MỘT số đặc TÍNH của các CHỦNG acinetobacter baumannii gây NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN MANG GEN NDM 1 KHÁNG CARBAPENEM

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM DUY THÁI MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN MANG GEN NDM-1 KHÁNG CARBAPENEM BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM DUY THÁI MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN MANG GEN NDM-1 KHÁNG CARBAPENEM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 BẢN TÓM TẮT LUẬN VĂN NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN HUY HOÀNG PGS TS BÙI THỊ VIỆT HÀ Hà Nội – 2015 MỞ ĐẦU Nhiễm khuẩn bệnh viện (NKBV) thách thức lớn bệnh viện việc điều trị tỷ lệ nhiễm khuẩn ngày cao NKBV nguyên nhân hàng đầu đe dọa đến tính mạng người bệnh, nguyên nhân gây tỷ lệ mắc, tử vong cao cho bệnh nhân bệnh viện giới [76] NKBV thường gây nên vi khuẩn kháng đa kháng sinh, gây nhiều khó khăn cho cơng tác điều trị, kéo dài thời gian mắc bệnh, tăng biến chứng, tăng kháng thuốc vi sinh vật qua tăng mức sử dụng kháng sinh, tăng chi phí dùng thuốc gánh nặng bệnh tật cho người bệnh hệ thống y tế Hiện Acinetobacter baumannii (A baumannii) tác nhân gây bệnh quan trọng hàng đầu tác động đến sở điều trị giới Tuy nhiên gia tăng nhanh chóng chủng vi khuẩn A baumannii kháng lại kháng sinh thuộc nhóm β-lactam, bao gồm kháng sinh nhóm carbapenem thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” Đặc biệt xuất chủng Acinetobacter mang gen New Delhi Metallo-beta-lactamase-1 (NDM-1) kháng carbapenem ghi nhận số quốc gia Đức Vương quốc Anh Trong nghiên cứu gần số bệnh viện Hà Nội, A baumannii chiếm 53,33% (320/600) tổng số chủng vi khuẩn gram âm gây NKBV 95% số chủng kháng lại cephalosporin hệ 3, với kháng sinh nhóm carbapenem Câu hỏi nghiên cứu đặt liệu chủng A baumannii kháng carbapenem phân lập bệnh viện có mang gen NDM-1 hay khơng? Chính cấp thiết ý nghĩa thực tiễn nêu trên, tiến hành đề tài nghiên cứu: “Một số đặc tính chủng Acinetobacter baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện mang gen NDM-1 kháng carbapenem” với mục tiêu: Mục tiêu cụ thể: Mô tả thực trạng kháng kháng sinh chủng A baumannii kháng carbapenem phân lập bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn Phát tỷ lệ vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 phân lập nghiên cứu Xác định số đặc tính sinh học phân tử vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nhiễm khuẩn bệnh viện Theo Tổ chức Y tế Thế giới, nhiễm khuẩn bệnh viện (hospital-acquired infection hay nosocomial infection) “những nhiễm khuẩn người bệnh mắc phải thời gian điều trị bệnh viện mà thời điểm nhập viện khơng thấy có yếu tố nhiễm khuẩn hay ủ bệnh Nhiễm khuẩn bệnh viện thường xuất sau 48 kể từ người bệnh nhập viện” Hiện nhiễm khuẩn bệnh viện vấn đề nghiêm trọng tác động đến sức khoẻ toàn cầu Theo báo cáo tổ chức Y tế giới nhiễm khuẩn bệnh viện từ năm 1995 đến 2010 cho thấy: Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện tính chung cho quốc gia có thu nhập cao nằm khoảng từ 5% đến 12% Tỷ lệ nhiễm khuẩn bệnh viện quốc gia có thu nhập trung bình thấp dao động từ 5,7% đến 19,9% tỷ lệ tính chung khoảng 10,1/100 bệnh nhân 1.2 Kháng sinh đề kháng kháng sinh vi khuẩn Kháng sinh phát kỷ 20 đóng vai trị quan trọng việc khống chế bệnh nhiễm trùng Cho đến nhiều hệ kháng sinh khác nghiên cứu chế tạo thành công đáp ứng kịp thời cho công tác điều trị Tuy nhiên gia tăng tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh bệnh viện cộng đồng vấn đề quan trọng hàng đầu giới cần nghiên cứu tìm giải pháp phịng chống cách hiệu 1.2.1 Lịch sử phát triển kháng sinh Năm 1929 Alexander Fleming người nghiên cứu phát minh loại thuốc kháng sinh có tên Penicillin Tuy nhiên phải đến năm 1939, Ernst Chain Howard Florey tách chiết thành công hoạt chất penicillin sử dụng để điều trị bệnh nhiễm khuẩn chiến tranh giới lần thứ II Năm 1946, penicillin bắt đầu sử dụng lâm sàng có đóng góp to lớn cho y học Bác sỹ người Đức Gerhard Domagk công bố phát minh tổng hợp hoạt chất kháng sinh prontosil Đây hệ kháng sinh thuộc dòng sulfonamides sử dụng lâm sàng để điều trị bệnh nhiễm trùng đường tiết niệu hô hấp số bệnh nhiễm trùng khác Thập kỷ 50 đến 70 kỷ 20 coi thời kỳ hoàng kim kháng sinh, nhiều loại kháng sinh giới thiệu bao gồm: streptomycin, chloramphenicol tetracycline sử dụng điều trị bệnh nhiễm trùng vi khuẩn 1.2.2 Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn 1.2.2.1 Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn Trong tự nhiên phần lớn vi khuẩn sở hữu riêng gen kháng kháng sinh Dưới áp lực chọn lọc tự nhiên đấu tranh sinh tồn giúp loài vi khuẩn có khả chống lại tác dụng kháng sinh, đề kháng kháng sinh vi khuẩn thường xuất nhanh sau kháng sinh đưa vào sử dụng Phân loại đề kháng 1.2.2.2 Đề kháng chia làm hai loại đề kháng giả đề kháng thật Đề kháng giả: tượng có biểu đề kháng chất di truyền Đề kháng thật bao gồm đề kháng tự nhiên đề kháng thu + Đề kháng tự nhiên: Là cấu trúc di truyền số loài vi khuẩn + Đề kháng thu được: Có nhiều chế vi khuẩn phát triển để kháng lại kháng sinh 1.2.3 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn Vi khuẩn có nhiều chết kháng khang sính - 1.2.4 1.3 Thay đổi đích tác động Tạo enzyme Giảm tính thấm màng nguyên sinh chất Các yếu tố nguy gây kháng kháng sinh - Lạm dụng sử dụng kháng sinh cộng đồng - Sử dụng kháng sinh bệnh viện - Sử dụng kháng sinh chăn nuôi - Chất lượng kháng sinh - Gia tăng lại quốc tế Kháng sinh nhóm carbapenem Carbapenem nhóm kháng sinh coi “lựa chọn cuối cùng” dùng để điều trị NKBV Kháng sinh thuộc nhóm carbapenem có khả tiêu diệt vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng sinh enzym beta-lactamase (ESBL) cách ức chế q trình tổng hợp vỏ ngồi tế bào vi khuẩn 1.4 Thực trạng kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm Thực trạng đa kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm vấn đề mang tính tồn cầu, đặc biệt quốc gia phát triển với gánh nặng bệnh nhiễm khuẩn Bằng chứng lây lan chủng vi khuẩn Gram âm Klebsiella, Pseudomonas, E coli, A baumannii mang gen New Delhi Metallo-β-lactamase (NDM-1) kháng carbapenem “thuộc nhóm lựa chọn cuối cùng” số quốc gia Hậu vi khuẩn kháng đa kháng sinh để lại nặng nề, tác động đến nhiều lĩnh vực khác sức khỏe người, kinh tế, dịch tễ học, ngành công nghiệp dược phẩm biện pháp phòng chống vi khuẩn kháng kháng sinh 1.5 Đặc điểm vi sinh vật học tình trạng kháng kháng sinh A baumannii 1.5.1 Đặc điểm vi sinh vật học A baumannii 1.5.1.1 Đặc điểm chung A baumannii chủng Acinetobacter spp có cấu trúc cầu trực khuẩn Gram âm, có nguồn gốc từ thiên nhiên đất, nước, thực phẩm Ngày nay, người ta phát chúng tác nhân thường trú bệnh viện có khả phát tán lây lan thành vụ dịch A baumannii vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối dễ mọc mơi trường thông thường nhiệt độ 20 - 30oC, nhiệt độ tối ưu 35oC 1.5.1.2 Đặc điểm sinh học A baumannii A baumannii có tính chất sinh học thay đổi tùy theo điều kiện mơi trường sống, tính chất giúp vi khuẩn tồn lâu mơi trường, dụng cụ dùng chăm sóc điều trị bệnh nhân bệnh viện, đặc biệt khả kháng với hầu hết loại kháng sinh thông thường với kháng sinh điều trị đặc hiệu cho vi khuẩn kháng sinh nhóm carbapenem 1.5.2 Cơ chế kháng kháng sinh A baumannii A baumannii có khả kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau, đề kháng với kháng sinh dùng để điều trị đặc hiệu cho vi khuẩn Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn khác theo loài, địa phương A baumannii với đặc tính lồi có khả tích lũy nhiều gen kháng kháng sinh dẫn đến phát triển chủng đa kháng Có bốn chế thường gặp gây tượng đa kháng thuốc A baumannii nói đến nhiều là: (i) Thay đổi vị trí đích tác động (thay đổi đích PBP) (ii) Đột biến kênh porin không cho kháng sinh qua màng vào bên vi khuẩn, (iii) Bất hoạt kháng sinh qua bơm đẩy kháng sinh (iv) tiết enzyme để phá hủy kháng sinh 1.5.3 Tình hình A baumannii kháng carbapenem Thế giới Hiện nay, vi khuẩn A baumannii biết đến tác nhân quan trọng hàng đầu gây nhiễm khuẩn bệnh viện toàn giới Đặc biệt 15 năm trở lại có nhiều phát quan trọng khả thích ứng loại vi khuẩn nhằm kháng lại kháng sinh báo cáo, điều cho thấy loại vi khuẩn đe dọa đến thời đại kháng sinh Hiện số chủng A baumannii kháng lại tất kháng sinh có báo cáo, cần phải giám sát chặt chẽ chí phải đưa hành động cụ thể nhằm ngăn chặn lây lan vi khuẩn hệ thống y tế toàn giới 1.5.4 Tình hình A baumannii kháng carbapenem Việt Nam Ở bệnh viện vi khuẩn Gram âm kháng lại kháng sinh mức độ cao Theo tổng kết thực trạng kháng kháng sinh hiệp hội kháng kháng sinh toán cầu (GARP) Việt Nam từ nghiên cứu khác bệnh viện thành phố Hồ Chí Minh cho thấy từ năm 2000-2001 có 25% vi khuẩn Gram âm phân lập kháng lại cephalosporin, nhiên năm 2009 42% số chủng vi khuẩn Gram âm kháng lại cefftazidime, gentamicin 63% nalidixic acid 74% [1] Nghiên cứu gần nhóm nghiên cứu chúng tơi tiến hành năm từ 2010-2011 nhằm phát tỷ lệ kháng carbapenem vi khuẩn Gram âm gây nhiễm khuẩn bệnh viện Hà Nội Kết ban đầu cho thấy A baumannii chiếm tỷ lệ nhiễm khuẩn cao 53,33% (320/600) tổng số chủng vi khuẩn Gram âm thu thập 95% kháng lại cephalosporin hệ với kháng sinh thuộc nhóm carbapenem Đặc biệt phát 5% (16/320) số chủng A baumannii mang gen NDM-1 bệnh viện CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG,VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng A baumannii phân lập từ bệnh viện Hà Nội bao gồm: bệnh viện Việt Đức, bệnh viện Thanh Nhàn bệnh viện Xanh Pôn giai đoạn 2010-2014 2.2 Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm vật tư tiêu hao - Trang thiết bị, sinh phẩm dụng cụ tiêu hao đầy đủ đạt tiêu chuẩn sử dụng nghiên cứu 2.3 Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu hồi cứu – mô tả cắt ngang 2.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu tiến hành từ: năm 2014 đến 2015 Địa điểm nghiên cứu: Tại phịng thí nghiệm Kháng sinh Khoa Vi khuẩn Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 2.5 Cỡ mẫu nghiên cứu Cỡ mẫu nghiên cứu: Cỡ mẫu toàn bao gồm 582 chủng A baumannii thu thập từ bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn từ năm 2010 đến năm 2014 Các chủng A baumannii phân lập từ bệnh phẩm nhiễm khuẩn như: máu, đờm khí quản, nước tiểu, dịch vết mổ … 2.6 Các phương pháp nghiên cứu 2.6.1 Các kỹ thuật phát vi khuẩn kháng kháng sinh 2.6.1.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán thạch Mức độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh biểu đường kính vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh Đường kính vịng vơ khuẩn thu ghi lại tính toán dựa theo tiêu chuẩn CLSI, năm 2010 Các loại khoanh giấy kháng sinh sử dụng bao gồm imipenem (IMP), meropenem (MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacin (AK) colistin (CS) Chủng chuẩn quốc tế: Escherichia coli ATCC-25922 tiến hành song song với chủng vi khuẩn thử nghiệm 2.6.1.2 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) Các chủng vi khuẩn thử nghiệm nuôi cấy đĩa thạch Muellerhinton có nồng độ kháng sinh khác theo tiêu chuẩn CLSI ủ 37 oC qua đêm (khoảng 18 giờ) Nồng độ kháng sinh tối thiểu có tác dụng ức chế vi khuẩn xác định mật độ khuẩn lạc ≤ Các kháng sinh thử nghiệm bao gồm imipenem (IMP), meropenem (MEM), ceftazidime (CAZ), cefotaxime (CTX), ciprofloxacin (CIP), gentamicin (GM), amikacin (AK) colistin (CS) Chủng chuẩn quốc tế: Escherichia coli ATCC-25922 tiến hành song song với chủng vi khuẩn thử nghiệm 2.6.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử 2.6.2.1 Kỹ thuật PCR phát vi khuẩn mang gen NDM-1 Trình tự mồi để phát gen NDM-1 vi khuẩn TT Tên Trình tự mồi Kích thước (bp) Ndm1-F 5’-atgcacccggtcgcgaagctgag-3’ Ndm1-R 5’-ttcgacccagccattggcggcga-3’ 499 Vi khuẩn sau xác định chủng nuôi cấy môi trường thạch dinh dưỡng tách triết DNA để làm khuân mẫu cho phản ứng PCR Sản phẩm PCR điện di thạch điện di agarose nồng độ 1,5% đệm TAE 1X 30 phút Sau điện di xong gel nhuộm dung dịch ethidium bromine nồng độ 10mg/ml 10 phút, rửa nước cất 15 phút Gel mang quan sát chụp lại máy chụp ảnh gel 2.6.2.2 Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử kỹ thuật multilocus sequence typing (MLST) Kỹ thuật MLST sử dụng PCR để khuếch đại đoạn gen bảo tồn (gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi rpoD) sau tiến hành giải trình tự phân tích kết sở liệu MLST Acinetobacter baumannii http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_abaumannii_oxford_seqdef Bảng 2.2 Các trình tự mồi sử dụng kỹ thuật MLST chủng A baumannii Kích TT Tên Trình tự mồi thước (bp) gltA -F gltA -R gyrB -F Tài liệu tham khảo AAT TTA CAG TGG CAC ATT AGG TCC C GCA GAG ATA CCA GCA GAG ATA 772 CAC G TGA AGG CGG CTT ATC TGA GT A baumannii MLST website 594 2.6.2.3 gyrB -R GCT GGG TCT TTT TCC TGA CA gdhB -F GCT ACT TTT ATG CAA CAG AGC C gdhB -R GTT GAG TTG GCG TAT GTT GTG C recA -F CCT GAA TCT TCY GGT AAA AC recA -R GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC cpn60-F GGT GCT CAA CTT GTT CGT GA cpn60-R CAC CGA AAC CAG GAG CTT TA gpi-F GAA ATT TCC GGA GCT CAC AA gpi-R TCA GGA GCA ATA CCC CAC TC rpoD -F ACC CGT GAA GGT GAA ATC AG rpoD -R TTC AGC TGG AGC TTT AGC AAT 774 425 640 456 672 Phân tích mối liên hệ kiểu gen chủng A baumannii kỹ thuật PFGE [39] - Tách DNA vi khuẩn đệm thạch: Rửa plug sau ly giải: Cắt DNA vi khuẩn enzyme cắt giới hạn: Cắt chromosomal DNA vi khuẩn tách chiết thạch Enzym giới hạn XbaI (đối với chủng chuẩn Braenderup H9812 ) ApaI (cho A baumannii) nồng độ 30UI/ miếng thạch 370C vòng 12-16 Sản phẩm cắt DNA điện di điện di CHEF-DR III (Bio-Rad laboratories, Richmond, Calif) thạch Seakem gold 1%, hiệu điện 6V/cm 19 nhiệt độ 14 0C, thời gian xung từ 25 đến 60s góc 2.6.2.4 điện trường 120 độ Phát plasmid mang gen NDM-1 kỹ thuật Southern-Blotting [39] - Tạo mẫu dò cho gen NDM-1: Tách chiết DNA vi khuẩn đệm thạch (giống với phương pháp PFGE phần 2.6.2.3) - Thực kỹ thuật S1-PFGE: Cắt loại bỏ DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn enzym S1 nồng độ 20UI/200µl dung dịch đệm enzym S1, Ủ 37 0C Sản phẩm cắt DNA điện di điện di CHEF-DR III (BioRad laboratories, Richmond, Calif) thạch Seakem gold 1% để tách CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mô tả thực trạng kháng kháng sinh chủng A baumannii kháng carbapenem phân lập bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn Trong năm, từ năm 2010 đến năm 2014 nghiên cứu thu thập 582 chủng A baumannii kháng carbapenem bệnh viện Hà Nội (Hình 3.1) Hình 3.1 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem bệnh viện theo năm (n=582) Trong 582 chủng A baumannii phân lập bệnh viện, có 428 chủng phát nam giới chiếm khoảng 74% 154 chủng phát nữ giới chiếm khoảng 26% tổng số trường hợp (tỷ suất chênh Nam/nữ=2,78) (Hình 3.2) Hình 3.2 Tỷ lệ phân bố chủng vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem bệnh viện theo giới (n=582) Tỷ lệ giới thể rõ bệnh viện biểu đồ tỷ lệ phân bố theo giới phát chủng A baumannii kháng carbapenem (Hình 3.3) Hình 3.3 Phân bố theo giới chủng A baumannii kháng carbapenem bệnh viện (n=582) Tỷ lệ bệnh nhân nam nhiễm khuẩn bệnh viện vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem cao nhiều so với bệnh nhân nữ bệnh viện (Hình 3.3) 3.2 Phát tỷ lệ vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập nghiên cứu Trong nghiên cứu này, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen NDM-1 (Ndm1-F: 5’-atgcacccggtcgcgaagctgag-3’; Ndm1-R: 5’- ttcgacccagccattggcggcga-3’) để phát chủng A baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 [79] Hình 3.4 Hình ảnh đại diện cho chủng vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 nghiên cứu P: positive; N: negative; M: thang chuẩn 100bp Kết cho thấy 23/582 chủng A baumannii, phát dương tính với gen NDM-1 chiếm khoảng 3,95% tổng số chủng thu thập Hình 3.5 Tỷ lệ vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem nghiên cứu (n=582) 3.2.1 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 phân lập bệnh viện Trong 23 chủng A baumannii mang gen NDM-1, có chủng phân lập từ bệnh viện Việt Đức, chủng phân lập bệnh viện Thanh Nhàn 11 chủng phân lập bệnh viện Xanh Pơn Hình 3.6 Tỷ lệ phân bố A baumannii mang gen NDM-1 bệnh viện (n=23) 3.2.2 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 theo khoa Sự phân bố theo khoa chủng A baumannii mang gen NDM-1 thể biểu đồ Hình 3.7 Hình 3.7 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 theo khoa bệnh viện (n=23) Tỷ lệ phát vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 Khoa Nhi bệnh viện Xanh Pôn cao khoa bệnh viện, liệu có xuất nhiễm khuẩn chéo xảy bệnh viện Xanh pơn cơng tác phịng chống nhiễm khuẩn chưa hiệu 3.2.3 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 theo nhóm tuổi theo giới Trong 23 trường hợp phát nhiễm khuẩn mang gen NDM-1 có độ tuổi từ đến 77 tuổi Trong nhóm tuổi < 10 tuổi chiếm tỷ lệ 36%, cao so với nhóm tuổi khác tập trung Khoa Nhi bệnh viện Xanh Pôn (Hình 3.8) Hình 3.8 Tỷ lệ phân lập chủng A baumannii mang gen NDM-1 theo độ tuổi (n=23) Theo số liệu thống kê được, số lượng chủng A baumannii phân lập bệnh viện Xanh Pơn bệnh viện Tuy nhiên, số trường hợp phát chủng mang gen NDM-1 lại cao so với bệnh viện lại chủ yếu phát Khoa Nhi Liệu điều có liên quan đến nhiễm khuẩn chéo khoa cơng tác phịng chống nhiễm khuẩn bệnh viện thực chưa đạt hiệu mong đợi bệnh nhân điều trị đông dẫn đến tình trạng tải bệnh viện Điều chứng minh kỹ thuật sinh học phân tử thực 3.2.4 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 theo giới Trong 23 ca phân lập vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 có trường hợp nữ giới (13%) 20 trường hợp nam giới (87%) Tỷ xuất giới tính Nam/Nữ 6.67/1 (Hình 3.9) Hình 3.9 Tỷ lệ chủng A baumannii mang gen NDM-1 theo giới (n=23) 3.2.5 Mức độ nhạy cảm kháng sinh chủng A baumannii mang gen NDM-1 Kết thử nghiệm nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) chủng A baumannii dương tính với NDM-1 cho thấy: tất chủng kháng lại kháng sinh Cefotaxime (>64mg/L), Ceftazidime (>32mg/L) Hầu chủng kháng với kháng sinh thuộc nhóm carbapenem (nhóm kháng sinh cho lựa chọn cuối để điều trị nhiễm khuẩn) bao gồm: Imipenem, Meropenem Chỉ có chủng kháng imipenem meropenem mức độ trung gian (4) Trong nghiên cứu này, phần lớn chủng A baumannii kháng lại với nhóm cephalosporin carbapenem Tuy nhiên, chủng có nhiều chủng nhạy cảm với ciprofloxacin (11 chủng) Điều lý giải Việt Nam, kháng sinh thuộc nhóm carbapenem đưa vào sử dụng sớm (từ đầu năm 2000) Việc đưa carbapenem vào điều trị bệnh nhân nhiễm trùng bệnh viện sớm với liều cao gây áp lực cho chủng vi khuẩn dẫn đến tình trạng kháng lại nhóm kháng sinh 3.3 Xác định số đặc tính sinh học phân tử vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 3.3.1 Kiểu gen PFGE chủng vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 DNA chủng A baumannii mang gen NDM-1 xử lý enzyme ApaI sau chạy điện di xung trường 19 Kết đọc máy Biodoc phân tích phần mềm BioNumerics Hình 3.10 Hình ảnh đại diện cho kiểu gen PFGE số chủng A baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem nghiên cứu Hình 3.11 Cây phân loại kiểu gen PFGE chủng A baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem Kết nghiên cứu cho thấy, phân tích 23 chủng A baumannii mang gen NDM-1 kỹ thuật PFGE, chia thành nhóm (Hình 3.11) Nhóm I, Nhóm II, Nhóm III Nhóm IV với mức độ tương đồng Nhóm I, II, III khoảng 90% độ tương đồng nhóm IV 100% Nhóm I bao gồm chủng (1105TN, 1398TN, 1146TN) phân lập từ bệnh viện Thanh Nhàn năm 2013 Nhóm II gồm chủng 303VD 320TN phân lập bệnh viện Việt Đức bệnh viện Thanh Nhàn năm 2011 Nhóm III gồm chủng (351XP, 357XP, 393XP, 650XP, 327XP, 275XP, 282XP, 271XP) phân lập bệnh viện Xanh Pôn từ năm 2011 2012 Nhóm IV gồm chủng 1267VD 1413VD phân lập bệnh viện Việt Đức năm 2013 Ở nhóm III, cặp chủng (351XP, 357XP) (275XP, 282XP) có kiểu gen PFGE giống hồn tồn Qua phiếu điều tra bệnh án, phát chủng phân lập từ Khoa Nhi, bệnh viện Xanh Pơn Bên cạnh đó, Nhóm IV gồm chủng 1267VD khoa Hồi Sức 1413VD khoa Phẫu thuật nhiễm khuẩn bệnh viện Việt Đức có tương đồng kiều gen PFGE 100% Các nghiên cứu giới cho thấy, chủng A baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem không thuộc kiểu gen (single clone) mà có đa dạng kiểu gen [70] Trong nghiên cứu kết PFGE cho thấy kiểu gen chủng A baumannii phân lập chia làm nhóm khác có tương đồng với tỷ lệ định Ngồi có số chủng A baumannii có kiểu gen khác hồn tồn so với chủng cịn lại Điều chứng tỏ đa dạng mặt kiểu gen chủng A baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem phân lập bệnh viện Quan trọng nghiên cứu phát nhóm vi khuẩn có độ tương đồng 90% có cặp vi khuẩn phân lập có kiểu gen tương đồng 100% (2 cặp Xanh Pôn cặp Việt Đức) cho thấy có mối liên hệ chủng A baumannii bệnh nhân khoa (Khoa Nhi – Xanh Pôn) khoa khác bệnh viện (Khoa Hồi sức Khoa Phẫu thuật nhiễm khuẩn – Việt Đức) Điều chứng tỏ có lây lan chủng A baumannii mang gen NDM-1 khoa bệnh viện (Xanh Pơn, Việt Đức) có liên hệ chủng A baumannii bệnh viện Việt Đức Thanh Nhàn (Nhóm II) Hiện kỹ thuật PFGE sử dụng nhiều để nghiên cứu đánh giá lây truyền vi khuẩn gây bệnh trọng bệnh viện cộng đồng 3.3.2 Phát plasmid mang gen NDM-1 Kết Southern blotting cho thấy có chủng phân lập có chứa plasmid mang gen NDM-1 Kích thước plasmid khoảng 50kb thuộc type NrepA (Hình 3.12) Hầu hết chủng A baumannii dương tính với NDM-1 có gen NDM-1 nằm nhiễm sắc thể chúng tơi tiến hành thí nghiệm Southern blotting với enzyme IceuI (loại enzym cắt dùng cho nhiễm sắc thể dùng thí nghiệm Southern blotting) Hình 3.12 Kết đại diện phát plasmid mang gen NDM-1 số chủng vi khuẩn A baumannii phân lập bệnh viện Trong nghiên cứu này, phát chủng A baumannii phân lập bệnh viện Thanh Nhàn có plasmid với kích thước khoảng 50kb tương đồng với số plasmid chủng vi khuẩn đường ruột mang gen NDM-1 phân lập bệnh viện Việt Đức [3].Trong nghiên cứu vi khuẩn đường ruột gây nhiễm khuẩn bệnh viện mang gen NDM-1 kháng carbapenem ba bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pơn tác giả Trần Huy Hồng cộng sự, đa số chủng dương tính với NDM-1 có nhiều Plasmid mang gen NDM-1 [3] Có thể lý giải cho khác sau, chủng A baumannii có khác biệt với chủng vi khuẩn đường ruột Gram âm hệ thống porin (kênh protein màng) Hệ thống porin A baumannii nhỏ so với vi khuẩn đường ruột Gram âm hạn chế plasmid qua màng tế bào thông qua đường tiếp hợp để truyền plasmid mang gen kháng kháng sinh ngồi Tuy nhiên có plasmid mang gen NDM-1 chứng tỏ có truyền plasmid từ chủng vi khuẩn đường ruột sang 3.3.3 A baumannii Kỹ thuật multilocus sequence typing xác định kiểu gen chủng vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 Kỹ thuật thực phản ứng PCR với cặp mồi bao gồm: gltA, gyrB, gdhB, recA, cpn60, gpi rpoD Hình 3.13 Hình ảnh đại diện cho PCR – MLST chủng A baumannii Sau điện di xác định kết phản ứng PCR, sản phẩm PCR tinh mang giải trình tự máy đọc trình tự ABI-3130 (Applied Biosystem, Mỹ) Kết giải trình tự đọc phân tích phần mềm Bioedit website http://pubmlst.org Bảng 3.2 Phân tích kết MLST chủng A baumannii Chúng tiến hành giải trình tự song song chủng A baumannii mang gen NDM-1 chủng không mang gen NDM-1 phân lập từ bệnh viện (Bảng 3.2) Đối với 12 chủng dương tính với NDM-1 nghiên cứu, có tới kiểu trình tự (ST) phát chia làm nhóm (clonal complex) gồm nhóm A, B, C, D CC92 Trong 11 chủng âm tính với NDM-1, có kiểu trình tự tìm thấy chia làm nhóm gồm CC92, E, CC109, F Kết MLST phát chủng thuộc kiểu trình tự biết, cịn lại kiểu trình tự chưa cơng bố giới Điều giải thích việc sử dụng kháng sinh nhóm carbapenem Việt Nam tạo áp lực chọn lọc cho A baumannii tiến hóa theo hướng riêng không giống với nơi khác giới Nghiên cứu có chủng thuộc nhóm cơng bố giới nhóm CC92 CC109 hai nhóm gây dịch bệnh giới [34] Đây phát quan trọng cho thấy bệnh viện Việt Nam xuất chủng A baumannii có nguy gây dịch đồng thời xuất chủng áp lực việc điều trị nhiễm khuẩn kháng sinh, điều trở thành áp lực lớn ngành y tế cơng tác phịng chống điều trị nhiễm khuẩn bệnh viện Đặc biệt, ta so sánh 12 chủng phân lập mang gen NDM-1 với 11 chủng âm tính với gen này, chủng mang gen NDM-1, số kiểu trình tự phát nhiều hẳn so với chủng âm tính với NDM-1 Quan trọng tất chủng thuộc novel nằm bệnh viện Xanh Pơn tìm thấy allele giống hồn tồn, điều cho thấy có mối liên hệ chủng gây nhiễm trùng bệnh viện với Bên cạnh chủng thuộc ST 302 có chủng phân lập Việt Đức chủng phân lập Xanh Pôn có allele giống nhau, thấy phải chủng có đặc trưng riêng gây nhiễm khuẩn bệnh viện Để đến kết luận xác, chi tiết cần phải tiến hành điều tra thêm yếu tố dịch tễ học lâm sàng nghiên cứu sâu kỹ thuật sinh học phân tử KẾT LUẬN Tình trạng kháng kháng sinh chủng A baumannii kháng carbapenem phân lập bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pơn • Đã phát tỷ lệ cao chủng vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem (28%; 582/2088) tổng số chủng vi khuẩn kháng carbapenem bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn thu • thập năm từ năm 2010 đến 2014 Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm A baumannii kháng carbapenem nam giới cao nhiều so với nữ giới (74%, 26%) Tỷ lệ vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 phân lập nghiên cứu • 23/582 A baumannii kháng carbapenem có kết dương tính với gen NDM-1 chiếm tỷ lệ 3,95 % • Các chủng mang gen NDM-1 phân lập bệnh nhân thuộc nhiều nhóm tuổi, cao trẻ nhỏ 10 tuổi phát bệnh viện Xanh Pơn Tỷ lệ phân lập theo giới có chênh lệch đáng kể nam giới chiếm tới 87% so với 13% nữ giới (tỷ suất chênh 6,67) • Kết MIC cho thấy chủng A baumannii mang gen NDM-1 kháng lại kháng sinh với tỷ lệ cao Một số đặc tính sinh học phân tử vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 • Bốn chủng phân lập bệnh viện Xanh Pôn chủng chủng phân lập bệnh viện Việt Đức có tương đồng hồn tồn kiểu gen • PFGE Một chủng phân lập bệnh viện Thanh Nhàn phát plasmid mang gen NDM-1 có kích thước khoảng 50kb • Kết MLST cho thấy có chủng A baumannii mang gen NDM-1 bệnh viện Việt Đức nằm nhóm CC92 gây dịch giới, chủng cịn lại có kiểu trình tự gen khơng giống với kiểu trình tự gen công bố hệ thống MLST ngân hàng gen giới KIẾN NGHỊ Đối với bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pơn: • Cần tiếp tục giám sát tình trạng vi khuẩn A baumannii mang gen NDM- kháng carbapenem ba bệnh viện • Các bệnh viện cần mở rộng hợp tác nghiên cứu để nghiên cứu sâu đặc điểm lâm sàng, đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng vi khuẩn mang gen NDM-1