Nghiên cứu nuôi cấy in vitro và tạo rễ tơ ở cây ô đầu (aconitum carmichaelii debx)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ HỒNG NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO VÀ TẠO RỄ TƠ Ở CÂY Ô ĐẦU (Aconitum carmichaelii Debx.) Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Ngọc Lan THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trình bày luận văn kết nghiên cứu hướng dẫn trực tiếp TS Nguyễn Thị Ngọc Lan Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Trần Thị Hồng Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện luận văn này, em tạo điều kiện nhận giúp đỡ quý báu từ thầy cô, quan, bạn bè đồng nghiệp gia đình Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Ngọc Lan, người hướng dẫn khoa học tận tâm bảo giúp đỡ em suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn cảm ơn sâu sắc tới Quý thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên tận tình hướng dẫn, truyền dạy kiến thức cho em suốt khóa học Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy giáo, cô giáo Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Hội đồng Khoa học trường Q thầy, phòng ban chức tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian học tập trường Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh học tạo điều kiện giúp đỡ vật chất tinh thần cho tơi q trình học tập Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới đồng nghiệp, bạn bè gia đình quan tâm, động viên, ủng hộ giúp đỡ Dù cố gắng, nhiên không tránh khỏi thiếu sót luận văn, mong nhận ý kiến đóng góp Q thầy/cơ để luận văn thêm hoàn thiện Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả luận văn Trần Thị Hồng Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Ô đầu 1.1.1 Đặc điểm phân loại hình thái Ơ đầu 1.1.2 Thu hái, chế biến bảo quản Ô đầu 1.1.3 Thành phần hóa học, giá trị dược liệu cơng dụng Ơ đầu 1.1.4 Nguồn gốc phân bố Ô đầu Việt Nam 1.1.5 Vai trò Ô đầu 1.2 Các nghiên cứu nhân giống in vitro giới Việt Nam 1.2.1 Các nghiên cứu nhân giống in vitro giới .7 1.2.2 Các nghiên cứu nhân giống in vitro Việt Nam 1.3 Các nghiên cứu tạo rễ tơ ứng dụng 14 1.3.1 Tạo sinh khối rễ tơ 14 1.3.2 Một số nghiên cứu tạo rễ tơ 14 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu hóa chất 18 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 18 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 2.2 Địa điểm nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 19 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy in vitro 19 2.4 Phương pháp nuôi cấy tạo rễ tơ Ô đầu 21 2.4.1 Chuẩn bị mẫu lây nhiễm 21 2.4.2 Chuẩn bị dịch khuẩn Agrobacterium rhizogenes 22 2.4.3 Lây nhiễm mẫu với vi khuẩn 22 2.4.4 Diệt khuẩn cảm ứng rễ tơ 22 2.4.5 Nhân nuôi rễ tơ 22 2.4.6 Xác định khối lượng rễ khô 22 2.4.7 Phương pháp xử lý số liệu 23 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Kết tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro Ô đầu 24 3.2 Kết tái sinh chồi in vitro Ô đầu 25 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến khả nhân nhanh sinh trưởng chồi in vitro Ô đầu 25 3.2.2 Ảnh hưởng kinetin đến khả nhân nhanh sinh trưởng chồi in vitro Ô đầu 29 3.3 Kết tạo Ô đầu in vitro hoàn chỉnh 31 3.3.1 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ in vitro Ô đầu 31 3.3.2 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ in vitro Ô đầu 33 3.4 Kết trồng vườn ươm 35 3.5 Tạo dòng rễ tơ ô đầu 37 3.5.1 Kết tạo dòng rễ tơ Ơ đầu 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4D-Dichlorophenoxy Acetic Acid AS : Acetosyringone BAP : 6-Benzyl Amino Purin ĐC : Đối chứng IAA : Indoly Acetic Acid IBA : Indoly Butyric Acid Kinetin : 6-furturylamino purine LB : Luria Bertani MS : Murashige – Skoog NAA : α - Napthalen Acetic Acid Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết tạo vật liệu khởi đầu nuôi cấy in vitro từ đoạn thân Ô đầu (n = 100 sau tuần nuôi cấy) 24 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP đến khả nhân nhanh sinh trưởng chồi Ô đầu (n = 30) 26 Bảng 3.3 Ảnh hưởng Kinetin đến khả nhân chồi sinh trưởng Ô đầu (n = 30) 29 Bảng 3.4 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ in vitro Ô đầu 32 Bảng 3.5 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ in vitro Ô đầu 34 Bảng 3.6 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống Ô đầu giai đoạn vườn ươm (n = 30) 36 Bảng 3.7 Kết khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Ô đầu (n=150, sau tuần) 38 Bảng 3.8 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ từ đoạn rễ Ô đầu (n=150, sau tuần) 41 Bảng 3.9 Xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime sau tuần 42 Bảng 3.10 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến tăng trưởng rễ tơ Ô đầu sau tuần 43 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây Ơ đầu Hình 3.1 Hình ảnh chồi tái sinh khử trùng HgCl2 0,1% phút 24 Hình 3.2 Ảnh hưởng BAP tới phát sinh chồi Ô đầu sau tuần nuôi cấy 27 Hình 3.3 Ảnh hưởng Kinetin tới phát sinh chồi Ô đầu sau tuần nuôi cấy 30 Hình 3.4 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ in vitro Ơ đầu sau tuần ni cấy 33 Hình 3.5 Ảnh hưởng IBA đến phát sinh rễ in vitro Ô đầu sau tuần nuôi cấy 35 Hình 3.6 Hình ảnh Ơ đầu giá thể đất phù sa + trấu hun 36 Hình 3.7 Khảo sát vật liệu thích hợp để tạo rễ tơ Ô đầu sau tuần biến nạp 38 Hình 3.8 Hình ảnh cảm ứng ni cấy rễ tơ Ơ đầu 43 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam nước nhiệt đới có hệ thực vật phong phú đa dạng Trong có nhiều lồi thực vật sử dụng làm thuốc làm nguyên liệu để sản xuất thuốc chữa bệnh như: Xạ đen, Bình vơi, Diệp hạ châu, Giảo cổ lam Ơ đầu… Tuy nhiên, nguồn dược liệu tự nhiên bị suy giảm với tốc độ nhanh chóng số lượng chất lượng Nhiều loài dược liệu quý tình trạng khan có nguy bị tuyệt chủng làm ảnh hưởng đến đa dạng sinh học nguồn cung cấp dược liệu cho người, có Ơ đầu Ngun nhân chủ yếu vấn đề việc khai thác mức, với điều kiện bất lợi từ môi trường, biến đổi khí hậu thu hẹp diện tích rừng tự nhiên Vì vậy, cần thiết phải có biện pháp bảo vệ phát triển nguồn gen dược liệu nói chung Ơ đầu nói riêng Cây Ơ đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) có chứa aconitin loại alkaloid có độc tính cao, tập trung chủ yếu củ Ơ đầu Ngồi ra, Ơ đầu chứa nhiều hợp chất khác polysaccharide, flavonoid acid hữu cơ… Đối với người, hợp chất Ô đầu có tác dụng giảm đau, chống oxy hố, tăng cường hệ miễn dịch, ngăn cản tăng sinh tế bào, chống ung thư, tác động lên tim mạch Hiện nay, Ô đầu nhân giống củ (phụ tử) cành giâm, trồng cành giâm tỷ lệ mọc thành khơng cao Vì vậy, cần có nghiên cứu tạo nguồn đồng đều, bệnh để đáp ứng nhu cầu trồng phát triển Ô đầu Thực tiễn cho thấy việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân giống trồng lựa chọn hiệu với nhiều ưu điểm bật nhân giống nhanh, chủ động, với số lượng lớn, thu nguồn giống bệnh giảm chi phí Bên cạnh đó, để đáp ứng nhu cầu thu hợp chất thứ cấp từ Ô đầu, việc sản xuất sinh khối thông qua nuôi cấy rễ tơ hướng Ni cấy rễ tơ có tính ổn định di truyền, sinh hóa, tốc độ sinh trưởng nhanh Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn khả tổng hợp hợp chất tự nhiên mức tương đương so với ngun vẹn Do đó, ni cấy rễ tơ dược liệu hệ thống hữu ích cho việc sản xuất hợp chất có hoạt tính sinh dược cao, đặc biệt Ơ đầu Xuất phát từ lý trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: "Nghiên cứu nuôi cấy in vitro tạo rễ tơ Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.)’’ Mục tiêu nghiên cứu Xác định mơi trường thích hợp ni cấy in vitro tạo rễ tơ Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu ni cấy in vitro Ơ đầu 3.2 Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro Ô đầu 3.3 Nghiên cứu tạo Ô đầu in vitro hoàn chỉnh 3.4 Nghiên cứu trồng ngồi vườn ươm 3.5 Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ Ơ đầu Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn in vitro, ni cấy mơi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng, ánh sáng nhân tạo vô trùng Khi đưa trồng giá thể vườn ươm, phải sống tự dưỡng môi trường tự nhiên chịu tác động nhân tố vô sinh hữu sinh khác Do vậy, việc lựa chọn giá thể phù hợp với Ô đầu cần thiết, giúp trồng mơi trường tự nhiên tự dưỡng mà không ảnh hưởng đến sinh trưởng Bảng 3.6 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống Ô đầu giai đoạn vườn ươm (n = 30) Tỷ lệ sống (%) Chất lượng Đất phù sa 61,70 + Đất phù sa + trấu hun (tỉ lệ 1:1) 93,56 +++ Đất thịt trung bình 79,23 ++ Giá thể Sau tuần Sau tuần Hình 3.6 Hình ảnh Ơ đầu giá thể đất phù sa + trấu hun Các in vitro đạt chiều cao từ - cm, mọc - lá, - rễ, chiều dài rễ đạt từ – cm, rễ mập đưa vườn ươm Khi đưa in vitro khỏi môi trường cần phải rửa agar bám bề mặt rễ Sử dụng loại giá thể để trồng thăm dò: Đất phù sa (CT1); đất phù sa + trấu hun (tỷ lệ 1:1) (CT2); đất thịt trung bình (CT3) Kết theo dõi ảnh hưởng giá thể Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn đến tỷ lệ sống chất lượng Ô đầu sau tuần trình bày bảng 3.6 hình 3.6 Kết cho thấy, loại giá thể khác cho tỷ lệ sống chất lượng khác rõ rệt Tỷ lệ sống giá thể sau tuần trồng dao động từ 61,70 % - 93,56 % Trên giá thể đất phù sa + trấu hun (1:1), tỷ lệ sống đạt 93,56 %, sinh trưởng phát triển tốt so với công thức khác, phát triển nhanh, hình thành thêm mới, có màu xanh đậm, khơng có tượng rụng cũ Những trồng giá thể đất thịt trung bình, tỷ lệ sống đạt 79,23 %, sinh trưởng phát triển bình thường, có màu xanh nhạt Cây trồng giá thể đất phù sa, tỷ lệ sống thấp đạt 61,70 %, không phát triển giá thể này, khơng hình thành mới, có màu xanh nhạt, có tượng rụng cũ Vì vậy, giá thể đất phù sa + trấu hun (1:1) nghiên cứu phù hợp để trồng Ơ đầu chuyển từ mơi trường ni cấy in vitro ngồi vườn ươm 3.5 Tạo dòng rễ tơ đầu 3.5.1 Kết tạo dòng rễ tơ Ơ đầu 3.5.1.1 Khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Ô đầu Sau tuần lây nhiễm với vi khuẩn A rhizogenes mật độ khuẩn tương ứng với giá trị OD600= 0,6; nồng độ AS 100 μmol/l; thời gian lây nhiễm 15 phút, thời gian đồng nuôi cấy ngày, nồng độ cefotaxime diệt khuẩn 500 mg/l [34] Kết khảo sát loại mơ thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ thể qua bảng 3.7 hình 3.7 Kết bảng 3.7 hình 3.7 cho thấy, loại mô khảo sát cho cảm ứng tạo rễ tơ đoạn rễ cho tỷ lệ tạo rễ tơ cao 50,8% (6 tuần tuổi), thấp từ cho tỷ lệ tạo rễ tơ 32,6% (6 tuần tuổi) Như vậy, đoạn rễ in vitro sau - tuần ni cấy nguồn vật liệu thích hợp cho tạo rễ tơ Ơ đầu Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Bảng 3.7 Kết khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Ô đầu (n=150, sau tuần) Tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ Loại mô (%) Chiều dài rễ Số rễ/mẫu (cm) Cuống 36,2b 1,69b 1,20b Lá 32,6a 1,55a 1,25a Rễ 50,8c 3,10c 2,35c Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể khơng có sai khác với p < 0,05 B A C Hình 3.7 Khảo sát vật liệu thích hợp để tạo rễ tơ Ô đầu sau tuần biến nạp A: rễ tơ cảm ứng từ cuống B: rễ tơ cảm ứng từ đoạn rễ C: rễ tơ cảm ứng từ Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 3.5.1.2 Ảnh hưởng mật độ A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian lây nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ từ đoạn rễ Ô đầu Mật độ A rhizogenes thành tố có ảnh hưởng lớn đến hiệu cảm ứng tạo rễ tơ thực vật Do đó, để xác định ảnh hưởng mật độ vi khuẩn đến hiệu cảm ứng tạo rễ tơ từ đoạn rễ Ô đầu tiến hành nhiễm khuẩn 15 phút, bổ sung AS 100 μmol/l, thời gian đồng nuôi cấy ngày mật độ vi khuẩn khác Kết bảng 3.8 cho thấy khác tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ sau đoạn rễ Ô đầu nhiễm A rhizogenes với mật độ vi khuẩn khác tương ứng giá trị OD600 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 Tỷ lệ đoạn rễ cảm ứng tạo rễ tơ cao mật độ vi khuẩn có giá trị OD600= 0,6 (55,6%) Ở mật độ vi khuẩn thấp (OD600= 0,2; 0,4) hay cao (OD600= 0,8; 1,0) cho thấy tỷ lệ đoạn rễ cảm ứng tạo rễ thấp Vì vậy, mật độ vi khuẩn tương ứng với giá trị OD600 = 0,6 thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ từ đoạn rễ Ô đầu AS loại phenol tiết từ thực vật bị tổn thương, có tác dụng dẫn dụ vi khuẩn A rhizogenes xâm nhập vào tế bào thực vật nơi tổn thương Vậy AS bổ sung vào môi trường lây nhiễm nhằm nâng cao hiệu xâm nhập vi khuẩn vào đoạn rễ Ô đầu Khi xác định ảnh hưởng nồng độ AS đến hiệu cảm ứng tạo rễ tơ từ đoạn rễ tiến hành nhiễm khuẩn vào đoạn rễ 15 phút, mật độ vi khuẩn tương ứng với giá trị OD600 = 0,6; thời gian đồng nuôi cấy ngày nồng độ AS khác Ở bảng 3.8 cho thấy, bổ sung AS với nồng độ khác ảnh hưởng khác đến tỷ lệ tạo rễ tơ đoạn rễ Ô đầu Tỷ lệ đoạn rễ Ô đầu cảm ứng tạo rễ tơ cao 55,6 % nồng độ AS 100 μmol/l Ở nồng độ AS thấp (50 μmol/l; 75 μmol/l) hay cao (125 μmol/l; 150 μmol/l) cho thấy tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn rễ tơ thấp Do đó, nồng độ AS 100 μmol/l thích hợp để cảm ứng tạo rễ tơ từ đoạn rễ Ô đầu Kết phù hợp với nghiên cứu Manuhara cộng (2015) [34] Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm A rhizogenes đến hiệu cảm ứng tạo rễ tơ từ đoạn rễ Ô đầu nghiên cứu Khi tiến hành nhiễm khuẩn vào đoạn rễ khoảng thời gian khác nhau, mật độ vi khuẩn tương ứng với giá trị OD600 = 0,6; thời gian đồng nuôi cấy ngày, nồng độ AS 100 μmol/l Kết bảng 3.8 cho thấy, với khoảng thời gian nhiễm khuẩn khác nhau, tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ khác Trong thời gian nhiễm khuẩn 15 phút thu tỷ lệ đoạn rễ cảm ứng tạo rễ cao (55,6 %) Ở thời gian ngâm thấp 10 phút hay cao (20; 25 phút) cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ thấp hơn, thời gian ngâm cao tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ tơ thấp, thời gian ngâm lâu làm cho mẫu rễ bị nhũn dễ bị thối Do đó, đồng ni cấy khoảng thời gian vi khuẩn bám vào mẫu có điều kiện tăng sinh số lượng mơi trường rắn Sự chuyển đoạn T-DNA vào hệ gen thực vật xảy vào giai đoạn Ở bảng 3.8 cho thấy, với khoảng thời gian đồng nuôi cấy khác nhau, tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ khác Thời gian đồng nuôi cấy ngày thu tỷ lệ từ đoạn rễ cảm ứng tạo rễ cao (55,6%) Trong thời gian đồng nuôi cấy thấp (1 ngày) cao (3, 4, ngày) cho tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo rễ thấp hơn, thời gian đồng ni cấy ngắn vi khuẩn xâm nhập vào nên trình biến nạp khơng hồn tồn, thời gian đồng nuôi cấy dài hiệu chuyển gen lại giảm lượng vi khuẩn phát sinh lớn gây hại trực tiếp đến đoạn rễ Ô đầu Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Bảng 3.8 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn A rhizogenes, nồng độ AS, thời gian nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu tạo rễ tơ từ đoạn rễ Ô đầu (n=150, sau tuần) Ảnh hưởng mật Ảnh hưởng độ khuẩn nồng độ AS Tỷ lệ mẫu Nồng độ OD600 tạo rễ tơ AS (%) (μmol/l) Tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ (%) 33,23b Ảnh hưởng thời gian nhiễm khuẩn Thời gian nhiễm Tỷ lệ Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy Thời gian mẫu tạo đồng nuôi Tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ cấy (%) (ngày) 25,43d 30,15d 10 35,9e 25,9e khuẩn (phút) rễ tơ (%) 0,2 21,22a 50 0,4 32,46c 75 0,6 55,6e 100 55,6d 15 46,29c 55,6c 0,8 43,24d 125 38,14c 20 33,12b 11,12b 1,0 28,53b 150 36,10a 25 10,52a 3,11a 42,32c Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể khơng có sai khác với p < 0,05 3.5.1.3 Nghiên cứu xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime Khi bổ sung kháng sinh vào môi trường nuôi cấy thường sử dụng kháng sinh có môi trường làm chậm sinh trưởng mô tế bào Tuy nhiên, số tế bào thực vật dễ bị nhiễm để ngăn chặn phát triển vi sinh vật này, cần thiết phải bổ sung kháng sinh Ở nghiên cứu này, kháng sinh sử dụng để diệt khuẩn sau biến nạp cefotaxime Cefotaxime loại kháng sinh sử dụng phổ biến chi phí rẻ, có tác dụng loại trừ chủng vi khuẩn A rhizogenes khỏi môi trường mô nuôi cấy sau biến nạp Cho thấy kết xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime thể bảng 3.9 Ở bảng 3.9 cho thấy, tăng nồng độ cefotaxime làm giảm khả nhiễm trình biến nạp, cao nồng độ 650 mg/l cho tỷ lệ đĩa cấy Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn không bị nhiễm 100 % khơng bổ sung cefotaxime q trình chuyển gen tỷ lệ nhiễm mẫu cấy 100 % Tuy nhiên, tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ lại tỷ lệ nghịch với nồng độ cefotaxime Khi nồng độ cefotaxime cao tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ thấp Ở thí nghiệm khơng bổ sung cefotaxime tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ cao 69,2 %, 100 % mẫu bị nhiễm Bảng 3.9 Xác định ngưỡng diệt khuẩn cefotaxime sau tuần Nồng độ cefotaxime Tỷ lệ đĩa cấy không bị nhiễm Tỷ lệ mẫu tạo rễ (mg/l) (%) tơ (%) 0 69,2e 350 42,6a 66,6d 400 77,42b 64,23d 450 86,25c 64,01d 500 92,75d 66,8d 550 95,25e 45,23c 600 97,33e 40,12b 650 100 31,20a Giá trị cột với chữ kèm giống thể khơng có sai khác với p < 0,05 Như vậy, nồng độ cefotaxime tối ưu diệt khuẩn 500 mg/l cho tỷ lệ đĩa cấy không bị nhiễm 92,75 % tỷ lệ mẫu tạo rễ tơ 66,8 % Kết phù hợp với nghiên cứu Manuhara cộng (2015) [34] 3.5.1.4 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến tăng trưởng rễ tơ Ô đầu Đã thử nghiệm ba trạng thái môi trường gồm: Đặc, bán lỏng lỏng rễ tơ môi trường lỏng nuôi lắc cho tốc độ tăng trưởng cao (3,18 g rễ tươi), tiếp sau môi trường bán lỏng (2,15 g rễ tươi) cuối môi trường đặc (1,65 g rễ tươi) tăng 6,87; 5,35 3,25 lần so với khối lượng rễ ban đầu sau tuần nuôi cấy thể bảng 3.10 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Bảng 3.10 Ảnh hưởng trạng thái môi trường đến tăng trưởng rễ tơ Ô đầu sau tuần Khối lượng Khối lượng rễ Khối lượng rễ ban đầu (g) tươi sau tuần (g) rễ tăng (lần) Lỏng nuôi lắc 0,55 3,18c 6,87 0,28b Bán lỏng 0,55 2,15 b 5,35 0,21a Đặc 0,55 1,65a 3,25 0,15a Trạng thái môi trường Khối lượng rễ khô (g) Ghi chú: Giá trị cột với chữ kèm giống thể khơng có sai khác với p < 0,05 Như vậy, môi trường lỏng ni lắc giúp rễ tơ Ơ đầu tăng trưởng tốt Kết nuôi cấy tạo rễ tơ Ô đầu thể hình 3.10 A B D E C Hình 3.8 Hình ảnh cảm ứng nuôi cấy rễ tơ Ô đầu A - Đoạn rễ Ô đầu; B - rễ tơ cảm ứng sau tuần; C - nuôi cấy rễ tơ môi trường bán lỏng sau tuần; D - nuôi rễ tơ môi trường lỏng nuôi lắc sau tuần; E - rễ tơ tăng trưởng sau tuần Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Như vậy, loại vật liệu nhiễm với A rhizogenes (cuống lá, mơ đoạn rễ) đoạn rễ vật liệu thích hợp tạo rễ tơ Ô đầu Mật độ vi khuẩn tương ứng với giá trị OD600 = 0,6; nồng độ AS 100 μmol/l; thời gian nhiễm khuẩn 15 phút; thời gian đồng nuôi cấy ngày; nồng độ cefotaxime 500 mg/l điều kiện thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ từ đoạn rễ Ơ đầu Mơi trường MS trạng thái lỏng khơng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, ni điều kiện lắc thích hợp cho tăng trưởng rễ tơ Ô đầu Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đoạn thân mang mắt chồi bên khử trùng cồn 70 % (1 phút) HgCl2 0,1 % phút, cho tỷ lệ đoạn thân phát sinh chồi đạt 91 % Môi trường thích hợp để tạo đa chồi từ đoạn thân Ô đầu invitro MS + sucrose 30g/l + agar 9g/l + BAP 1,5 mg/l Trên môi trường chồi mập, phát triển cân đối, số chồi/mẫu đạt 2,53; chiều cao chồi đạt 5,8 cm (sau tuần) Mơi trường thích hợp cho q trình tạo Ơ đầu in vitro hồn chỉnh MS + sucrose 30g/l + agar 9g/l có bổ sung IBA 0,5 mg/l Trên môi trường này, số rễ/chồi đạt 2,07, chiều dài rễ đạt 3,72 cm (sau tuần), rễ phát sinh mập, khỏe, bề mặt rễ nhẵn, màu trắng xanh Giá thể phù hợp cho Ô đầu sinh trưởng tốt vườn ươm đất phù sa + trấu hun theo tỷ lệ (1:1), cho tỷ lệ sống đạt 93,56 % mập, sinh trưởng tốt Đoạn rễ vật liệu thích hợp cho cảm ứng tạo rễ tơ Ô đầu Điều kiện ni cấy phù hợp để tạo dòng rễ tơ Ô đầu là: Mật độ khuẩn với OD600 = 0,6; nồng độ AS 100 μmol/l; thời gian nhiễm khuẩn 15 phút; thời gian đồng nuôi cấy ngày; nồng độ cefotaxime 500 mg/l sau tuần thu 5/7 dòng rễ tơ Mơi trường MS trạng thái lỏng khơng bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, ni điều kiện lắc thích hợp cho tăng trưởng rễ tơ Ô đầu với khối lượng rễ tươi đạt 3,18 g, khối lượng rễ tăng đạt 6,87 lần khối lượng rễ khô đạt 0,28 g Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng chất phụ gia khác đến phát sinh chồi Ô đầu in vitro Tiếp tục phân tích so sánh hàm lượng flavonoid dòng rễ tơ Ơ đầu Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Bá (2010), Hình thái học thực vật, NXB Giáo dục Việt Nam Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ tế bào thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội Trịnh Đình Đạt (2006), Cơng nghệ sinh học tập – Công nghệ di truyền, NXB Giáo dục Lê Văn Hồng, (2008), Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật Vũ Thị Hoài, Ninh Thị Nhíp (2019), “Nhân giống in vitro rau đắng đất (Glinus oppositifolius (L.) DC.)”, Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 17(1), tr 22 - 28 Nguyễn Văn Hồng, Trần Thị Tý (2013), “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Sa nhân tím (Amomum longiligulare) phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ, Đại học Thái Ngun, 108(08), tr 105 - 112 Phan Xuân Huyên, Nguyễn Văn Kết, Phan Hoàng Đại, Nguyễn Thị Cúc (2016), “Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng lan gấm (Anoectochilus Lylei Rolfe Ex Downies) điều kiện ex vitro”, Tạp chí khoa học Đại học Đà Lạt, 6(4), tr 481– 492 Trần Trung Hiếu, Huỳnh Văn Chung, Bùi Thị Linh Huệ, Lương Thị Mỹ Ngân, Bùi Lan Anh, Bùi Văn Lệ (2017), “Nhân giống in vitro Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guil l)”, Tạp chí phát triển KH&CN, 20 (T2), tr (48-57) Vũ Thị Lan, Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành (2011), “Ảnh hưởng tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng nước dừa đến sinh khối mơ sẹo trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, 82(06), tr 65 - 69 Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 10 Đỗ Tất Lợi (2004), Cây thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học 11 Hà Thị Loan, Dương Hoa Xơ, Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Hoàng Quân, Vũ Thị Đào, Nathalie Pawlicki-Jullian, Eric Gontier (2014), “Nghiên cứu tạo rễ tóc Sâm Ngọc Linh panax vietnamensis phương pháp chuyển gen rol nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes”, Tạp chí Sinh học, 36(1), tr 293 - 300 12 Mai Xn Lương (2005), Giáo trình Cơng nghệ Sinh học thực vật, NXB Đại học Đà Lạt 13 Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở phương pháp sinh học phân tử, NXB Đại học Sư phạm 14 Đoàn Thị Thanh Nhàn (2001), Giáo trình thuốc, NXB đại học Nông nghiệp I, Hà Nội 15 Khuất Thị Hải Ninh, Nguyễn Quỳnh Trang, Bùi Văn Thắng, Vũ Văn Thông (2017), “Nghiên cứu nhân giống in vitro Re hương Cinnamomum parthenoxylon (Jack) Meisn’’, Tạp chí khoa học cơng nghệ lâm nghiệp, (201), tr 42 - 47 16 Trà Đông Phương, Vũ Thị Bạch Phượng, Quách Ngô Diễm Phương (2016), “Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ cát cánh (Platycodon grandiflorum (Jacq.) A DC.) từ bốn chủng Agrobacterium rhizogenes”, Tạp chí phát triển KH&CN, 19(t5), tr 64 – 75 17 Vũ Thị Bạch Phượng, Quách Ngô Diễm Phương, Bùi Văn Lệ (2013) “Nghiên cứu nuôi cấy in vitro nguồn ngun liệu có hoạt tính kháng oxi hóa Thổ tam thất (Gynura pseudochina (L) DC)”, Báo cáo khoa học - Hội nghị khoa học công nghệ sinh học tồn quốc, NXB Khoa học tự nhiên cơng nghệ, tr 1006 – 1010 18 Vũ Hoài Sâm, Bùi Đức Quỳnh, Nguyễn Thị Hương, Nguyễn Văn khiêm (2016) Nghiên cứu nhân giống in vitro Bách hợp (Lilium Brownii F.E Brown), Tạp chí Cơng Nghệ Sinh học, 14(1), tr 121 - 129 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 19 Ngô Thanh Tài, Nguyễn Bá Nam, Hồ Thanh Tâm, Hà Thị Mỹ Ngân, Dương Tấn Nhựt (2013), “Nghiên cứu tác động ánh sáng đèn LED lên khả tăng sinh mô sẹo hình thành hồn chỉnh từ phơi vơ tính sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha ET Grushv.)”, Báo cáo khoa học - Hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc, NXB Khoa học tự nhiên công nghệ, tr 1038 – 1042 20 Nguyễn Thị Tâm, Vũ Thu Thủy (2016), Giáo trình Cơng nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Đại học Thái Nguyên 21 Ninh Thị Thảo, Lê Tiến Vinh, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Phương Thảo (2015), “Nghiên cứu cảm ứng nuôi cấy rễ tơ Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 13(2), tr 251 - 258 22 Bùi Đình Thạch, Nguyễn Minh Hiếu, Phạm Thị Phương Uyên, Ngô Kế Sương, Nguyễn Hữu Hổ (2012), “Tạo nguyên liệu in vitro bước đầu khảo sát khả tạo rễ tơ Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.)”, Tạp chí sinh học, 2012, 34(3se), tr 161 - 169 23 Bùi Văn Thắng (2017), “Nhân giống in vitro Hà thủ ô đỏ (Polygonum Multiforum Thunb) tuyển chọn tỉnh Hà Giang’’, Tạp chí khoa học Cơng nghệ Lâm Nghiệp, (4), tr 23 - 28 24 Vũ Thị Như Trang, Chu Hoàng Mậu (2017), “Nghiên cứu tạo rễ tơ Thổ nhân sâm Việt Nam (Talinum paniculatum Gaertn.)”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 33(2S), tr 233 - 241 25 Trần Ngọc Truồi, Nguyễn Đăng Nhật, Nguyễn Văn Đức, Trần Thị Triệu Hà, Nguyễn Tiến Long, Lã Thị Thu Hằng (2017), “Nghiên cứu ảnh hưởng hệ thống chiếu sáng đơn sắc đến trình nhân giống in vitro Hoa Chng (Sinningia speciosa)”, Tạp chí Khoa học & Cơng nghệ nơng nghiệp, 1(1), tr 195 – 200 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 26 Bùi Thanh Tùng, Nguyễn Tiến Vững, Vũ Đức Lợi, Khoa Y Dược; Xác định tên khoa học Ô đầu phương pháp giải trình tự gen ADN; Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, 33(1), tr 19 - 23 27 Võ Châu Tuấn, Huỳnh Minh Tư (2010), “Nghiên cứu nhân giống in vitro Ba kích (Morinda officinalis how)”, Tạp chí Khoa học cơng nghệ, Đại học Đà Nẵng, 5(40), tr 191 - 196 28 Lê Tiến Vinh, Ninh Thị Thảo, Lã Hoàng Anh, Nguyễn Thị Thủy, Nguyễn Thị Phương Thảo (2014), “Quy trình nhân giống in vitro Đan Sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge)”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 12(5), tr 744 - 752 Tài liệu tiếng Anh 29 Autade R H., Fargade S R., Borhade P G., Udmale S K., Choudhary R S (2014), “In vitro propagation of Stevia rebaudiana Bert a natural, non caloric sweetener herb”, J Cell Tissue Res, 14, pp 4659 – 4664 30 Ayyadurai V., Ramar K (2016), “In vitro direct multiple shoot induction from leaf explants of Solanum pubescens Willd.”, Int J Res, 4, pp 23 - 28 31 Cristiano P M., Thiago S L., Rodrigo P C., Renaze R L P., Marco A M (2015), “Evaluation of protocorm formation in meristematic regions of roots and leaves of Miltonia spectabilis moreliana (Orchidaceae)”, Journal of Advances in Biotechnology, 5(1), pp 508 – 513 32 Dhakulkar S., Ganapathi T R., Bhargava S., Bapat V A (2005), “Induction of hairy roots in Gmelina arborea Roxb and production of verbascoside in hairy roots”, Plant Sci, 169, pp 812 - 818 33 Kowalczyk T., Lucka M., Szemraj J., Sakowicz T (2016), “Hairy roots culture as a source of valuable biopharmaceuticals”, Postepy Hig Med Dosw (Online), 70, pp 1-9, doi: 10.5604/17322693.1192186 34 Manuhara Y S W., Kristanti A N., Utami E S W., Yachya A (2015), “Effect of sucrose and potassium nitrate on biomass and saponin content of Talinum paniculatum Gaertn hairy root in balloon-type bubble bioreactor”, Asian J Biol Sci, 5, pp 1027 – 1032 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 35 Ritu M., Nisha K., Iqbal S (2015), “Effect of Growth Regulators on in vitro Cultures of Aconitum heterophyllum: An Endangered Medicinal Plant”, Int J Pure App Biosci (5), pp 50 - 55 36 Jaiswal Y, Liang Z, Ho A, Wong L, Yong P, Chen H, Zhao Z (2014), “Distribution of toxic alkaloids in tissues from three herbal medicine Aconitum species using laser micro-dissection, UHPLC-QTOF MS and techniques”, LC-MS/MS Phytochemistry, 107, pp 155-74 doi: 10.1016/j.phytochem.2014.07.026 37 Jahan A A., Anis M (2009), “In vitro rapid multiplication and propagation of Cardiospermum halicacabum L through axillary bud culture”, Acta Physiol Plant, 31, pp 133 - 138 38 Yongxiang Kang, Łukasz Jakub Łuczaj, Sebastian Ye (2012), “The highly toxic Aconitum carmichaelii Debeaux as a root vegetable in the Qinling Mountains (Shaanxi, China)”, Genetic Resources and Crop Evolution, 59 (7), pp 1569 - 1575 Tài liệu internet 39 Trung tâm liệu thực vật Việt Nam (2019), http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=edir&v=Aconitum%20carmich aeli&list=species, ngày 15/09 /2019 40 Cồn xoa bóp Jamda (2019), http://traphaco.com.vn/vi/san-pham/28-conxoa-bop-jamda.html] , ngày 15/09/2019 41 Từ điển dược liệu (2019), https://wikiduoclieu.org/tu-dien/o-dau/, ngày 08/09 /2019 42 Viện Dược liệu (2019), http://www.vienduoclieu.org.vn, ngày 08/09/2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ... cứu tạo vật liệu khởi đầu ni cấy in vitro Ơ đầu 3.2 Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro Ô đầu 3.3 Nghiên cứu tạo Ơ đầu in vitro hồn chỉnh 3.4 Nghiên cứu trồng vườn ươm 3.5 Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ. .. tạo rễ tơ Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.)’’ Mục tiêu nghiên cứu Xác định môi trường thích hợp ni cấy in vitro tạo rễ tơ Ô đầu (Aconitum carmichaelii Debx.) Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu. .. 3.2.2 Ảnh hưởng kinetin đến khả nhân nhanh sinh trưởng chồi in vitro Ô đầu 29 3.3 Kết tạo Ơ đầu in vitro hồn chỉnh 31 3.3.1 Ảnh hưởng α-NAA đến phát sinh rễ in vitro Ô đầu 31