Nghiên cứu đánh giá huyết tương giàu tiểu cầu , dịch chiết nguyên bào sợi đến khả năng tăng sinh và di cư của tế bào gốc biểu mô màng ối

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ HUYẾT TƯƠNG GIÀU TIỂU CẦU, DỊCH CHIẾT NGUYÊN BÀO SỢI ĐẾN KHẢ NĂNG TĂNG SINH VÀ DI CƯ CỦA TẾ BÀO GỐC BIỂU MÔ MÀNG ỐI Giáo viên hướng dẫn : TS Đỗ Minh Trung Sinh viên thực : Nguyễn Văn Cường Lớp : YD.13 Hà Nội-2017 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Minh Trung tận tâm, nhiệt tình bảo, hướng dẫn động viên, cổ vũ tinh thần cho em suốt trình thực đề tài luận văn tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Viện Đại Học Mở Hà NộiKhoa công nghệ sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa học Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô giáo giảng dạy em năm qua, kiến thức mà em nhận giảng đường hành trang giúp em vững bước tương lai Xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị Lab Nghiên cứu TBG, Trung tâm Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y quan tâm, hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè tất người thân u ln động viên, khích lệ, giúp đỡ em trình học tập để em hoàn thành luận văn này! Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2017 Học viên MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH DANH MỤC BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Huyết tương giàu tiểu cầu 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Cấu tạo chức tiểu cầu 1.1.2.1 Đặc điểm chức tiểu cầu 1.1.2.2 Tiểu cầu trình làm lành vết thương 1.1.3 Ứng dụng PRP điều trị 1.2 Nguyên bào sợi vai trò nguyên bào sợi liền vết thương 11 1.3 Tế bào gốc tế bào gốc màng ối 13 1.3.1 Tế bào gốc 13 1.3.2 Tế bào gốc từ màng ối 16 1.3.3 Ứng dụng TBG màng ối 19 PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 2.1.1 Đối tương nghiên cứu: 21 2.1.2.Hóa chất, dụng cụ, vật tư tiêu hao thiết bị nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.2 Bảo quản tế bào 23 2.2.3 Giải đông tế bào 23 2.2.4 Xác định mật độ tế bào 23 2.2.5 Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu 24 2.2.6 Nuôi cấy chuẩn bị dịch chiết nguyên bào sợi 24 2.2.7 Phản ứng MTT đánh giá khả tăng sinh TBG biểu mô màng ối 24 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết nuôi cấy tăng sinh TBG biểu mô màng ối 27 3.2 Kết đánh giá tác dụng PRP TBG biểu mô màng ối 29 3.2.1 Kết đánh giá tác dụng PRP đến khả sinh thông qua số lượng TBG màng ối 29 3.2.2 Kết đo phản ứng MTT đánh giá tác dụng PRP đến khả tăng sinh TBG màng ối 33 3.2.3 Kết đánh giá tác dụng PRP đến khả di cư TBG biểu mô màng ối vết thương in vitro 37 3.3 Kết đánh giá tác dụng dịch chiết nguyên bào sợi TBG biểu mô màng ối 40 3.3.1 Kết đánh giá tác dụng dịch chiết nguyên bào sợi đến khả sinh thông qua số lượng TBG màng ối 40 3.3.2 Kết đo phản ứng MTT đánh giá tác dụng dịch chiết nguyên bào sợi đến khả tăng sinh TBG biểu mô màng ối 43 3.4 Kết so sánh đánh giá tác dụng PRP dịch chiết nguyên bào sợi TBG màng ối 47 KẾT LUẬN 51 KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BMNC DC DMEM DMSO ECGF EGF FBS FGF-2 PBS PDAF PDEGF PDGF PF PRP GM IGF KGF MTT TBG TGF-β TSP-1 VEGF Bề mặt nhãn cầu Đối chứng Dulbecco-Modifed Eagle Medium Dimethyl sulfoxide Epithelial Cell Growth Factor Yếu tố tăng trưởng tế bào biểu mô Epidermal growth factor Yếu tố tăng trưởng biểu bì Fetal bovine serum (Huyết bào thai bò) Fibroblast Growth Factor-2 Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi-2 Phosphate buffered saline (Dung dịch đệm photphat) Platelet-Derived Angiogenesis Factor Yếu tố tăng sinh mạch nguồn gốc tiểu cầu Platelet-Derivedendothelial Growth Factor Yếu tố tăng trưởng nội mô nguồn gốc tiểu cầu Platelet-derived growth factor Platelet factor (Yếu tố tiểu cầu) Platelet Rich Plasma (Huyết tương giàu tiểu cầu) Giác mạc Insulin-Like Growth Factor Yếu tố tăng trưởng giống Insulin Keratinocyte Growth Factor Yếu tố tăng trưởng keratinocyte [3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] Tế bào gốc Transforming growth factorbeta Thrombospondin-1 Vascular endothelial growth factor Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Số lượng tế bào sau 48 tiếp xúc PRP (n=8) 29 Bảng 3.2: Số lượng trung bình TBG màng ối tiếp xúc với PRP tỷ lệ pha loãng khác (n=8) 31 Bảng 3.3: Kết phản ứng MTT tế bào tiếp xúc PRP (n=8) 34 Bảng 3.4: Bảng giá trị OD trung bình phản ứng MTT mẫu tế bào sau 48 nuôi cấy bổ sung với PRP (n=8) 36 Bảng 3.5: Số lượng TBG màng ối giếng nuôi cấy sau cho PRP tiếp xúc với vết thương in vitro (n=3) 38 Bảng 3.6: Số lượng TBG màng ối sau 48 nuôi cấy bổ sung với dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) 40 Bảng 3.7: Bảng giá trị trung bình số lượng TBG màng ối tiếp xúc với dịch chiết tỷ lệ pha loãng khác (n=8) 42 Bảng 3.8: Kết phản ứng MTT tế bào tiếp xúc Dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) 44 Bảng 3.9: Bảng giá trị OD trung bình phản ứng MTT mẫu tế bào sau 48 tiếp xúc với Dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) 46 Bảng 3.10: Bảng giá trị trung bình số lượng TBG màng ối tiếp xúc với mẫu PRP mẫu dịch chiết tỷ lệ pha loãng khác 47 Bảng 3.11: Kết giá trị OD trung bình phản ứng MTT TBG àng ối sau tiếp xúc PRP dịch nuôi cấy 48 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Tỷ lệ tế bào máu huyết tương giàu tiểu cầu Hình 1.2: Cấu trúc tiếp cầu (Theo Neumuller) Hình 1.3: Ng̀ n gớ c thu nhâ ̣n TBG và tiề m biê ̣t hóa của chúng tương ứng với các giai đoa ̣n phát triể n của thể 15 Hình 1.4: Bánh màng ối 17 Hình 2.1: Một số thiết bị nghiên cứu 22 Hình 3.1: Hình ảnh kết nuôi cấy tăng sinh TBG từ màng ối 27 Hình 3.2: Hình ảnh TBG Biểu mơ màng ối sau nhuộm giemsa - 200X 28 Hình 3.3: Hình ảnh mật độ TBG biểu mơ màng ối tạo tinh thể formazan sau bổ sung MTT 33 Hình 3.4 Vết rạch khả di cư TBG biểu mô màng ối 38 Hình 3.5: Hình ảnh TBG biểu mơ màng ối tạo tinh thể Formazan sau bổ sung MTT 43 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Kết số lượng TBG màng ối sau 48 tiếp xúc PRP 30 Biểu đồ 3.2: Số lượng trung bình TBG màng ối tiếp xúc với mẫu PRP tỷ lệ pha loãng khác 31 Biểu đồ 3: Kết đo OD phản ứng MTT mẫu TBG màng ối sau 48 nuôi cấy bổ sung PRP 35 Biểu đồ 3.4: Biểu đồ kết đo OD trung bình phản ứng MTT mẫu tế bào sau 48 tiếp xúc PRP 36 Biểu đồ 3.5: Kết số lượng TBG màng ối sau 48 nuôi cấy bổ sung với dịch chiết nguyên bào sợi 41 Biểu đồ 3.6: Số lượng trung bình TBG màng ối tiếp xúc với dịch chiết nguyên bào sợi tỷ lệ pha loãng khác 42 Biểu đồ 3.7:Kết đo OD phản ứng MTT mẫu TBG màng ối sau 48 tiếp xúc dịch chiết nguyên bào sợi 45 Biểu đồ 3.8: Giá trị kết đo OD trung bình phản ứng MTT TBG màng ối sau 48 tiếp xúc với dịch chiết nguyên bào sợi 46 Biểu đồ 3.9: Giá trị trung bình số lượng tế bào sau tiếp xúc với PRP dịch nuôi cấy 47 Biểu đồ 3.10: Giá trị kết đo OD trung bình phản ứng MTT mẫu tế bào sau 48 tiếp xúc với PRP dịch chiết nguyên bào sợi 48 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung ĐẶT VẤN ĐỀ Da quan lớn thể, có vai trị bảo vệ thể trước tác động với mơi trường xung quanh, vết thương khó lành, vết thương mạn tính lt bàn chân đái tháo đường, loét tỳ đè, loét chi có xu hướng ngày gia tăng, làm ảnh hưởng đến chất lượng sống gây nguy hiểm Cụ thể Mỹ với 260 triệu dân hàng năm có khoảng 6,5 triệu người mang vết thương mạn tính Riêng Đức có khoảng triệu người bị loét chi phí điều trị lên tới tỷ Euro Ở Việt Nam hàng năm ước tính khoảng 791.000 người gặp tai nạn bỏng [3] Có nhiều phương pháp điều trị chưa thực hiệu cao Những nghiên cứu gần cho thấy ứng dụng tế bào tế bào gốc, nguyên bào sợi, sản phẩm từ tế bào huyết tương giàu tiểu cầu có nhiều ưu điểm tiềm điều trị lớn đặc biệt điều trị vết thương vết bỏng, vết thương mạn tính lâu liền Tế bào gốc (stem cells) tế bào chưa có chức chuyên biệt biệt hóa thành số loại tế bào khác Tế bào gốc nghiên cứu ứng dụng điều trị cho số bệnh thoái hoá khớp, chấn thương tế bào, chấn thương tuỷ sống, tổn thương mô bệnh tiểu đường, bỏng nhiều bệnh khác Trong đó, tế bào gốc biểu mơ biệt hóa thành tế bào biểu mơ, tế bào tham gia vào q trình liền vết thương di cư đến vùng tổn thương để thực nhiều khâu pha tăng sinh trình liền vết thương, chúng bao quanh thể da, mặt cấu trúc rỗng ruột, đường hô hấp Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) ghi nhận liệu pháp tiên tiến việc phục hồi chấn thương cấp tính mạn tính, sử dụng điều trị, sửa chữa, tái tạo mô thể thông qua nhiều chế khác Đã có nhiều nghiên cứu ứng dụng huyết tương giàu tiểu cầu, phát nuôi cấy tê bào có mặt huyết tương giàu tiểu SVTH: Nguyễn Văn Cường Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung cầu nồng độ nhân tố tăng trưởng cytokine cao nhiều lần so với q trình ni cấy thơng thường Điều cho thấy huyết tương giàu tiểu cầu có khả kích thích tái tạo mơ lành hóa vết thương Nguyên bào sợi (fibroblasts) tế bào tham gia vào trình làm lành vết thương, chúng tạo thành phần đệm gian bào làm cho q trình biểu mơ hố để tế bào biểu mơ bám trượt giúp tăng nhanh q trình biểu mơ hố che phủ vết thương Trong q trình sinh trưởng phát triển nguyên bào sợi tiết môi trường thành phần ngoại tiết TGF-β1, PDGF,KGF, protein chất gồm collagen, fibronectin hyaluronan thúc đẩy liền vết thương in vitro thực nghiệm [6] Nhờ đặc điểm này, nguyên bào sợi sản phẩm nguyên bào sợi nghiên cứu ứng dụng điều trị số vết thương mạn tính lâu liền Sự tăng sinh di cư tế bào tượng có lợi việc điều trị vết thương làm lành da, việc nghiên cứu tác động yếu tố PRP, dịch chiết nguyên bào sợi tới tế bào gốc biểu mô loại tế bào nằm da biệt hóa thành tế bào tạo nên cấu trúc da trình liền vết thương cho ta định hướng rõ rệt việc ứng dụng chế phẩm để điều trị vết thương Xuất phát từ sở khoa học tiềm ứng dụng tế bào, tiến hành nghiên cứu:“Nghiên cứu đánh giá huyết tương giàu tiểu cầu, dịch chiết nguyên bào sợi đến khả tăng sinh di cư tế bào gốc biểu mô màng ối” với mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu: 1: Ni cấy tăng sinh dịng TBG biểu mô từ màng ối 2: Đánh giá tác dụng huyết tương giàu tiểu cầu, dịch chiết nguyên bào sợi đến khả tăng sinh liền vết thương in vitro TBG biểu mô màng ối SVTH: Nguyễn Văn Cường Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Bảng 3.7: Bảng giá trị trung bình số lượng TBG màng ối tiếp xúc với dịch chiết tỷ lệ pha loãng khác (n=8) 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Tỷ lệ pha loãng (50%) (25%) Số lượng tế bào 6,83 5,63 4,88 4,45 4,01 3,33 (n=8) (x106tb/ml) ±1,01 ±0,70 ±0,64 ±0,69 ±0,68 ±0,60 ĐC (n=8) 3,03 3,06 3,10 2,94 3,03 3,15 (x106tb/ml) ±0,06 ±0,63 ±0,30 ±0,57 ±0,72 ±0,26 (12.5%) (6.25%) (3.12%) (1.56%) Biểu đồ 3.6: Số lượng trung bình TBG màng ối tiếp xúc với dịch chiết nguyên bào sợi tỷ lệ pha lỗng khác (n=8) Tế bào ni cấy đĩa ban đầu 2,6x106 tế bào/ml, 48 sau nuôi cấy đĩa 96 giếng kết cho thấy tất mẫu tế bào có bổ sung dịch chiết tỷ lệ pha lỗng khác có khả kích thích TBG tăng sinh: Ở giếng có nồng độ dịch chiết cao (ở tỷ lệ 1/2 - 50% dịch chiết) cho kết tăng sinh mạnh Ở tỷ lệ Dịch chiết 1/64 (1,56% Dịch chiết) mẫu Dịch chiết 2, Dịch chiết 4, Dịch chiết Dịch chiết kết có tế bào tăng sinh kết khơng cao mẫu đối chứng - nuôi điều kiện môi trường nuôi cấy thông thường không bổ sung Dịch chiết So sánh kết số lượng tế bào trung bình mẫu Dịch chiết, kết cho SVTH: Nguyễn Văn Cường 42 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung thấy tỷ lệ Dịch chiết từ 1/2 đến 1/64 cao so với đối chứng (bảng 3.7 biều đồ 3.6) Từ kết cho thấy nuôi cấy TBG biểu mơ màng ối có bổ sung dịch chiết cho kết tế bào tăng sinh tốt so với điều kiện nuôi cấy thông thường, nuôi cấy TBG biểu mơ màng ối có bổ sung dịch chiết nguyên bào sợi nồng độ khác không làm thay đổi hình thái TBG biểu mơ so với môi trường nuôi cấy thông thường (không bổ sung FBS) Tốc độ tăng sinh TBG giảm dần theo tỷ lệ pha loãng từ 1/2 lần đến 1/64 lần, nhiên cao so với mẫu đối chứng môi trường không bổ sung dịch chiết 3.3.2 Kết đo phản ứng MTT đánh giá tác dụng dịch chiết nguyên bào sợi đến khả tăng sinh TBG biểu mô màng ối Sau 48 nuôi cấy TBG màng ối có bổ sung dịch chiết nguyên bào sợi Tiến hành đo mật độ quang lượng tinh thể formazan tạo thành sau tiếp xúc Kết thể thơng qua hình 3.5, biểu đồ 3.7 bảng 3.8 đây: Hình 3.5: Hình ảnh TBG biểu mô màng ối tạo tinh thể Formazan sau bổ sung MTT (n=8) (DC: mẫu đối chứng – Mẫu TBG màng ối ni cấy bình thường, Dịch chiết 1,2,3: mẫu TBG nuôi cấy bổ sung Dịch chiết nguyên bào sợi (100X) SVTH: Nguyễn Văn Cường 43 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Bảng 3.8: Kết phản ứng MTT tế bào tiếp xúc Dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) Dịch Dịch Dịch DỊch Dịch Dịch Dịch Dịch Tỷ lệ chiết chiết chiết chiết chiết chiết chiết chiết ĐC pha (OD) loãng (OD) (OD) (OD) (OD) (OD) (OD) (OD) (OD) 1/2 0,146 0,123 0,123 0,123 0,103 0,184 0,148 0,173 0,065 1/4 0,116 0,096 0,116 0,121 0,101 0,145 0,116 0,131 0,065 1/8 0,100 0,089 0,107 0,095 0,094 0,131 0,102 0,109 0,066 1/16 0,091 0,090 0,101 0,083 0,088 0,122 0,093 0,100 0,061 1/32 0,081 0,089 0,096 0,075 0,070 0,110 0,083 0,069 0,061 1/64 0,065 0,078 0,067 0,060 0,058 0,089 0,066 0,060 0,061 SVTH: Nguyễn Văn Cường 44 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Biểu đồ 3.7:Kết đo OD phản ứng MTT mẫu TBG màng ối sau 48 tiếp xúc dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) (DC; mẫu đối chứng; Dịch chiết: mẫu tế bào có bổ sung Dịch chiết nguyên bào sợi) SVTH: Nguyễn Văn Cường 45 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Bảng 3.9: Bảng giá trị OD trung bình phản ứng MTT mẫu tế bào sau 48 tiếp xúc với Dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) Tỷ lệ pha 1/2 1/4 1/8 1/16 loãng (50%) (25%) (12.5%) (6.25%) 0,140 0,118 0,104 0,096 0,084 0,068 ±0,028 ±0,016 ±0,013 ±0,012 ±0,014 ±0,010 ĐC (OD) 0,065 0,065 0,066 0,061 0,061 0,061 (n=8) ±0,011 ±0,011 ±0,011 ±0,010 ±0,010 ±0,010 Giá trị OD trung bình (n=8) 1/32 1/64 (3.12%) (1.56%) Biểu đồ 3.8: Giá trị kết đo OD trung bình phản ứng MTT TBG màng ối sau 48 tiếp xúc với Dịch chiết nguyên bào sợi (N=8) Kết cho thấy TBG màng ối môi trường nuôi cấy có dịch chiết nguyên bào sợi có tăng mật độ tế bào so với số lượng cấy ban đầu mật độ tế bào quan sát nhiều so với nhóm chứng (hình 3.5), hay mơi trường ni cấy có dịch chiết ngun bào sợi, TBG màng ối có phân chia, tăng sinh Sự tăng mật độ phụ thuộc vào nồng độ pha loãng dịch chiết Ở nồng độ cao (tỷ lệ pha loãng 1/2, 1/4), mật độ tế bào dày đặc hơn, đo hệ số OD phản ứng MTT cao nhóm chứng (bảng 3.8 bảng 3.9) Như vậy, quan sát mật độ TBG thông qua khả tạo SVTH: Nguyễn Văn Cường 46 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung formazan, đo hệ số OD phản ứng tạo mầu forrmazan nhận thấy dịch chiết nguyên bào sợi có tác dụng kích thích khả tăng sinh TBG màng ối 3.4 Kết so sánh đánh giá tác dụng PRP dịch chiết nguyên bào sợi TBG màng ối Để so sánh tác dụng PRP dịch nguyên bào sợi, tế bào nuôi cấy đĩa ban đầu có số lượng tương đồng 2,6x106 tế bào/ml, sau 48 nuôi cấy đĩa 96 giếng tiến hành bổ sung MTT đọc kết Kết đánh giá dựa số lượng tế bào kết đo giá trị OD phản ứng MTT Biểu đồ 3.9: Giá trị trung bình số lượng tế bào sau tiếp xúc với PRP dịch nuôi cấy Bảng 3.10: Bảng giá trị trung bình số lượng TBG màng ối tiếp xúc với mẫu PRP mẫu dịch chiết tỷ lệ pha loãng khác 1/2 1/4 (50%) (25%) Giá trị OD trung 8.21 7,44 6.51 5.29 4.08 3.38 bình (PRP) ±1,03 ±0,76 ±0,58 ±0,45 ±0,33 ±0,62 Giá trị OD trung 6.83 5.63 4.88 4.45 4.01 3.33 bình (Dịch chiết) ±1.01 ±0,70 ±0,64 ±0,69 ±0,68 ±0,60 3.03 3.06 3.1 2.94 3.03 3.05 ±0,06 ±0,63 ±0,30 ±0,57 ±0,72 ±0,26 Tỷ lệ pha loãng ĐC (OD) SVTH: Nguyễn Văn Cường 1/8 1/16 1/32 (12.5%) (6.25%) (3.12%) 47 1/64 (1.56%) Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Kết cho thấy tất mẫu tế bào có bổ sung PRP Dịch chiết tỷ lệ pha lỗng khác có khả kích thích TBG tăng sinh: Ở giếng có nồng độ PRP Dịch chiết cao (ở tỷ lệ 1/2 - 50% Dịch chiết) cho kết tăng sinh mạnh Dựa vào biểu đồ 3.9 bảng 3.10 kết giá trị trung số lượng tế bào sau tiếp xúc PRP dịch nuôi cấy ta thấy số lượng tế bào sau tiếp xúc PRP Dịch chiết giảm từ nồng độ cao xuống nồng độ tấp nhiên cao so với đối chứng Biểu đồ 3.10: Giá trị kết đo OD trung bình phản ứng MTT mẫu tế bào sau 48 tiếp xúc với PRP Dịch chiết nguyên bào sợi Bảng 3.11: Kết giá trị OD trung bình phản ứng MTT TBG àng ối sau tiếp xúc PRP dịch nuôi cấy Mẫu PRP (OD) Dịch chiết (OD) ĐC (OD) 1/2 1/4 (50%) (25%) 0,174 0,133 0,099 0,081 0,069 0,062 ±0,010 ±0,011 ±0,013 ±0,008 ±0,007 ±0,006 0,140 0,118 0,104 0,096 0,084 0,068 ±0,028 ±0,016 ±0,013 ±0,012 ±0,014 ±0,010 0,065 0,065 0,066 0,061 0,061 0,061 ±0,011 ±0,011 ±0,011 ±0,010 ±0,010 ±0,010 SVTH: Nguyễn Văn Cường 1/8 1/16 1/32 1/64 (12.5%) (6.25%) (3.12%) (1.56%) 48 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung Khi so sánh kết giá trị trung bình kết MTT tế bào sau tiếp xúc PRP Dịch chiết nguyên bào sợi ta thấy số đo OD PRP Dịch chiết giảm từ nồng độ cao xuống nồng độ thấp cao so với đối chứng Chỉ số đo cao PRP có nồng độ cao 1/2 (0,174±0,010) cao so với số đo Dịch chiết có nồng độ cao 1/2 (0,140±0,028) Tại nồng độ cao PRP (1/2 1/4 ) cho số đo OD cao so với nồng độ cao dịch chiết nguyên bào sợi (1/2 1/4) nồng độ lại PRP (1/8, 1/16, 1/32, 1/64) lại cho số đo OD thấp nồng độ tương ứng dịch chiết nguyên bào sợi, nhiên cao so với đối chứng (Biểu đồ 3.10 Bảng 3.11) Điều chứng tỏ PRP nồng độ cao cho kết tăng sinh tế bào tốt so với dịch chiết nguyên bào sợi Sự tăng sinh di cư tế bào tượng có lợi việc điều trị vết thương làm lành da Do đó, việc nghiên cứu tác động yếu tố tới TBG biểu mô loại tế bào nằm da biệt hóa thành tế bào tạo nên cấu trúc da trình liền vết thương cho ta định hướng rõ rệt việc ứng dụng chế phẩm để điều trị vết thương Trong nghiên cứu để làm sáng tỏ ảnh hưởng PRP dịch chiết nguyên bào sợi tới liền vết thương, thử nghiệm đánh giá tác động tế bào thơng qua yếu tố Kết nghiên cứu, sau 24 nuôi cấy tế bào có khả bám dính bề mặt dụng cụ ni cấy Các mẫu tế bào sau thay môi trường 2-3 lần tuần vịng 10-15 ngày hầu hết mẫu tế bào đạt 80-90% độ che phủ thu hoạch quy trình sử dụng trypsin Khi quan sát kính hiển vi tế bào có hình dáng TBG biểu mô màng ối Quan sát từ thí nghiệm, chúng tơi thấy số lượng tế bào tăng sinh tốt, khả sống tế bào sau phân lập lớn tế bào với mảnh vỡ mô, chúng loại bỏ việc thay môi trường nuôi cấy sau 24-48 giờ, đạt mật độ che phủ 70-80% sau 12 ngày nuôi cấy Thơng qua nhuộm xanh trypan, chúng tơi thấy hình ảnh đặc chưng TBG biểu mô SVTH: Nguyễn Văn Cường 49 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung màng ối có hình sao, bào tương trải rộng nhiều nhánh, nhân tế bào có hình trịn hình trứng, ranh giới bờ nhân rõ rệt, bắt màu đậm MTT ([3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide ]) loại tetrazole có màu vàng Trong tế bào sống MTT chuyển hóa thành tinh thể Formazan màu tím tác dụng enzym sucinate dehydrogenase ty thể Số lượng tế bào lớn tạo lượng formazan nhiều, giá trị OD dung dịch formazan cao Nhìn chung kết chúng tơi cho hình ảnh formazan có màu tím đặc chưng rõ rệt, quan sát kính hiển vi thấy có dõ rệt số lượng tinh thể tạo ra, số đo OD PRP dịch chiết nguyên bào sợi giảm từ nồng độ cao đến nồng độ thấp nhiên số OD mẫu bổ sung PRP cao so với dịch chiết, nên PRP có tác dụng kích thích tăng sinh tế bào mạnh so với dịch chiết Cũng có số cơng trình nghiên cứu đánh giá tác dụng PRP cơng trình nghiên cứu Nguyễn Ngọc Tuấn, Nguyễn Thị Bích Phượng cộng Viện Bỏng Quốc gia phối hợp với Trung tâm Nghiên cứu y Dược học Quân sự, Học viện Quân y đánh giá tác dụng PRP đến khả tăng sinh di cư tế bào Tuy nhiên nghiên cứu tác giả đánh giá dòng tế bào khác, nguyên bào sợi Kết nghiên cứu tương đồng với kết nghiên cứu tác giả Kết nuôi cấy TBG biểu mơ màng ối có bổ sung huyết tương giàu tiểu cầu nồng độ khác không làm thay đổi hình thái TBG so với mơi trường ni cấy thông thường Tốc độ tăng sinh TBG biểu mô màng ối cao, giảm dần theo tỷ lệ pha loãng từ 1/2 lần đến 1/64 lần, nhiên cao so với điều kiện môi trường không bổ sung PRP cao tỷ lệ pha loãng 1/2 Các vết thương in vitro môi trường bổ sung PRP tỷ lệ pha loãng 1/4 lần (tỷ lệ 25%) có tế bào lan nhiên diện tích che phủ chưa cao Huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) chứa hỗn hợp yếu tố tăng trưởng nhiều tác giả chứng minh có hiệu vết thương mạn tính Đánh giá ảnh hưởng huyết tương giàu tiểu cầu tới TBG biểu mô màng ối nuôi cấy sở cho phép tiến hành nghiên cứu bệnh nhân Đây kết tích cực cơng nghệ cấy ghép tế bào có nhiều tiềm ứng dụng điều trị lâm sàng SVTH: Nguyễn Văn Cường 50 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung KẾT LUẬN Đã nuôi cấy tăng sinh dịng TBG biểu mơ từ màng ối - Các mẫu TBG màng ối sau giải đông nuôi cấy mơi trường DMEM có bổ sung thêm 10% FBS, 1% kháng sinh điều kiện 37oC, 5% CO2 - Tế bào có khả bám dính bề mặt đĩa nuôi cấy sau 24 Thời gian nuôi cấy tăng sinh đạt mật độ 60-80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy sau 12 ngày - Tế bào có dạng hình đa giác đặc trưng TBG biểu mô màng ối Đã đánh giá tác dụng huyết tương giàu tiểu cầu, Dịch chiết từ nguyên bào sợi đến khả tăng sinh liền vết thương in vitro TBG biểu mô màng ối - Các mẫu có bổ sung PRP kích thích TBG từ màng ối tăng sinh di cư: + Ở nhóm bổ sung PRP, tế bào tăng sinh mạnh, mật độ tế bào cao tỷ lệ pha loãng từ 1/2 đến 1/16 Ở tỷ lệ pha loãng 1/32 1/64 tốc độ tăng sinh TBG có xu hướng giảm dần cao so với nhóm chứng + Ở tỷ lệ 25% (tỷ lệ pha loãng 1/4) Các mẫu bổ sung PRP kích thích TBG màng ối di cư tốt so với nhóm chứng sau ngày ni cấy - Các mẫu có bổ sung dịch chiết nguyên bào sợi kích thích TBG từ màng ối tăng sinh: tế bào tăng sinh mạnh, mật độ tế bào cao tỷ lệ pha loãng từ 1/2 đến 1/16 Ở tỷ lệ pha loãng 1/32 1/64 tốc độ tăng sinh TBG có xu hướng giảm dần cao so với nhóm chứng SVTH: Nguyễn Văn Cường 51 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung KIẾN NGHỊ Mặc dù cố gắng dành thời gian tìm hiểu vấn đề thời gian điều kiện có hạn lĩnh vực y học tái tạo lĩnh vực cịn q Vì mong muốn thân tơi có điều kiện xin tiếp tục tìm hiểu nghiên cứu: Tiếp tục nghiên cứu đánh giá khả liền vết thương invitro với số lượng mẫu lớn Nghiên cứu thành phần yếu tố kích thích tăng sinh tế bào PRP dịch chiết nguyên bào sợi SVTH: Nguyễn Văn Cường 52 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Đinh Văn Hân, Trần Ngọc Diệp, Nguyễn Tiến Dũng (2013) “Đánh giá tác dụng dung dịch chiết nguyên bào sợi da nuôi cấy điều trị vết thương mạn tính” Tạp chí y học thảm hoạ & Bỏng Số 2, tr: 47 – 54 Vũ Thị Tuệ Khanh (2010) Phẩu thuật ghép màng ối nhãn khoa Tạp chí nghiên cứu y học Việt Nam Số 67 (2): 331-339 Nguyễn Viết Lượng (2009) “Tình hình bỏng Việt Nam năm 20052007” Tạp chí y học thảm hoạ & bỏng Số 1, tr 26 Phan Kim Ngọc CS (2009) “Tạo vật liệu sinh học màng ối người phục vụ công nghệ tế bào động vật trị liệu” Đỗ Minh Trung, Phạm Văn Trân, Nguyễn Bảo Trân, Trần Hải Anh, Toshiko Yoshida, Toshio Nikaido (2012) Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy nhận biết TBG từ màng ối người Tạp chí Sinh ly học Việt Nam Số 16(1), tr: 36-41 Chu Anh Tuấn cộng (2012) “Nghiên cứu xác định thành phần dịch chiết ngoại bào nguyên bào sợi nuôi cấy từ da người” Tạp chí y học thảm họa Bỏng Số 4,tr.32-7 Nguyễn Xuân Trường (2005).“Ứng dụng phương pháp ghép màng ối đông khô điều trị loét giác mạc sâu khó lành” Tạp chí Y học TP.HCM Tập 9, phụ 1; 43-47 Tài liệu tiếng anh AL-Bayati A.H, R.N Al-Asadi, Mahdi A.L Al-Falahi N.H (2013) “Effects of Autologous Platelets Rich Plasma on Full-thickness Cutaneous Wounds Healing in Goats” Atiyeh B.S cộng (2007) “Cultured epithelial autograft (CEA) in burn treatment: three decades later” Burns 33 (4): 405-414 10 Beck LS, De Guzman L, Lee WP, Yvette XU, Siegel MW, Amento EP (1993) “One systemic administration of transforming growth factor-beta SVTH: Nguyễn Văn Cường 53 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung reverses age or glucocorticoid-impaired wound healing” J Clin Invest 92:2841–9 11 Bikfalvi A, Klein.S, Pintucci.G, Rifkin D.B (1997) Biological roles of fibroblast growth factor-2 Endocrine Reviews 18: 26-45 12 Boswell SG, Cole BJ, Sundman EA, Karas V, Fortier LA (2012): “PlateletRich plasma: a milieu of bioactive factors” Arthroscopy.28(3):429-439 13 Cecdric Blanpain , 1, Valerie Horsley , and Elaine Fuchs (2007) “Epithelial Stem Cells: Turning over New Leaves”.Cell Feb 9;128(3):445–458 14 De Vos RJ, Weir A, van Schie HT, Bierma-Zeinstra SM, Verhaar JA, Weinans H., and Tol JL (Jan 13, 2010) “Platelet-rich plasma injection for chronic Achilles tendinopathy: a randomized controlled trial” JAMA 303(2): 144-149 15 Dieudonne SC, Foo P, van Zoeken EJ, Burger EH (1991) “Inhibiting and stimulating effects of TGF-1 on osteoclastic bone resorption in fetal mouse bone organ cultures” J Bone Miner Res.6:479–87 16 Donna Alderman, DO (2010) “The New Age of Prolotherapy” 17 Ferrari M, Zia S, Valbonesi M cộng (1987) “A new technique for hemodi-lution, preparation of autologous platelet-rich plasma and intraoperative blood salvage in cardiac surgery” Int J Artif Org.10:47–50, 18 Goldring M.B (2000) “The role of the chondrocyte in osteoarthritis” ArthritisRheum, 43 (9), 1916-1926 19 Hajdu SI (1980) : “The Paradox of Sarcomas” Acta Cytol 24:373-383, 1980 20 Jamie Textor (2014) “Plate-Rich Plasma (PRP) as a Therapeutic Agent“ Platelet Biology Growth Factors and a Review of the Literrature 21 Josef Neumuller A.E, Thomas Wagner (2015) “Transmission Electron Microscopy of Platelets FROM Apheresis and Buffy-Coat-Derived Platelet Concentrates, The Transmission Electron Microscope” Theory and Applications, Dr Khan Maaz (Ed.) 22 Kon E, Buda R, Filardo G, cộng (2010) “Platelet-rich plasma : Intra articular knee injections produced favorable results on degenerative cartilage lesions Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc“.18:472-479 SVTH: Nguyễn Văn Cường 54 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung 23 Marck RE, Middelkoop E, Breederveld RS (2014) “Considerations on the use of platelet-rich plasma, specifically for burn treatment”.J Burn Care Res 35(3):219-27 24 Mishra, A and Pavelko T (2006) “Treatment of chronic elbow tendonosis with buffered platelet-rich plasma” American Journal of Sports Medicine 34(11): 1774-1778 25 Mohan S, Baylink DJ Bone (1991) “growth factors Clin Orthop Rel Res” ;263:30–43 26 O.B Mai, J.P Thiery, J Jouanneau (2000) “Molecules in focus Fibroblast growth factor2” The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 32, 263 – 267 27 Oz MC, Jeevanandam V, Smith CR, cộng (1992) “Autologous fibrin glue from intraoperatively collected platelet-rich plasma”.Ann Thorac Surg.53:530-1 28 Pencho Kossev Tsvetan Sokolov (2015) “Platelet-rich Plasm (PRP) in Orthopedics and Traumatology” 29 Pietrzak W.S and B L Eppley (2005) “Platelet rich plasma: biology and new technology”.J Craniofac Surg, 16 (6), 1043-1054 30 P.Rozman and Z.Bolta (2007) “Use of plate growth factor in treating wound and soft-tissue injuries” 31 Peter A.M Everts, EKP, ECCP (2006 Jun) “Platelet-Rich Plasma and Platelet Gel: A Review” J Extra Corpor Technol 38(2): 174–187 32 Pro Finn Gottrup, Denmark (2015) “Clinical wound Assessment” 33 Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, cộng (2004) “Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells”, Circulation, 109, 1292-8 34 Sampson S, M Gerhardt and B Mandelbaum (2008) “Platelet rich plasma injection grafts for musculoskeletal injuries: a review” Curr Rev Musculoskelet Med, (3-4), 165-174 SVTH: Nguyễn Văn Cường 55 Lớp 13.01 Khóa luận tốt nghiệp GVHD: TS Đỗ Minh Trung 35 Scarpone M cộng (2013) “PRP as a treatment alternative for symptomatic rotator cuff tendinopathy for patients failing convervative treatments” Techniques in Orthopaedics 22(1): 26-33 36 Tawes RL, Sydorak GR, DuVall TB Autologous fibrin glue (1994) “The last step in operative hemostasis” Am J Surg 168:120–2 37 Weissman IL (2000) “Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution” Cell 100: 157-168 38 Yavuz Kececi, MD;Sibel Ozsu, MD; Oktay Bilgir, MD (2014) “A CostEffective Method for Obtaining Standard Platelet-Rich Plasma” SVTH: Nguyễn Văn Cường 56 Lớp 13.01 ... 7,9 2 1 0,1 0 8,7 1 9,2 0 7,0 5 7,5 0 7,5 9 7,5 9 3,0 3 1/4 7,5 0 7,7 0 8,2 5 8,7 0 6,4 5 7,1 0 6,8 9 6,8 9 3,0 6 1/8 6,7 5 6,6 0 7,5 0 6,7 5 6,0 1 6,3 9 6,5 5 5,5 2 3,1 0 1/16 5,5 0 4,4 0 5,5 5 5,5 5 4,9 5 5,2 1 5,8 6 5,2 7 2,9 4... 6,7 5 5,7 5 5,7 5 7,1 8 5,9 9 8,6 0 6,8 9 7,7 4 3,0 3 1/4 5,5 0 4,7 5 5,6 0 5,7 5 4,8 0 6,8 9 5,5 2 6,2 0 3,0 6 1/8 4,7 3 4,6 1 5,0 0 4,5 0 4,0 0 6,2 0 4,8 3 5,1 7 3,1 0 1/16 4,4 0 3,7 5 4,5 6 4,0 0 3,7 5 5,8 6 4,4 9 4,8 3 2,9 4... dụng tế bào, tiến hành nghiên cứu: ? ?Nghiên cứu đánh giá huyết tương giàu tiểu cầu, dịch chiết nguyên bào sợi đến khả tăng sinh di cư tế bào gốc biểu mô màng ối? ?? với mục tiêu sau: Mục tiêu nghiên cứu: