xác định sự sinh trưởng của VSV với bước sóng 600nm. Mẫu trắng là NaCl 0,9% chuẩn bị song song cùng mẫu thử.
+ Tiến hành nhuộm Ogietska xác định lượng bào tử hình thành theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.7.
Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng của B. clausii thể hiện qua giá trị mật độ quang và hình ảnh sau nhuộm Ogietska
Thời gian 1 ngày 4 ngày 7 ngày
Mật độ quang (10-1) 0,203 0,554 0,498 Hình ảnh B. clausii sau nhuộm Ogietska dưới kính hiển vi vật kính 100
Tế bào màu xanh đôi khi nối với nhau thành sợi dài, chưa thấy sự xuất hiện của
bào tử
Tế bào màu xanh, nhiều bào tử đỏ và tế bào chứa bào tử
bên trong
Toàn tế bào màu xanh, không thấy
bào tử
Nhận xét:
Các số liệu và hình ảnh ở bảng 3.1 cho thấy:
+ Lượng sinh khối đạt cực đại sau 4 ngày nuôi cấy (giá trị mật độ quang sau khi pha loãng đạt mức 0,554), sau đó giảm nhẹ còn 0,498 vào ngày thứ 7.
+ Ngày thứ 1, bào tử chưa xuất hiện, đến ngày thứ 4 bào tử xuất hiện với lượng lớn và ngày thứ 7 hầu như không thấy sự có mặt của bào tử.
Bàn luận:
Các kết quả trên phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Hiền khi khảo sát thời điểm nuôi cấy B. clausii từ 1 đến 7 ngày cũng cho kết quả là ngày thứ 4 lượng bào tử hình thành lớn nhất [5]. Điều này có thể được giải thích:
+ Về lượng sinh khối: ngày đầu tiên vi khuẩn đang ở pha tiềm phát. Trong pha này vi khuẩn từ dạng bào tử phải thích ứng với môi trường mới, chúng bắt đầu sinh sản,
phát triển thành tế bào, do đó lượng sinh khối còn ít, giá trị mật độ quang thấp nhất. Đến ngày thứ 4 theo chu kì sinh trưởng, vi khuẩn đang ở pha cân bằng nên số lượng tế bào lớn. Ngày thứ 7 lượng sinh khối giảm đi có thể giải thích do vi sinh vật chuyển sang giai đoạn suy vong, tế bào VSV tự phân giải do các enzym nội bào [4]. + Về lượng bào tử: ngày đầu tiên, môi trường giàu chất dinh dưỡng, vi khuẩn chủ yếu tăng sinh và phân chia nên trên vi trường chỉ thấy toàn tế bào. Sang đến ngày thứ 4, chất dinh dưỡng trong môi trường lên men đã giảm nhiều; ở điều kiện thiếu chất dinh dưỡng, tế bào chuyển dần thành bào tử. Vào ngày thứ 7, môi trường vẫn còn nguồn dinh dưỡng, có thể do tạo thành từ xác tế bào chết phân giải, đã giúp bào tử nảy mầm trở lại dạng tế bào.
Từ các kết quả trên, nhận thấy 4 ngày là thời điểm ngắn nhất để thu được lượng bào tử nhiều nhất. Do đó, các thí nghiệm tiếp theo sử dụng thời gian nuôi cấy vi sinh vật là 4 ngày.
3.1.2. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn khi bổ sung glucose vào môi trường nuôi cấy nuôi cấy
Mục tiêu:
Lựa chọn nồng độ glucose bổ sung vào môi trường canh thang để thu được bào tử nhiều nhất.
Tiến hành:
Nuôi cấy vi khuẩn trong các bình nón chứa môi trường canh thang bổ sung glucose với các nồng độ 0,5%, 1%, 2%, 4% theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.2, môi trường nuôi cấy được hấp tiệt trùng ở 115ºC trong 20 phút.
Sau 4 ngày, thu sinh khối theo phương pháp 2.3.4, pha loãng sinh khối trong vừa đủ 100ml NaCl 0,9%. Tiến hành lấy mẫu từ hỗn dịch đã pha loãng tiếp tục pha loãng 10 lần và đo quang ở bước sóng 600nm. Mẫu trắng là NaCl 0,9% chuẩn bị song song cùng mẫu thử.
Đồng thời lấy mẫu xác định nồng độ glucose còn lại trong dịch lên men theo phương pháp 2.3.9 và so sánh với nồng độ glucose ban đầu.
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.1.
Kết quả:
Bảng 3.2. Giá trị mật độ quang và lượng đường tiêu thụ của B. clausii trong 100ml môi trường nuôi cấy khi bổ sung các nồng độ glucose khác nhau
Nồng độ glucose 0 % 0,5% 1,0% 2,0% 4,0%
OD (10-1) 0,491 0,616 0,748 1,160 0,744
Nồng độ đường ở dịch KĐ (%) 0 0,44 0,99 1,87 3,87 Nồng độ đường ở dịch KT (%) 0 0,39 0,43 0,69 1,58 Lượng đường đã tiêu thụ (%) 0 0,05 0,56 1,18 2,29
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn biến thiên mật độ quang và lượng glucose tiêu thụ
của B. clausii theo nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy
Nhận xét: 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0,5 1,0 2,0 4,0
Mật độ quang Lượng đường tiêu thụ
Nồng độ Glucose (%) M ật đ ộ q u an g ( 10 -1) Lượ ng glu cose t iê u thụ ( % )
Từ bảng 3.2 và đồ thị hình 3.1 có thể thấy lượng sinh khối vi sinh vật tăng dần theo nồng độ glucose bổ sung vào môi trường canh thang, đạt giá trị cao nhất tại nồng độ glucose 2% (mật độ quang sau pha loãng là 1,160), ở nồng độ glucose 4% mật độ quang giảm còn 0,744.
Lượng glucose mà vi sinh vật tiêu thụ tăng dần theo lượng glucose bổ sung vào môi trường nuôi cấy, đạt giá trị cao nhất khi thêm 4% glucose vào môi trường, lúc này lượng glucose B. clausii tiêu thụ đạt 2,29%.
Bàn luận:
Thành phần của môi trường canh thang chủ yếu chỉ có nitơ mà không có hydratcacbon. Do đó, bổ sung glucose làm tăng nguồn hydratcarbon, là nhân tố ảnh hưởng trực tiếp tới việc tái tạo tế bào vi sinh vật nên số lượng tế bào vi sinh vật tăng [4]. Ở nồng độ glucose 2% sinh khối B. clausii tăng nhiều nhất, vì vậy 2% glucose là nồng độ thích hợp cho sự phát triển của B. clausii. Với các nồng độ 0,5% và 1%, lượng hydratcarbon bổ sung còn thấp, vi khuẩn chưa đủ năng lượng cho sự phát triển sinh khối, giá trị mật độ quang đo được thấp hơn. Mặt khác, ở nồng độ 4%, có thể do nồng độ đường lớn, dẫn đến sự thay đổi áp suất thẩm thấu, gây ra điều kiện ưu trương, ảnh hưởng tới cấu tạo tế bào vi khuẩn, gây hạn chế cho sự phát triển của vi khuẩn [9], [10]. Theo một nghiên cứu trước đây, khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose từ 1% đến 6% tới sự phát triển của B. clausii trong 1 ngày kết luận bổ sung 2% glucose vào môi trường nuôi cấy, vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất [9]. Kết hợp với kết quả thu được ở bảng 3.2, môi trường nuôi cấy B. clausii tối ưu là môi trường canh thang (MT1) + 2% glucose.
Từ lượng đường mà vi sinh vật tiêu thụ sau 4 ngày nuôi cấy nhận thấy B. clausii
đã đồng hóa glucose để phát triển. Lượng đường mà B. clausii tiêu thụ trong môi trường MT1 + 4% glucose cao hơn trong môi trường MT1 + 2% glucose nhưng trong môi trường MT1 + 2% glucose vi sinh vật lại phát triển mạnh hơn, thể hiện ở giá trị mật độ quang cao hơn. Cần các nghiên cứu tiếp theo tìm hiểu sự ảnh hưởng của glucose đến sự phát triển của vi sinh vật.
Kết luận sơ bộ:
Từ các kết quả thu được cho thấy với thời gian nuôi cấy 4 ngày và môi trường canh thang bổ sung 2% glucose, sinh khối vi sinh vật đạt lượng cao nhất. Tuy nhiên, do sau 4 ngày nuôi cấy trong dịch lên men vẫn còn một lượng nhỏ glucose chưa được VSV tiêu thụ hết (0,69g/ml). Vì vậy, để thuận tiện cho quá trình xử lý tế bào, khóa luận lựa chọn môi trường canh thang không bổ sung glucose với thời gian nuôi cấy 4 ngày cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Lựa chọn phương pháp xử lý, bảo quản và theo dõi độ ổn định của mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản nguyên liệu trong quá trình bảo quản
Theo số liệu thu được từ phần 3.1 cho thấy sau 4 ngày nuôi cấy trong môi trường canh thang có thể thu được nhiều bào tử nhưng vẫn lẫn tế bào sinh dưỡng. Tuy nhiên, các mẫu nguyên liệu không chỉ cần đạt được số lượng vi sinh vật mà cần phải tinh khiết theo tiêu chuẩn và giữ được chất lượng ổn định khi bảo quản trong thời gian dài. Do đó, cần có phương pháp xử lý và bảo quản thích hợp để nhằm loại bỏ hết môi trường dinh dưỡng và chuyển hết tế bào B. clausii sang dạng bào tử. Các thí nghiệm sau nhằm giải quyết vấn đề trên và đánh giá chất lượng của các mẫu nguyên liệu trong quá trình bảo quản.
3.2.1. Xác định phương pháp xử lý mẫu nuôi cấy
Mục tiêu:
Xác định phương pháp xử lý thích hợp nhằm thu được bào tử tinh khiết với lượng lớn nhất.
Tiến hành:
Chuẩn bị 8 bình nón 250ml, mỗi bình chứa 150ml môi trường canh thang đã hấp tiệt trùng để nuôi cấy B. clausii (theo mục 2.3.2). Sau 4 ngày nuôi cấy, thu sinh khối theo phương pháp trong mục 2.3.4. Sau đó tiến hành:
a. Pha loãng trong nước cất
Sinh khối thu được từ bình 1 và 2 được trộn lẫn và pha loãng trong vừa đủ 300ml nước cất đã hấp tiệt trùng.
b. Pha loãng trong nước muối sinh lí
Sinh khối thu được từ bình 3 và 4 được trộn lẫn và pha loãng trong vừa đủ 300ml NaCl 0,9%.
c. Đông khô
Sinh khối thu được từ bình 5 và 6 được xử lý và tiến hành đông khô theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.6.
d. Xử lý lysozym rồi pha loãng trong NaCl 0,9%
Sinh khối thu được từ bình 7 và 8 được pha loãng trong 300ml nước cất đã hấp tiệt trùng. Tiến hành xử lý bằng lysozym theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.5. Sinh khối sau khi xử lý pha loãng với vừa đủ 300ml NaCl 0,9%.
Lấy mẫu sau khi xử lý ở tất cả bình, pha loãng bằng NaCl 0,9%, tiến hành đo quang ở bước sóng 600nm, mẫu trắng là NaCl 0,9% chuẩn bị song song cùng mẫu thử. Đồng thời đếm số lượng VSV theo phương pháp pha loãng liên tục đã nêu trong mục 2.3.8.
Nhuộm Ogietska theo dõi hình thái các mẫu sau xử lý.
Kết quả:
Bảng 3.3. Mật độ quang và số lượng VSV sống sót trong các mẫu sau khi xử lý
Tình trạng mẫu OD (10-1) Trước xử lý OD (10-1) Sau xử lý Số lượng VSV (Tính theo lượng tương đương với 1ml dịch ban đầu) Pha loãng trong nước cất 0,477 0,477 100.108 cfu/ml
Pha loãng trong
NaCl 0,9% 0,483 0,483 93.10
8
cfu/ml
Đông khô 0,486 0,342 19.108 cfu/ml
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót và mật độ quang của các mẫu sau khi xử lý bằng các phương pháp khác nhau
Bảng 3.4. Hình thái B. clausii trên tiêu bản nhuộm Ogietska Tình trạng mẫu
Hình ảnh sau nhuộm Tế bào Bào tử
Pha loãng trong nước cất + +
Pha loãng trong NaCl 0,9% + +
Đông khô + +
Xử lý bằng lysozym _ +
Chú thích: (+) Có (-) Không
Nhận xét:
Các kết quả thu được từ bảng 3.3 và hình 3.2 cho thấy:
100 93 28 19 0.477 0.483 0.197 0.342 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 20 40 60 80 100 120 Mẫu nước cất Mẫu NaCl 0,9% Mẫu Lysozyme Mẫu đông khô Số lượng VSV (x 10^8 cfu/ml) OD (10^-1) Số lượ ng VSV ( x 10 8 cfu/m l) Mật độ quang
+ Lượng sinh khối thu được nhiều nhất khi pha loãng trong nước cất và nước muối sinh lí, thể hiện ở giá trị mật độ quang cao (0,477 và 0,483). Trong khi đó giá trị mật độ quang sau khi đông khô là 0,342 và xử lý bằng lysozym chỉ còn 0,197.
+ Sau khi pha loãng sinh khối bằng nước cất và nước muối sinh lí, thu được số lượng vi sinh vật sống sót nhiều hơn phương pháp xử lý bằng lysozym và đông khô (100.108 cfu/ml và 93.108 cfu/ml). Xử lý bằng lysozym số lượng VSV giảm còn 28.108 cfu/ml, sau đông khô số lượng VSV sống sót thấp nhất (19.108 cfu/ml).
Từ bảng 3.4 nhận thấy: khi pha loãng sinh khối bằng nước cất và nước muối sinh lí thu được bào tử nhưng vẫn lẫn tế bào sinh dưỡng; đông khô ngay sinh khối VSV từ môi trường nuôi cấy thu được bào tử lẫn cả tế bào sinh dưỡng và xác tế bào; xử lý bằng lysozym thu được hoàn toàn dạng bào tử.
Bàn luận:
Các kết quả trên có thể được giải thích như sau:
+ Sinh khối thu được sau 4 ngày nuôi cấy, không qua xử lý, pha loãng ngay trong nước cất hoặc dung dịch NaCl 0,9% thì số lượng vi sinh vật gần như không thay đổi nhưng tại thời điểm đó, tế bào VSV vẫn chưa chuyển hết thành dạng bào tử, do vậy cần thêm thời gian để tế bào vi khuẩn chuyển hết thành dạng bào tử.
+ Đông khô ngay sinh khối thu được từ môi trường nuôi cấy, số lượng VSV vẫn đạt ở nồng độ cao (ở mức 108
cfu/ml) tuy nhiên số lượng VSV sống sót ít hơn khi pha loãng ngay sinh khối trong nước cất hoặc NaCl 0,9% và phương pháp xử lý bằng lysozym. Mặt khác khi xử lý theo phương pháp này, sinh khối thu được vẫn còn lẫn rất nhiều tế bào B. clausii. Do đó, đông khô không tối ưu để sử dụng cho mục đích thu được bào tử tinh khiết với lượng lớn nhất.
+ Xử lý bằng lysozym có ưu điểm hơn các phương pháp trên: chỉ trong thời gian