Mục tiêu:
Xác định phương pháp xử lý thích hợp nhằm thu được bào tử tinh khiết với lượng lớn nhất.
Tiến hành:
Chuẩn bị 8 bình nón 250ml, mỗi bình chứa 150ml môi trường canh thang đã hấp tiệt trùng để nuôi cấy B. clausii (theo mục 2.3.2). Sau 4 ngày nuôi cấy, thu sinh khối theo phương pháp trong mục 2.3.4. Sau đó tiến hành:
a. Pha loãng trong nước cất
Sinh khối thu được từ bình 1 và 2 được trộn lẫn và pha loãng trong vừa đủ 300ml nước cất đã hấp tiệt trùng.
b. Pha loãng trong nước muối sinh lí
Sinh khối thu được từ bình 3 và 4 được trộn lẫn và pha loãng trong vừa đủ 300ml NaCl 0,9%.
c. Đông khô
Sinh khối thu được từ bình 5 và 6 được xử lý và tiến hành đông khô theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.6.
d. Xử lý lysozym rồi pha loãng trong NaCl 0,9%
Sinh khối thu được từ bình 7 và 8 được pha loãng trong 300ml nước cất đã hấp tiệt trùng. Tiến hành xử lý bằng lysozym theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.5. Sinh khối sau khi xử lý pha loãng với vừa đủ 300ml NaCl 0,9%.
Lấy mẫu sau khi xử lý ở tất cả bình, pha loãng bằng NaCl 0,9%, tiến hành đo quang ở bước sóng 600nm, mẫu trắng là NaCl 0,9% chuẩn bị song song cùng mẫu thử. Đồng thời đếm số lượng VSV theo phương pháp pha loãng liên tục đã nêu trong mục 2.3.8.
Nhuộm Ogietska theo dõi hình thái các mẫu sau xử lý.
Kết quả:
Bảng 3.3. Mật độ quang và số lượng VSV sống sót trong các mẫu sau khi xử lý
Tình trạng mẫu OD (10-1) Trước xử lý OD (10-1) Sau xử lý Số lượng VSV (Tính theo lượng tương đương với 1ml dịch ban đầu) Pha loãng trong nước cất 0,477 0,477 100.108 cfu/ml
Pha loãng trong
NaCl 0,9% 0,483 0,483 93.10
8
cfu/ml
Đông khô 0,486 0,342 19.108 cfu/ml
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót và mật độ quang của các mẫu sau khi xử lý bằng các phương pháp khác nhau
Bảng 3.4. Hình thái B. clausii trên tiêu bản nhuộm Ogietska Tình trạng mẫu
Hình ảnh sau nhuộm Tế bào Bào tử
Pha loãng trong nước cất + +
Pha loãng trong NaCl 0,9% + +
Đông khô + +
Xử lý bằng lysozym _ +
Chú thích: (+) Có (-) Không
Nhận xét:
Các kết quả thu được từ bảng 3.3 và hình 3.2 cho thấy:
100 93 28 19 0.477 0.483 0.197 0.342 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 20 40 60 80 100 120 Mẫu nước cất Mẫu NaCl 0,9% Mẫu Lysozyme Mẫu đông khô Số lượng VSV (x 10^8 cfu/ml) OD (10^-1) Số lượ ng VSV ( x 10 8 cfu/m l) Mật độ quang
+ Lượng sinh khối thu được nhiều nhất khi pha loãng trong nước cất và nước muối sinh lí, thể hiện ở giá trị mật độ quang cao (0,477 và 0,483). Trong khi đó giá trị mật độ quang sau khi đông khô là 0,342 và xử lý bằng lysozym chỉ còn 0,197.
+ Sau khi pha loãng sinh khối bằng nước cất và nước muối sinh lí, thu được số lượng vi sinh vật sống sót nhiều hơn phương pháp xử lý bằng lysozym và đông khô (100.108 cfu/ml và 93.108 cfu/ml). Xử lý bằng lysozym số lượng VSV giảm còn 28.108 cfu/ml, sau đông khô số lượng VSV sống sót thấp nhất (19.108 cfu/ml).
Từ bảng 3.4 nhận thấy: khi pha loãng sinh khối bằng nước cất và nước muối sinh lí thu được bào tử nhưng vẫn lẫn tế bào sinh dưỡng; đông khô ngay sinh khối VSV từ môi trường nuôi cấy thu được bào tử lẫn cả tế bào sinh dưỡng và xác tế bào; xử lý bằng lysozym thu được hoàn toàn dạng bào tử.
Bàn luận:
Các kết quả trên có thể được giải thích như sau:
+ Sinh khối thu được sau 4 ngày nuôi cấy, không qua xử lý, pha loãng ngay trong nước cất hoặc dung dịch NaCl 0,9% thì số lượng vi sinh vật gần như không thay đổi nhưng tại thời điểm đó, tế bào VSV vẫn chưa chuyển hết thành dạng bào tử, do vậy cần thêm thời gian để tế bào vi khuẩn chuyển hết thành dạng bào tử.
+ Đông khô ngay sinh khối thu được từ môi trường nuôi cấy, số lượng VSV vẫn đạt ở nồng độ cao (ở mức 108
cfu/ml) tuy nhiên số lượng VSV sống sót ít hơn khi pha loãng ngay sinh khối trong nước cất hoặc NaCl 0,9% và phương pháp xử lý bằng lysozym. Mặt khác khi xử lý theo phương pháp này, sinh khối thu được vẫn còn lẫn rất nhiều tế bào B. clausii. Do đó, đông khô không tối ưu để sử dụng cho mục đích thu được bào tử tinh khiết với lượng lớn nhất.
+ Xử lý bằng lysozym có ưu điểm hơn các phương pháp trên: chỉ trong thời gian ngắn đã loại hết tế bào và thu toàn bào tử, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của dược sĩ Vũ Thị Ngọc Bích [1]. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là trải qua nhiều giai đoạn (phá vỡ vỏ tế bào, loại bỏ vỏ tế bào, rửa) sau mỗi lần lượng sinh khối bị rửa trôi rất nhiều và lượng tế bào vi khuẩn chưa chuyển sang bào tử cũng bị loại đi nên số lượng vi sinh vật giảm đáng kể (trước khi xử lý giá trị mật độ quang
đo được là 0,491 và sau khi xử lý chỉ còn 0,197). Hơn nữa, phương pháp này sử dụng nhiều loại hóa chất khác nhau, cách tiến hành phức tạp và giá thành lysozym rất cao dẫn đến chi phí tăng cao. Sinh khối thu được có thể vẫn còn chứa lượng nhỏ lysozym sẽ ảnh hưởng đến chất lượng nguyên liệu trong thời gian bảo quản và sử dụng.
Từ các nhận định trên, lựa chọn phương pháp pha loãng sinh khối VSV trong nước cất, NaCl 0,9% và phương pháp xử lý bằng lysozym để tiến hành thí nghiệm tiếp theo.