Nghiên cứu nuôi cấy tăng sinh và tạo màng nguyên bào sợi trên nền màng polymer sinh học PHB v

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - ĐỀ TÀI : NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TĂNG SINH VÀ TẠO MÀNG NGUYÊN BÀO SỢI TRÊN NỀN MÀNG POLYMER SINH HỌC PHB-V Giáo viên hướng dẫn : TS Đỗ Minh Trung Sinh viên thực : Nguyễn Thành Công Lớp : YD.13 HÀ NỘI-2017 Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Minh Trung tận tâm, nhiệt tình bảo, hướng dẫn động viên, cổ vũ tinh thần cho em suốt trình thực đề tài luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Viện Đại Học Mở Hà NộiKhoa công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa học Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo giảng dạy em năm qua, kiến thức mà em nhận giảng đường hành trang giúp em vững bước tương lai Xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị La bô Nghiên cứu Tế bào gốc, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè tất người thân u ln động viên, khích lệ, giúp đỡ em q trình học tập để em hồn thành luận văn này! Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2017 Học viên SVTH: Nguyễn Thành Công GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan nguyên bào sợi 1.1 Nguyên bào sợi 1.2 Ứng dụng nguyên bào sợi 1.3 Các thành tựu đạt từ nuôi cấy nguyên bào sợi Việt Nam Các loại polymer sinh học 10 2.1 Polyhydroxyalkanoates – PHA 10 2.2 Polyhydroxybutyrate - PHB 11 2.3 Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) – PHB-V 12 2.4 Ứng dụng polyhydroxybutyrate 13 Tổng quan bỏng vết thương mạn tính 14 3.1 Thực trạng bỏng vết thương mạn tính 14 3.2 Tình hình nghiên cứu điều trị bỏng vết thương mạn tính 19 3.2.1 Các phương pháp điều trị bỏng: 20 3.2.2 Ứng dụng PHB y học tái tạo điều trị vết thương bỏng 23 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 25 1.1 Đối tượng nghiên cứu 25 1.2 Hóa chất vật tư tiêu hao 25 1.3 Máy móc thiết bị nghiên cứu 25 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Nuôi cấy tăng sinh tế bào 26 2.2 Bảo quản tế bào 26 2.3 Giải đông tế bào 26 2.4 Xác định mật độ tế bào 27 2.5 Tạo màng PHB-V 27 SVTH: Nguyễn Thành Cơng GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội 2.6 Nuôi cấy tế bào màng PHB-V 28 2.7 Địa điểm nghiên cứu 29 2.8 Xử lý số liệu 29 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết nuôi cấy tăng sinh tế bào nguyên bào sợi 30 3.2 Kết tạo màng PHB-V khảo sát điều kiện tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB-V 31 3.2.1 Tạo màng PHB-V 31 3.2.2 Kết khảo sát điều kiện tạo màng nguyên bào sợi màng PHB-V 32 3.2.2.1 Kết khảo sát nuôi cấy nguyên bào sợi màng PHB-V nồng độ khác 32 3.2.2.2 Kết nuôi cấy nguyên bào sợi màng PHB-V 0,75% thể tích khác 35 3.2.2.3 Kết nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi màng PHB-V có mật độ tế bào ban đầu khác 37 3.2.2.4 Tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB-V 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 SVTH: Nguyễn Thành Công GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐC Đối chứng EGF Epidermal growth factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì HA Hydroxyalkanoates HB Hydroxybutyrate MCL-PHA Medium-chain-length-PHA PBS Phosphate buffered saline Dung dịch muối đệm photphat PHA Polyhydroxyalkanoates PHB Polyhydroxybutyrate PHB-V Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) PHV Polyhydroxyvalerate FBM Fibroblast Basal Medium FBS Fetal bovine serum Huyết bào thai bò Rtase Reverse Transcriptase SCL-PHA Short-chain-length-PHA TLR3 Toll-like receptor WHO World Health Organization Tổ chức Y tế giới SVTH: Nguyễn Thành Cơng GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ khác 34 Bảng 3.2 Kết mật độ tế bào ni cấy màng PHB-V 0,75% thể tích khác 36 Bảng 3.3 Kết nuôi cấy tế bào màng PHB-V mật độ tế bào ban đầu khác 38 SVTH: Nguyễn Thành Cơng GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ khác 34 Biểu đồ 3.2 Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V 0,75% thể tích khác 35 Biểu đồ 3.3.a Kết nuôi cấy tế bào màng PHB-V mật độ tế bào ban đầu khác 37 Biểu đồ 3.3.b Kết so sánh nuôi cấy tế bào màng PHB-V mật độ tế bào ban đầu khác 38 SVTH: Nguyễn Thành Cơng GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Ngun bào sợi Hình 1.2 Cấu trúc không gian ba chiều collagen .8 Hình 1.3 Polyhydroxyalkanoates-PHA .10 Hình 1.4 Cấu trúc PHB-V 13 Hình 1.5 Các cấp độ bỏng 14 Hình 1.6 Các loại thực vật chữa bỏng .22 Hình 1.7 Trung bì da lợn 23 Hình 2.1 Hình ảnh số máy móc thiết bị nghiên cứu 26 Hình 2.2 Quy trình tạo màng PHB-V 28 Hình 3.1 Hình ảnh kết ni cấy tăng sinh nguyên bào sợi 30 Hình 3.2 Hình ảnh kết tạo màng PHB-V 32 Hình 3.3 Hình ảnh kết nuôi cấy tế bào màng PHB-V nồng độ khác 33 Hình 3.4 Hình ảnh màng PHB-V với lớp màng nguyên bào sợi nhuộm Giemsa quan sát vật kính 10X-20X-40X 40 SVTH: Nguyễn Thành Công GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ Da phận quan trọng thể Bên cạnh việc đóng vai trò rào cản thể chống lại vi khuẩn vi rút, da cịn trì cân chất giúp điều hòa nhiệt độ thể Tuy nhiên, với phát triển không ngừng công nghệ xã hội, loại tổn thương da có chiều hướng tăng lên mạnh mẽ vết thương tia xạ, vết thương mạn tính tiểu đường, loét điểm tỳ bệnh lý thần kinh, loét bệnh lý mạch ngoại vi Theo Tổ chức Y tế giới (WHO) ước tính “Gánh nặng Bệnh tật Tồn cầu” năm 2004 có 310.000 người tử vong bỏng lửa, có 30% tuổi 20 Bỏng liên quan đến lửa nguyên nhân thứ tử vong trẻ em nhóm tuổi 5-14 Tính tổng thể, trẻ em có nguy bị tử vong bỏng cao, với tỷ lệ toàn cầu 3,9 người chết 100.000 dân Trong số người toàn cầu, trẻ nhỏ có tỷ lệ tử vong bỏng cao Tỷ lệ tử vong quốc gia có thu nhập thấp trung bình cao gấp lần so với quốc gia có thu nhập cao Theo nghiên cứu Ủy ban quốc gia phòng chống tai nạn thương tích Cục Y tế dự phịng năm 2007, số lượng tai nạn bỏng nước đứng thứ hai sau tai nạn giao thông, với khoảng 20.000 đến 25.000 bệnh nhân bỏng năm số không ngừng tăng lên theo năm Theo thống kê Viện Bỏng quốc gia, năm Viện nhận điều trị cho khoảng 4.000 bệnh nhân bỏng, số lượng nạn nhân trẻ em chiếm 50% tổng số nạn nhân bỏng (khoảng 1.200 – 1.600 bệnh nhân/năm) khoảng 3% số ca tiếp nhận ca nặng thường khơng qua khỏi Có nhiều phương pháp điều trị bỏng vết thương mạn tính dùng thuốc kích thích phát triển tế bào, dùng oxy cao áp, tia laser hiệu thấp, can thiệp phẫu thuật thường thất bại áp dụng sức khỏe bệnh nhân không cho phép phẫu thuật Các bác sĩ Viện SVTH: Nguyễn Thành Công GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Bỏng quốc gia nghiên cứu áp dụng thành công phương pháp ghép nguyên bào sợi đồng loại nuôi cấy điều trị cho bệnh nhân bị vết loét mãn tính bệnh lý sau xạ trị ung thư Đây phương pháp áp dụng Việt Nam Với công nghệ này, cần phần da nhỏ, sau nuôi cấy, tế bào da tạo mảnh da với diện tích theo ý muốn để ghép cho bệnh nhân Vì thế, điều trị vết loét rộng Để điều trị vết thương, vết bỏng hiệu quả, bên cạnh việc tạo nguồn ứng dụng nguyên bào sợi việc kết hợp với vật liệu giá thể (màng sinh học) vô quan trọng Giá thể vừa vật liệu để tế bào sinh trưởng phát triển tạo thành lớp màng tế bào bền chắc, dễ dàng sử dụng che phủ vết thương Hiện Poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) – PHB-V, biết đến nguồn cung cấp vật liệu sinh học có nhiều tiềm ứng dụng, có khả tự phân hủy, khơng độc hại, có tương thích sinh học cao tổng hợp từ vi khuẩn Do vậy, PHB-V ứng dụng nhiều lĩnh vực khác dược phẩm vật liệu che phủ Những đặc tính mong muốn mở tiềm ứng dụng PHB-V vào y học, sử dụng vật liệu có tính tương thích sinh học khơng độc hại thích hợp cho việc tạo vật liệu cấy ghép người Xuất phát từ vấn đề em tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tạo màng nguyên bào sợi màng polymer sinh học PHB-V” với mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu: Nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi Tạo màng nguyên bào sợi màng polymer sinh học PHB-V SVTH: Nguyễn Thành Công GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Hình 3.3 Hình ảnh kết ni cấy tế bào màng PHB-V nồng độ khác (0.5, 0,75, 1, 1,25 %: nguyên bào sợi khảo sát nuôi cấy màng PHB V nồng độ khác nhau; ĐC; Mẫu đối chứng nuôi cấy nguyên bào sợi đĩa nhựa) SVTH: Nguyễn Thành Công 33 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Số lượng tế bào (x106) Biểu đồ kết đếm tế bào khảo sát nuôi cấy tăng sinh tạo màng nguyên bào sợi màng PHB-V nồng độ 1,8 1,6 1,4 1,2 0,8 0,6 0,4 0,2 1,68 1,46 1,38 1,44 1,22 0,50% 0,75% 1% Nồng độ PHB-V (%) 1,25% ĐC Biểu đồ 3.1 Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ khác Bảng 3.1 Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V nồng độ khác Nồng độ PHB-V (%) 0,5 0,75 1,25 ĐC Mật độ tế bào x106 (n=5) 1,38 1,68 1,46 1,44 1,22 (Mean ± SD) ± 0,86 ± 0,46 ± 0.59 ± 0.66 ± 0.73 Trong nghiên cứu khảo sát nuôi cấy tế bào màng PHBV nồng độ khác từ 0,5% 1,25% để tìm nồng độ phù hợp nhất Kết nồng độ PHB-V 0,5% số lượng tế bào/giếng đạt là: 1,38 ± 0,86 x106 tế bào; 0,75%: 1,68 ± 0,46 x106 tế bào; 1%: 1,46 ± 0,59 x106; 1,25%: 1,44 ± 0,66 x106 tế bào; mẫu đối chứng (ĐC) là: 1,22 ± 0,73 x106 tế bào Kết cho thấy nồng độ PHB-V 0,75% có số lượng tế bào cao sau nuôi cấy Trong nghiên cứu này, tất nồng độ màng PHB-V cho kết ni cấy có số lượng tế bào cao mẫu đối chứng SVTH: Nguyễn Thành Công 34 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội nuôi cấy thông thường plate nhựa nuôi cấy Kết thu cho thấy việc sử dụng màng PHB-V nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi thu kết tốt so với điều kiện thông thường Tuy nhiên để tiết kiệm nguyên vật liệu màng tạo có số lượng tế bào tối ưu Chính vậy, chúng tơi chọn sử dụng màng PHB-V nồng độ 0,75% cho nghiên cứu 3.2.2.2 Kết nuôi cấy nguyên bào sợi màng PHB-V 0,75% thể tích khác Sau thử nghiệm tạo màng PHB-V nồng độ 0,75% với thể tích đổ màng khác từ 6ml, 7ml, 8ml, 9ml, 10ml đĩa petri có đường kính d = 10cm Kết đánh giá thông qua số lượng tế bào sau ngày nuôi cấy thể biểu đồ 3.2 bảng 3.2 Biểu đồ kết đếm tế bào khảo sát nuôi cấy tăng sinh tạo màng nguyên bào sợi màng PHB-V thể tích 2,55 Số lượng tế bào x106 2,5 2 2,05 2,15 2,15 1,95 1,5 0,5 10 ĐC Thể tích màng PHB-V (ml) Biểu đồ 3.2 Kết mật độ tế bào ni cấy màng PHB-V 0,75% thể tích khác SVTH: Nguyễn Thành Công 35 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Bảng 3.2 Kết mật độ tế bào nuôi cấy màng PHB-V 0,75% thể tích khác Thể tích màng PHB-V (ml) Số lượng tế bào x106 (n=5) (Mean ± SD) 10 ĐC 2,0 ± 0,365 2,05 ± 0,755 2,15 ± 0,526 2,55 ± 0,772 2,15 ± 0,342 1,95 ± 0,1 Màng PHB-V tạo có độ dày khác nhau, khơng phụ thuộc vào nồng độ PHB-V hòa tan dung mơi mà cịn phụ thuộc vào thể tích đổ màng Độ dày mỏng màng PHB-V có ảnh hưởng đến khả bám dính tăng sinh tế bào hay khơng, chúng tơi tiến hành thí nghiệm tạo màng PHB-V có nồng độ 0,75% với thể tích khác 6ml, 7ml, 8ml, 9ml, 10ml đĩa petri có đường kính d = 10cm Kết thu màng có độ dày khác Các màng sau hấp tiệt trùng 121°C, 15 phút tiến hành thử nghiệm làm giá thể nuôi nguyên bào sợi để tìm màng PHB-V 0,75% thể tích cho kết tăng sinh tế bào tốt Kết thu cho thấy nguyên bào sợi nuôi màng PHB-V 0,75% thể tích 9ml cho kết cao 2,55 ± 0,772 x10 tế bào; thể tích 6ml cho kết thấp ± 0,365 x106 Các thể tích khác cho kết 7ml: 2,05 ± 0,755 x10 6; 8ml: 2,15 ± 0,526 x106; 10ml: 2,15 ± 0,342 x106 Tất thể tích cho số lượng tế bào cao mẫu đối chứng (ĐC) là: 1,95 ± 0,1 x10 Kết cho thấy việc nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi màng PHB-V đạt hiệu tốt hơn, tạo tiền đề cho nghiên cứu sau Chính vậy, chúng tơi định chọn thể tích màng PHB-V 0,75% có kết ni cấy tế bào tốt 9ml để sử dụng cho nghiên cứu SVTH: Nguyễn Thành Công 36 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội 3.2.2.3 Kết nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi màng PHBV có mật độ tế bào ban đầu khác Sau chọn nồng độ thể tích tốt màng PHB-V 0.75% - 9ml, tiếp tục tiến hành thí nghiệm ni cấy tăng sinh ngun bào sợi màng PHB-V có mật độ tế bào ban đầu khác để tìm mật độ tế bào tối ưu cho thí nghiệm sau Các mật độ tế bào sử dụng thí nghiệm là: 3,4 x104, 3,4 x105 3,4 x106 Kết đánh giá thông qua số lượng tế bào sau ngày nuôi cấy thể biểu đồ 3.3.a, biểu đồ 3.3.b bảng 3.3 Biểu đồ 3.3.a Kết nuôi cấy tế bào màng PHB-V mật độ tế bào ban đầu khác SVTH: Nguyễn Thành Cơng 37 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Kết nuôi cấy tế bào màng PHB-V mật độ tế bào ban đầu khác 14 12 10 0 ngày 10⁴ ngày ngày 10 ngày 12 ngày ĐC 10⁴ 10⁵ ĐC 10⁵ 10⁶ ĐC 10⁶ Biểu đồ 3.3.b Kết so sánh nuôi cấy tế bào màng PHB-V mật độ tế bào ban đầu khác Bảng 3.3 Kết nuôi cấy tế bào màng PHB-V mật độ tế bào ban đầu khác SLTB x106 (n=5) 104 (Mean ± SD) ĐC 104 (Mean ± SD) 105 (Mean ± SD) ĐC 105 (Mean ± SD) 106 (Mean ± SD) ĐC 106 (Mean ± SD) 0,017 0,017 0,17 0,17 1,7 1,7 ngày ngày 1,25 ±0,35 0,75 ±0,35 7,75 ±1,06 6,25 ± 0,35 11,75 ±1,06 ±0,7 2,75 ±0,35 1,75 ±0,35 12 ±0,707 ±1,41 12 ±2,12 10 ±1,41 5,75 ±0,35 4,25 ±1,06 11,5 ±1,414 ±0,70 11,75 ±1,06 10,75 ±1,06 7,75 ±1,06 ±0,70 11,5 ±0,707 10,5 ±0,70 11,25 ±0,35 10,75 ±3,18 10 ngày 12 ngày 10,2 10,2 ±0,35 ±1,06 6,75 7,5 ±1,06 ±0,70 11,25 10,25 ±2,474 ±0,353 9,75 9,5 ±1,06 ±2,12 11 9,25 ±0,70 ±1,06 10,25 9,5 ±1,76 ±0,70 Mật độ tế bào ban đầu cho vào nuôi cấy yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thời gian nuôi cấy tạo màng nguyên bào sợi Mật độ tế bào SVTH: Nguyễn Thành Cơng 38 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội cao đồng nghĩa với số lượng tế bào lớn Chính vậy, mật độ tế bào cho vào cao thời gian tạo màng nguyên bào sợi rút ngắn Trong nghiên cứu này, dễ dàng thấy mật độ tế bào ban đầu nuôi cấy 1,7 x106 cho thời gian tăng sinh che phủ hồn tồn bề mặt ni cấy nhanh ngày với số lượng tế bào 11,25 x106 Mật độ tế bào ban đầu 1,7 x104 tăng sinh chậm số lượng tế bào ít, phải 10 ngày che phủ gần tồn bề mặt nuôi cấy với số lượng tế bào đếm thời điểm cao 10,25 x106 tế bào Số lượng tế bào cao đếm 12 x106 giếng có mật độ tế bào ban đầu 1,7 x105 tế bào thời điểm ngày sau nuôi cấy Việc số lượng tế bào cao khơng phải giếng có mật độ tế bào ban đầu cao 1,7 x106 giải thích sau: - Mật độ tế bào 106 nên số lượng tế bào nhiều, sau cấy chuyển từ đĩa petri nuôi cấy sang màng PHB-V tế bào gần che phủ kín bề mặt nuôi cấy Sau ngày, số lượng tế bào màng PHB-V tăng lên nhanh che phủ hoàn toàn bề mặt nuôi cấy mà tế bào tiếp tục phát triển, sinh sôi khiến tế bào mọc chồng chéo lên thành mảng nguyên bào sợi không bám dính nên bật lên khỏi bề mặt nuôi cấy Khi hút bỏ dịch nuôi cấy để xử lý tế bào đem đếm, mảng nguyên bào sợi khơng bám dính bị hút theo nên số lượng lớn tế bào bị làm cho kết đếm tế bào khơng xác hồn tồn Điều giải thích cho việc sau số lượng tế bào đạt kết cao (2 ngày mật độ 10 ngày mật độ 105) ngày sau số lượng tế bào lại giảm đi, tế bào bị chết hay bị nhiễm vi khuẩn, vi-rút mà ngun nhân bề mặt ni cấy khơng cịn để tế bào tiếp tục bám xuống phát triển Còn mật độ 105, số lượng tế bào lại khiến cho việc tăng sinh chậm, phải 10 ngày để phát triển kín bề mặt nuôi cấy Việc tế bào tăng sinh chậm gây hao phí mơi trường ni cấy, đồng thời tế bào ban đầu nuôi SVTH: Nguyễn Thành Công 39 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội cấy dài ngày bị thối hóa biến đổi tính chất, hình thái, khơng đáp ứng mục tiêu nghiên cứu Do đó, thí nghiệm chúng tơi chọn mật độ tế bào ban đầu nuôi cấy 105 thí nghiệm thời gian ngày tế bào phát triển kín hồn tồn bề mặt ni cấy mà khơng có dấu hiệu bị bật lên mảng mật độ 106 3.2.2.4 Tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB-V Sau khảo sát điều kiện tối ưu tiến hành nuôi cấy tạo màng tế bào Kết thu nguyên bào sợi có khả bám dính tốt khả tăng sinh mạnh, sau ngày đạt mật độ 80% diện tích bề mặt màng PHBV Sau cố định nhuộm màng với Giemsa cho thấy PHB-V có lớp tế bào bắt mầu với thuốc nhuộm Kết thể hình 3.4 Hình 3.4 Hình ảnh màng PHB-V với lớp màng nguyên bào sợi nhuộm Giemsa quan sát vật kính 10X-20X-40X SVTH: Nguyễn Thành Cơng 40 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội Hình ảnh quan sát lớp màng màu xanh sau nhuộm Giemsa Quan sát qua vật kính cho thấy tế bào phát triển dày, kín bề mặt ni cấy liên kết với tạo thành lớp màng nguyên bào sợi Ta dễ dàng quan sát mắt thường lớp màng nguyên bào sợi bắt màu xanh thuốc nhuộm Như nuôi cấy màng nguyên bào sợi màng polymer sinh học PHB-V SVTH: Nguyễn Thành Công 41 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội KẾT LUẬN Đã nuôi cấy tăng sinh tế bào nguyên bào sợi: - Nuôi cấy nguyên bào sợi môi trường FBM nhiệt độ 37°C, 5% CO₂ - Sau 24 nuôi cấy, tế bào có khả bám dính vào bề mặt đĩa ni cấy, tế bào có dạng hình thoi Sau ngày ni cấy, đạt mật độ khoảng 80% diện tích bề mặt đĩa ni cấy - Kết có ý nghĩa đạt yêu cầu việc tạo nguồn tế bào làm nguyên liệu để cung cấp cho việc tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB-V Đã nuôi cấy tạo màng nguyên bào sợi màng polymer sinh học PHB-V: - Đã tạo màng PHB-V, quan sát màng có mầu trắng đục, có độ dai, mềm màng PHB-V sử dụng làm giá đỡ nuôi cấy tế bào - Đã tạo màng nguyên bào sợi màng PHB V: nồng độ tạo màng PHB-V 0,75%, thể tích đổ màng ml, mật độ tế bào sử dụng cho nuôi cấy tạo màng 3,4 x105, thời gian nuôi cấy ngày SVTH: Nguyễn Thành Công 42 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội KIẾN NGHỊ Kết bước đầu khảo sát điều kiện nuôi cấy tạo màng nguyên bào sợi màng polymer sinh học PHB-V Tuy nhiên khuôn khổ thời gian có hạn Chính nghiên cứu cần phải đánh giá khả kích ứng đánh giá hiệu màng tế bào mơ hình động vật SVTH: Nguyễn Thành Cơng 43 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước: Chu Anh Tuấn (2012) Nghiên cứu tác dụng dịch chiết ngoại bào nguyên bào sợi nuôi cấy từ da người điều trị vết thương mạn tính Báo Y học Thực hành Đinh Văn Hân (2015) Trung bì da lợn điều trị vết thương, vết bỏng Đinh Văn Hân (2015) Những điều cần biết vết thương mạn tính Margie Peden (2008) Báo cáo Thế giới thương tích trẻ em Tổ chức Y tế Thế giới Nhan Ngọc Hiền (2005) Qui trình ni cấy ngun bào sợi người phù hợp điều kiện Việt Nam Nguyễn Viết Lượng (2010) Tình hình bỏng Việt Nam năm 2008-2009 Tạp chí Y học thực hành Lê Năm, Nguyễn Gia Tiến (2011) Phát triển kỹ thuật công nghệ ứng dụng điều trị thảm họa bỏng, Báo Khoa học – Cơng nghệ Tài liệu nước ngồi: Attia-Vigneau Joan, Legendre Florence, Nguyen Q.T (2008) Evaluation of Adhesion, Proliferation, and Functional Differentiation of Dermal Fibroblasts on Glycosaminoglycan-Coated Polysulfone Membranes Tissue Engineering Part A 14(10):1687-97 Baum Jennifer, Duffy Heather S (2011) Fibroblasts and Myofibroblasts: What are we talking about? J Cardiovasc Parmacol, 2011, 57(4), 376-379 10 Brunel Gomes Daiane, Pachekoski Maurício Wagner, Dalmolin Carla, Agnelli Augusto Marcondes José (2014) Natural additives for poly (hydroxybutyrate - CO - hydroxyvalerate) - PHBV: effect on SVTH: Nguyễn Thành Công 44 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội mechanical properties and biodegradation Mat Res Vol.17 no.5 São Carlos 2014 11 Cammas S, Bear MM, Moine L, Escalup R, Ponchel G, Kataoka K, Guerin P (1999) Polymers of malic acid and 3-alkylmalic acid as synthetic PHAs in the design of biocompatible hydrolyzable devices International Journal of Biological Macromolecules;25:273-282 12 Chaw Su Thwin (2004) Fabrication, characterzation and degradation of PHB and PHBV microsphere for liver cell growth, a thesis submitted for the degree of master of engineering National university of Singapore 13 Guan, Qi (2013) Fabrication and Characterization of PLA, PHBV and Chitin Nanowhisker Blends, Composites and Foams for High Strength Structural Applications Master of Applied Science Mechanical Engineering University of Toronto 14 Hankermeyer, Tjeerdema (1999) Polyhydroxybutyrate: plastic made and degraded by microorgamisms Rev Environ Contam Toxicol, 1999, 159, 1-24 15 Kalluri Raghu, Zeisberg Michael (2006) Fibroblasts in cancer Nature review|cancer 2006, volume 6, 392-401 16 Karlsson Lisa (2009) Differentiation of Human Dermal Fibroblasts a New Tool in Vascular Tissue Engineering Linköping Studies in Health Sciences Thesis No 99 17 Khan April, Solan Matthew (2016) Burns: Types, Treatments and More Medically Reviewed by George Krucik, MD, MBA on August 13, 2014 18 Khosravi Darani K, Poly(hydroxyalkanoate) Bucci In D Food Z (2015) Packaging: Application of Improvements by Nanotechnology Chem Biochem Eng 29(2): 275-285 19 King Samuel P Burns Statistics Website: Burn Injury 2015 SVTH: Nguyễn Thành Công 45 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội 20 McAnulty Robin J (2006) Fibroblasts and myofibroblasts: Their source, function and role in disease The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, Volume 39, Issue 4, 2007, Pages 666-671 21 Leonard Hayflick, Moorhead (1961) The serial cultivation of human diploid cell strains Experimental Cell Research 25: 585–621 22 Ornitz David M, Nobuyuki Itoh (2001) Fibroblast growth factors Genome Biology 2001 Vol No 23 Papini R (2004) Management of burn injuries of various depths BMJ 329, pp 158–160 24 Peter Franks J (2008) The burden of chronic wounds in the UK Nursing times, January 2008 25 Potter M, Steinbuchel A (2006) Biogenesis and structure of polyhydroxyalkanoate granules In: J M Shively editor Inclusions in Prokaryotes Berlin: Springer-Verlag: p 110-129 26 Shrivastav Anupama, Kim Hae-Yeong, Kim Young-Rok (2013) Advances in the Applications of Polyhydroxyalkanoate Nanoparticles for Bovel Drug Delivery System Biomed Research International 2013 27 Sinhal Kounteya (2012) 10 lakh Indians suffer from burns every year The times of india, Jun 7, 2012 28 Thwin Su Chaw (2004) Fabrication, Characterization and Degradation of PHB and PHBV Microspheres For Liver Cell Growth A thesis submitted for the degree of master of engineering department of chemical and biomolecular engineering National University of Singapore 2004 29 Tong H W., Wang M., Lu W W (2011) In Vitro Biological Evaluation of Fibrous PHBV Polymer and CHA/PHBV Nanocomposite Scaffolds Developed for Tissue Engineering Applications Bioceramics Development and Applications, Vol (2011) SVTH: Nguyễn Thành Công 46 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung Khóa luận tốt nghiệp Viện đại học Mở Hà Nội 30 Tracy E Lauren, Minasian A Raquel, Caterson E.J (2016) Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound Adv Wound Care (New Rochelle) 2016 Mar 1; 5(3); 119-136 31 Wang Min, Sultana Naznin (2011) PHBV Tissue Engineering Scaffolds Fabricated via Emulsion Freezing / Freeze-drying: Effects of Processing Parameters International Conference on Biomedical Engineering and Technology IPCBEE vol.11 (2011) SVTH: Nguyễn Thành Công 47 GVHD: T.S Đỗ Minh Trung ... nuôi cấy tạo màng nguyên bào sợi màng polymer sinh học PHB- V? ?? v? ??i mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu: Nuôi cấy tăng sinh nguyên bào sợi Tạo màng nguyên bào sợi màng polymer sinh học PHB- V SVTH:... sử dụng nguồn tế bào để sử dụng việc nuôi cấy tạo màng tế bào màng PHB- V 3.2 Kết tạo màng PHB- V khảo sát điều kiện tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB V 3.2.1 Tạo màng PHB V Sau thực bước... QUẢ V? ? THẢO LUẬN 30 3.1 Kết nuôi cấy tăng sinh tế bào nguyên bào sợi 30 3.2 Kết tạo màng PHB- V khảo sát điều kiện tạo màng tế bào nguyên bào sợi màng PHB- V 31 3.2.1 Tạo màng PHB- V