Một số đặc tính của các chủng acinetobacter baumannii gây nhiễm khuẩn bệnh viện mang gen NDM 1 kháng carbapenem

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM DUY THÁI MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN MANG GEN NDM-1 KHÁNG CARBAPENEM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM DUY THÁI MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG Acinetobacter baumannii GÂY NHIỄM KHUẨN BỆNH VIỆN MANG GEN NDM-1 KHÁNG CARBAPENEM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN HUY HOÀNG PGS TS BÙI THỊ VIỆT HÀ Hà Nội – 2015 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi nhận giúp đỡ nhiệt tình nhiều người Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Trần Huy Hồng, Phó trưởng Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương PGS TS Bùi Thị Việt Hà, Chủ nhiệm Bộ môn Vi sinh vật học trường Đại học Khoa học Tự nhiên ĐHQG Hà Nội, người thầy tận tình hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, cán môn Vi sinh vật học khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Hà Nội có nhiều dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình học tập Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (Nafosted) tài trợ kinh phí để tơi thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn PGS TS Trần Như Dương, chủ nhiệm đề tài Nafosted, tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Để hồn thành luận văn, tơi nhẫn giúp đỡ quý báu bạn đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Trần Vân Phương, CN Nguyễn Hiệp Lê Yên anh chị đồng nghiệp Khoa Vi khuẩn – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cuối cùng, vô biết ơn gia đình, bạn bè giúp đỡ động viên tơi suốt q trình học tập thực đề tài Hà Nội, ngày tháng Học Viên Phạm Duy Thái năm 2015 Nghiên cứu đƣợc thực dựa đề tài dự án: Đề tài nghiên cứu khoa học tự nhiên quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia tài trợ kinh phí thực hiện, tên đề tài: “ Ứng dụng kỹ thuật Multilocus Sequence Typing (MLST) để mô tả đặc điểm dịch tễ học phân tử chủng vi khuẩn A baumannii mang gen New Delhi Metallo – β – lactamase phân lập đƣợc bệnh viện Hà Nội năm (2010-2014)” PGS TS Trần Như Dương, Phó viện trưởng viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương làm chủ nhiệm dự án MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Nhiễm khuẩn bệnh viện 1.2 Kháng sinh đề kháng kháng sinh vi khuẩn 10 1.2.1 Lịch sử phát triển kháng sinh 10 1.2.2 Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn 11 1.2.2.1 Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn 11 1.2.2.2 Phân loại đề kháng 13 1.2.3 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn 14 1.2.3.1 Thay đổi đích tác động 14 1.2.3.2 Tạo enzym 15 1.2.3.3 Giảm tính thấm màng nguyên sinh chất 15 1.2.4 Các yếu tố nguy gây kháng kháng sinh 15 1.2.4.1 Lạm dụng sử dụng kháng sinh cộng đồng 15 1.2.4.2 Sử dụng kháng sinh bệnh viện 16 1.2.4.3 Sử dụng kháng sinh chăn nuôi 17 1.2.4.4 Do bác sỹ 17 1.2.4.5 Chất lượng kháng sinh 18 1.2.4.6 Gia tăng lại quốc tế 18 1.2.4.7 Hệ thống giám sát kháng sinh 18 1.3 Kháng sinh nhóm carbapenem 19 1.4 Thực trạng kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm 22 1.5 Đặc điểm vi sinh vật học tình trạng kháng kháng sinh A baumannii 23 1.5.1 Đặc điểm vi sinh vật học A baumannii 23 1.5.1.1 Đặc điểm chung 23 1.5.1.2 Đặc điểm sinh học A baumannii 24 1.5.2 Cơ chế kháng kháng sinh A baumannii 26 1.5.3 Đặc điểm gen kháng kháng sinh nhóm carbapenem A baumannii 27 1.5.4 Tình hình A baumannii kháng carbapenem Thế giới 30 1.5.5 Tình hình A baumannii kháng carbapenem Việt Nam 32 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG,VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Đối tượng nghiên cứu 35 2.2 Vật liệu nghiên cứu – trang thiết bị sinh phẩm vật tư tiêu hao 35 2.3 Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu hồi cứu – mô tả cắt ngang 35 2.4 Thời gian địa điểm nghiên cứu 35 2.5 Cỡ mẫu nghiên cứu 35 2.6 Các phương pháp nghiên cứu 35 2.6.1 Các kỹ thuật phát vi khuẩn kháng kháng sinh 35 2.6.1.1 Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán thạch 35 2.6.1.2 Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) 36 2.6.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử 36 2.6.2.1 Kỹ thuật PCR phát vi khuẩn mang gen NDM-1 36 2.6.2.2 Phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử kỹ thuật multilocus sequence typing (MLST) 37 2.6.2.3 Phân tích mối liên hệ kiểu gen chủng A baumannii kỹ thuật PFGE…… 39 2.6.2.4 Phát plasmid mang gen NDM-1 kỹ thuật SouthernBlotting … 40 2.7 Quản lý phân tích số liệu 41 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Mô tả thực trạng kháng kháng sinh chủng A baumannii kháng carbapenem phân lập bệnh viện Việt Đức, Thanh Nhàn, Xanh Pôn 43 3.2 Phát tỷ lệ vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 phân lập nghiên cứu 45 3.2.1 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 phân lập bệnh viện 47 3.2.2 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1theo khoa 47 3.2.3 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 theo nhóm tuổi theo giới 48 3.2.4 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 theo giới 49 3.2.5 Mức độ nhạy cảm kháng sinh chủng A baumannii mang gen NDM-1… 50 3.3 Xác định số đặc tính sinh học phân tử vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 52 3.3.1 Kiểu gen PFGE chủng vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 52 3.3.2 Phát plasmid mang gen NDM-1 56 3.3.3 Kỹ thuật multilocus sequence typing xác định kiểu gen chủng vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem mang gen NDM-1 57 3.4 Hướng nghiên cứu 60 KẾT LUẬN 62 KIẾN NGHỊ 64 Tài Liệu Tham Khảo 65 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên Bảng Trang 1.1 Phân loại số nhiễm khuẩn bệnh viện 1.2 Sự phát triển đề kháng kháng sinh vi khuẩn 12 1.3 Một số đặc tính enzym ly giải carbapenem chủng vi khuẩn Gram âm 21 2.1 Trình tự mồi để phát gen NDM-1 vi khuẩn 38 2.2 Các trình tự mồi sử dụng kỹ thuật MLST chủng A baumannii 40 3.1 Nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC) 23 chủng vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 phân lập nghiên cứu 53 3.2 Phân tích kết MLST chủng A baumannii 61 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên Hình Trang 1.1 Sơ đồ nhiễm khuẩn bệnh viện 1.2 Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện nước có thu nhập cao 1.3 Tỷ lệ phân bố nhiễm khuẩn bệnh viện nước có thu nhập thấp trung bình 1.4 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm 14 1.5 Cấu trúc phân tử carbapenem 19 1.6 Sự phân bố cách thức di truyền kiểu gen OXA A baumannii 30 3.1 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem bệnh viện theo năm (n=582) 45 3.2 Tỷ lệ phân bố chủng vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem bệnh viện theo giới (n=582) 46 3.3 3.4 3.5 3.6 Phân bố theo giới chủng A baumannii kháng carbapenem bệnh viện (n=582) Hình ảnh đại diện cho chủng vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 nghiên cứu Tỷ lệ vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem nghiên cứu (n=23) Tỷ lệ phân bố A baumannii mang gen NDM-1 bệnh viện (n=23) 46 48 48 49 3.7 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A baumannii mang gen NDM-1 theo khoa bệnh viện (n=23) 50 3.8 Tỷ lệ phân lập chủng A baumannii mang gen NDM-1 theo độ tuổi (n=23) 51 3.9 Tỷ lệ chủng A baumannii mang gen NDM-1 theo giới (n=23) 52 3.10 Hình ảnh đại diện cho kiểu gen PFGE số chủng A baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem nghiên cứu 55 3.11 Cây phân loại kiểu gen PFGE chủng A baumannii mang gen NDM-1 kháng carbapenem 56 3.12 Kết đại diện phát plasmid mang gen NDM-1 số chủng vi khuẩn A baumannii phân lập bệnh viện 58 3.13 Hình ảnh đại diện cho PCR – MLST chủng A baumannii 60 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết đầy đủ tiếng anh Ký hiệu Viết giải nghĩa tiếng việt DNA Deoxyribonucleic Acid Phân tử axit nucleic bp Base pair Đơn vị đo trọng lượng phân tử DNA CDC Centers for Disease Control and Prevention Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa bệnh dịch ESBL Extended-spectrum beta-lactamases Enzym kháng kháng sinh phổ rộng beta lactam GARP Global Antibiotic Resistance Partnership Hiệp hội kháng kháng sinh toàn cầu MBLs Metallo-beta-lactamase Enzym kháng kháng sinh nhóm beta lactam MLST Multilocus Sequence Typing Phân loại dựa đa điểm trình tự gen NDM-1 New Delhi Metallo-beta-lactamase-1 New Delhi Metallo-betalactamase-1 kháng carbapenem PCR Polymerase chain reaction Chuỗi phản ứng trùng hợp PFGE Pulsed-field gel electrophoresis Điện di xung trường WHO World Health Orgnization Tổ chức Y tế Thế giới 27 Feil, E J., Smith J M , Enright M C., Spratt B G (2000), "Estimating recombinational parameters in Streptococcus pneumoniae from multilocus sequence typing data", Genetics 154, pp 1439-1450 28 Fournier, P E., Richet H (2006), "The epidemiology and control of Acinetobacter baumannii in health care facilities", Clinical Infectious Diseases 42, pp 692-699 29 Fu Y., Zhou J., Zhou H et al (2010), "Wide dissemination of OXA-23producing carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clonal complex 22 in multiple cities of China", Journal Antimicrob Chemother 65, pp 644-50 30 GARP-Vietnam (2010), "Situation Analysis on Antibiotic Use and resistance in Vietnam", Global Antibiotic Resistance Partnership (GARP)-Vietnam, Hanoi, Vietnam 31 Gerischer, Ulrike (2008), "Acinetobacter Mocular Biological, International Microbiology Caister Academic Press Norfolk UK", pp 147-150 32 Giannouli M., Tomasone F., Agodi A et al (2002), "Molecular epidemiology of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii strains in intensive care units of multiple Mediterranean hospitals", Journal of Antimicrobial Chemotherapy 46, pp 2155-2161 33 Goel P., Ross-Degnan D., Berman P., Soumerai S (1996), "Retail pharmacies in developing countries: a behavior and intervention framework", Social Science & Medicine - Journal 42, pp 1155-1161 34 Guyon A B., Barman A., Ahmed J U., Ahmed A U., Alam M S (1994), "A baseline survey on use of drugs at the primary health care level in Bangladesh", Bull World Health Organ 72, pp 265-271 35 Haak, H (1988), "Pharmaceuticals in two Brazilian villages: lay practices and perceptions", Social Science & Medicine - Journal 27, pp 1415-1427 68 36 Jale Moradi, Farhad B., Abbas Bahador (2015), "Antibiotic Resistance of Acinetobacter baumannii in Iran: A Systemic Review of the Published Literature", Osong Public Health Res Perspect 6(2), pp 79–86 37 Klevens, R.M etal (2007), "Estimating health care associated infections and deaths in U.S hospitals, 2002", Public Health Reports 122, pp 160-166 38 Kulah C., Mooij M J., Comert F et al (2010), "Characterisation of carbapenem- resistant Acinetobacter baumannii outbreak strains producing OXA-58 in Turkey", International Journal of Antimicrobial Agents 36, pp 114-8 39 Kumarasamy K K., Toleman M A., Walsh T R., Bagaria J., Butt F., Balakrishnan R et al (2010), "Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study", Lancet Infectious Diseases 10(9), pp 597-602 40 Kuo S C., Chang S C., Wang H Y et al (2012), "Emergence of extensively drugresistant Acinetobacter baumannii complex over 10 years: Nationwide data from the Taiwan Surveillance of Antimicrobial Resistance (TSAR) program", BMC Infectious Diseases 12, p 200 41 Land, T (1992), "Combating counterfeit drugs", Nature 355, p 192 42 Laurent Poirel, Patrice Nordmann (2008), "Acinetobacter baumannii: Mechanisms of Resistance, Multiple ß-Lactamases Acinetobacter Biology and Pathogenesis", Springer, Temple University School of Medicine Philadelphia, pp 129-144 43 Lee Y., Yum J H., Kim C K et al (2010), "Role of OXA-23 and AdeABC Efflux Pump for Acquiring Carbapenem Resistance in an Acinetobacter baumannii Strain Carrying the blaOXA-66 Gene", Annals of Clinical & Laboratory Science 40 (1), pp 43-48 44 Lim S., Mark A T., Janis L W.,Robin A H.,Timothy R W.,Karthikeyan K K (2014), "Plasmid Carriage of blaNDM-1 in Clinical Acinetobacter baumannii Isolates from India", Antimicrob Agents Chemother 58(7), pp 4211–4213 69 45 McGregor, A (1997), "Counterfeit drugs flood developing world", Lancet 350, p 1690 46 Michelle Lowings, Marthie Magdaleen Ehlers, Andries William Dreyer, Marleen Magdalena Kock (2015), "High prevalence of oxacillinases in clinical multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolates from the Tshwane region, South Africa – an update", BMC Infectious Diseases 15, p 521 47 Mugnier P D., Poirel L., Naas T et al (2010), "Worldwide Dissemination of the blaOXA-23 Carbapenemase Gene of Acinetobacter baumannii", Emerging Infectious Diseases 16 (1), pp 35-40 48 Nemec A., Křížová L., Maixnerová M et al (2009), "Emergence of carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii in the Czech Republic is associated with the spread ", Journal Antimicrob Chemother 62, pp 484489 49 Nizami S Q., Khan I A., Bhutta Z A (1996), "Drug prescribing practices of general practitioners and paediatricians for childhood diarrhoea in Karachi, Pakistan", Social Science & Medicine - Journal 42, pp 1133-1139 50 Nordmann P., Dortet L., Poirel L (2012), "Carbapenem resistance in Enterobacteriaceae: here is the storm", Trends in Molecular Medicine 18 (5), pp 263-272 51 Okeke I., Lamikanra A (1995), "Quality and bioavailability of tetracycline capsules in a Nigerian semi-urban community", International Journal of Antimicrobial Agents 5, pp 245-250 52 Paredes P., Pena M., Flores-Guerra E., Diaz J., Trostle J (1996), "Factors influencing physicians’ prescribing behavior in the treatment of childhood diarrhoea: knowledge may not be the clue", Social Science & Medicine Journal 42, pp 1141-1153 53 Park Y K., Lee G H., Baek J Y et al (2010), "A single clone of Acinetobacter baumannii, ST22, is responsible for high antimicrobial 70 resistance rates of Acinetobacter spp isolates that cause bacteremia and urinary tract infections in Korea", Microbial Drug Resistance 16, pp 143-9 54 Peleg A Y., Hooper D C (2010), "Hospital-Acquired Infections Due to Gram-Negative Bacteria", New England Journal of Medicine 362(19), pp 1804-1813 55 Peleg A Y., Hooper D C (2010), "Hospital-Acquired Infections Due to Gram-Negative Bacteria", New England Journal of Medicine 362 (19), pp 1804-1813 56 Peleg A Y., Seifert H., Paterson D L (2008), "Acinetobacter baumannii: Emergence of a Successful Pathogen", Clinical Microbiology Reviews 21 (3), pp 538-582 57 Perez F., Hujer A M., Hujer K M (2007), "Global Challenge of MultidrugResistant Acinetobacter baumannii", Antimicrobiol Agents and Chemotherapy American Society for Microbiology 51 (10), pp 3471-3484 58 Pierre E F., Herve´ Richet (2006), "The Epidemiology and Control of Acinetobacter baumannii in Health Care Facilities", Clinical Infectious Diseases 42, p 692 59 Prashanth K., Vasanth T., Saranathan R (2012), "Antibiotic Resistance, Biofilms and Quorum Sensing in Acinetobacter Species, Antibiotic Resistant Bacteria - A Continuous Challenge in the New Millennium", www.intechopen.com, Acceess on 15 Feb 2012 60 Report, ECDC Technical (2011), "Updated ECDC risk assessment on the spread of New Delhi metallo-β-lactamase (NDM) and its variants within Europe" 61 Rice, L B (2009), "The clinical consequences of antimicrobial resistance", Current Opinion in Microbiology 12, pp 476-481 62 Rustam, I A (2010), "A brief history of the antibiotic era: lessons learned and challenges for the future", Front Microbiology 1(134), pp 1-7 71 63 Schouten M A., Voss A., Hoogkamp-Korstanje J A A (1997), "VRE and meat", Lancet 349, p 1258 64 Struelens M J., Monnet D L., Magiorakos A P., Santos O'Connor F., Giesecke J (2010), "New Delhi metallo-β-lactamase 1-producing Enterobacteriaceae: emergence and response in Europe", Euro Surveill 15(46), p 19716 65 Taylor R B., Shakoor O., Behrens R H (1995), "Drug quality, a contributor to drug resistance?", Lancet 346, p 122 66 Tenover (2006), "Mechanisms of Antimicrobial Resistance in Bacteria", The American Journal of Medicine 119 (6), pp 3-10 67 Thamarai Schneiders, Jacqueline Findlay et al (2008), "Efflux Pumps in Acinetobacter baumannii, Acinetobacter Biology and Pathogenesis", Springer.com, pp 105 - 128 68 Tikhomirov, E (1987), "Programme for the Control of Hospital Infections", Chemiotherapia 3, pp 148-151 69 Villegas, M V., Hartstein A I (2003), "Acinetobacter outbreaks, 19772000", Infect Control Hosp Epidemiology 24, pp 284-295 70 Wain J., Hoa N T., Chinh N T., Vinh H., Everett M J., Diep T S et al (1997), "Quinolone-resistant Salmonella typhi in Viet Nam: molecular basis of resistance and clinical response to treatment", Clin Infect Dis 25(6), pp 1404-1410 71 Walsh, T R (2003), "Section III: Antibiotic Resistance, In: Antibiotics: Action, Origins, Resistance", American Society for Microbiology, pp 89155 72 Walsh T R., Weeks J., Livermore D M., Toleman M A (2011), "Dissemination of NDM-1 positive bacteria in the New Delhi environment and its implications for human health: an environmental point prevalence study", Lancet 11(5), pp 355-62 72 73 Wegener H C., Aarestrup F M., Jensen L B et al (1999), "Use of antimicrobial growth promoter in food animals and Enterococcus faecium resistance to therapeutic antimicrobial drugs in Europe", Emerging Infectious Disease 5, pp 329-332 74 Weinberg J., Grimaud O., Newton L (1999), "Establishing priorities for European collaboration in communicable disease surveillance", European Journal of Public Health 9, pp 236-240 75 Willey J., Sherwood L., Woolverton C (2008), Prescott’s Principles of Microbiology, New York: McGraw-Hil 76 World Health Organization (2002), "Prevention of Hospital Acquired Infections A Practical Guide, 2nd ed Geneva: WHO Press" 77 World Health Organization (2011), Report on the Burden of Endemic Health Care-Associated Infection Worldwide 78 Yokoe D S., Mermel L A., Anderson D J et al (2008), " A compendium of strategies to prevent healthcare-associated infections in acute care hospitals", Infection Control & Hospital Epidemiology 29, pp 12-21 79 Yong D., Toleman M A., Giske C G., Cho H S., Sundman K., Lee K., Walsh T R (2009), "Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla (NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India", Antimicrob Agents Chemother 53 (12), pp 5046-5054 73 PHỤ LỤC CÁC QUY TRÌNH KỸ THUẬT THỰC HIỆN TRONG LUẬN ÁN PCR phát gen NDM-1 Thành phần hỗn hợp phản ứng PCR Thành phần phản ứng mẫu (µl) Nồng độ cuối 15 1X 0,3 (10µM/ul) 0,1àM 0,3 (10àM/ul) 0,1àM 2X Go-taq Master-Mix (GoTaqđ ADN Polymerase: 400µM dATP, 400µM dGTP, 400µM dCTP, 400µM dTTP and 3mM MgClNDM-1-F 2) Mồi NDM-1-R Nước siêu 10 ADN Tổng số: 30µl 250ng Chu trình nhiệt Các bƣớc Nhiệt độ Biến tính 940C phút Biến tính 940C 36 giây Gắn mồi 600C 36 giây Tổng hợp 720C 50 giây Kết thúc 720C phút Giữ nhiệt độ 40C Thời gian 30 chu kỳ Quy trình thực kỹ thuật MLST Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng mẫu (µl) 10 Mẫu (µl) 2X Master-Mix 15 150 0.5 0.5 Nước siêu 11 110 Tổng số: 27 270 Cặp primers Chu trình nhiệt Các bƣớc Nhiệt độ Biến tính 940C phút Biến tính 950C 36 giây Gắn mồi 500C 36 giây Tổng hợp 720C 50 giây Kết thúc 720C phút Thời gian 30 chu kỳ Giữ nhiệt độ 40C - Sau chạy PCR với chu trình nhiệt đặc trưng với đoạn gen bảo tồn vi khuẩn cho kỹ thuật MLST, sản phẩm PCR mang tinh kit ADN Gel purification (QIAGEN) - Thực phản ứng Bigdye – PCR với mồi xuôi mồi ngược đoạn gen bảo tồn Hỗn hợp cho phản ứng Bigdye PCR Thành phần phản ứng mẫu (µl) Sản phẩm PCR tinh 1.5µl Mồi xi ngược µl Bigdye 3.1 µl Buffer 5X µl Nước siêu 9.5 µl Tổng số: 20 µl Chu trình nhiệt cho bigdye-PCR: 960C: phút 960C: 30giây 500C: 30 giây 30 chu kỳ 600C: phút - Giữ 40C Tinh sản phẩm DNA: Cho 45 µl Sam solution 10 µl Xtermination/ mẫu bệnh phẩm Lắc 2000 vòng/30, phút Ly tâm 3000 vòng 2-3 phút lấy nước cho vào máy giải trình tự gen - Đọc trình tự gen máy đọc trình tự ABI-3130 (Applied Biosystem, Mỹ) - Alignment trình tự xi ngược đoạn gen bảo tồn thu sau giải trình tự phần mềm Bioedit - Nhập kết thu lên http://pubmlst.org/ để xác định liệu Allele đoạn gen bảo tồn nghiên cứu - So sánh kết Allele để xác định ST (sequence type) loại vị khuẩn nghiên cứu - So sánh kết tìm nghiên cứu với kết công bố sở liệu ngân hàng gen giới KẾT QUẢ ĐẠI DIỆN CHO GIẢI TRÌNH TỰ TRONG KỸ THUẬT MLST CÁC CHỦNG A baumannii MANG GEN NDM-1 KHÁNG CARBAPENEM ... 250 217 200 Số Chủng 15 3 15 0 10 0 49 50 31 36 15 14 35 13 12 1 2 010 2 011 Việt Đức 2 012 Tha nh Nhà n 2 013 2 014 Xa nh Pôn Hình 3 .1 Tỷ lệ phân bố vi khuẩn A baumannii kháng carbapenem bệnh viện theo... kháng kháng sinh vi khuẩn 10 1. 2 .1 Lịch sử phát triển kháng sinh 10 1. 2.2 Sự đề kháng kháng sinh vi khuẩn 11 1. 2.2 .1 Sự phát triển đặc tính kháng kháng sinh vi khuẩn 11 1. 2.2.2... khuẩn bệnh viện 1. 2 Sự phát triển đề kháng kháng sinh vi khuẩn 12 1. 3 Một số đặc tính enzym ly giải carbapenem chủng vi khuẩn Gram âm 21 2 .1 Trình tự mồi để phát gen NDM- 1 vi khuẩn 38 2.2 Các trình