Nghiên cứu đánh giá huyết tương giàu tiểu cầu , dịch chiết nguyên bào sợi đến khả năng tăng sinh và di cư của tế bào gốc biểu mô màng ối

Những nghiên cứu gần đây cho thấy ứng dụng tế bào như tế bào gốc, nguyên bào sợi, các sản phẩm từ tế bào và huyết tương giàu tiểu cầu có nhiều ưu điểm và tiềm năng điều trị rất lớn đặc b

BÀO GỐC BIỂU MÔ MÀNG ỐI

Giáo viên hướng dẫn : TS Đỗ Minh Trung Sinh viên thực hiện : Nguyễn Văn Cường

Trước tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới

TS Đỗ Minh Trung đã tận tâm, nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn cũng như động viên, cổ vũ tinh thần cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Viện Đại Học Mở Hà Nội- Khoa công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa học

Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến những thầy cô giáo đã giảng dạy

em trong những năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị tại Lab Nghiên cứu TBG, Trung tâm Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y đã quan tâm,

hỗ trợ, tạo điều kiện để em thực hiện đề tài.

Cuối cùng, xin được gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và tất cả những người thân yêu đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong quá trình học tập để em hoàn thành bản luận văn này!

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2017

Học viên

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Huyết tương giàu tiểu cầu 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Cấu tạo và chức năng của tiểu cầu 4

1.1.2.1 Đặc điểm và chức năng của tiểu cầu 4

1.1.2.2 Tiểu cầu trong quá trình làm lành vết thương 6

1.1.3 Ứng dụng của PRP trong điều trị 9

1.2 Nguyên bào sợi và vai trò của nguyên bào sợi trong liền vết thương 11 1.3 Tế bào gốc và tế bào gốc màng ối 13

1.3.1 Tế bào gốc 13

1.3.2 Tế bào gốc từ màng ối 16

1.3.3 Ứng dụng của TBG màng ối 19

PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.1 Đối tương nghiên cứu: 21

2.1.2.Hóa chất, dụng cụ, vật tư tiêu hao và thiết bị nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.2 Bảo quản tế bào 23

2.2.3 Giải đông tế bào 23

2.2.4 Xác định mật độ tế bào 23

2.2.5 Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu 24

2.2.6 Nuôi cấy và chuẩn bị dịch chiết nguyên bào sợi 24

màng ối 24

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả nuôi cấy tăng sinh TBG biểu mô màng ối 27

3.2 Kết quả đánh giá tác dụng của PRP trên TBG biểu mô màng ối 29

3.2.1 Kết quả đánh giá tác dụng của PRP đến khả năng sinh thông qua số lượng TBG màng ối 29

3.2.2 Kết quả đo phản ứng MTT đánh giá tác dụng của PRP đến khả năng tăng sinh của TBG màng ối 33

3.2.3 Kết quả đánh giá tác dụng của PRP đến khả năng di cư của TBG biểu mô màng ối trên vết thương in vitro 37

3.3 Kết quả đánh giá tác dụng dịch chiết nguyên bào sợi trên TBG biểu mô màng ối 40

3.3.1 Kết quả đánh giá tác dụng của dịch chiết nguyên bào sợi đến khả năng sinh thông qua số lượng TBG màng ối 40

3.3.2 Kết quả đo phản ứng MTT đánh giá tác dụng của dịch chiết nguyên bào sợi đến khả năng tăng sinh của TBG biểu mô màng ối 43

3.4 Kết quả so sánh đánh giá tác dụng của PRP và dịch chiết nguyên bào sợi trên TBG màng ối 47

KẾT LUẬN 51

KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

BMNC Bề mặt nhãn cầu

ECGF Epithelial Cell Growth Factor

Yếu tố tăng trưởng tế bào biểu mô

Yếu tố tăng trưởng biểu bì FBS Fetal bovine serum (Huyết thanh bào thai bò)

FGF-2 Fibroblast Growth Factor-2

Yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi-2 PBS Phosphate buffered saline (Dung dịch đệm photphat) PDAF Platelet-Derived Angiogenesis Factor

Yếu tố tăng sinh mạch nguồn gốc tiểu cầu PDEGF Platelet-Derivedendothelial Growth Factor

Yếu tố tăng trưởng nội mô nguồn gốc tiểu cầu PDGF Platelet-derived growth factor

PF 4 Platelet factor 4 (Yếu tố 4 tiểu cầu)

PRP Platelet Rich Plasma (Huyết tương giàu tiểu cầu)

Yếu tố tăng trưởng giống Insulin

Yếu tố tăng trưởng keratinocyte MTT [3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide]

TGF-β Transforming growth factorbeta

VEGF Vascular endothelial growth factor

Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu

Bảng 3.1: Số lượng tế bào sau 48 giờ tiếp xúc PRP (n=8) 29Bảng 3.2: Số lượng trung bình TBG màng ối tiếp xúc với PRP ở các tỷ lệ pha loãng khác nhau (n=8) 31Bảng 3.3: Kết quả phản ứng MTT của tế bào tiếp xúc PRP (n=8) 34Bảng 3.4: Bảng giá trị OD trung bình phản ứng MTT của các mẫu tế bào sau

48 giờ nuôi cấy bổ sung với PRP (n=8) 36Bảng 3.5: Số lượng TBG màng ối ở các giếng nuôi cấy sau khi cho PRP tiếp xúc với các vết thương in vitro (n=3) 38Bảng 3.6: Số lượng TBG màng ối sau 48 giờ nuôi cấy bổ sung với dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) 40Bảng 3.7: Bảng giá trị trung bình số lượng TBG màng ối tiếp xúc với dịch chiết ở các tỷ lệ pha loãng khác nhau (n=8) 42Bảng 3.8: Kết quả phản ứng MTT của tế bào tiếp xúc Dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) 44Bảng 3.9: Bảng giá trị OD trung bình phản ứng MTT của các mẫu tế bào sau

48 giờ tiếp xúc với Dịch chiết nguyên bào sợi (n=8) 46Bảng 3.10: Bảng giá trị trung bình số lượng TBG màng ối tiếp xúc với 8 mẫu PRP và 8 mẫu dịch chiết ở các tỷ lệ pha loãng khác nhau 47Bảng 3.11: Kết quả giá trị OD trung bình của phản ứng MTT của TBG àng ối sau khi tiếp xúc PRP và dịch nuôi cấy 48

Hình 1.1: Tỷ lệ tế bào trong máu và huyết tương giàu tiểu cầu 3

Hình 1.2: Cấu trúc tiếp cầu (Theo Neumuller) 5

Hình 1.3: Nguồ n gố c thu nhâ ̣n TBG và tiềm năng biê ̣t hóa của chúng tương ứng với các giai đoa ̣n phát triển của cơ thể 15

Hình 1.4: Bánh nhau và màng ối 17

Hình 2.1: Một số thiết bị trong nghiên cứu 22

Hình 3.1: Hình ảnh kết quả nuôi cấy tăng sinh TBG từ màng ối 27

Hình 3.2: Hình ảnh TBG Biểu mô màng ối sau khi nhuộm giemsa - 200X 28

Hình 3.3: Hình ảnh về mật độ TBG biểu mô màng ối tạo tinh thể formazan sau khi bổ sung MTT 33

Hình 3.4 Vết rạch khả năng di cư của TBG biểu mô màng ối 38

Hình 3.5: Hình ảnh TBG biểu mô màng ối tạo tinh thể Formazan sau khi bổ sung MTT 43

Biểu đồ 3.1: Kết quả số lượng TBG màng ối sau 48 giờ tiếp xúc PRP 30 Biểu đồ 3.2: Số lượng trung bình TBG màng ối tiếp xúc với 8 mẫu PRP ở các

tỷ lệ pha loãng khác nhau 31Biểu đồ 3 3: Kết quả đo OD của phản ứng MTT của các mẫu TBG màng ối sau 48 giờ nuôi cấy bổ sung PRP 35Biểu đồ 3.4: Biểu đồ kết quả đo OD trung bình phản ứng MTT của các mẫu tế bào sau 48 giờ tiếp xúc PRP 36Biểu đồ 3.5: Kết quả số lượng TBG màng ối sau 48 giờ nuôi cấy bổ sung với dịch chiết nguyên bào sợi 41Biểu đồ 3.6: Số lượng trung bình TBG màng ối tiếp xúc với dịch chiết nguyên bào sợi ở các tỷ lệ pha loãng khác nhau 42Biểu đồ 3.7:Kết quả đo OD của phản ứng MTT của các mẫu TBG màng ối sau 48 giờ tiếp xúc dịch chiết nguyên bào sợi 45Biểu đồ 3.8: Giá trị kết quả đo OD trung bình phản ứng MTT của TBG màng

ối sau 48 giờ tiếp xúc với dịch chiết nguyên bào sợi 46Biểu đồ 3.9: Giá trị trung bình số lượng tế bào sau khi tiếp xúc với PRP và dịch nuôi cấy 47Biểu đồ 3.10: Giá trị kết quả đo OD trung bình phản ứng MTT của các mẫu tế bào sau 48 giờ tiếp xúc với PRP và dịch chiết nguyên bào sợi 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Da là cơ quan lớn nhất của cơ thể, có vai trò bảo vệ cơ thể trước các tác động với môi trường xung quanh, trong khi đó các vết thương khó lành, vết thương mạn tính như loét bàn chân do đái tháo đường, loét tỳ đè, loét chi dưới

có xu hướng ngày càng gia tăng, làm ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống và gây nguy hiểm Cụ thể ở Mỹ với 260 triệu dân thì hàng năm có khoảng 6,5 triệu người mang các vết thương mạn tính Riêng tại Đức có khoảng 3 triệu người bị loét và chi phí điều trị lên tới hơn 1 tỷ Euro Ở Việt Nam hàng năm ước tính khoảng 791.000 người gặp tai nạn về bỏng [3] Có nhiều phương pháp điều trị nhưng chưa thực sự hiệu quả cao Những nghiên cứu gần đây cho thấy ứng dụng tế bào như tế bào gốc, nguyên bào sợi, các sản phẩm từ tế bào và huyết tương giàu tiểu cầu có nhiều ưu điểm và tiềm năng điều trị rất lớn đặc biệt trong điều trị vết thương vết bỏng, vết thương mạn tính và lâu liền

Tế bào gốc (stem cells) là tế bào chưa có chức năng chuyên biệt nhưng

có thể biệt hóa thành một số loại tế bào khác nhau Tế bào gốc đã được nghiên cứu và ứng dụng trong điều trị cho một số bệnh như thoái hoá khớp, chấn thương mất tế bào, chấn thương tuỷ sống, các tổn thương mô do bệnh tiểu đường, bỏng và nhiều bệnh khác Trong đó, tế bào gốc biểu mô có thể biệt hóa thành tế bào biểu mô, là tế bào tham gia vào quá trình liền vết thương

và có thể di cư đến vùng tổn thương để thực hiện nhiều khâu trong pha tăng sinh của quá trình liền vết thương, chúng bao quanh cơ thể như da, mặt trong các cấu trúc rỗng như ruột, đường hô hấp

Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma) được ghi nhận là liệu pháp tiên tiến trong việc phục hồi các chấn thương cấp tính và mạn tính, đã được sử dụng trong điều trị, sửa chữa, tái tạo mô trong cơ thể thông qua nhiều

cơ chế khác nhau Đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng của huyết tương giàu tiểu cầu, phát hiện khi nuôi cấy tê bào dưới sự có mặt huyết tương giàu tiểu

cầu thì nồng độ các nhân tố tăng trưởng và cytokine cao hơn nhiều lần so với quá trình nuôi cấy thông thường Điều này cho thấy huyết tương giàu tiểu cầu

có khả năng kích thích sự tái tạo mô và lành hóa vết thương

Nguyên bào sợi (fibroblasts) là một trong những tế bào tham gia vào quá trình làm lành vết thương, chúng tạo ra các thành phần đệm gian bào làm nền cho quá trình biểu mô hoá để tế bào biểu mô bám và trượt trên đó giúp tăng nhanh quá trình biểu mô hoá che phủ vết thương Trong quá trình sinh trưởng

và phát triển nguyên bào sợi tiết ra môi trường các thành phần ngoại tiết như TGF-β1, PDGF,KGF, và các protein chất nền gồm collagen, fibronectin và

hyaluronan thúc đẩy liền vết thương in vitro và trên thực nghiệm [6] Nhờ

những đặc điểm này, nguyên bào sợi và sản phẩm của nguyên bào sợi cũng đã được nghiên cứu ứng dụng trong điều trị một số vết thương mạn tính lâu liền

Sự tăng sinh và di cư của tế bào là hiện tượng có lợi trong việc điều trị vết thương làm lành da, việc nghiên cứu sự tác động của yếu tố nào đó như PRP, dịch chiết nguyên bào sợi tới tế bào gốc biểu mô là một loại tế bào nằm dưới da và biệt hóa thành các tế bào tạo nên cấu trúc của da trong quá trình liền vết thương sẽ cho ta định hướng rõ rệt hơn trong việc ứng dụng chế phẩm

đó để điều trị vết thương

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và tiềm năng ứng dụng của tế bào,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu:“Nghiên cứu đánh giá huyết tương giàu tiểu

cầu, dịch chiết nguyên bào sợi đến khả năng tăng sinh và di cư của tế bào gốc biểu mô màng ối” với các mục tiêu như sau:

Mục tiêu nghiên cứu:

1: Nuôi cấy tăng sinh dòng TBG biểu mô từ màng ối

2: Đánh giá tác dụng của huyết tương giàu tiểu cầu, dịch chiết nguyên bào sợi đến khả năng tăng sinh và liền vết thương in vitro của TBG biểu

mô màng ối

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Huyết tương giàu tiểu cầu

1.1.1 Định nghĩa

Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet rich plasma - PRP) là một chế phẩm được chiết xuất từ máu toàn phần Chế phẩm này bao gồm lượng huyết tương nhỏ nhưng có độ tập trung tiểu cầu cao Bình thường số lượng tiểu cầu trong máu khoảng từ 140,000 đến 400,000 tiểu cầu/μl máu (trung bình 200,000), trong khi đó số lượng tiều cầu trong PRP cao hơn gấp nhiều lần, từ 2- 8 lần,

so với mức trung bình [29,34]

Hình 1.1: Tỷ lệ tế bào trong máu và huyết tương giàu tiểu cầu

(a: tỷ lệ tế bào trong một cục máu đông; b: tỷ lệ tế bào trong PRP) [16]

Máu là một tổ chức được tạo thành từ chất dịch cơ bản và các yếu tố hữu hình Chất dịch cơ bản của máu được gọi là huyết tương (plasma), các thành phần cơ bản lơ lững trong huyết tương, gồm 3 loại chính là hồng cầu (erythrocytes); bạch cầu (leukocytes) và các tiểu cầu (platelets) Hồng cầu chiếm khoảng 94% thành phần tế bào trong máu, chúng có nhiệm vụ chính là vận chuyển và phân phối oxy cho cơ thể Bạch cầu chiếm khoảng 6% thành phần tế bào trong máu là một phần quan trọng của hệ miễn dịch có nhiệm vụ tiêu diệt các tác nhân gây nhiễm trùng và phát động đáp ứng miễn dịch của cơ

thể Tiểu cầu chiếm khoảng 1% thành phần máu, chịu trách nhiệm trong quá trình đông máu Tiểu cầu tham gia rất sớm vào việc hình thành nút tiểu cầu, bước khởi đầu hình thành cục máu đông trong chấn thương mạch máu

Sở dĩ cần một nồng độ lớn tiểu cầu trong PRP vì vai trò quan trọng và chủ yếu của tiểu cầu trong liệu pháp PRP Tiểu cầu là yếu tố độc đáo của máu, chức năng chính của chúng là khởi đầu quá trình cầm máu và chữa lành vết thương Do đó, tiềm năng của các ứng dụng yếu tố tăng trưởng tự thân PRP là rất lớn PRP chứa một nồng độ cao của tiểu cầu, có thể được kích hoạt giải phóng các yếu tố tăng trưởng để sử dụng điều trị Các thành phần nhân tố tăng trưởng tự nhiên được sản sinh trực tiếp từ tiểu cầu có khả năng kích thích

sự phát triển của các tế bào nội sinh thu hút đại thực bào, các mạch máu đơn nhân, các TBG trung mô, biểu mô tham gia tái tạo và phục hồi tổn thương Trong PRP cũng có một lượng nhỏ bạch cầu (Leukocyte) để tổng hợp interleukin như một phần đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu [32] Trong những nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học đã có cái nhìn mới về tiểu cầu, chúng kích thích sự di cư của tê bào, sự tăng sinh và hình thành mạch mới trong quá trình liền vết thương PRP đã được công bố là có tác dụng có lợi trên chữa lành vết thương trong các lĩnh vực khác nhau của phẫu thuật và trong điều trị cấp tính, mạn tính và các vết thương do bệnh tiểu đường [23]

Vì vậy tiềm năng ứng dụng của PRP trong y học tái tạo là rất lớn

1.1.2 Cấu tạo và chức năng của tiểu cầu

1.1.2.1 Đặc điểm và chức năng của tiểu cầu

Tiểu cầu là các tế bào nhỏ, hình đĩa hoặc elip, không có nhân, đường kính từ 1-4µm, là các mảnh vỡ tế bào không nhân ,thu được từ các phân mảnh mẫu tiểu cầu trong tủy xương thông qua sự vỡ tế bào có điều chỉnh (megakaryocytoe) [16,20] Tiểu cầu trú ngụ trong mạch máu và có nồng độ cao trong lách Chu kì vòng đời của tiều cầu từ 5-9 ngày trước khi bị đại thực bào của hệ thống dưới nội mô Tiểu cầu có chức năng chính là tham gia vào quá trình đông- cầm máu và khởi đầu quá trình làm lành vết thương Về cấu

tạo, bên trong tiểu cầu là một siêu cấu trúc phức tạp, chủ yếu gồm một hệ thống vi quản ở ngoại vi, hệ thống ống dày đặc, ti lạp thể, nhiều hạt (alpha , delta- δ, lambda- λ) và hệ thống các kênh mở

Vùng ngoại vi: là phần ở ngoài cùng, bao gồm kháng nguyên, glycoprotein và nhiều loại enzyme khác Vùng này kết nối với các tiểu cầu và các tế bào khác , trong mạch máu Lượng lớn protein huyết tương và các yếu

tố đông máu được gắn một cách chắc chắn với bề mặt này Bên trong màng là các protein ( hầu hết là glucoprotein và lượng nhỏ carbohydrate) Màng này bao gồm lớp phospholipid, cholesteron và glycolipid Glucoprotein có một số lượng thụ thể đặc hiệu cho các yếu tố đông máu như GPIb (thrombin receptor) và yếu tố Willerband von Phức bộ GOIIbIIIa được hình thành từ glycoprotein Iib và IIIa và hoạt động như một thụ cảm thể fibrinogen Sự bám dính tập trung tiểu cầu cùng bởi chính các glycoprotein này [30]

Hình 1.2: Cấu trúc tiếp cầu (Theo Neumuller) [21]

Vùng các vi cơ quan bao gồm các hạt α, bộ máy Golgi, hệ thống ống dày đặc và hệ thống kênh hở, lysosome và ty thể [20]

Các hạt α có số lượng lớn nhất trong tiểu cầu và hình thành trong quá trình trưởng thành của mẫu tiểu cầu, bao gồm hơn 300 loại protein khác nhau,[20], yếu tố phát triển và yếu tố đông máu, yếu tố viêm [28]

Hạt có đường kính khoảng 200- 500 nm, được bao quanh bởi một lớp

đó có thể kể đến các protein như yếu tố 4 tiểu cầu, yếu tố von Willebrand, fibrinogen, thrombospondin, protein S, yếu tố XIII… đóng vai trò chính trong

cơ chế cầm máu; sự cầm máu chính là giai đoạn đầu tiên trong quá trình liền vết thương Hạt α của các tiểu cầu chưa được được kích hoạt trong PRP, các yếu tố tăng trưởngsẽ không có chức năng, bởi vì chúng chưa được kích hoạt hoặc tiếp xúc với các mô Để giải phóng những yếu tố tăng trưởng, tiểu cầu phải được kích hoạt

Như vậy trong cơ thể tiểu cầu có chức năng chính là tham gia vào quá trình đông- cầm máu và khởi đầu quá trình làm lành vết thương

1.1.2.2 Tiểu cầu trong quá trình làm lành vết thương

Vết thương là sự phá vỡ chức năng bảo vệ của da, mất tính liên tục của biểu mô, làm lành vết thương là sự sửa chữa hoặc tái tạo khiếm khuyết trong một cơ quan hoặc mô, thường là da, làm lành vết thương là một cơ chế phức tạp bao gồm: đông máu, viêm, tổng hợp phức chất và chất nền, hình thành mạch mới, tăng sinh nguyên bào sợi, biểu mô hóa, co vết thương và tổ chức hóa Sự hình thành các mạch máu mới là điều thiết yếu để duy trì các mô hạt mới được thành lập Hình thành mạch là một quá trình phức tạp dựa trên chất nền ngoại bào trong nền vết thương cũng như di chuyển và kích thích phân bào của các tế bào nội mô[8] Diễn biến liền vết thương đều trải qua các giai đoạn đông máu, viêm, tăng sinh, tái lập mô và liền sẹo:

- Quá trình viêm: Khi máu thoát khỏi thành mạch bị tổn thương, tiểu cầu tham gia thực hiện chức năng cầm máu Lúc này tiểu cầu đã được hoạt hóa cùng với nhiều tế bào (TB) khác nhau và hạt α của tiểu cầu giải phóng các yếu tố tăng trưởng và các cytokine[22] Quá trình này hấp dẫn các TB di chuyển tập trung đến nơi tổn thương, tăng sinh, biệt hóa và tổng hợp các chất căn bản

- Giai đoạn tăng sinh: các mô hoại tử dần bị loại bỏ và được thay thế bởi

mô sống tương tự với mô trước khi bị tổn thương Giai đoạn tăng sinh của liền vết thương bắt đầu khoảng ngày thứ 2 đến 3 sau khi bị thương và được

báo hiệu bởi sợ vận chuyển đến nơi tổn thương của các nguyên bào sợi vào trong vết thương Các nguyên bào sợi di cư từ mép vết thương, mạng lưới fibrin được hình thành trong giai đoạn viêm Trong khoảng thời gian đầu sau khi bị thương, nguyên bào sợi được di chuyển bởi macrophage-derived buff, TGF-β và PDGF tới sinh sản và tổng hợp glucosaminoglycan và proteoglycans, các khối có sẵn để xây dựng phức hợp mô hạt ngoại bào mới

và collagen [12,38] Sự hình thành mạch máu mới bắt đầu ngày thứ 3 sau khi

bị thương, tiếp sau đó tổng hợp collagen ở ngày thứ 3 đến ngày thứ 5

- Giai đoạn sửa chữa, tái tạo tổ chức: mô mới được tái tạo sẽ thay đổi hình dạng và cấu trúc cho giống với mô gốc Tại đây mật độ các tế bào và mạch máu tăng lên, các TB sợi collagen, TB xương… tăng trưởng

Bình thường tiểu cầu không dính vào thành mạch (có thể do prostaglandin gây ức chế dính tiểu cầu) Khi thành mạch tổn thương thì lập tức tiểu cầu được hoạt hoá và dính vào nơi tổn thương, tiểu cầu còn có thể dính vào các bề mặt lạ như thuỷ tinh, lam kính Khi tiểu cầu được hoạt hóa

sẽ dẫn đến quá trình ly giải các hạt α của tiểu cầu, từ đó giải phóng ra nhiều loại protein có vai trò quan trọng đối với quá trình làm lành vết thương hay tổn thương [31, 32] Một số protein quan trọng:

- Platelet-derived growth factor (PDGF-αα, ββ, αβ): yếu tố tăng trưởng

có nguồn gốc từ tiểu cầu có tác dụng hóa ứng động đối với đại thực bào, thu hút đại thực bào tới nơi tổn thương; PDGF dường như là yếu tố tăng trưởng đầu tiên có mặt tại vết thương và bắt đầu làm lành các mô liên kết thông qua việc thúc đẩy các collagen và tổng hợp protein [31] PDGF được giải Phối hợp PDGF với TGF-β, IGF có tác dụng thúc đẩy tăng trưởng mạch máu, phân chia TB, hình thành da, chất căn bản xương, tổng hợp collagen

- Transforming growth-factor-beta (TGF-β: β1, β2): yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta có tác dụng thúc đẩy các TB gốc nguồn gốc trung mô (sụn, xương, cơ, sợi….) và các nguyên bào xương… phân bào; thúc đẩy quá trình

TGF-β còn phối hợp với IGF-1 và BMPs tham gia vào quá trình tổng hợp chất căn bản của sụn khớp [18] Các chức năng khác của TGF-β là thúc đẩy, tạo sự phân bào của nguyên bào sợi và tế bào tiền thân của nguyên bào xương, mà sau này sẽ biệt hóa thành các tế bào xương trưởng thành, và cũng

để kích thích lắng đọng nguyên bào xương vào chất nền collagen trong những khu vực chữa bệnh và chất nền mô xương vết thương [25] TGF-β hoạt động

cả trong một thời trang autocrine và paracrine, làm cho nó một yếu tố tăng trưởng với chữa bệnh lâu dài và khả năng tái tạo xương [10] Một số lo ngại

về việc sử dụng TGF-β bởi theo Dieudonne và cộng sự [15] ông nghiên cứu thấy nó tác động lên tế bào hủy xương trong một quá trình thử nghiệm Họ kết luận rằng nồng độ thấp có tác dụng kích thích về sự tăng sinh tế bào xương, trong khi ở nồng độ cao hơn, tăng sinh bị ức chế

- Vascular endothelial growth factor (VEGF): yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu,thúc đẩy hình thành mạch máu Chúng là một loại protein tín hiệu nhằm thúc đẩy sự phát triển của các mạch máu mới VEGF là một phần của

cơ chế để phục hồi các nguồn cung cấp máu đến các tế bào và các mô khi bị mất máu được oxy hóa do lưu thông máu bị tổn thương

- Epidermal growth factor (EGF): yếu tố tăng trưởng biểu bì, thúc đẩy tăng trưởng tế bào và sự biệt hóa, hình thành mạch máu, hình thành collagen

- PDEGF (platelet-derivedendothelial growth factor): yếu tố tăng trưởng nội mô nguồn gốc tiểu cầu

- PDAF (platelet-derived angiogenesis factor): yếu tố tăng sinh mạch nguồn gốc tiểu cầu

- ECGF(epithelial cell growth factor): yếu tố tăng trưởng tế bào biểu mô -Fibroblast growth factor-2(FGF-2):yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi-2,

là một protein đa chức năng, tham gia điều hòa hoạt động của nhiều quá trình trong cơ thể như cân bằng nội mô, ngăn chặn quá trình xơ hóa ở phổi, duy trì

và tăng sinh tế bào thần kinh, chữa lành xương bị tổn thương, kích thích hình thành tế bào bạch cầu, kích thích sự hình thành mạch máu mới từ mạch máu

sẵn có, kích thích sự tăng trưởng của tế bào cơ mềm, chữa lành vết thương và sửa chữa mô [11,26]

- Insulin-like growth factor (IGF): yếu tố tăng trưởng giống Insulin, một điều tiết sinh lý học bình thường trong gần như mọi loại tế bào của cơ thể IGF-1 còn phối hợp với các yếu tố tăng trưởng TGF-β và BMPs tham gia vào quá trình tổng hợp chất căn bản của sụn khớp [18]

Các yếu tố khác do tiểu cầu sinh ra như PF 4 (Platelet factor 4): yếu tố

4 tiểu cầu; Osteocalcin; Osteonectin; Fibrinogen, Vitronectin; Fibronectin; TSP-1: thrombospondin-1…và nhiều chất khác; trong đó nhóm các chất Fibrinogen, Fibronectin, Vitronectin và TSP-1 tham gia vào quá trình hình thành cục máu đông

Đã có nhiều nghiên cứu và ứng dụng của PRP, phát hiện khi nuôi cấy tê bào dưới sự có mặt PRP đã được hoạt hóa tiểu cầu thì nồng độ các nhân tố tăng trưởng và cytokine cao hơn nhiều lần giúp tế bào tăng sinh mạnh hơn so với nuôi cấy thông thường Do vậy khi đưa PRP vào trong công nghệ tế bào

sẽ rất có tiềm năng ứng dụng lớn trong nghiên cứu cũng như điều trị lâm sàng đối trong y học tái tạo

1.1.3 Ứng dụng của PRP trong điều trị

Từ những năm 2000, PRP đã được sử dụng rộng rãi trong ngành chấn

thương chỉnh hình về việc hỗ trợ điều trị làm tăng khả năng chữa bệnh trong ghép xương và gãy xương và PRP đã được khuyến khích việc sử dụng hỗ trợ điều trị trong các chấn thương thể thao để sửa các mô liên kết Năm 2006 Mishra, Pavelko và cộng sự ở Trường Đại học Stanford đã công bố công trình nghiên cứu về việc sử dụng PRP cho các vấn đề về gân [24] Tiếp đó PRP được chấp nhận và ứng dụng rộng rãi hơn trên thế giới với nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu quả của việc sử dụng PRP như điều trị cho một số bệnh về chấn thương dây chằng, thoái hóa khớp gối dây chằng, cơ, viêm dây chằng đùi và

bệnh chấn thương gân cơ khớp quay [35,38]

PRP tự thân lần đầu tiên được sử dụng trong phẫu thuật tim trong công trình của Ferrari và cộng sự năm 1987 [17], PRP tự thân được sử dụng bằng đường truyền sau khi phẫu thuật mở tim Đầu những năm 1990, gel tiểu cầu

đã được sử dụng như một sản phẩm phụ của quá trình thu nhận, như là một sản phẩm thay thế cho fibrin sealant để kiểm soát cầm máu trong phẫu thuật tim [27,36] PRP có rất nhiều ứng dụng trên lâm sàng với tác dụng chung là thúc đẩy nhanh quá trình lành vết thương, rút ngắn thời gian điều trị bệnh, làm giảm nhiễm trùng sau phẫu thuật, giảm đau và mất máu Những lĩnh vực

có thể ứng dụng PRP bao gồm: phẫu thuật răng miệng; phẫu thuật hàm mặt; phẫu thuật thẩm mỹ và chỉnh hình; điều trị loét da và phần mềm mạn tính trong bệnh đái tháo đường… Trong chuyên ngành cơ xương khớp từ 20 năm nay đã ứng dụng PRP rất nhiều trong các lĩnh vực chấn thương thể thao: viêm gân và các điểm bám tận như viêm lồi cầu ngoài- lồi cầu trong xương cánh tay, viêm lồi củ xương chày, viêm gân gót, đứt dây chằng chéo khớp gối, kích thích sự lành vết thương phần mềm cũng như làm nhanh liền xương trong phẫu thuật…

Ứng dụng của PRP trong liền vết thương: PRP tự thân được sử dụng trong điều trị vết thương mạn tính, khó liền Trong nghiên cứu của Sarvajnamurthy và cộng sự khi điều trị 7 vết loét ở 12 bệnh nhân bằng PRP, tác giả cho thấy thời gian trung bình liền vết thương là 5.1 tuần, tỷ lệ tiến triển trung bình tại chỗ và thể tích vết loét lần lượt là 94.7% Theo Marcus Gurhen khi áp dụng PRP tự thân điều trị cho 13 bệnh nhân với 14 vết thương mạn tính, kết quả cho thấy ở ngày 7,11 vết thương giảm kích thước trung bình 31.4%, sau 28 ngày một vết thương liền hoàn toàn, 12 vết thương giảm kích thước trung bình 55.2% Cuối cùng 50% vết thương liền hoàn toàn và 35.7 vết thương giảm kích thước và 14.2% vết thương không thay đổi

Ứng dụng của PRP trong viêm xương khớp: Từ 20 năm nay PRP đã được ứng dụng rất nhiều trong điều trị các lĩnh vực chấn thương thể thao: viêm gân và các điểm bám tận như viêm lồi cầu ngoài- lồi cầu trong xương

cánh tay, viêm lồi củ xương chày, viêm gân gót, bệnh lý rách gân bao xoay, đứt dây chằng chéo khớp gối Kết quả cho thấy PRP kích thích làm lành vết thương phần mềm cũng như làm nhanh liền xương trong phẫu thuật… Đặc biệt từ khoảng 5-7 năm trở lại đây, PRP tự thân đã được nghiên cứu sử dụng rất nhiều trong điều trị các bệnh lý có tổn thương sụn khớp nói chung và thoái hóa khớp gối nói riêng cho kết quả khả quan cùng rất ít tác dụng phụ Khi sử dụng PRP, sự tập trung các yếu tố tăng trưởng ở một đơn vị thể tích cho thấy PRP kích thích hoạt động các tế bào tại chỗ làm tăng nhanh quá trình tái tạo sụn khớp một cách liên tục Kỹ thuật này có chi phí thấp và không có tác dụng phụ đối với bệnh nhân [30] Theo kết quả của Kon và cộng sự ở 115 bệnh nhân viêm khớp gối đã điều trị bằng PRP, kết quả cho thấy thể hiện sự cải thiện chức năng một cách tích cực, có sự tăng sinh tế bào sụn và có hiệu quả rõ rệt trên lâm sàng ở thoái hóa khớp gối [22]

1.2 Nguyên bào sợi và vai trò của nguyên bào sợi trong liền vết thương

Mô liên kết là mô tạo ra và giữ cho cơ thể có hình dạng nhất định, đồng thời mô liên kết giữ nhiều vai trò quan trọng và đa dạng đối với cơ thể như trao đổi chất, bảo vệ và tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học Khác với các

mô khác (mô cơ, thần kinh, biểu mô) mô liên lết có khoảng gian bào rộng chứa chất căn bản và các sợi liên kết Vùng trong chất gian bào đó là nhiều loại tế bào khác nhau Nhiều tế bào đã biệt hóa trong cơ thể trưởng thành có thể tạo thành nhóm mà các phần tử trong nhóm có liên quan mật thiết với nhau ở những vùng như mô hay những đặc tính của các phần tử có liên quan với nhau, mô liên kết là một họ tế bào như vậy, các phần tử của chúng không chỉ liên quan tới nhau mà còn tương tác chuyển hóa qua lại Ở mức độ phân

tử, lớp trung bì rất quan trọng cho các tế bào biểu bì phát triển và trưởng thành chúng tiết ra các yếu tố như các sợi fibrin gắn kết, các yếu tố kết dính

để gắn biểu bì vào trung bì Sự tương tác giữa các yếu tố thuộc lớp biểu mô và trung mô sẽ kích thích sự trưởng thành của từng lớp trong da

Nguyên bào sợi (Fibroblasts) là tế bào thường gặp nhất trong mô liên kết, chúng là một trong những tế bào tham gia quá trình làm lành vết thương,

có nguồn gốc trung mô, có nhiều trong gân, cơ, màng bao xơ của nhiều cơ quan, là cơ sở cấu tạo của vết sẹo chúng sản sinh ra collagen có vai trò quan trọng trong quá trình sửa chữa vết thương, phục hồi cấu trúc và chức năng của mô[1] Vào những năm đầu của thập niên 1960, các nhà khoa học đã bắt đầu quan tâm và chú ý đến dòng nguyên bào sợi nhờ những đặc tính đặc biệt của

chúng Khả năng phân chia invitro dài, có khả năng biệt hóa invitro thành các

dạng tế bào xương, tế bào mỡ, tế bào cơ trơn, nguyên bào cơ và một số loại tế bào khác dưới những điều kiện biệt hóa thích hợp [19] Nguyên bào sợi có khả năng tăng trưởng mạnh và là loại tế bào chiếm phần lớn trong các mô liên kết của cơ thể, giữ vai trò quan trọng trong việc thành lập khung của mô liên kết Chúng phân tán khắp nơi trong cơ thể, tiết ra chất nền ngoại bào một cách linh động giàu collagen kiểu I và kiểu III Khi mô liên kết bị hủy, nguyên bào sợi gần như di chuyển vào bên trong vết thương, tăng trưởng và tạo ra một lượng lớn chất nền collagen giúp cho việc tái lập và sửa chữa mô bị tổ thương Khả năng phát triển nhanh trong bề mặt của mô bị tổn thương lý giải

phần nào chúng là loại tế bào dễ phát triển trong điều kiện nuôi cấy in vitro,

đây là một nét đặc trưng của dòng tế bào này trong sinh học tế bào

Các vết thương khó lành, vết thương mạn tính có đặc điểm là giảm số lượng và chức năng của các nguyên bào sợi Sử dụng nguyên bào sợi đồng loại nuôi cấy đã được chứng minh có tác dụng tốt trong điều trị một số loại vết thương mạn tính vốn không liền bằng các biện pháp điều trị truyền thống [9] Tuy nhiên việc sử dụng tấm nguyên bào sợi da đồng loại nuôi cấy có nhiều hạn chế về điều kiện nuôi cấy, bảo quản, vận chuyển, mặt khác giá thành của các sản phẩm này là rất cao Do đó nghiên cứu chế tạo các sản phẩm sinh học quá trình nuôi cấy nguyên bào sợi có tác dụng điều trị, dễ bảo quản, vận chuyển và sử dụng, có giá thành hợp lý là một hướng nghiên cứu phù hợp Nghiên cứu của Chu Anh Tuấn và cộng sự năm 2012 đã chứng minh

tác dụng của dịch chiết nguyên bào sợi nuôi cấy từ da người có chứa các thành phần ngoại tiết của nguyên bào sợi: collagen, các yếu tố phát triển như EGF chế phẩm có độc tính thấp, có tính an toàn và tác dụng kích thích liền vết thương, vết bỏng trên động vật thực nghiêm Trong thành phần dịch chiết nguyên bào sợi có chứa các thành phần ngoại tiết của nguyên bào sợi: collagen, các yếu tố liền vết thương như TGF-β1, PDGF,KGF, [6] và các protein chất nền khác gồm fibronectin, hyaluronan góp phần thúc đẩy liền vết

thương một cách sinh lý và hài hòa nhất trên in vitro và trên thực nghiệm

dịch chiết nguyên bào sợi là một sản phẩm sinh học từ quá trình nuôi cấy nguyên bào sợi có tác dụng điều trị Đây là cơ sở để đưa dịch chiết nguyên bào sợi vào trong môi trường nuôi cấy tế bào, chúng có tác dụng kích thích tăng sinh nhờ những yếu tố tăng tưởng khác nhau trong đó, góp phần phục vụ trong các nghiên cứu tiếp theo cũng như trên lâm sàng

1.3 Tế bào gốc và tế bào gốc màng ối

1.3.1 Tế bào gốc

Tế bào gốc (TBG) là những tế bào chưa có chức năng chuyên biệt, có tiềm năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau và có khả năng tự thay mới (Self-Renewal) Nhờ những đặc điểm này mà TBG đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu ứng dụng để chữa một số bệnh của cơ quan tạo máu, một số bệnh di truyền bẩm sinh liên quan đến chuyển hoá và suy giảm miễn dịch, ung thư máu, và có nhiều ứng dụng lâm sàng dùng để chữa được nhiều bệnh nan y như tiểu đường, liệt do chấn tương tuỷ sống, chấn thương mất da, bỏng, suy tim do tổn thương cơ tim, một số bệnh ung thư và bệnh lý gen TBG là những tế bào đầu tiên tạo ra phôi người khoảng 2 tuần sau thụ tinh Sau đó chúng biệt hóa thành 250 loại tế bào khác nhau tạo nên các mô và cơ quan trong cơ thể Khi TBG được đưa vào một cơ quan bị tổn thương, nó sẽ biệt hóa thành tế bào đặc biệt của cơ quan đấy thay thế cho những tế bào chết giúp phục hồi chức năng

Có nhiều cách phân loại và gọi tên TBG khác nhau tuỳ theo tiêu chí phân loại, ví dụ như dựa trên nguồn gốc, thời điểm phân lập và tiềm năng biệt hoá Có thể chia các TBG theo nhiều cách như sau:

-TBG phôi (enbryonic stem cell): là các TBG từ phôi, được phân lập từ

phôi (bất kỳ phần nào của phôi, không giới hạn chỉ vào các tế bào của khối tế bào bên trong phôi nang), là các TBG toàn năng hoặc vạn tiềm năng Để có được các tế bào này thường phải hủy phôi Đã có những thông báo sinh thiết phôi lấy ra một số tế bào của phôi sau đó phôi vẫn phát triển bình thường Tuy nhiên còn nhiều nghi ngại về tính an toàn của kỹ thuật này đối với phôi được sinh thiết, đặc biệt là sinh thiết khối tế bào bên trong của phôi nang để

có được các TBG phôi “kinh điển”

- TBG thai (fetal stem cell): được phân lập từ các mô của thai sau nạo

phá thai, thường là đa tiềm năng hoặc vạn tiềm năng Việc nghiên cứu và sử dụng các tế bào này có ảnh hưởng khá nặng nề về đạo đức nghiên cứu, nên thường chỉ giới hạn vào mục đích tìm hiểu quá trình phát triển phôi thai

- TBG nhũ nhi (infant stem cell): được phân lập từ trẻ sơ sinh hoặc các

phần phụ của thai như dây rốn, nhau thai, màng ối, dịch ối… Các tế bào này thường là đa tiềm năng hoặc vạn tiềm năng Tùy theo cách thu thập có thể ảnh hưởng hoặc không ảnh hưởng đến đối tượng cho tế bào Chọc dịch ối trước khi sinh hoặc chọc tĩnh mạch dây rốn trước sinh để lấy để lấy TBG của em bé

có trong dịch ối hoặc trong máu dây rốn có những nguy cơ của các kỹ thuật này là nhiễm trùng, chảy máu, sẩy thai hoặc đẻ non… Tuy nhiên, lấy máu dây rốn từ dây rốn hoặc bánh nhau sau khi đã “mẹ tròn con vuông” vừa được tế bào có thành phần giống hệt máu tĩnh mạch của trẻ sơ sinh lại không ảnh hưởng gì đến em bé Tương tự như vậy, lấy các tế bào từ mô dây rốn và bánh nhau sau khi sinh cũng không ảnh hưởng đến sức khỏe của em bé vì các thành phần này là sản phẩm bỏ đi sau khi sinh

- TBG trưởng thành (adult stem cell): được phân lập từ các mô của

người từ trẻ em đến người già Các tế bào này rất đa dạng, từ đa tiềm năng

đến vài tiềm năng hoặc đơn tiềm năng Kỹ thuật thu thập ít nhiều đều ảnh hưởng đến sức khỏe của người cho nhưng mức độ dao động rất lớn Ví dụ lấy răng sữa hoặc da qui đầu của trẻ sau khi rụng hoặc cắt bỏ để tách TBG không ảnh hưởng gì đáng kể đến trẻ; lấy dịch tủy xương để có TBG tủy xương của bệnh nhân hoặc người hiến tủy xương là kỹ thuật tương đối phức tạp có có hưởng nhất định đến người cho vì ngoài việc thao tác chọc hút còn phải sử dụng thêm một số thuốc tác động lên tủy xương

- Tế bào giống TBG phôi (embryonic-like stem cell): hay TBG vạn tiềm

năng cảm ứng (induced pluripotent stem cell: iPS): được tạo ra bằng cách cảm ứng các tế bào đã biệt hoá của cơ thể trở lại trạng thái giống như TBG phôi hay còn gọi là TBG nhân tạo Đây là kỹ thuật chủ yếu thao tác trong phòng thí nghiệm, người cho tế bào để cảm ứng (ví dụ tế bào da) bị ảnh hưởng rất ít, có thể là sinh thiết để lấy một miếng da nhỏ

- TBG ung thư (cancer stem cell): được phân lập từ các khối u Các

TBG này được coi là nguồn gốc của khối u

Hình 1.3: Nguồn gốc thu nhận TBG và tiềm năng biê ̣t hóa của chúng

tương ứng với các giai đoạn phát triển của cơ thể

(Nguồ n: http://biomedia.vn/review/t-bao-gc-phn-1.html)

Những nghiên cứu về TBG đã chứng minh, hàng ngày cơ thể chúng ta thay thế những tế bào già chết là do nguồn TBG biệt hoá thành những tế bào chức năng bổ sung vào khi bị thiết hụt những tế bào đó Khi bị thương các TBG từ các ổ (niche) có thể ở gần vết thương hoặc từ các mô khác nhau… sẽ

di cư đến và biệt hoá thành các tế bào chuyên biệt có chức năng liền vết thương Khi nguồn TBG này không đủ đáp ứng với những tổn thương tế bào

do tổn thương diện tích rộng, do cơ thể bị suy yếu… thì hậu quả là gây ra những vết thương vết loét lâu lành, thậm chí không liền được Do đó công nghệ TBG đang mang lại những hy vọng lớn trong việc khắc phục và hỗ trợ trong điều trị hiện nay đặc biệt trong điều trị liền vết thương

Mỗi loại TBG kể trên có tiềm năng biệt hoá khác nhau và do vậy triển vọng ứng dụng khác nhau Việc phân lập và duy trì mỗi loại TBG này cũng đòi hỏi những kỹ thuật và công nghệ khác nhau Trên phương diện đạo đức y sinh học, việc thu thập nguồn cung cấp tế bào, tách và sử dụng mỗi loại TBG trên cũng có những tác động khác nhau Nhìn bao quát nhiều khía cạnh thì mỗi loại TBG kể trên đều có những ưu điểm và hạn chế nhất định Do đó việc lựa chọn loại TBG nào để nghiên cứu phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó mục tiêu sử dụng thường là yếu tố quyết định Và TBG phân lập từ màng ối được xem là nguồn phân lập TBG có đặc điểm ưu việt không phải loại TBG nào cũng có

1.3.2 Tế bào gốc từ màng ối

Nhau thai được tạo ra từ 3 lớp : màng ối, màng đệm và màng rụng Mỗi lớp được thu nhận từ các nguồn khác nhau (màng rụng được thu nhận từ mẹ, màng ối và màng đệm được thu nhận từ phôi) Màng đệm được thu nhận từ lớp trophoblast, màng ối xuất phát từ epiblastvà ngày 8 sau thụ tinh Sự phôi

vị hóa sảy ra khi thụ tinh, gần 2 tuần sau, khi các tế bào biểu mô màng ối được hình thành do đó màng ối vẫn giữ được tính toàn năng của các tế bào epiblast Màng ối là khoang màng mỏng chứa đầy dịch, nâng đỡ phôi suốt quá trình phát triển và bám dính của phôi vào cấu trúc mẹ

Hình 1.4: Bánh nhau và màng ối

(Nguồn: http://www.humpath.com/spip.php?article5400)

Màng ối nằm ở lớp trong cùng của màng nhau thai, tiếp xúc với buồng

ối Màng ối dai, chắc và có tính đàn hồi, có khả năng ngăn cản các loại vi khuẩn, đồng thời tạo môi trường sống cho thai, bảo vệ thai tránh các tác động

cơ học, áp suất Hơn nữa, màng ối còn có khả năng trao đổi khí và lọc cơ học [4] Màng ối là màng mỏng trong suốt, có tính đàn hồi tốt, bao gồm lớp màng đáy và trên màng đáy là hàng tế bào biểu mô Màng ối được phát triển

từ các TBG phôi, và các tế bào ối đã được chứng minh để thể hiện tiềm năng với nhiều sự khác biệt

Màng ối thu nhận được chỉ sau khi được bóc tách khỏi nhau thai, nhau thai được coi là rác thải y tế, là nguồn cung cấp tê bào gốc lý tưởng, các TBG biểu mô được phân lập từ màng ối, có tính sinh miễn dịch thấp, không có khả năng ung thư hóa và có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau [5] Giống với nhiều loại TBG hay một số loại TBG trưởng thành khác, sự biểu hiện của kháng nguyên lớp I chuỗi nặng myosin rất thấp trên TBG biểu

mô màng ối điều này có ỹ nghĩa trong điều trị Các tế bào epiblast tạo ra màng

ối cũng như tất cả ba lá mầm của phôi.Trên bề mặt của màng đáy thuộc màng

ối người ta cũng thấy sự có mặt của các mối liên kết hemidesmosome α6β4, các mối liên kết này có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ cho quá trình phát triển và kết dính các tế bào biểu mô trên màng đáy [2]

TBG từ màng ối được phân lập từ màng ối của nhau thai sau khi sinh nên không gây bất kỳ ảnh hưởng nào tới sức khỏe của cả mẹ và sản nhi, không vi phạm đạo đức và cũng như các vấn đề về mặt khoa học xã hội Do được thu nhận từ màng ối nên các TBG được thu nhận có tiềm năng biệt hóa cao, dễ dàng thu nhận, sàng lọc các bệnh truyền nhiễm Dựa trên phương pháp hóa miễn dịch và phân tích di truyền, các TBG biểu mô màng ối cho thấy có tiềm năng để biệt hóa thành tế bào của lớp nội bì, trung bì và ngoại bì

trên in vitro Như vậy TBG biểu mô màng ối vẫn có thể duy trì được đặc tính

của TBG phôi ban đầu

TBG biểu mô là một trong những tế bào quan trọng trong quá trình làm lành vết thương Chúng liên kết mật thiết với các tế bào có nguồn gốc trung

mô để tạo lên cấu trúc da hoành chỉnh Sự liên tục của các tế bào liên kết chặt chẽ tạo thành bề mặt (như các lớp biểu bì và biểu mô giác mạc) và lót (như tiêu hóa, hô hấp, và biểu mô niệu-sinh dục) của cơ thể Da liên tục tự đổi mới trong suốt thời gian sống của cơ thể và nang tóc trải qua một chu kỳ vô tận của sự phát triển và thoái hóa Tại các vùng trên, biểu mô không chỉ cung cấp một hàng rào bảo vệ chống lại môi trường bên ngoài mà còn điều tiết nước và hấp thu dinh dưỡng cũng như tiết các tuyến nội tiết TBG cư trú ở lớp biểu bì

và nang lông đảm bảo duy trì sự ổn định về da của cơ thể và tái tạo tóc, nhưng chúng cũng tham gia vào việc sửa chữa các lớp biểu bì sau khi chấn thương Ngoài ra chúng còn sản xuất nhanh hơn nếu da bị tổn thương, từ đó giúp kịp thời hồi phục Chúng được coi là nguồn lực quan trọng cho sự tái sinh biểu bì

và da phụ, và được đề xuất như là một mục tiêu ưu tiên của liệu pháp da [13] Nghiên cứu tìm hiểu TBG biểu mô sinh học có ý nghĩa quan trọng lâm sàng

để chẩn đoán, phòng ngừa và điều trị bệnh cho người, đặc biệt trong y học tái tạo Chúng có tiềm năng để điều trị rất nhiều bệnh bao gồm cả bệnh Parkinson

và Alzheimer, tiểu đường, chấn thương cột sống và bỏng [37]

Hiện nay TBG trong nghiên cứu và điều trị được phân lập một số nguồn khác nhau TBG phôi, TBG thai còn gặp nhiều rào cản về đạo đức

trong nghiên cứu, các TBG trưởng thành thì việc thu nhận, phân lập cũng còn gặp nhiều khó khăn và số lượng tế bào thu được không nhiều để dùng cho nghiên cứu cũng như điều trị cho bệnh nhân Do vậy tiềm năng ứng dụng của TBG biểu mô màng ối là rất lớn

1.3.3 Ứng dụng của TBG màng ối

Nhờ những ưu điểm của mình, màng ối được sử dụng đầu tiên vào năm

1910 trong phẫu thuật ghép da, sau đó còn được sử dụng trong các phẫu thuật đường sinh dục tiết niệu, da, não, đầu, mặt và cổ Lần đầu tiên vào thập kỷ

1940, màng ối được sử dụng trong nhãn khoa điều trị bỏng mắt Đến thập kỷ những năm 1990, sự phát triển vượt bậc trong nghiên cứu cơ bản liên quan đến sinh bệnh học nhãn khoa và cấu trúc phân tử Tác dụng sinh học của màng ối, phẫu thuật ghép màng ối trong điều trị bệnh giác mạc (GM) và bệnh

bề mặt nhãn cầu (BMNC) được giới thiệu trở lại như một phương pháp đầy hứa hẹn Theo nghiên cứu của tác giả Fukuda K và cộng sự , 1999 màng đáy của màng ối hoàn toàn giống với màng đáy của kết mạc vì có chứa collagen typ IV, V, fibronectin, laminin-1, laminin-5, vì thế màng ối được sử dụng được thay thế cho kết mạc [7] Năm 1997, quy trình lấy, bảo quản và phân phối mô màng ối đã được FDA của Hoa kỳ phê chuẩn.[2]

Vật liệu sinh học mới từ màng ối người đã được nghiên cứu và ứng dụng hiệu quả trong điều trị bỏng Nghiên cứu của Phan Kim Ngọc và cộng

sự (2009) đã thử nghiệm đắp màng lên các vết thương mất da của chuột Kết quả là bề mặt vết thương khô ráo, không chảy dịch, không phù nề ung mủ mà xuất hiện mảng da non màu hồng nhạt lan dần ra từ các mép vết thương, giúp khép nhỏ miệng vết thương.Cùng với các bác sĩ chuyên khoa, các nhà nghiên cứu thử nghiệm trên 2 bệnh nhân bị bỏng độ IIA, kết quả cho thấy chỉ sau 4 ngày, vết thương đã khô và tiến triển rất tốt Đặc biệt, theo các bệnh nhân, khi đắp miếng trị bỏng từ màng ối thì cảm giác đau đớn giảm đi rất nhiều [4]

Trước đây để sử dụng liệu pháp TBG trong điều trị cần phải thu nhận

nhiều khó khăn cả về kỹ thuật lẫn số lượng mẫu thu thập được TBG màng ối

đã chứng tỏ được những ưu việt vượt trội của mình khi là nguồn cung cấp dồi dào, số lượng tế bào thu được lớn, không vi phạm các vấn đề về đạo đức Và đặc biệt hơn là nó có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tê bào mong muốn khác nhau trong quá trình nuôi cấy để phục vụ cho việc cấy ghép tế bào

TBG màng ối còn được biết đến như một vật liệu sinh học nhờ vào khả năng chế tạo tấm TBG biểu mô màng ối và sử dụng màng ối làm giá đỡ trong nuôi cấy tế bào phục vụ nhiều nghiên cứu và ứng dụng trong y học

PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tương nghiên cứu:

Tế bào gốc biểu mô màng ối được phân lập từ màng ối được cung cấp từ Labo Nghiên cứu TBG, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược hoc Quân sự, Học viện Quân y, là sản phẩm của đề tài Nghị định thư với Nhật bản được sử dụng

để nuôi cấy tăng sinh làm nguồn tế bào và tạo mô hình để đánh giá

Huyết tương giàu tiểu cầu (n=8) được thu nhận từ nhóm nghiên cứu đã được tách chiết theo quy trình của AdiStem, Úc

Dịch chiết từ nguyên bào sợi (n=8) được thu nhận và xử lý trong qua trình nuôi cấy nguyên bào sợi (của hãng ATCC, Mỹ)

2.1.2.Hóa chất, dụng cụ, vật tư tiêu hao và thiết bị nghiên cứu

 Hoá chất và vật tư tiêu hao chính:

Các môi trường, hóa chất: DMEM, Kít PRP dùng để tách huyết tương giàu tiểu cầu, canxi clorua (AdiStem, Úc), FBS, Kháng sinh, Trypsin/EDTA 0,25%, PBS (Invitrogen, Mỹ), MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), DMSO (Sigma, Mỹ), môi trường Basal (ATCC, Mỹ), rh-FGFb, Lglutamine, Ascorbic acid, Hydrocortisone Hemisuccinate, rh Insulin, Đĩa nuôi cấy 10mm x 20mm, đĩa nuôi cấy 96 giếng, pipet nhựa 5,10,25 ml (Corning, Mỹ) và các hóa chất vật tư tiêu hao khác đều được cung cấp từ các hãng có uy tín, đảm bảo đạt tiêu chuẩn phân tích

 Các máy móc thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu:

Phòng sạch, Tủ ấm CO2 (Nuiair), Kính hiển vi đảo ngược Olympus IX83 (Olympus, Nhật Bản), Hệ thống DTX 880 (Beckman Coulter, Mỹ), Bể ổn nhiệt, Máy ly tâm lạnh, Thiết bị hấp sấy vô trùng, Tủ lạnh -80, -20, 4oC (Sanyo, Nhật Bản), Bình chứa ni tơ lỏng, Cân điện tử v.v…

Hình 2.1: Một số thiết bị trong nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nuôi cấy tăng sinh TBG biểu mô từ màng ối

Để tạo nguồn tế bào, mẫu TBG biểu mô màng ối sau giải đông được nuôi cấy trong đĩa nhựa có môi trường DMEM được bổ sung 10% FBS, 1% kháng sinh và các yếu tố khác, nuôi cấy ở nhiệt độ 37℃, 5% CO2 Sau khi tế bào tăng sinh và che phủ khoảng 80% diện tích bề mặt nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển Một phần tế bào được tiếp tục nuôi cấy tạo mô hình đánh giá và một phần được bảo quản để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo

• Thay môi trường dinh dưỡng

- Hút bỏ dịch môi trường trong đĩa

-Thêm 10ml môi trường vào đĩa nuôi cấy, đặt đĩa nuôi cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C, 5% CO2

• Cấy chuyển tế bào khi tế bào đạt mật độ mong muốn

- Kiểm tra tình trạng tế bào, đánh giá mức độ che phủ của tế bào trên bề mặt đĩa nuôi cấy (độ che phủ đạt 80% diện tích bề mặt đĩa nuôi cấy)

- Hút bỏ dịch nổi trong đĩa nuôi cấy rồi đem rửa bằng dung dịch đệm PBS

- Hút bỏ dung dịch đệm rồi thêm 10ml dung dịch Trypsin/EDTA 1X, đặt đĩa nuôi cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C, 5% CO2 trong 5 phút để tế bào bong

ra khỏi bề mặt đĩa nuôi cấy, thu tế bào vào ống ly tâm

- Ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút Hút dịch bỏ dịch nổi sau ly tâm, thu cặn tế bào và bổ sung môi trường nuôi cấy

- Khối tế bào thu được cấy chuyển sang đĩa mới để gia tăng số lượng tế bào hoặc sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.2.2 Bảo quản tế bào

Khi tế bào sinh trưởng và phát triển 60-80% diện tích bề mặt nuôi cấy,

ta hút môi trường cũ, rửa lại bằng dung dịch đệm, sau đó bổ sung Trypsin, ly tâm thu hoạch tế bào, rửa lại tế bào bằng PBS, bổ sung dung dịch bảo quản DMSO 10% và bảo quản ở nhiệt độ -196OCcho đến khi sử dụng

2.2.3 Giải đông tế bào

Mục đích khôi phục lại trạng thái hoạt động, đặc điểm, tính chất của tê bào trong nuôi cấy Lấy ống TBG đông lạnh từ trong bình nitơ lỏng, đặt vào

bể ổn nhiệt ở 37OC Ly tâm trong 10 phút với tốc độ 1500 vòng/phut Bổ sung môi trường rồi chuyển sang đĩa nuôi cấy, nuôi cấy ở 37OC, 5% CO2.

2.2.4 Xác định mật độ tế bào

Phương pháp này sử dụng buồng đếm hồng cầu Neubauer

- Sau khi thu nhận tế bào hoặc các mẫu tế bào được nuôi cấy trong điều kiện có bổ sung PRP hoặc dịch nguyên bào sợi, sau 48 giờ nuôi cấy các mẫu

tế bào được thu hoạch và kiểm tra số lượng tế bào Các mẫu tế bào thu nhận, được lấy thể tích hỗn dịch tế bào pha tỷ lệ 1:1 với thể tích chất nhuộm màu Trypan-blue Hút hỗn dịch tế bào và chất nhuộm màu bằng đầu pipet, bơm nhẹ hỗn dịch TB vào mép buồng đếm và để hỗn dịch tự chảy đầy vào buồng đếm Đếm số lượng tế bào dưới kính hiển vi

- Số lượng TB được tính theo công thức: C = 5.a.n.10 4 (TB/ml)

Trong đó:

+ a: số lượng TB đã đếm được trong buồng đếm

+ n: độ pha loãng mẫu

+ C: mật độ tế bào (TB/ml)

2.2.5 Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu

Mẫu máu ngoại vi sau khi thu nhận được cho vào các ống chứa chất chống đông ACD theo bộ kít PRP của AdiStem, Úc, máu được ly tâm với tốc

độ 100g trong 10 phút, sau đó chuyển lớp huyết tương sang ống nghiệm mới,

ly tâm tiếp với tốc độ 1800g trong 10 phút Loại bớt 50% thể tích huyết tương sau đó hoạt hóa huyết tương giàu tiểu cầu bằng dung dịch canxi clorua, trộn đều cho hình thành cục đông Sản phẩm huyết tương giàu tiểu cầu sau hoạt hóa tạo cục đông được thu hoạch và sử dụng để hoạt hóa và đánh giá trên mô hình TBG màng ối Sản phẩm cuối cùng thu được là PRP một phần được bảo quản ở -80OC để phục vụ quá trình nghiên cứu sau này

2.2.6 Nuôi cấy và chuẩn bị dịch chiết nguyên bào sợi

Nguyên bào sợi được nuôi cấy trong môi trường cơ bản FBM (fibroblast Basal medium có thêm các thành phần bổ sung) của hãng ATCC, Mỹ Tế bào được nuôi cấy ở nhiệt độ 37C, 5% CO2 Sau khi tế bào tăng sinh và che phủ khoảng trên 90% diện tích bề mặt dụng cụ nuôi cấy, tiến hành thu dịch nuôi cấy và phá vỡ tế bào tạo dịch chiết nguyên bào sợi Dịch nguyên bào sợi thu nhận được sử dụng một phần, một phần được bảo quản vô trùng ở -80OC cho

các nghiên cứu tiếp theo

2.2.7 Phản ứng MTT đánh giá khả năng tăng sinh của TBG biểu mô màng ối

Đây là phương pháp dùng để đánh khả năng tăng sinh, mật độ của tế bào trong nghiên cứu Phương pháp MTT được tiến hành dựa trên phản ứng khử của MTT [3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] là một chất nền màu vàng nhạt với các enzyme dehydrogenase trong ty thể của