Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn tại hưng yên, khảo sát một số đặc tính sinh học phân tử của mầm bệnh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  VŨ PHÚC TRƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN TẠI HƯNG YÊN, KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MẦM BỆNH LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  VŨ PHÚC TRƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN TẠI HƯNG YÊN, KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MẦM BỆNH CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y MÃ SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, cơng trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Đề tài thực khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân tử chủng virus gây dịch tiêu chảy cấp lợn (Porcine epidemic diarrhea-PED) lưu hành Việt Nam ứng dụng chẩn đoán định hướng sản xuất vaccine” Quỹ phát triển khoa học công nghệ quốc gia (NAFOSTED) tài trợ, mã số đề tài 106-NN.04-2014.16 Tôi xin cam đoan, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả luận văn Vũ Phúc Trường ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng thân, nhận quan tâm giúp đỡ thầy cô giáo bạn bè đồng nghiệp Nhân dịp này, trước tiên xin chân thành cảm ơn giúp đỡ giảng viên khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam giảng dạy suốt thời gian học tập Trường Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Bá Hiên tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi q trình thực hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn thầy giáo TS Lê Văn Phan giúp đỡ suốt thời gian qua Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình, đồng nghiệp ln giúp đỡ, động viên giúp tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Vũ Phúc Trường iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục biểu đồ viii Danh mục hình ix MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.1.1 Nước ngồi 1.1.2 Trong nước 1.2 Tình hình dịch bệnh PED giới Việt Nam năm gần 1.2.1 Tình hình dịch bệnh PED giới 1.2.2 Tình hình dịch bệnh PED Việt Nam 1.2.3 Tình hình PED địa bàn tỉnh Hưng Yên 1.3 Bệnh dịch tiêu chảy cấp tính lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) 1.3.1 Phân loại 1.3.2 Hình thái, cấu trúc PEDV 1.3.3 Đặc tính ni cấy virút 1.3.4 Dịch tễ học 10 1.3.5 Triệu chứng lâm sàng 12 1.3.6 Bệnh tích 13 1.3.7 Các phương pháp chẩn đoán PEDV 14 Chương NỘI DUNG, ĐỊA ĐIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nội dung nghiên cứu 17 iv 2.2 Nguyên liệu 17 2.3 Địa điểm nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 18 2.3.2 Khảo sát số đặc tính sinh học phân tử mầm bệnh 18 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 21 3.1 Một số đặc điểm dịch tễ bệnh 21 3.1.1 Kết điều tra bệnh tiêu chảy thành dịch lợn theo lứa tuổi 21 3.1.2 Tỷ lệ tử vong bệnh tiêu chảy thành dịch lợn theo lứa tuổi 29 3.1.3 Triệu chứng lâm sàng bệnh 32 3.1.4 Kết mổ khám bệnh tích đại thể 35 3.2 Khảo sát số đặc tính sinh học phân tử mầm bệnh 36 3.2.1 Kết chẩn đoán bệnh PED phương pháp PT-PCR 36 3.2.2 Kết chẩn đoán bệnh PED phân theo lứa tuổi 38 3.2.3 Kết RT-PCR để nhân đoạn gen S virus PED 40 3.2.4 Kết phân tích trình tự gen S chủng virus PED 42 3.2.5 Phân tích trình tự protein S (spike) virus PED 45 3.2.6 Kết xây dựng phả hệ (phylogenetic tree) 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 v DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ DNA Axit deoxyribonucleic ELISA Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay EVD Epidemic Viral Diarrhea PED Porcine Epidemic Diarrhea PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Virus RNA Axit ribonucleic RT - PCR Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction TGE Transmissible Gastro Enteritis 95% CI 95 % Confidence Level vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Kết điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi với độ tin 21 3.2 Kết điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi huyện 23 3.3 Kết điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi huyện Phù Cừ với độ tin cậy 95%CI 24 3.4 Kết điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi huyện 25 3.5 Kết điều tra lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi huyện 27 3.6 So sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh theo lứa tuổi bệnh PED 28 3.7 Tỷ lệ tử vong bệnh PED theo lứa tuổi 38 3.8 Kết so sánh tỷ lệ tử vong bệnh tiêu chảy thành dịch 31 3.9 Triệu chứng lâm sàng bệnh theo lứa tuổi 33 3.10 Kết mổ khám bệnh tích đại thể 35 3.11 Kết chẩn đốn bệnh PED RT-PCR theo loại mẫu 37 3.12 Kết chẩn đoán bệnh PED RT-PCR theo lứa tuổi 39 3.13 Thông tin mẫu bệnh phẩm sử dụng giải trình 41 3.14 Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự nucleotide gene S chủng 43 3.15 Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự acid amin gene S vii 45 DANH MỤC BIỂU ĐỒ STT Tên biểu đồ Trang 3.1 Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo độ tuổi 22 3.2 Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi huyện Tiên Lữ 23 3.3 Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi huyện Phù Cừ 25 3.4 Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi huyện Ân Thi 26 3.5 Tỷ lệ lợn mắc bệnh PED theo lứa tuổi huyện Văn 27 3.6 So sánh tỷ lệ lợn mắc bệnh theo lứa tuổi bệnh PED huyện Tiên Lữ, Phù Cừ, Ân Thi Văn Giang 29 3.7 Tỷ lệ tử vong mắc bệnh PED theo độ tuổi 30 3.8 Tỷ lệ tử vong bệnh PED theo lứa tuổi huyện Tiên 32 3.9 Kết mổ khám bệnh tích đại thể 36 3.10 Kết chẩn đoán mẫu kỹ thuật RT-PCR 38 3.11 Kết chẩn đoán mẫu kỹ thuật RT-PCR 38 3.12 Kết chẩn đoán mẫu kỹ thuật RT-PCR theo lứa 39 viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Hình thái, cấu trúc PEDV 1.2 Bệnh tích ruột căng phồng lợn 3.1 Kết chẩn đoán virus PED phản ứng RT-PCR M: Marker 13 DNA (1 kb Plus DNA Ladder, Invitrogen) Giếng – 8: mẫu bệnh phẩm khác tương ứng VNUA/PED-HY1, VNUA/PED-HY2, VNUA/PED-HY3,VNUA/PED-HY4, VNUA/PED-HY5, VNUA/PED-HY6, VNUA/PED-HY7, VNUA/PED-HY8 Sản phẩm PCR có kích thước 651bp 3.2 41 So sánh trình tự nucleotide gen S chủng virus PED nghiên cứu với với chủng virus PED tham chiếu khác Dấu (.) biểu thị trình tự nucleotide giống với trình tự nucleotide chủng virus VNUA/PED-HY1 3.3 44 So sánh trình tự amino acid suy diễn gen S chủng virus PED nghiên cứu với với chủng virus PED tham chiếu khác Dấu (.) biểu thị giống với trình tự amino acid chủng VNUA/PED- HY1, sai khác amino acid chủng 3.3 thể chữ ký hiệu chúng 46 Mối quan hệ di truyền chủng virus PED nghiên cứu 48 ix Biểu đồ 3.10 Kết chẩn đoán mẫu kỹ thuật RT-PCR Biểu đồ 3.11 Kết chẩn đoán mẫu kỹ thuật RT-PCR huyện Tiên Lữ, Phù Cừ, Ân Thi, Văn Giang 3.2.2 Kết chẩn đoán bệnh PED phân theo lứa tuổi Ta đánh giá tỷ lệ lưu hành PEDV theo giai đoạn phát triển, dựa vào thông tin điều tra kết chẩn đốn, ta có kết trình bày bảng 3.12 biểu đồ 3.12 38 Bảng 3.12 Kết chẩn đoán bệnh PED RT-PCR theo lứa tuổi Lợn sau Lợn theo mẹ cai sữa choai 14 Số mẫu 1 Tỷ lệ % 57,14 33,33 20,00 33,33 Số mẫu Tỷ lệ % 87,5 33,33 50,00 0,00 Số mẫu Tỷ lệ % 44,44 37,5 16,67 13 0 Số mẫu 0 Tỷ lệ % 53,85 25,00 0,00 Lứa tuổi mắc Tiên Lữ Số mẫu PEDV(+) Số mẫu Phù cừ PEDV (+) Số mẫu Ân Thi Văn Giang PEDV(+) Số mẫu PEDV(+) Lợn Lợn trưởng Tổng thành 31 19 23 21 Biểu đồ 3.12 Kết chẩn đoán mẫu kỹ thuật RT-PCR theo lứa tuổi 39 Qua bảng 3.12 biểu đồ 3.12 cho thấy: Tỷ lệ lưu hành PEDV giai đoạn lợn khác không đồng huyện Nhìn chung tỷ lệ có xu hướng giảm dần qua độ tuổi, tỷ lệ cao độ tuổi lợn theo mẹ, tiếp đến độ tuổi lợn sau cai sữa, lợn choai lợn trưởng thành Tỷ lệ lưu hành PEDV lợn theo mẹ lợn sau cai sữa cao Phù Cừ 87.5% tiếp đến Tiên Lữ 57.14%, Văn Giang 53.85% thấp Ân Thi 44.44% Ở tuần tuổi thứ 2, Ân Thi cao 37,5% tiếp đến Tiên Lữ (33,33%), Phù Cừ (33,33%) thấp Văn Giang 25,00% Do thời kì này, lợn dần hồn thiện đặc điểm chức quan thể đặc biệt máy tiêu hóa quan điều tiêt thân nhiệt Vì lợn độ tuổi sau cai sữa mắc so với lợn theo mẹ Đối với lợn choai lúc hệ tiêu hóa hệ miễn dịch phát triển hơn, điều hòa thân nhiệt tác động yếu tố stress bất lợi từ mơi trường Vì lợn mắc bệnh Nhóm lợn trưởng thành, hệ miễn dịch thể hoạt động mạnh nên vật có khả chống công virus, tác động xấu từ ngoại cảnh Ở nhóm tuổi mắc bệnh 3.2.3 Kết RT-PCR để nhân đoạn gen S virus PED Để nhân gen S chủng virus PED, tiến hành phản ứng RTPCR với cặp mồi P1/P2 (Kim cs, 2001(20)) Trong nghiên cứu lựa chọn ngẫu nhiên mẫu bệnh phẩm dương tính với virus PED từ huyện Tiên Lữ, Phù Cừ, Ân Thi, Văn Giang cho phản ứng RT-PCR giải trình tự gen Thơng tin mẫu bệnh phẩm liên quan trình bày bảng 3.13 40 Bảng 3.13 Thông tin mẫu bệnh phẩm sử dụng giải trình tự gen Thời gian STT Tên mẫu VNUA/PED-HY1 Tuổi lợn Huyện Loại mẫu 01/2014 Tiên Lữ Phân 25 VNUA/PED-HY2 01/2014 Tiên Lữ Phân VNUA/PED-HY3 03/2014 Tiên Lữ Ruột non 25 VNUA/PED-HY4 12/2014 Văn Giang Phân VNUA/PED-HY5 12/2014 Văn Giang Phân 19 VNUA/PED-HY6 12/2014 Ân Thi Ruột non VNUA/PED-HY7 02/2015 Phù Cừ Phân 11 VNUA/PED-HY8 02/2015 Phù Cừ Ruột non 10 lấy mẫu M (Ngày) Hình3.1 Kết chẩn đoán virus PED phản ứng RT-PCR M: Marker DNA (1 kb Plus DNA Ladder, Invitrogen) Giếng – 8: mẫu bệnh phẩm khác tương ứng VNUA/PED-HY1, VNUA/PED-HY2, VNUA/PED-HY3, VNUA/PED-HY4, VNUA/PED-HY5, VNUA/PEDHY6, VNUA/PED-HY7, VNUA/PED-HY8 Sản phẩm PCR có kích thước 651bp Kết RT-PCR từ hình 3.1 cho thấy mẫu virus cho kết PCR dương tính dùng cặp mồi P1/P2, sản phẩm PCR thu có kích thước 651bp Kết thu trùng lập với kết công bố trước Kim cs, 2001(20) 41 3.2.4 Kết phân tích trình tự gen S chủng virus PED Để xác định xác type phân type chủng virus VNUA/PED-HY1, VNUA/PED-HY2, VNUA/PED-HY3, VNUA/PED-HY4, VNUA/PED-HY5, VNUA/PED-HY6, VNUA/PED-HY7, VNUA/PED-HY8, sản phẩm PCR thu đặc hiệu cho gen S tiến hành giải trình tự gen Kết phân tích trình tự nucleotide cho thấy gen S (gen mã hóa cho protein Spike) chủng PEDV có mức độ tương đồng trình tự nucleotide (nt) với cao, từ 96,2 - 99,8% (bảng 3.14 hình 3.2) Khi so sánh mức độ tương đồng trình tự gen S chủng virus nghiên cứu với chủng virus PED tham chiếu khác Việt Nam thu thập ngân hàng GenBank, mức độ tương đồng trình tự nt giao động từ 95,3 - 98,9% (bảng 3.14) Khi so sánh mức độ tương đồng trình tự gen S chủng virus PED nghiên cứu với chủng virus vaccine PED Trung Quốc (chủng CV777, mã số truy cập ngân hàng GenBank JN599150), mức độ tương đồng giao động từ 95,7 - 97,1% Tương tự so sánh với chủng virus vaccine Hàn Quốc (chủng DR13, mã số truy cập ngân hàng GenBank DQ462404), mức độ tương đồng trình tự nt giao động từ 95,5 - 96,9% Kết phân tích trình tự nucleotide gene S cho thấy chủng virus VNUA/PED-HY7 VNUA/PED-HY8 phân lập Phù Cừ vào năm 2015 có tương đồng với cao (99,6%), có sai khác vị trí nucleotide 1916 (C↔T) 1987 (T↔A) Khi so sánh trình tự gene S hai chủng Phù Cừ với chủng phân lập Tiên Lữ (VNUA/PED-HY1, VNUA/PED-HY2, VNUA/PED-HY3), Văn Giang (VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5), Ân Thi (VNUA/PED-HY6) năm 2014 cho thấy mức độ tương đồng trình tự gene thấp (96,2 - 97,8%), có đến 12 vị trí nucleotide sai khác vị trí 1539: A↔C; 1556: A↔G; 1575: C↔T; 1593: T↔C; 1635: C↔T; 1710: C↔T; 1833: T↔C; 1928: A↔G; 2016: T↔C; 2019: A↔G; 2040: G↔A; 2043: C↔T (bảng 3.14 hình 3.2) Như kết cho thấy khu vực tỉnh hai mốc thời gian khác huyện khác có biến đổi trình tự gene S chủng virus PED lưu hành 42 Khi so sánh trình tự gene S chủng virus PED nghiên cứu với chủng virus PED tham chiếu khác trước Việt Nam thu thập ngân hàng GenBank cho thấy có 10 sai khác trình tự gene vị trí khác 1545: G↔T; 1546: T↔G; 1548: C↔T; 1575: C↔T; 1593: C↔T; 1635: C↔T; 1710: C↔T; 1833: T↔C; 2040: G↔A; 2043: C↔T (bảng 3.14 hình 3.2) Bảng 3.14: Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự nucleotide gene S chủng virus PED nghiên cứu với với chủng virus PED tham chiếu khác STT Chủng virus 10 11 12 13 14 15 16 17 VNUA/PED-HY1 VNUA/PED-HY2 99,1 VNUA/PED-HY3 99,4 99,6 VNUA/PED-HY4 98,9 98,7 99,1 VNUA/PED-HY5 98,4 98,5 98,9 98 VNUA/PED-HY6 99,2 99,4 99,8 98,9 98,7 VNUA/PED-HY7 96,6 96,4 96,8 96,2 97,5 96,6 VNUA/PED-HY8 96,9 96,8 97,1 96,6 97,8 96,9 99,6 KJ960178/JFP1013/Vietnam/2013 95,7 96,2 96,2 95,3 96,6 96 96,6 96,9 10 KJ960179/VAP1113/Vietnam/2013 96,8 96,9 97,3 96,4 97,6 97,1 97,6 98 98,5 11 HQ883492/VN122S8/Vietnam/2010 97,5 97,6 98 97,1 98,4 97,8 98,4 98,7 97,8 98,9 12 HQ883491/VN116S7/Vietnam/2010 97,5 97,6 98 97,1 98,4 97,8 98,4 98,7 97,8 98,9 100 13 HQ883486/VN94S2/Vietnam/2009 97,3 97,5 97,8 96,9 98,2 97,6 98,5 98,9 97,6 98,7 99,8 99,8 14 HQ883485/VN92S1/Vietnam/2009 96,6 96,8 97,1 96,2 97,5 96,9 97,5 97,8 96,9 98 98,7 98,7 98,5 15 JN599150/CV777/China/1994 96,9 97,1 97,1 96,2 96,9 96,9 95,7 96 95,2 96,2 96,9 96,9 96,8 96 16 DQ462404/DR13/Korea 96,8 96,9 96,9 96 96,8 96,8 95,5 95,9 95 96 96,8 96,8 96,6 95,9 99,8 17 AF353511/CV777/Belgium 95,3 95,2 95,2 94,6 95 95 94,3 94,6 93,4 94,5 95,2 95,2 95 94,3 97,3 97,1 43 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 1610 1620 1630 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | VNUA/PED-HY1 VNUA/PED-HY2 VNUA/PED-HY3 VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5 VNUA/PED-HY6 VNUA/PED-HY7 VNUA/PED-HY8 KJ960178/JFP1013/Vietnam/2013 KJ960179/VAP1113/Vietnam/2013 HQ883492/VN122S8/Vietnam/2010 HQ883491/VN116S7/Vietnam/2010 HQ883486/VN94S2/Vietnam/2009 HQ883485/VN92S1/Vietnam/2009 JN599150/CV777/China/1994 DQ462404/DR13/Korea AF353511/CV777/Belgium ACTGTCTCTGCGTCCTTTGGTGGTCATAGTGGTGCCAACCTCATTGCATCTGACACTACCATCAATGGGTTTAGTTCTTTCTGTGTTGACACTAGACAAT .A T T .T A TG.T .A T .T .A TG.T .A T .T TG.T C G T .T C.G TG.T T .T .G TG.T T .T TG.T T .T TG.T .A T .T TG.T T .T G.T T G.T T G.T T A .T G T 1640 1650 1660 1670 1680 1690 1700 1710 1720 1730 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | VNUA/PED-HY1 VNUA/PED-HY2 VNUA/PED-HY3 VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5 VNUA/PED-HY6 VNUA/PED-HY7 VNUA/PED-HY8 KJ960178/JFP1013/Vietnam/2013 KJ960179/VAP1113/Vietnam/2013 HQ883492/VN122S8/Vietnam/2010 HQ883491/VN116S7/Vietnam/2010 HQ883486/VN94S2/Vietnam/2009 HQ883485/VN92S1/Vietnam/2009 JN599150/CV777/China/1994 DQ462404/DR13/Korea AF353511/CV777/Belgium TCACCATTTCACTGTTTTATAATGTTACAAACAGTTATGGTTATGTGTCTAAATCACAGGACAGTAATTGCCCTTTCACCTTGCAATCTGTTAATGATTA C G C .T C C T T .T T .T G .C C C GT C G .T .TT C C C C T .T C T .T C T .T C T .T C A T C T A C G T .T A C G T .T A T T 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800 1810 1820 1830 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | VNUA/PED-HY1 VNUA/PED-HY2 VNUA/PED-HY3 VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5 VNUA/PED-HY6 VNUA/PED-HY7 VNUA/PED-HY8 KJ960178/JFP1013/Vietnam/2013 KJ960179/VAP1113/Vietnam/2013 HQ883492/VN122S8/Vietnam/2010 HQ883491/VN116S7/Vietnam/2010 HQ883486/VN94S2/Vietnam/2009 HQ883485/VN92S1/Vietnam/2009 JN599150/CV777/China/1994 DQ462404/DR13/Korea AF353511/CV777/Belgium CCTGTCTTTTAGCAAATTTTGTGTTTCTACCAGCCTTTTGGCTAGTGCCTGTACCATAGATCTTTTTGGTTACCCTGAGTTTGGTAGTGGTGTTAAGTTT GTG A .C C C C C C C C C G G C A .G T C .A .G T C .A .G T C C .G 1840 1850 1860 1870 1880 1890 1900 1910 1920 1930 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | VNUA/PED-HY1 VNUA/PED-HY2 VNUA/PED-HY3 VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5 VNUA/PED-HY6 VNUA/PED-HY7 VNUA/PED-HY8 KJ960178/JFP1013/Vietnam/2013 KJ960179/VAP1113/Vietnam/2013 HQ883492/VN122S8/Vietnam/2010 HQ883491/VN116S7/Vietnam/2010 HQ883486/VN94S2/Vietnam/2009 HQ883485/VN92S1/Vietnam/2009 JN599150/CV777/China/1994 DQ462404/DR13/Korea AF353511/CV777/Belgium ACGTCCCTTTACTTTCAATTCACAAAGGGTGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCACTTGAAGGTGTTACGGACGTTTCTTTTATGACTCTGGATGTGT C C G G T T C .C .T C .C .C .T A .A.C A 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 2020 2030 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | VNUA/PED-HY1 VNUA/PED-HY2 VNUA/PED-HY3 VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5 VNUA/PED-HY6 VNUA/PED-HY7 VNUA/PED-HY8 KJ960178/JFP1013/Vietnam/2013 KJ960179/VAP1113/Vietnam/2013 HQ883492/VN122S8/Vietnam/2010 HQ883491/VN116S7/Vietnam/2010 HQ883486/VN94S2/Vietnam/2009 HQ883485/VN92S1/Vietnam/2009 JN599150/CV777/China/1994 DQ462404/DR13/Korea AF353511/CV777/Belgium GTACCAAGTATACTATCTATGGCTTTAAAGGTGAGGGTATTATTACCCTTACAAATTCTAGCTTTTTGGCAGATGTTTATTATACATCTGATTCTGGACA C .G C .G C .G C .G C .G C T G .C G C .G .C G C .G C .G G C .G G C .G G C .G C .G G G A .G 2040 2050 2060 2070 2080 2090 | | | | | | | | | | | | | VNUA/PED-HY1 VNUA/PED-HY2 VNUA/PED-HY3 VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5 VNUA/PED-HY6 VNUA/PED-HY7 VNUA/PED-HY8 KJ960178/JFP1013/Vietnam/2013 KJ960179/VAP1113/Vietnam/2013 HQ883492/VN122S8/Vietnam/2010 HQ883491/VN116S7/Vietnam/2010 HQ883486/VN94S2/Vietnam/2009 HQ883485/VN92S1/Vietnam/2009 JN599150/CV777/China/1994 DQ462404/DR13/Korea AF353511/CV777/Belgium GTTGTTGGCCTTTAAGAATGTCACTAGTGGTGCTGTTTATTCTGTTACGCCATGTTCTTTTTCA A T A T A T A T A T A T A T A T C A A A C Hình 3.2: So sánh trình tự nucleotide gen S chủng virus PED nghiên cứu với với chủng virus PED tham chiếu khác Dấu (.) biểu thị trình tự nucleotide giống với trình tự nucleotide chủng virus VNUA/PED-HY1 44 3.2.5 Phân tích trình tự protein S (spike) virus PED Kết phân tích trình tự amino acid cho thấy chủng virus PED nghiên cứu có mức độ tương đồng với cao, từ 95,7 - 100% Khi so sánh mức độ tương đồng trình tự amino acid gen S chủng virus nghiên cứu với chủng virus PED tham chiếu khác Việt Nam thu thập ngân hàng GenBank, mức độ tương đồng trình tự nt giao động từ 94,1 - 98,9% Khi so sánh mức độ tương đồng trình tự amino acid gen S chủng virus PED nghiên cứu với chủng virus vaccine PED Trung Quốc (chủng CV777, mã số truy cập ngân hàng GenBank JN599150), mức độ tương đồng giao động từ 96,2 - 97,8% Tương tự so sánh với chủng virus vaccine Hàn Quốc (chủng DR13, mã số truy cập ngân hàng GenBank DQ462404), mức độ tương đồng trình tự nt giao động từ 95,7 - 97,3% (bảng 3.15) Bảng 3.15 Tỷ lệ (%) tương đồng trình tự acid amin gene S chủng virus PED nghiên cứu với với chủng virus PED tham chiếu khác STT Chủng virus 10 11 12 13 14 15 16 VNUA/PED-HY1 VNUA/PED-HY2 98,9 VNUA/PED-HY3 99,4 99,4 VNUA/PED-HY4 97,8 97,8 98,4 VNUA/PED-HY5 99,4 99,4 100 98,4 VNUA/PED-HY6 98,9 98,9 99,4 97,8 99,4 VNUA/PED-HY7 96,8 96,8 97,3 95,7 97,3 96,8 VNUA/PED-HY8 97,8 97,8 98,4 96,8 98,4 97,8 98,9 KJ960178/JFP1013/Vietnam/2013 95,2 96,2 95,7 94,1 95,7 95,2 94,1 95,2 10 KJ960179/VAP1113/Vietnam/2013 96,8 96,8 97,3 95,7 97,3 96,8 95,7 96,8 96,8 11 HQ883492/VN122S8/Vietnam/2010 98,4 98,4 98,9 97,3 98,9 98,4 97,3 98,4 95,7 97,3 12 HQ883491/VN116S7/Vietnam/2010 98,4 98,4 98,9 97,3 98,9 98,4 97,3 98,4 95,7 97,3 100 13 HQ883486/VN94S2/Vietnam/2009 97,8 97,8 98,4 96,8 98,4 97,8 97,8 98,9 95,2 96,8 99,4 99,4 14 HQ883485/VN92S1/Vietnam/2009 96,8 97,3 97,3 95,7 97,3 96,8 95,7 96,8 94,6 95,7 97,3 97,3 96,8 15 JN599150/CV777/China/1994 97,3 97,3 97,8 96,8 97,8 97,3 96,2 97,3 94,6 96,2 97,8 97,8 97,3 96,2 16 DQ462404/DR13/Korea 96,8 96,8 97,3 96,2 97,3 96,8 95,7 96,8 94,1 95,7 97,3 97,3 96,8 95,7 99,4 17 AF353511/CV777/Belgium 94,1 94,1 94,6 93,6 94,6 94,1 45 93 94,1 91,4 93 94,6 94,6 94,1 93 95,7 95,2 17 Ngồi việc phân tích trình tự nucleotide chúng tơi tiến hành phân tích trình tự amino acid suy diễn (deduced amino acid) gene S chủng virus PED Kết phân tích trình tự amino acid gene S bảng 3.15 hình 3.3 cho thấy hai chủng virus PED thu thập Phù Cừ năm 2015 có tương đồng cao với (98,9%), có vị trí sai khác acid amin (639: Serin↔Phenylalanin; 663: Tyrosin ↔Asparagin) Khi so sánh trình tự acid amin gene S hai chủng Phù Cừ với chủng phân lập Tiên Lữ (VNUA/PED-HY1, VNUA/PED-HY2, VNUA/PED-HY3), Văn Giang (VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5), Ân Thi (VNUA/PED-HY6) năm 2014 cho thấy mức độ tương đồng trình tự acid amin thấp (95,7 - 98,4%), với sai khác acid amin vị trí 516: Serine↔Alanine; 519: Glycine↔Aspartic acid; 643: Aspartic acid↔Glycine (Hình 3.3) 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | VNUA/PED-HY1 VNUA/PED-HY2 VNUA/PED-HY3 VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5 VNUA/PED-HY6 VNUA/PED-HY7 VNUA/PED-HY8 KJ960178/JFP1013/Vietnam/2013 KJ960179/VAP1113/Vietnam/2013 HQ883492/VN122S8/Vietnam/2010 HQ883491/VN116S7/Vietnam/2010 HQ883486/VN94S2/Vietnam/2009 HQ883485/VN92S1/Vietnam/2009 JN599150/CV777/China/1994 DQ462404/DR13/Korea AF353511/CV777/Belgium TVSASFGGHSGANLIASDTTINGFSSFCVDTRQFTISLFYNVTNSYGYVSKSQDSNCPFTLQSVNDYLSFSKFCVSTSLLASACTIDLFGYPEFGSGVKF .G .WC N L A D A D A R .R .R PT G G A W S .PT A A A D A N A G A .T G A .T G A L.S V T G A L 620 630 640 650 660 670 680 690 | | | | | | | | | | | | | | | | | VNUA/PED-HY1 VNUA/PED-HY2 VNUA/PED-HY3 VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5 VNUA/PED-HY6 VNUA/PED-HY7 VNUA/PED-HY8 KJ960178/JFP1013/Vietnam/2013 KJ960179/VAP1113/Vietnam/2013 HQ883492/VN122S8/Vietnam/2010 HQ883491/VN116S7/Vietnam/2010 HQ883486/VN94S2/Vietnam/2009 HQ883485/VN92S1/Vietnam/2009 JN599150/CV777/China/1994 DQ462404/DR13/Korea AF353511/CV777/Belgium TSLYFQFTKGELITGTPKPLEGVTDVSFMTLDVCTKYTIYGFKGEGIITLTNSSFLADVYYTSDSGQLLAFKNVTSGAVYSVTPCSFS G .G .G .G .G S G Y G .G .G .G .G R G R G R G L G Q G S Q G I .I G Hình 3.3: So sánh trình tự amino acid suy diễn gen S chủng virus PED nghiên cứu với với chủng virus PED tham chiếu khác Dấu (.) biểu thị giống với trình tự amino acid chủng VNUA/PED- HY1, sai khác amino acid chủng thể chữ ký hiệu chúng 46 3.2.6 Kết xây dựng phả hệ (phylogenetic tree) Việc xây dựng phả hệ (phylogenetic tree) để đánh giá mối quan hệ di truyền chủng virus PED nghiên cứu với với chủng tham chiếu khác vô quan trọng Các nghiên cứu trước phả hệ cho thấy virus PED phân thành nhóm (group) lớn gồm G1, G2, G3 G1 chia thành nhóm phụ bao gồm G1-1, G1-2, G1-3 (Park cộng sự, 2007) Trong nghiên cứu chủng virus PED thu thập thuộc nhóm G2 Kết phân tích phả hệ cho thấy chủng virus PED thu thập huyện Phù Cừ năm 2015 có mối quan hệ gần gũi với chủng virus PED phân lập Việt Nam trước nằm nhánh, chủng virus PED phân lập Tiên Lữ (VNUA/PED-HY1, VNUA/PED-HY2, VNUA/PED-HY3), Văn Giang (VNUA/PED-HY4 VNUA/PED-HY5), Ân Thi (VNUA/PED-HY6) năm 2014 nằm nhánh với chủng virus PED phân lập Trung Quốc giai đoạn 2011 - 2012 (Hình 3.4) 47 Hình 3.3 Mối quan hệ di truyền chủng virus PED nghiên cứu với với chủng virus PED tham chiếu khác Những chủng virus PED sử dụng nghiên cứu đánh dấu hình trịn ( ) 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, rút số kết luận sau: • Lứa tuổi mắc bệnh Bệnh xảy lứa tuổi tập trung cao lứa tuổi lợn theo mẹ với tỷ lệ tỷ lệ lợn theo mẹ mắc bệnh PED hộ có dịch cao, tỷ lệ mắc lứa tuổi 90.16% • Tỷ lệ tử vong bệnh PED theo lứa tuổi Tỷ lệ tử vong cao giai đoạn lợn theo mẹ, giai đoạn tỷ lệ tử vong tới 91.14% giảm xuống thấp giai đoạn sau • Triệu chứng lâm sàng bệnh Triệu chứng lợn bị tiêu chảy nước cao tất lứa tuổi, triệu chứng lên tới 100% Ở triệu chứng lợn bỏ ăn có khác độ tuổi Ở độ tuổi lợn theo mẹ chiếm tỷ lệ 88.33%, sau cai sữa tỷ lệ 77.78%., lợn choai tỷ lệ 54.55%, lợn trưởng thành tỷ lệ 45,24% Với biểu gầy còm mắc bệnh đội tuổi khác Đối với lợn theo mẹ triệu chứng gầy còm 100%, lợn sau cai sữa triệu chứng 77.78%, lợn choai tỷ lệ 72,73%, lợn trưởng thành tỷ lệ 78,57% Triệu chứng nôn mửa lợn mắc bệnh khác qua lứa tuổi Triệu chứng thể cao lứa tuổi lợn theo mẹ với tỷ lệ 48.33% Ở lứa tuổi lợn sau cai sữa tỷ lệ 75% Đối với độ tuổi lợn choai tỷ lệ 18,18% Ở lợn trưởng chiếm tỷ lệ 19,05% • Kết mổ khám bệnh tích đại thể Tỷ lệ lợn mắc bệnh có bệnh tích Dạ dày lợn theo mẹ căng phồng,chứa nhiều thức ăn không tiêu chiếm tỷ lệ cao với 91.03% Bệnh tích hành ruột non bị bào mỏng, phồng to, chất chứa đường ruột lợn cợn lên đến 85.90% Đối với loại hạch: hạch bẹn hạch bạch huyết màng treo ruột có biểu bị sưng cao Biểu hạch bẹn sưng lớn có 67 tổng số 78 49 mổ khám chiếm tỷ lệ 69.23% hạch bạch huyết màng treo ruột sưng lớn 47.44% Tỷ lệ viêm phổi xác định 15.38 % tổng số 78 mắc bệnh mổ khám • Khảo sát đặc tính sinh học phân tử mầm bệnh - Đã ứng dụng thành cơng phương pháp RT- PCR để chẩn đốn nhanh virus gây bệnh PED từ mẫu bệnh phẩm thực địa - Đã giải trình tự gen thành cơng gen S chủng virus thu thập - Kết phân tích trình tự nucleotide (nt) amino acid (aa) gen S cho thấy chủng PEDV có mức độ tương đồng với cao, tương đồng nt từ 96-100% aa từ 95-100% Các chủng có tương đồng cao với chủng phân lập Hàn Quốc - Đã xây dựng phả hệ để đánh giá mối quan hệ di truyền chủng PEDV nghiên cứu với với chủng PEDV tham chiếu khác Các chủng thu thập nghiên cứu có đặc tính di truyền gần gũi với chủng PEDV gây bùng phát đợt dịch giới Kiến nghị Kết nghiên cứu đề tài thực địa bàn tỉnh Hưng Yên thời gian ngắn Vì vậy, cần có nghiên cứu tiếp đặc điểm dịch tễ học khảo sát đặc tính sinh học phân tử mầm bệnh nhiều địa phương thời gian dài để đánh giá đặc điểm dịch tễ học PED toàn quốc nắm bắt đặc tính sinh học mầm bệnh từ có biện pháp phịng chống dịch hiệu 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương Giáo trình miễn dịch học thú y, NXBNN, Hà Nội, 2009 Nguyễn Bá Hiên, Trần Xuân Hạnh, Phạm Quang Thái, Hoàng Văn Năm Công nghệ chế tạo sử dụng vaccine thú y Việt Nam, (sách nhà nước đặt hàng), NXBNN, Hà Nội, 2011 Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2012) Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội, Việt Nam Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ chủ biên (2013) Bệnh truyền nhiễm động vật nuôi biện pháp khống chế Nhà xuất Nông nghiệp Nguyễn Tất Tồn, Nguyễn Đình Qt, Trịnh Thị Thanh Huyền, Đỗ Tiến Duy, Trần Thị Dân, Nguyễn Thị Phước Ninh Nguyễn Thị Thu Năm Phát vi rút gây bệnh tiêu chảy cấp (PEDV) heo tỉnh miền Đông Nam Bộ Khoa học kỹ thuật thú y tập XIX số – 2012 Nguyễn Tất Tồn, Nguyễn Đình Quát, Trịnh Thị Thanh Huyền, Đỗ Tiến Duy, Trần Thị Dân, Nguyễn Thị Phước Ninh, Nguyễn Thị Thu Năm (2012) Phát virut gây bệnh tiêu chảy cấp (PEDV) heo tỉnh miền Đơng Nam Bộ Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y số 7, 2012 Tài liệu tiếng nước Bridgen A, Duarte M, Tobler K, Laude H, Ackermann M 1993 Sequence determination of the nucleocapsid protein gene of the porcine epidemic diarrhoea virus confirms that this virus is a coronavirus related to human coronavirus 229E and porcine transmissible gastroenteritis virus J Gen Virol 74(9):1795-1804 Bridgen A, Kocherhans R, Tobler K, Carvajal A, Ackermann M 1998 Further analysis of the genome of porcine epidemic diarrhoea virus Advances in experimental medicine and biology 440:781-786 Chen X, Yang J, Yu F, Ge J, Lin T, Song T 2012 Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) samples from field cases in Fujian, China Virus Genes 45(3):499-507 10 Debouck P, Pensaert M 1980 Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus, CV 777 American journal of veterinary research 41(2):219-223 11 Do Tien Duy, Nguyen Tat Toan, Puranaveja S, Thanawongnuwech R 2011 Genetic characterization of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) isolates from southern Vietnam during 2009-2010 outbreaks Thai Journal of Veterinary Medicine 41(1):55-64 12 Duarte M, Laude H 1994 Sequence of the spike protein of the porcine epidemic diarrhoea virus J Gen Virol 75 ( Pt 5):1195-1200 51 13 Kocherhans R, Bridgen A, Ackermann M, Tobler K 2001 Completion of the porcine epidemic diarrhoea coronavirus (PEDV) genome sequence Virus genes 23(2):137-144 14 Kusanagi K, Kuwahara H, Katoh T, Nunoya T, Ishikawa Y, Samejima T, Tajima M 1992 Isolation and serial propagation of porcine epidemic diarrhea virus in cell cultures and partial characterization of the isolate The Journal of veterinary medical science / the Japanese Society of Veterinary Science 54(2):313-318 15 Nguyen Dinh Quat, Pham Hoang Diep, Dang Thi Thanh Nguyen, Trinh Thi Thanh Huyen, Nguyen Thi Thu Nam, Nguyen Thi Phuoc Ninh, Tran Thi Dan, Toan NT First Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus by Nested Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (rRT-PCR) Technique in Vietnam; 2011; Pattaya, Thailand 16 Phan LV, Park MJ, Kye SJ, Kim JY, Lee HS, Choi KS 2013 Development and field application of a competitive ELISA for detection of Newcastle disease virus antibodies in chickens and ducks Poult Sci:Accepted 17 Puranaveja S, Poolperm P, Lertwatcharasarakul P, Kesdaengsakonwut S, Boonsoongnern A, Urairong K, Kitikoon P, Choojai P, Kedkovid R, Teankum K, Thanawongnuwech R 2009 Chinese-like strain of porcine epidemic diarrhea virus, Thailand Emerging infectious diseases 15(7):1112-1115 18 Ren X, Li P 2011 Development of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of porcine epidemic diarrhea virus Virus genes 42(2):229-235 19 Song D, Park B 2012 Porcine epidemic diarrhoea virus: a comprehensive review of molecular epidemiology, diagnosis, and vaccines Virus genes 44(2):167-175 20 Song DS, Kang BK, Oh JS, Ha GW, Yang JS, Moon HJ, Jang YS, Park BK 2006 Multiplex reverse transcription-PCR for rapid differential detection of porcine epidemic diarrhea virus, transmissible gastroenteritis virus, and porcine group A rotavirus J Vet Diagn Invest 18(3):278-281 21 Tobler K, Ackermann M 1995 PEDV leader sequence and junction sites Advances in experimental medicine and biology 380:541-542 22 Tobler K, Ackermann M 1996 (Identification and characterization of new and unknown coronaviruses using RT-PCR and degenerate primers) Schweizer Archiv fur Tierheilkunde 138(2):80-86 23 Wood EN 1977 An apparently new syndrome of porcine epidemic diarrhoea The Veterinary record 100(12):243-244 24 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ truy cập 12/2014 25 http://www.veterinaryresearch.org/ truy cập 2/2015 52 ... PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  VŨ PHÚC TRƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN TẠI HƯNG YÊN, KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MẦM BỆNH... dịch tễ bệnh tiêu chảy thành dịch lợn Hưng Yên, khảo sát số đặc tính sinh học phân tử mầm bệnh? ?? Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát Xác định số đặc điểm dịch tễ, phân bố type virus PED... dung nghiên cứu 17 iv 2.2 Nguyên liệu 17 2.3 Địa điểm nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học 18 2.3.2 Khảo sát số đặc tính sinh học phân tử mầm bệnh 18 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU