phẩm tạo thành
Mục tiêu: Xác định lượng ống sản phẩm tạo được.
Tiến hành:
Lập đường chuẩn :
+ Từ ống nguyên liệu trên thị trường pha loãng 2, 4, 6, 8, 10 lần bằng nước muối sinh lí trong các ống nghiệm khác nhau. Tiến hành đo quang với bước sóng 600nm, mẫu trắng là nước muối sinh lí được chuẩn bị song song cùng mẫu thử.
+ Đồng thời ở các mức pha loãng trên lại tiếp tục tiến hành pha loãng theo nguyên tắc pha loãng liên tục theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.8. Cấy 3ml dịch chứa vi khuẩn cần khảo sát vào bình nón có chứa môi trường thạch thường đã được hấp tiệt trùng, lắc đều sau đó đổ ra 3 đĩa petri. Nuôi cấy trong tủ ấm 37ºC trong 24 giờ.
Từ số liệu đo quang và số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa petri vẽ được đường chuẩn.
Xác định lượng ống sản phẩm có thể tạo ra từ 100ml môi trường nuôi cấy.
+ Tiến hành lấy mẫu nguyên liệu bảo quản trong nước muối sinh lí thu được ở mục 3.2.2 (bảng 3.5 và 3.6), pha loãng 10 lần, sau đó tiến hành đo quang với bước sóng 600nm, mẫu trắng là nước muối sinh lí được chuẩn bị song song cùng mẫu thử.
Số liệu đo quang được đưa vào đường chuẩn để suy ra số lượng vi sinh vật.
Kết quả:
Bảng 3.8. Mật độ quang và số lượng bào tử B. clausii trong ống chuẩn ở các nồng độ pha loãng Độ pha loãng 2 lần 4 lần 6 lần 8 lần 10 lần OD 0,506 0,251 0,170 0,125 0,104 Số lượng VSV 124.107 cfu/ml 46.107 cfu/ml 39.107 cfu/ml 27.107 cfu/ml 13.107 cfu/ml
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn xác định số lượng bào tử B. clausii
Mật độ quang của mẫu nguyên liệu chứa toàn dạng bào tử được nuôi cấy từ môi trường canh thang sau khi pha loãng 10 lần là 0,440 (bảng 3.6).
Dựa vào đường chuẩn tính được số lượng bào tử B. clausii có trong 1ml môi trường nuôi cấy là 106,8.108 cfu.
y = 0.0037x + 0.045 R² = 0.98 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 20 40 60 80 100 120 140 M ật độ q u an g Số VSV (10^7) OD OD Linear (OD)
Do đó, trong 100ml môi trường nuôi cấy tạo ra: 106,8.1010 cfu. 1 ống sản phẩm trên thị trường 5ml có chứa 2.109 bào tử.
Do đó số lượng ống sản phẩm thu được sau khi nuôi cấy B. clausii trong 100ml môi trường là: 106,8.1010 : 2.109 = 533,7 ống.
Kết luận sơ bộ:
Tóm lại, sau 4 ngày nuôi cấy B. clausii, tiến hành ly tâm thu sinh khối và bảo quản sinh khối trong NaCl 0,9% thì sau 1 tháng tế bào sinh dưỡng chuyển hoàn toàn sang dạng bào tử. Sau 1 tháng số lượng VSV sống sót đạt mức 85.108 cfu/ml. Sau 3 tháng thì số lượng VSV vẫn giữ được 106.108 cfu/ml, không giảm so với lượng VSV ban đầu 93.108 cfu/ml. Do đó thấy được tính ưu việt của mẫu nguyên liệu chứa bào tử.
Trong quá trình bảo quản, bào tử không nảy mầm trở lại, ở điều kiện bảo quản bào tử vẫn giữ được màu trắng ngà lắng dưới đáy ống nghiệm, dung dịch bảo quản trong không màu.
Đã tính toán được lượng bào tử tạo ra được từ môi trường nuôi cấy: với 100ml môi trường nuôi cấy có thể thu được 533 ống sản phẩm với số lượng bào tử theo yêu cầu.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN
Sau thời gian thực hiện, đề tài đã thu được một số kết quả như sau:
1. Lựa chọn được điều kiện nuôi cấy thích hợp thu lượng bào tử Bacillus clausii lớn nhất:
Nuôi cấy B. clausii trong môi trường canh thang với thời gian 4 ngày.
2. Xác định được phương pháp xử lý và bảo quản để tạo ra nguồn nguyên liệu chứa toàn dạng bào tử với lượng lớn nhất và theo dõi được độ ổn định của mẫu nguyên liệu: xử lý và bảo quản trong nước muối sinh lí.
Sau 1 tháng bảo quản trong NaCl 0,9% sinh khối B. clausii chuyển hết thành bào tử. Lượng bào tử thu được tinh khiết và cao hơn khi bảo quản trong nước cất, khi xử lý bằng lysozym và bằng đông khô. Sau 3 tháng nồng độ VSV sống sót vẫn giữ ở mức 108 cfu/ml. Với 100ml môi trường nuôi cấy có thể thu được 533 ống sản phẩm với số lượng bào tử theo yêu cầu.
II. KIẾN NGHỊ
Vì thời gian có hạn nên khóa luận chưa thể đề cập được hết những vấn đề liên quan. Dưới đây là một vài đề xuất để đề tài có thể hoàn thiện hơn:
1. Tiếp tục theo dõi sự hình thành bào tử của B. clausii khi nuôi cấy trong môi trường canh thang bổ sung glucose từ 2% - 6%.
2. Nuôi cấy và bảo quản bào tử B. clausii trong NaCl 0,9% thu bào tử, tiếp tục nghiên cứu theo hướng tạo nguyên liệu dưới dạng khô để phát triển với quy mô lớn hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Vũ Thị Ngọc Bích (2013), Nghiên cứu xử lý sinh khối Bacillus clausii để thu bào tử, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội.
2. Bộ y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản y học.
3. Hồ Lê Quỳnh Châu và cộng sự (2010), “Đánh giá khả năng bám dính và kháng khuẩn ở mức độ invitro của một số chủng vi sinh vật có tiềm năng sử dụng làm probiotic”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế, số 57.
4. Nguyễn Lân Dũng (2011), Vi sinh vật học, NXB giáo dục.
5. Nguyễn Thị Hiền (2012), Khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội. 6. Hà Thị Thanh Huyền (2014), Nghiên cứu sử dụng Alginat làm chất bảo vệ trong
quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội.
7. Nguyễn Duy Khánh (2006), Khảo sát điều kiện nuôi cấy và sinh bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis, Luận văn kĩ sư chuyên ngành công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh.
8. Nguyễn Đình Luyện (2009), Thực tập kĩ thuật sản xuất dược phẩm, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.74 – 75.
9. Nguyễn Thị Bích Ngọc (2011), Khảo sát điều kiện nuôi cấy vi khuẩn B. clausii,
Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội.
10. Cao Văn Thu (2005), Sinh học đại cương, Trường đại học Dược Hà Nội, tr 33. 11. Cao Văn Thu (2008), Vi sinh vật học, NXB giáo dục, tr. 33 – 34.
12. Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), “Công nghệ sinh học”, NXB giáo dục, tập 4, tr. 129 – 154.
Tiếng Anh
13. Asha Devil N. K., Balakrishnan K., Gopal R. and Padmavathyl S. (2008), “Bacillus clausii MB9 from the east coast regions of India: Isolation,
biochemical characterization and antimicrobial potentials”, Current science, 95, pp. 627 – 635.
14. Barbosa T. M., Serra C. R., La Ragione R. M., Woodward M. J. and Henriques A. O. (2005), “Screening for Bacillus isolated in the broler gastrointestinal tract”, Applied and Environmental Microbiology, 71, pp. 968 – 978.
15. Casuala G., Cutting S. M. (2002), “Bacillus probiotics: spore germination in the gastrointestinal tract”, Appl. Environ Microbiol, 68, pp. 2344 – 2352.
16. Ciprandi G., Tosca M. A., Milanese M., Caligo G. and Ricca V. (2004), “Cytokines evaluation in nasal lavage of allergic children after Bacillus clausii
administration: A pilot study”, Pediatr Allergy Immunol, 15, pp. 148 – 151. 17. Ciprandi G., Vizzaccaro A., Cirrillo I. and Tosca M. A. (2005), “Bacillus
clausii effects in children with allergic rhinitis”, Allergy, 60(5), pp. 702 – 703. 18. Driks A. (2004), “The Bacillus Spore coat”, Phytopathology, 94, pp. 1249 –
1251.
19. Duc Le H, Hong H. A., Barbosa T. M., et al. (2004) “Charac – terization of
Bacillus probiotics available for human use”, Appl Environ Microbiol, 70, pp. 2161 – 2171.
20. Green D. H., Wakeley P. R., Page A., Barnes A., Baccigalupi L., Ricca E., and Cutting S. M. (1999), “Charac – terization of two Bacillus probiotics”, Appl. Environ Microbiol, 65, pp. 4288 - 4291
21. Hong H. A., Le Hong Duc, Simon M. C. (2005), “The use of bacterial spore formers as probiotics”, FEMS Microbiology Reviews, 29, pp. 813 – 835.
22. Ivanovska T. P., Petrusevska-Tozi L., Kostoska M. D., Geskovski G., Grozdanov A., Stain C., Stafilov T., Mladenovska K. (2012), “Microencapsulation of Lactobacillus casei in Chitosan-Ca-Alginate microparticles using spray-dying method”, Macedonian Journal of Chemistry and Chemical Engineering, 31, pp.115 – 123.
23. Kobayashi T., Kageyama Y., Sumitomo N., Saeki K., Shirai T. and Ito S. (2005), “Contribution of a salt bridge triad to the thermostability of a highly alkaline protease from an alkaliphilic Bacillus strain”, World J. Microbiol Biotechnol, 21, pp. 961 -967.
24. Lieske J. C., Goldfarb D. S., De Simone C., Regnier C. (2005), “Use of a Probiotic to Decrease Enteric Hyperoxaluria”, Kidney International, 68(3), pp. 1244 – 1249.
25. Marseglia G. L., Tosca M., Cirillo I., Licari A, Leone M., Marseglia A., et al. (2007), “Efficacy of Bacillus clausii spores in the prevention of recurrent respiratory infections in children: a pilot study”, The Clin Risk manag, 3(1), pp. 13 – 17.
26. Martini M. C., Bollweg G. L., Levitt M. D. and Savarano D. A. (1987), “Lactose digestion by yogurt ẞ-galactosidase: influence of pH and microbial cell integrity”, The American Journal of clinical nutrition, 45, pp. 432 - 436. 27. Mcfarlane G Cummings JH (1999), “Probiotics and prebiotics can regulating
the activities of intestinal bacteria benefit health”, pp. 999 – 1003.
28. Nicholson W. J., Munakata N., Horneck G., Melosh H. J. and Setlow P. (2000), “Resistance of Bacillusendospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64, pp. 548 – 572.
29. Nielsen P., Fritze D. and Priest F. G. (1995), “Phenetic diversity of alkaliphilic
bacillus strains: proposal for nine new species”, Microbiology, 141, pp. 1745 – 1761.
30. Nista E. C., Candelli M., Cremonini F., Cazzato I. A. and et al. (2004), “Bacillus clausii therapy to reduce side-effects of anti-Helicobacter pylori treatment: randomized, double-blind, placebo controlled trial”, Alimentary Pharmacology and Therapeutics, 20(10), pp. 1181 – 1188.
31. Oskouie S. F. G., Tabandeh F., Yakhchali B., Eftekhar F. (2008), “Response surface optimization of medium composition for alkaline protease production by
Bacillus clausii”,Biochemical Engineering Journal, 39, pp. 37 – 42.
32. Saad N., Delattre C., Urdaci M., Schmitter J. M., Bressollier P. (2013), “An overview of the last advances in probiotic and prebiotic field”, LWT – Food Science and Technology, 50(1), pp. 1 – 16.
33. Sazawal S., Hiremath G., Dhingra U., Malik P., Deb S., E Black R. (2006), “Efficacy of probiotics in prevention of acute diarrhea: a meta-analysis of
masked, randomized, placebo-controlled trials”, Lancet Infect Dis, 6, pp. 374 – 382.
34.Shirai T., Suzuki A.,Yamane T., Ashida T., Kobayashi T., Hitomi J. and Ito S. (1997), “High-resolution crystal structure of M-protease: phylogeny aided analysis of the high-alkaline a daptation mechanism”, Protein Engineering, 10(6), pp. 627 - 634.
35. Singh P. K., Deol P. K., Kaur I. P. (2012), “Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginate beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer”, Food Funct, 3, pp. 83 -90.
36. Spinosa M. R., Braccini T., Ricca E., De Felice M., Morelli L., Pozzi G. and Oggioni M. R. (2000), “On the fate of ingested Bacillus spores”, Research in Microbiology, 151, pp. 361 – 368.
37. Spinosa M. R., Wallet F., Courcol J. R. and Oggioni M. R. (2000), “The trouble in tracing opportunistic pathogens: cholangitis due to Bacillus in a French hospital caused by a train related to an Italian probiotics”, Microbial ercology in health and disease, 12, pp. 99 – 101.
38. Soccol C. R., De Souza L. P. and et al. (2010), “The potential of Probiotics”,
Food Technol. Biotechnol, 48(4), pp. 413 – 434.
39. Tuohy K. M., et al. (2007), “Survivability of a probiotic Lactobacillus casei in the gastrointestinal tract of healthy human volunteers and its impact on the faecal microflora”, J Appl Microbiol, 102, pp. 1026 – 1032.
40. Vivek K. B. (2013), “Use of encapsulated Probiotics in dairy based foods”, International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences ISSN: 2277 – 209X, 3(1), pp. 188 – 199.
41. World Gastroenterology Organization Food and Agriculture Organization of The United Nations (2006), “Probiotics in Food: Health and nutritional properties and guidelines for evaluation”.