khảo sát một số đặc tính của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lý bệnh cháy bìa lá lúa

Kết quả về đặc điểm nuôi cấy của tám chủng xạ khuẩn trong nghiên cứu được chia làm hai nhóm: nhóm 1 gồm có ba chủng với màu sắc của hệ sợi khí sinh là nhóm màu trắng, nhóm 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT



NGUYỄN VÕ

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ TRIỂN VỌNG TRONG

QUẢN LÝ BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần Thơ, 2014

i

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ TRIỂN VỌNG TRONG

QUẢN LÝ BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA

TS LÊ MINH TƯỜNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT



Do sinh viên Nguyễn Võ thực hiện

Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014

Cán bộ hướng dẫn

Ts Lê Minh Tường

iii

LÝ LỊCH CÁ NHÂN



1 LÝ LỊCH SƠ LƯỢC

Họ và tên sinh viên: Nguyễn Võ Giới tính: Nam

Ngày sinh: 02/12/1993 Dân tộc: Kinh

Nơi sinh: Thốt Nốt, Cần Thơ

Quê quán: ấp Phụng Phụng, xã Thạnh Tiến, huyện Vĩnh Thạnh, TP Cần Thơ

2 QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

Năm 1999-2004: học tại trường Tiểu Học Dân Lập An Bình

Năm 2004-2008: học tại trường Trung Học Cơ Sở Thạnh An

Năm 2008-2011: học tại trường Trung Học Phổ Thông Thạnh An

Năm 2011-2015: học tại trường Đại Học Cần Thơ Chuyên ngành Bảo Vệ Thực Vật, khóa 37, khoa Nông Nghiệp & Sinh học Ứng Dụng, trường Đại học Cần Thơ

kỳ công trình luận văn nào trước đây

Tác giả luận văn

Nguyễn Võ

Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến thầy cố vấn học tập - Nguyễn Chí Cương, quý thầy cô trong khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, những người đã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian học đại học

Để hoàn thành luận văn này, anh Lý Văn Giang đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài, xin gửi lời cám ơn chân thành đến anh Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến các anh chị và bạn bè trong phòng thí nghiệm phòng trừ sinh học đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn Các bạn trong Lớp Bảo Vệ Thực Vật khóa 37 đã nhiệt tình giúp đỡ, sẽ chia và động viên tôi trong những ngày tháng học Đại học

Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2014

Nguyễn Võ

Đề tài “Khảo sát một số đặc tính của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong

quản lý bệnh cháy bìa lá lúa” được thực hiện từ tháng 11/2013 đến tháng 9/2014 tại phòng thí nghiệm bệnh cây, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Ngiệp & Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ nhằm mục tiêu khảo sát đặc tính của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lý bệnh cháy bìa lá lúa Từ đó làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo, góp phần ứng dụng xạ khuẩn vào biện pháp phòng trừ sinh học đối với bệnh cháy bìa lá lúa

Kết quả về đặc điểm nuôi cấy của tám chủng xạ khuẩn trong nghiên cứu được chia làm hai nhóm: nhóm 1 gồm có ba chủng với màu sắc của hệ sợi khí sinh

là nhóm màu trắng, nhóm 2 gồm năm chủng với màu sắc hệ sợi khí sinh là nhóm màu xám Hình dạng chuỗi bà tử của tám chủng xạ khuẩn là dạng thẳng đến gợn sóng (RF) đối với các chủng CT6, CT7, CT8, ĐT6, VL19 và VL21, dạng móc câu đối với chủng ĐT4 và ST15 Bề mặt bào tử của tám chủng xạ khuẩn đều có dạng trơn (Smooth)

Kết quả thí nghiệm khảo sát đặc điểm sinh hóa của các chủng xạ khuẩn cho thấy tất cả điều có khả năng tiết enzyme protease, lipase, amylase Năm chủng xạ khuẩn CT8, ĐT4, ST15, VL19 và VL21 cho thấy khả năng tạo sắc tố melanin thông qua việc làm cho môi trường nuôi cấy từ màu vàng chuyển sang màu nâu cho đến nâu đen Riêng đối với ba chủng CT6, CT7 và ĐT6 thì không làm thay đổi màu của môi trường Như vậy, qua kết quả thí nghiệm có thể kết luận các chủng xạ khuẩn có

triển vọng trong quản lý bệnh cháy bìa lá lúa thuộc chi Streptomyces Tám chủng xạ khuẩn nghiên cứu có thể thuộc loài Streptomyces kanamyceticus, loài Streptomyces

willmorei, loài Streptomyces bacillaris, loài Streptomyces capoamus, loài myces lipmanii, loài Streptomyces capoamus, loài Streptomyces bikiniensis và loài Streptomyces ostreogriseus

Strepto-Từ khóa: amylase, lipase, protesae, Streptomyces, xạ khuẩn

vii

MỤC LỤC

PHỤ BÌA i

LÝ LỊCH CÁ NHÂN iii

LỜI CẢM ƠN v

TÓM LƯỢC vi

MỤC LỤC… vii

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH x

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

1.1 Sơ lược về xạ khuẩn 2

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên 2

1.1.1.1 Phân loại xạ khuẩn 2

1.1.1.2 Phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên 2

1.1.2 Đặc điểm xạ khuẩn 3

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái 3

1.1.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn 4

1.1.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự phát triển của xạ khuẩn 4

1.1.4 Vai trò của xạ khuẩn trong phòng trừ sinh học bênh cây 5

1.1.4.1 Khả năng tiết chất kháng sinh 6

1.1.4.2 Kích thích tăng trưởng cây trồng 6

1.1.4.3 Sự cộng sinh 6

1.1.4.4 Khả năng tiết enzyme ngoại bào 6

1.1.5 Những nghiên cứu về việc sử dụng xạ khuẩn đối kháng trong phòng trừ sinh học bệnh 8

1.1.5.1 Những nghiên cứu trong nước 8

1.1.5.2 Những nghiên cứu trên thế giới 10

1.1.6 Một số phương pháp phân loại xạ khuẩn 11

1.1.6.1 Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 11

1.1.6.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý – sinh hóa 11

1.1.7 Đặc điểm phân loại chi Streptomyces 11

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP 13

2.1 Phương tiện 13

viii

2.1.1 Thời gian và địa điểm 13

2.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 13

2.1.3 Vật liệu thí nghiệm 13

2.1.4 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm 13

2.2 PHƯƠNG PHÁP 16

2.2.1 Thí nghiệm 1 Xác định Gram âm/Gram dương của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng 16

2.2.2 Thí nghiệm 2 Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất và sắc tố tan 17

2.2.3 Thí nghiệm 3 Quan sát chuỗi bào tử và hình dạng bào tử 18

2.2.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát khả năng tiết enzyme protease các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng 18

2.2.5 Thí nghiệm 5 Khảo sát khả năng tiết enzyme lipase của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng 19

2.2.6 Thí nghiệm 6 Khảo sát khả năng tiết enzyme amylase các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng 19

2.2.7 Thí nghiệm 7 Khảo sát sự hình thành sắc tố melanin của các chủng xạ khuẩn có triển vọng 20

2.2.8 Xử lý số liệu 20

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Xác định Gram âm, Gam dương của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng 21

3.2 Màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS) và khuẩn ty cơ chất (KTCC) 22

3.3 Hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử của xạ khuẩn 28

3.4 Khảo sát khả năng tiết enzym phân giải protein 38

3.5 Khảo sát khả năng tiết enzym phân giải lipid 39

3.6 Khảo sát khả năng tiết enzym phân giải tinh bột 41

3.7 Khả năng hình thành sắc tố melanin 43

3.8 Vị trí phân loại của tám chủng xạ khuẩn 45

3.8.1 Đặc điểm phân loại chủng CT6 45

3.8.2 Đặc điểm phân loại chủng CT7 46

3.8.3 Đặc điểm phân loại chủng CT8 48

3.8.4 Đặc điểm phân loại chủng ĐT4 49

3.8.5 Đặc điểm phân loại chủng ĐT6 51

3.8.6 Đặc điểm phân loại chủng ST15 52

ix

3.8.7 Đặc điểm phân loại chủng VL19 54

3.8.8 Đặc điểm phân loại chủng VL21 55

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58

4.1 Kết luận 58

4.2 Đề nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

x

DANH SÁCH BẢNG

3.1 Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn CT6 và CT7 23

3.2 Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn CT8 và ĐT4 25

3.3 Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn ĐT6 và ST15 27

3.4 Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn VL19 và VL21 29

3.5 Khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn 48

3.6 Khả năng phân giải lipid của các chủng xạ khuẩn 40

3.7 Khả năng phân giải tinh bột của các chủng xạ khuẩn 42

3.3 Màu sắc của chủng xạ khuẩn CT7 ở thời điểm 7 ngày sau khi

cấy trên các môi trường ISP

23

3.4 Màu sắc của chủng xạ khuẩn CT8 ở thời điểm 7 ngày sau khi

cấy trên các môi trường ISP

24

3.5 Màu sắc của chủng xạ khuẩn ĐT4 ở thời điểm 7 ngày sau khi

cấy trên các môi trường ISP

25

3.6 Màu sắc của chủng xạ khuẩn ĐT6 ở thời điểm 7 ngày sau khi

cấy trên các môi trường ISP

26

3.7 Màu sắc của chủng xạ khuẩn ST15 ở thời điểm 7 ngày sau khi

cấy trên các môi trường ISP

27

3.8 Màu sắc của chủng xạ khuẩn VL19 ở thời điểm 7 ngày sau khi

cấy trên các môi trường ISP

28

3.9 Màu sắc của chủng xạ khuẩn VL21 ở thời điểm 7 ngày sau khi

cấy trên các môi trường ISP

29

3.10 Hình dạng chuỗi bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng

CT6 được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

30

3.11 Hình dạng chuỗi bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng

CT7 được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

31

3.12 Hình dạng chuỗi bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng

CT8 được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

32

xii

3.13 Hình dạng chuỗi bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng

ĐT4 được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

33

3.14 Hình dạng chuỗi bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng

ĐT6 được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

34

3.15 Hình dạng chuỗi bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng

ST15 được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

35

3.16 Hình dạng chuỗi bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng

VL19 được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

36

3.17 Hình dạng chuỗi bào tử (A) và bề mặt bào tử (B) của chủng

VL21 được quan sát dưới kính hiển vi điện tử

37

3.18 Khả năng phân giải protein của các chủng xạ khuẩn 39 3.19 Khả năng phân giải lipid của các chủng xạ khuẩn vùng rễ 41 3.20 Khả năng phân giải tinh bột của các chủng xạ khuẩn 42 3.21 Ba chủng xạ khuẩn không tạo sắc tố melanin trên môi trường

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Lúa là một trong những loại cây lương thực quan trọng nhất không chỉ ở nước ta mà còn ở các nước trên thế giới Đặc biệt, Việt Nam là một trong những quốc gia có sản lượng xuất khẩu gạo hằng năm đứng thứ 2-4 trong số các nước xuất khẩu lúa gạo trên thế giới (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008) Bên cạnh đó, sự phát triển liên tục ngày một tăng của dịch hại trên đồng ruộng đã ảnh hưởng đến năng suất cũng như là chất lượng của lúa gạo Trong đó bệnh cháy bìa lá lúa (bạc lá) do

vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae là một trong những bệnh gây hại nghiêm

trọng và nguy hiểm nhất

Ở nước ta, việc thăm canh tăng vụ, gieo xạ với mật độ dày, bón thừa phân hóa học cũng như sử dụng thuốc hóa học quá liều lượng cho phép đã dẫn đến bùng phát dịch bệnh, gây thiệt hại nghiêm trọng về năng suất và kinh tế Có nhiều biện pháp đã được đưa ra nhằm làm giảm tổn thất và tránh sự bùng phát của dịch bệnh, trong đó việc sử dụng thuốc hóa học để khống chế được xem là biện pháp chủ đạo, tuy nhiên việc sử dụng thuốc hóa học liên tục và không tuân theo nguyên tắc 4 đúng đã ảnh hưởng nghiệm trọng đến môi trường, sức khỏe con người và làm mất cân bằng sinh thái

Từ đó nhiều biện pháp sinh học đã được áp dụng nhằm thay thế thuốc hóa học Hiện nay xạ khuẩn vùng rễ cũng được sử dụng như một biện pháp sinh học để

quản lý bệnh hại trên lúa Năm 2006, Bonjar đã tìm ra chủng xạ khuẩn

Streptomy-ces coralus trong 200 chủng xạ khuẩn được phân lập từ nhiều loại đất khác nhau

của tỉnh Kerman, có khả năng đối kháng với vi khuẩn Rastonia solanacearum gây bệnh héo xanh cho cây trồng sau 8-11 ngày sau khi nuôi cấy trong điều kiện in

vitro (Bonjar et al., 2006)

Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Tuấn Vủ (2013) và Trần Hậu Em (2013)

đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có triển vọng trong phòng trừ bệnh cháy bìa lá lúa Tuy nhiên vẫn chưa có những nghiên cứu cụ thể để xác định tên của các

chủng xạ khuẩn này Do đó đề tài “Khảo sát một số đặc tính của các chủng xạ khuẩn có triển vọng trong quản lý bệnh cháy bìa lá lúa” được thực hiện nhằm

định danh xạ khuẩn bằng phương pháp truyền thống dựa vào các đặc tính của

chúng

2

CHƯƠNG 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về xạ khuẩn

1.1.1 Vị trí phân loại và phân bố xạ khuẩn trong tự nhiên

1.1.1.1 Phân loại xạ khuẩn

Xạ khuẩn là vi khuẩn đặc biệt Chúng có khuẩn lạc khô và đa số có dạng hình phóng xạ (action-) nhưng khuẩn lại có dạng sợi phân nhánh như nấm (myces) (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002) Theo khóa phân loại của Bergey, xạ khuẩn là vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, có tỉ lệ G+C cao trong trình tự 16S rARN (Prescott

et al., 2008) Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10

dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay có 478 loài được công bố thuộc chi

Streptomyces, hơn 500 loài thuộc chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ khuẩn

hiếm (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2002) Gần đây nhất thì xạ khuẩn được phân

thành 6 lớp, 23 bộ, 53 họ, 252 chi Trong đó, 2 chi thường được biết là

Actinomy-ces và StreptomyActinomy-ces thuộc lớp Actinobacteria bao gồm các chủng xạ khuẩn có

những vai trò khác nhau trong nông nghiệp Chi Actinonyces thuộc họ cetaeae, bộ Streptomycetales (Ludwig et al., 2012)

Actinomy-1.1.1.2 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, rác, phân chuồng, bùn và thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được

Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thành phần đất, điều kiện canh tác và loại thảm thực vật (Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2006) Theo Waksman (1961), trong một gam đất có khoảng 29.000-2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số vi sinh vật đất

pH là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phân bố của xạ, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính, kiềm yếu hoặc axit yếu từ 6,8 -7,5 Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng của xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian (Bùi Thị Hà, 2008)

Theo Phạm Văn Kim (2000), mật số vi sinh vật cũng như xạ khuẩn giảm dần khi khoảng cách càng xa rễ Ngoài ra mật số của xạ khuẩn cũng biến đổi theo chiều sâu của đất, càng sâu thì mật số càng giảm Ở các mẫu đất khác nhau thì số lượng xạ khuẩn trong 1 gram đất cũng khác nhau, đối với mẫu đất phù sa ven sông

và đất thịt pha cát số lượng xạ khuẩn trong 1 gam đất là cao nhất Đất sét pha cát

và đất nghèo dinh dưỡng thì số lượng xạ khuẩn trong 1 gam đất là thấp nhất (Đỗ Thu Hà và ctv 2010)

3

1.1.2 Đặc điểm xạ khuẩn

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái

 Hình thái khuẩn lạc

Khuẩn lạc xạ khuẩn khô và đa số có hình phóng xạ (action-) nhưng khuẩn thể lại phân nhánh như nấm (myces) (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Nữ Kim Thảo, 2006)

Theo Lê Xuân Phương (2008), khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, nhăn nheo, có dạng vôi, dạng da, nhung tơ hay dạng màng dẻo Chúng đa dạng về màu sắc như: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… Màu sắc và kích thước của khuẩn lạc khác nhau tùy theo loài và điều kiện nuôi cấy (thành phần môi trường, nhiệt độ, ẩm độ…) Đường kính mỗi khuẩn lạc thường chỉ từ 0,5 - 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính lên đến 1 cm hoặc lớn hơn

 Hình thái khuẩn ty

Trên môi trường đặc, xạ khuẩn thường có 2 dạng khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) phát triển trên bề mặt môi trường với chức năng chủ yếu là sinh sản, khuẩn ty cơ chất (subtrate mycelium) ăn sâu vào môi trường với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Tuy nhiên chỉ có một số xạ khuẩn chỉ có khuẩn ty cơ chất

nhưng cũng có loại chỉ có khuẩn ty khí sinh (chi Sporichthya), khi đó khuẩn ty khí

sinh vừa làm chức năng sinh sản vừa làm chức năng dinh dưỡng (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 1978)

Khuẩn ty của xạ khuẩn có nhiều hình dạng khác nhau: chân chim, rễ cây, hình xoắn chùm quả, hình xoắn cành lá, hình xoắn ốc, hình đốt thưa, hình đốt dày, hình đốt xoắn (Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2006)

 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Xạ khuẩn sinh sản vô tính bằng bào tử và cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn là chuỗi bào tử (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Nữ Kim Thảo, 2006) Hình thái chuỗi bào tử và bào tử là những đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn

Theo Nguyễn Lân Dũng và ctv (2006), chuỗi bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc gợn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA) Bào tử xạ khuẩn hình thành trên chuỗi bào tử theo 2 phương pháp: kết đoạn và cắt khúc Hình dạng bào tử xạ khuẩn rất đa dạng, có thể là hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5

µm

4

Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có thể sinh sản bằng khuẩn ty Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển thành hệ khuẩn ty (Lê Xuân Phương, 2008)

1.1.2.2 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào gồm các phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập (Bùi Thị Hà, 2008)

Thành tế bào: có cấu tạo dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành tế bào gồm 3 lớp: lớp ngoài, lớp trong và lớp giữa Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulose và chitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia quá trình trao đổi chất và vận chuyển vật chất qua màng tế bào Theo Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Thị Kim Thảo (2006), thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 8 loại dựa trên các đặc điểm về thành phần acid amin, đặc biệt là acid diaminopimelic, lysine và thành phần đường trong thành tế bào

Màng nguyên sinh chất: dày khoảng 50 nm, được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là phospholipit, protein và giống với cấu trúc màng sinh chất của vi khuẩn Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn (Bùi Thị Hà, 2008)

Nguyên sinh chất và nhân: có cấu tạo tương tự như tế bào vi khuẩn Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn có chứa: mezoxom, riboxom, các vật thể ẩn nhập gồm các hạt poliphotphat hình cầu Soudan III, các hạt polysaccarit bắt màu dung dịch lugol (Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2006; Bùi Thị Hà, 2008) Tuy nhiên điều khác biệt của xạ khuẩn với các nhóm nhân sơ (Prokaryotes) là chúng có tỷ lệ G +

C rất cao trong ADN, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này khoảng 25 - 45% (Nguyễn Lân Dũng và Nguyễn Thị Kim Thảo, 2006)

1.1.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến sự phát triển của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trong dãy pH từ 5 - 9, khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh nhiều nhất ở pH = 7 (Phạm Văn Ty và Đào Thị Lương, 2003) Xạ khuẩn sinh trưởng được ở nhiệt độ từ 25 - 400C, hoạt tính kháng sinh và sinh khối cao nhất ở 30 - 350C, nhiệt độ trên 400C thì khả năng sinh trưởng và tổng hợp chất kháng sinh đều giảm

Theo Đặng Thị Kim Uyên (2010), xạ khuẩn có thể sống được trong điều kiện

pH, nhiệt độ biến động là 4 - 8 và 7 - 600C, điều kiện môi trường bất lợi xạ khuẩn sẽ hình thành bào tử Nhưng chúng sẽ chết nếu nhiệt độ vượt quá 800C, riêng xạ khuẩn ưa nhiệt hoặc ưa lạnh có thể phát triển ở nhiệt độ thấp hoặc cao hơn

5

1.1.4 Vai trò của xạ khuẩn trong phòng trừ sinh học bệnh cây

1.1.4.1 Khả năng tiết chất kháng sinh

Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng sinh rộng, kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loài vi sinh vật khác nhau Một số chất kháng sinh dùng để trị bệnh cây như kasugamycin, aureo-fungin, blasticidin-S và validamycin (Phạm Văn Kim, 2000)

Theo Nduka (2007), kháng sinh được hiểu là các hợp chất hóa học do vi sinh vật tiết ra và ở nồng độ thấp chúng có thể kìm hãm sự dinh trưởng hoặc tiêu diệt vi sinh vật khác

Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật tiết ra chất kháng sinh chủ yếu, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Vì thế, ứng dụng xạ khuẩn trong phòng trừ sinh học bệnh cây là một hướng nghiên cứu mới (Phạm Văn Kim, 2006)

Theo Silvia và Mika (2008), một trong những khả năng quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh Trong số 8000 chất kháng sinh hiện diện trên thế giới, có hơn 80% có nguồn gốc từ xạ khuẩn

1.1.4.2 Kích thích tăng trưởng cây trồng

Theo Đặng Thị Kin Uyên (2010) khi ngâm hạt giống chanh Volka với huyền

phù xạ khuẩn Streptomyces SOFRI 1 năm giờ trước khi chủng nấm Fusarium

solani, kết quả cho thấy xạ khuẩn ngoài việc kích thích khả năng nảy mầm của hạt

mà còn giúp cây con phát triển tốt thể hiện qua việc tăng chiều cao và số rễ

Nhiều chủng Sreptomyces spp có khả năng sản xuất ra phytohormon kích thích tăng trưởng cây trồng như Indole-3-acetic acid (IAA) từ S griseus, S coeli-

color (Hasegawa et al 2006)

Meguro et al (2006) báo cáo một chủng Streptomyces sp MBR-52 có thể

kích thích sự nảy mầm và kéo dài của rễ ở trục hạ diệp Sự kéo dài của rễ tăng cường vượt trội khi cây con được xử lí với xạ khuẩn MBR-52 trong điều kiện nuôi cấy mô Dòng này có thể giúp rút ngắn thời gian quen với khí hậu của cây giống nuôi cấy mô trong môi trường ấm và ẩm ướt, do đó giảm nguy cơ nhiễm bệnh của cây trồng

1.1.4.3 Sự cộng sinh

Năm 1886, Brunchorst phân lập được các chủng Frankia thuộc nhóm xạ

khuẩn có thể cộng sinh với một số họ thực vật không phải cây họ đậu, đặc biệt là họ cây Phi lao (Casuarinacae), hình thành các nốt sần ở rễ Các nốt sần này có khả năng cố định đạm tự do trong không khí, giúp cây trồng sinh trưởng và phát triển

6

tốt trên đất nghèo dinh dưỡng, nhất là vùng đất cát ven biển (trích dẫn bởi Phạm

Văn Kim, 2006; Hasegawa et al., 2006)

1.1.4.4 Kí sinh

Nhiều nghiên cứu đã ghi nhận xạ khuẩn Streptomyces spp và các xạ khuẩn khác có ký sinh lên nấm gây bệnh (Shimizu et al., 2009)

Vi khuẩn và xạ khuẩn kí sinh trên bề mặt của bào tử nấm Helmintho sporium

sativus chôn sâu trong đất vườn sau 50 ngày, các vi sinh vật này phá hủy và tạo lỗ

hổng ở vách tế bào nấm (Phạm Văn Kim, 2006)

1.1.4.5 Khả năng tiết enzyme ngoại bào

Bên cạnh việc tiết kháng sinh, xạ khuẩn còn tiết ra hàng loạt các enzyme ngoại bào, giữ vai trò quan trọng trong phòng trừ sinh học bệnh cây Đặc biệt, có nhiều mối liên quan giữa việc đối kháng của nấm và sự tiết ra chitinases hoặc glu-

canases của xạ khuẩn đã được ghi nhận (Valois et al., 1996)

Xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững như cellulose, chất mùn, chitin, lig-nin, Ngoài ra xạ khuẩn còn có thể sinh ra một số vitamin nhóm B (B1, B2, B6, B12); một số acid hữu cơ như acid lactic, acid axetic và nhiều acid amin như acid glutamic, methionin, tryptophan, lysine Đặc biệt, xạ khuẩn còn được dùng rộng rãi trong các ngành công nghiệp lên men, chế tạo các chế phẩm men hoặc ứng dụng các men do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều như: protease, amyl-

ase, xenlulase, kitinase… (Nguyễn Xuân Thành và ctv., 2006)

 Khả năng phân giải protein

Enzyme protease thuộc nhóm enzyme thủy phân protein được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm chẳng hạn trong chế biến cá và thịt Protease có thể thủy phân protein có trong chất thải để sản xuất các dung dịch đặc hoặc các chất rắn khô có giá trị dinh dưỡng cho cá hoặc vật nuôi đồng thời có thể làm giảm các tác nhân gây ô nhiễm môi trường (Nguyễn Xuân Thành, 2007)

Mitra and Chakrabartty (2005), đã tìm thấy loài xạ khuẩn Streptomyces

nogalator dòng Ac 80 có khả năng tiết enzyme ngoại bào protease Dòng này

được phân lập từ đất, nó được tìm thấy có hiệu quả trong loại bỏ lông của da dê Lương Thị Hương Giang (2011) đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh học cao Theo kết quả khảo sát có 5 chủng xạ khuẩn TC12.10, TC13.1, TC15.4, TC16.4 và TC19.9 đều có khả năng tiết enzyme protease khi được nuôi trên môi trường Gause 1 Trong đó chủng TC19.9 có hoạt tính enzyme protease mạnh nhất

7

 Khả năng phân giải lipid

Lipid là thành phần quan trọng của màng sinh chất hay màng tế bào chất (Cytoplasmic membrane, CM) ở vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác Màng này được cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid (PL), chiếm 30-40% khối lượng của màng và các protein (Nguyễn Lân Dũng, 2005)

Ertuğrul et al (2007) đã phân lập được một số loài vi khuẩn có thể sống

trong môi trường có chứa chất thải của nhà máy xử lí nước thải olive Trong số 17

chủng được khảo sát, chủng Bacillus sp có khả năng tiết enzyme lipase mạnh nhất

khi được nuôi trong môi trường tributyrin agar ở pH = 6

Khi enzyme lipase ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công

nghiệp, Sundaramoorthi et al (2010) đã sử dụng loài xạ khuẩn Streptomyces

griseus để sản xuất enzyme lipase Dầu ôliu là chất nền tốt nhất cho việc tăng

cường hoạt động của enzyme, tuy nhiên do chi phí cao, thay vì sử dụng dầu ô liu, dầu hướng dương và dầu cọ đã được sử dụng như một chất nền cho sản xuất li-pase

 Khả năng phân giải tinh bột

Trong quá trình sống, để phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các chất đơn giản có thể hấp thu được, xạ khuẩn tiết vào môi trường các enzyme ngoại bào Theo kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Hà (2008) khi xác định hoạt tính của enzyme ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với các nguồn cơ chất như tinh bột tan (xác định hoạt tính amylase), cazein (xác định hoạt tính protease), CMC (xác định hoạt tính endoglucanase) Cả 2 chủng xạ khuẩn khảo sát Đ1 và Đ2 đều cho thấy khả năng phân giải mạnh tinh bột tan, Cazein và CMC

α-amylase là enzyme quan trọng và được sử dụng rộng rãi, nó đã phát triển cho các ứng dụng lâm sàng và dược liệu cũng như phân tích hóa học Bên cạnh đó còn được sử dụng trong các ngành công nghiệp về thực phẩm, bia, chất tẩy rửa,

dệt may, giấy và chưng cất ngành công nghiệp (Lin et al 1998; Saxena et al

2007; Trích dẫn bởi Santos, 2012) Ngoài ra việc sử dụng các phụ phẩm nông nghiệp và các hợp chất tự nhiên khác cho vi sinh vật phát triển có thể tạo thành một sự thay mới theo hướng sản xuất enzyme với chi phí thấp hơn Năm 2012,

Santos đã tìm thấy chủng Streptomyces sp SLBA-08 khi phân lập từ đất ở Brasil

Streptomyces sp SLBA-08 được sử dụng để sản xuất α-amylase sử dụng sisal, bã

mía và urê như nguồn C và N

8

1.1.5 Những nghiên cứu về việc sử dụng xạ khuẩn đối kháng trong phòng trừ sinh học bệnh cây

1.1.5.1 Những nghiên cứu trong nước

Trong việc khảo sát khả năng đối kháng với nấm gây bệnh trên chè của chi

xạ khuẩn Streptomyces, kết quả đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn là Đ1 và R2

có hoạt tính mạnh nhất trong số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, kháng được cả

2 chủng nấm gây bệnh trên chè là CT-2E và CT-5X, đồng thời cũng có khả năng kháng các nấm kiểm định (Bùi Thị Hà, 2008)

Huỳnh Văn An (2011) đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có khả năng

đối kháng nấm Phytophthora capsici gây bệnh thối trái dưa Kết quả cho thấy: cả

3 dòng xạ khuẩn 2, 3 và 9 đều thể hiện khả năng ức chế được bệnh thối trái dưa

hấu do Phytophthora capsici gây ra, trong đó dòng 2 và 9 thể hiện hiệu quả cao

hơn dòng 3 Trong 3 biện pháp xử lí thì biện pháp phun trước và phun trước + sau thể hiện hiệu quả cao hơn biện pháp phun sau

Xạ khuẩn cũng thể hiện khả năng đối kháng cao trong việc phòng trị bệnh

đốm lá trên ớt do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv vesicatoria gây ra ở điều

kiện nhà lưới Theo kết quả nghiên của Nguyễn Thị Thùy Linh (2011) có 3 chủng xạ khuẩn 2, 3, 33 đều thể hiện khả năng phòng trị bệnh Trong đó xạ khuẩn 3 thể hiện khả năng phòng trị bệnh cao ở biện pháp phun nước + sau ở thời điểm 13

ngày sau khi chủng

Bước đầu nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo

xanh của Streptomyces arabicus 112 Kết quả cho thấy chủng xạ khuẩn này có khả

năng sinh kháng sinh phổ rộng, kháng vi khuẩn Gram dương, Gram âm và nấm, nhưng đặc biết là chống được 3 chủng vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cà chua,

lạc, đặc biệt chất kháng sinh do chủng xạ khuẩn Streptomyces arabicus tạo ra

không ảnh hưởng xấu đến khả năng nảy mầm của hạt mà còn có tác dụng kích thích nảy mầm với nồng độ pha loãng 100-10.000 lần (Nguyễn Văn Ty và Đào Thị Lương, 2003)

Đinh Ngọc Trúc (2013) đã đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ

khuẩn phân lập từ đất lúa tại Hậu Giang với nấm Pyricularia oryzae Cavara trong điều kiện in vitro Kết quả phân lập được 183 dòng xạ khuẩn, trong đó có 129 dòng biểu hiện khả năng đối kháng với nấm P oryzae, trong đó có 5 dòng xạ

khuẩn PH1, C4t, CTA1, CTA2.St3, CTA4.P3t, CTA3.S1t đều có khả năng đối

kháng mạnh và ổn định với 3 dòng nấm P oryzae, kéo dài đến 14 ngày sau khi thí

nghiệm

Theo kết quả nghiên cứu của Đặng Thị Kim Uyên (2010), chủng xạ khuẩn

Streptomyces – SOFRI 1 có khả năng đối kháng với nấm Fusarium solani gây

9

bệnh thối rễ trên cây chanh Volka ở điều kiện phòng thí nghiệm, đồng thời chủng

Streptomyces – SOFRI 1 ảnh hưởng tốt đến sự phát triển chiều dài rễ, chiều cao

cây, trọng lượng thân, rễ tươi, số lượng rễ mới cao hơn nhiều so với nghiệm thức

chỉ chủng nấm gây bệnh là F solani Đặc biệt là số lượng rễ thối ở các nghiệm thức chủng Streptomyces – SOFRI 1 thấp và khác biệt có ý nghĩa với nghiệm thức chỉ chủng F solani trong các nghiệm thức xử lí thì nghiệm thức xử lí xạ khuẩn

Streptomyces – SOFRI 1 với mật số 106 cfu/ml và 107 cfu/ml cho hiệu quả cao nhất

Trần Thị Tím (2013), dùng xạ khuẩn đối kháng để chống lại vi khuẩn

Erwin-ia carotovora gây bệnh thối nhũn trên bắp cải trong điều kiện in vitro và nhà lưới

Kết quả có 3 chủng xạ khuẩn 5, 59, 59+ có khả năng đối kháng với vi khuẩn E

ca-rotovora gây bệnh thối nhũn bắp cải trong điều kiện in vitro Trong 2 biện pháp xử

lí thì biện pháp phun sau cho hiệu quả hơn biện pháp phun trước Riêng chủng 59 cho hiệu quả phòng trị như nhau ở cả 2 biện pháp Và nghiệm thức phun sau ở chủng 59+ cho hiệu quả phòng trị bệnh thối nhũn do vi khuẩn E carotovora cao

nhất

Năm 2010, Tô Huỳnh Như đã tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng đối

kháng và hiệu quả phòng trừ của xạ khuẩn đối với chủng nấm Colletotrichum ST2

gây bệnh thán thư trên giống ớt sừng Kết quả cho thấy: các chủng 4RM, 21RM, 54RM, 55RM, 58RM đều có hiệu quả ức chế chiều dài ống mầm và giết chết bào

tử nấm Colletotrichum ST2 Trong đó chủng 21RM thể hiện hiệu quả giảm bệnh

cao nhất Hai biện pháp phun trước và kết hợp cho hiệu quả kiểm soát bệnh tốt hơn biện pháp phun sau

Lê Thị Bích (2011), đã đánh giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn

đối với nấm Fusarium oxysporum f.sp niveum Kết quả cả 3 chủng xạ khuẩn 4,19,

21 đều có triển vọng trong phòng trừ sinh học bệnh héo rũ trên dưa hấu, trong đó

xạ khuẩn 21 có khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum f.sp niveum cao

nhất

1.1.5.2 Những nghiên cứu trên thế giới

Yan Min et al (2000) đã ghi nhân được 26 chủng Streptomyces spp có khả năng đối kháng với nhiều mầm bệnh quan trọng như Alternaria solani, Botritis ci-

nerea, Xanthomonas campestris và Erwinia carotovora Bên cạnh đó, 3 chủng Streptomyces diastatochromogenes, S libani và S avermitilis có khả năng kháng

nấm mạnh đối với Asperillus niger, Alternaria alternate, Bostrytis cinerea và

Phy-topthora capsici thông qua cơ chế tiết kháng sinh thuộc nhóm olygomycins A và

C

10

Cao et al (2005), đã ứng dụng chủng xạ khuẩn Streptomyces trong phòng trừ sinh học bệnh thối rễ chuối do Fusarium oxysporum f.sp cubense hiệu quả đến

37,5 % bằng cách sản xuất ra nhiều siderphore

Merriman et al (1974) đã thử nghiệm bằng cách chủng xạ khuẩn vào hạt lúa mì giúp giảm triệu chứng chết rạp do Rhizoctonia solani gây ra Sau đó Sabaratman và Traquair (2002) phân lập được chủng Streptomyces sp có khả năng

ức chế R solani gây bệnh chết rạp cây con ở cà chua ghép trong nhà kín (trích dẫn

bởi Trần Thị Tím, 2013)

Errakhi et al (2009), đã phân lập được 195 chủng xạ khuẩn trên đất trồng

cây củ cải đường, trong đó có 10 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với nấm

Sclerotium rolfsii gây bệnh thối rễ trên cây củ cải đường trong điều kiện in vitro

Qua khảo sát trong điều kiện in vitro, 2 chủng xạ khuẩn J-2 và B-11 có khả năng

giảm bệnh lần lượt là 81 và 80%

Tao et al (2011) đã khảo sát chất kháng sinh neomycin trích từ hợp chất kháng khuẩn của Streptomyces fradiae dòng HTP có khả năng ức chế 4 loài vi khuẩn gây hại nghiêm trọng trên cây trồng: vi khuẩn Xanthomonas campestris pv

citri gây bệnh loét trên cây có múi, Erwinia carotovora sub sp carotovora gây

thối nhũn trên cây cải bắp Trung Quốc, Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa và Ralstonia solanacearum gây bệnh héo xanh trên gừng trong điều kiện in vitro với bán kính vành khăn vô khuẩn từ 10,8 - 12 mm Khi đánh giá hiệu quả giảm bệnh của neomycin trong điều kiện in vitro thì phần trăm giảm bệnh lần

lượt là 80,5%, 77,5%, 60,1% và 77,5% Ngoài ra, kết quả thí nghiệm còn cho thấy neomycin không chỉ ức chế sự phát triển của các mầm bệnh mà còn giết chết làm giảm mật số vi khuẩn hiện có tại vết bệnh

1.1.6 Một số phương pháp phân loại xạ khuẩn

1.1.6.1 Phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại thể hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử (Bùi Thị Hà, 2008)

Theo Pridham và cộng sự, chuỗi bào tử chia thành 3 nhóm: RF cho những chuỗi bào tử thẳng và lượn sóng RA cho những chuỗi bào tử xoắn, thô sơ và ngắn S cho những chuỗi bào tử phát triển mạnh và xoắn (trích dẫn bởi Bùi Thị

11

Hà, 2008) Việc dùng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn được xem

là những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn

1.1.6.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý – sinh hóa

Để phân loại xạ khuẩn đến loài người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác nhau như khản năng đồng hóa cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích tăng trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống en-zyme Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng của xạ khuẩn (Bùi Thị Hà, 2008)

1.1.7 Đặc điểm phân loại chi Streptomyces

Theo Wakman and Henrici (1943) chi Streptomyces có số lượng loài được

miêu tả nhiều nhất Chúng có đặc trưng bởi hệ sợi cơ và khí sinh rất phát triển và phân nhánh mạnh mẽ (Waskman, 1961)

Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram dương,

hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25 - 300C, pH tối ưu 6,5 - 8,0 Đường kính sợi khuẩn ty là 0,7 - 0,8 µm, khuẩn lạc thường có đường kính khoảng 1 - 5 mm và có dạng các vòng đồng tâm hoặc dạng phóng xạ (http://vi.wikipedia.org/wiki/Streptomyces)

Theo Waksman (1961) khuẩn lạc rắn chắc có hệ sợi cơ chất ăn sâu vào môi trường và bên trên được phủ hệ sợi khí sinh Khuẩn ty cơ chất ăn sâu vào môi trường và có thể tiết ra các sắc tố hòa tan vào môi trường Màu sắc của khuẩn lạc

và khuẩn ty khí sinh có nhiều màu sắc khác nhau tùy thuộc vào nhóm

Streptomy-ces và nó cũng thay đổi khi tiến hành nuôi cấy trên các loại môi trường dinh

dưỡng khác nhau Theo đánh giá của Tresner and Backus (1963), xạ khuẩn chi

Streptomyces khi được nuôi cấy trên các môi trường ISP2, ISP3, ISP4 và ISP5

chúng sẽ thể hiện sự đa dạng về màu sắc Màu của khuẩn ty khí sinh (KTKS) được thể hiện qua các nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh Đồng thời theo Szabó and Marton (1964) khi quan sát màu sắc khuẩn ty cơ chất (KTCC) của xạ khuẩn ở mặt sau đĩa Petri, ghi nhận các màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây Ngoài ra xạ khuẩn còn có thể tiết ra các sắc tố hòa tan vào môi trường, gồm các màu: vàng, xanh, đỏ, tím… Đặc biệt xạ khuẩn có khả năng sinh sắc tố melanin làm cho môi

- 0,8 µm) (Waskman, 1953) Theo đánh giá của Tresner et al., (1961), chuỗi bào tử

có các dạng: thẳng hay hơi gợn sóng ký hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn ốc ký hiệu là S (Spirales) Đồng thời bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: dạng trơn (smooth), dạng gai (spiny), dạng nhăn nheo (warty), dạng có lông (hairy) Hình dạng của chuỗi bào tử và bào tử là đặc trưng riêng biệt của từng loài (Waskman

and Lechevalier 1953) Ví dụ loài xạ khuẩn Streptomyces griseus (Hình 1.1A) có chuỗi bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử dạng trơn, loài Streptomyces sp (Hình 1.1B), chuỗi bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử có dạng nhăn nheo và loài Strepto-

myces africanus có chuỗi bào tử dạng xoắn và bề mặt bào tử có dạng gai

Hình 1.1 Hình dạng chuỗi bào tử và bề mặt bào tử của các loài xạ khuẩn

13

Chương 2 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Phương tiện

2.1.1 Thời gian và địa điểm

 Thời gian: 11/2013 đến 09/2014

 Địa điểm: Phòng thí nghiệm bệnh cây, Bộ môn Bảo vệ thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

2.1.2 Dụng cụ thí nghiệm

 Tủ sấy hiệu Sibata (Nhật), model SPN 450

 Tủ thanh trùng ướt (autoclave) hiệu Sibata (Nhật), model KL300

 Kính hiển vi hiệu Olympus corporation, model CX21FS1

 Cân điện tử Shimadzu, model UX620H

 Đĩa petri (đường kính đáy 9,2 cm, nắp 10 cm)

 Các vật dụng cần thiết khác

2.1.3 Vật liệu thí nghiệm

Tám chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với vi khuẩn Xanthomonas oryzae

pv oryzae được cung cấp từ Bộ môn Bảo vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và

Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ

2.1.4 Các môi trường sử dụng trong thí nghiệm

 Môi trường MS (Mannitol Soyal four medium) (Hobbs et al., 1989)

 Môi trường Skim milk agar (Jha et al., 2009)

Sữa bột gạn béo thanh trùng 70 g

 Môi trường tinh bột (Santos et al., 2012): tinh bột tan - 10g; yeast

extract – 1g; agar – 15g; NaNO3 - 1.2g; KH2PO4 3g; K2HPO4 – 6g; MgSO4.7H2O - 0.2g; CaCl2.2H2O - 0.05g; MnSO4.7H2O 0.01g; ZnSO4.7H2O - 0.001g; pH =7; Nước cất – 1 lít

2.2 Phương pháp

 Nội dung : Khảo sát đặc tính sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn vùng

rễ có triển vọng trong việc kiểm soát bệnh cháy bìa lá lúa

 Mục tiêu: nhằm khảo sát các đặc điểm nuôi cấy, hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng xạ khuẩn triển vọng có khả năng đối kháng với vi khuẩn

Xanthomonas oryzae pv oryzae

2.2.1 Thí nghiệm 1 Xác định Gram âm/Gram dương của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng: (Prescott et al., 2002)

 Mục tiêu: xác định các chủng xạ khuẩn triển vọng thuộc Gram âm/Gram dương

 Tiến hành

Thuốc nhuộm:

+ Dung dịch A:

Crystal Violet 0,5 g Nước cất 100 ml

+ Dung dich B (lugol):

Iodine 1 g Potassium iodine 2 g

17

Nước cất 100 ml

+ Dung dịch C (carbon fuchsin)

Basic fuchsin 1 g Absolute ethanol 10 ml Phenol 5 g Nước cất 1000 ml

 Cách thực hiện: trải đều giọt huyền phù xạ khuẩn trên lame, sau đó cố định xạ khuẩn bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn Kế tiếp, nhỏ dung dịch A trong thời gian từ 1-2 phút, kế tiếp nhỏ dung dịch B trong 1 phút Đổ bỏ thuốc thừa và rửa lame bằng cồn 960 cho đến khi nào không còn màu chảy ra nữa, tiếp theo là rửa qua nước cất, để khô và nhuộm với dung dịch C trong 15 giây, rửa nước và để khô Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại 100X, xạ khuẩn Gram âm sẽ có màu đỏ, xạ khuẩn Gram dương sẽ có màu tím xanh

2.2.2 Thí nghiệm 2 Quan sát màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan

 Mục tiêu: Ghi nhận màu sắc các chủng xạ khuẩn trên nhiều loại môi trường khác nhau

 Tiến hành: thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Shirling and Gottlieb (1966)

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường: ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, mỗi chủng cấy năm đĩa, để ở nhiệt độ phòng Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát màu sắc khuần ty cơ chất (KTCC), khuẩn ty khí sinh (KTKS) và sắc tố tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy

Màu sắc của khuẩn ty khí sinh được thể hiện qua các màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám , Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh (Tresner and Backus, 1963)

Ghi nhận màu sắc của khuẩn ty cơ chất theo Szabó and Marton (1964): quan sát màu sắc khuẩn lạc của xạ khuẩn ở mặt sau đĩa Petri Ghi nhận các màu: vàng nâu, vàng nâu ánh đỏ hoặc da cam, vàng nâu ánh xanh da trời hoặc tím, vàng nâu lẫn xanh lá cây Nếu thấy các màu trên ký hiệu là (1), nếu không ký hiệu là (0) ( trích bởi Shirling and Gottlieb,1966)

Sắc tố hòa tan vào môi trường có các màu: vàng, xanh, đỏ, tím… Nếu có ký hiệu là (1), nếu không ký hiệu là (0)

+ Cấy xạ khuẩn lên miếng thạch môi trường, sau đó đậy lamen lại

+ Miếng lam được đặt trong đãi petri vô trùng trong điều kiện 12 giờ sáng 12 giờ tối, nhiệt độ trung bình 280C Mỗi chủng tiến hành nuôi cấy trên năm đĩa

+ Sau 10 ngày quan sát hình dạng chuỗi bào, bề mặt bào tử của xạ khuẩn dưới kính hiển vi điện tử

+ Ghi nhận theo đánh giá của Tresner et al., (1961):

Chuỗi bào tử có các dạng: thẳng hay hơi gợn sóng ký hiệu là RF (Rectif lexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn ốc ký hiệu là S (Spirales)

Hình dạng bề mặt bào tử được quan sát dưới kính hiển vi điện tử có các dạng: dạng trơn, dạng gai, dạng khối u, dạng có lông

2.2.4 Thí nghiệm 4 Khảo sát khả năng tiết enzyme protease của các chủng xạ

khuẩn có triển vọng

 Mục tiêu: nhằm xác định khả năng tiết enzyme protease của các chủng xạ khuẩn triển vọng

 Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 chủng xạ khuẩn vùng rễ có triễn vọng

Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (5 mm)

có tẩm huyền phù xạ khuẩn trên đĩa petri có chứa môi trường Skim milk agar

19

 Chỉ tiêu theo dõi

Tiến hành đo bán kính vòng phân giải protein sau 2, 4, 6 ngày sau thí nghiệm

2.2.5 Thí nghiệm 5 Khảo sát khả năng tiết enzyme lipase của các chủng xạ khuẩn có triển vọng

 Mục tiêu: nhằm xác định khả năng tiết enzyme lipase của các chủng xạ khuẩn triển vọng

 Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 chủng xạ khuẩn vùng rễ có triễn vọng

 Cách thực hiện:

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của (Ertuğrul et al., 2007)

Xạ khuẩn vùng rễ được nhân nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường MS để mặt nghiêng trong 5 ngày

Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (5 mm)

có tẩm huyền phù xạ khuẩn trên đĩa petri có chứa môi trường Tributyrin agar

 Chỉ tiêu theo dõi

Tiến hành đo bán kính vòng phân giải lipid sau 2, 4, 6, 8 ngày sau thí nghiệm

2.2.6 Thí nghiệm 6 Khảo sát khả năng tiết enzyme amylase của các chủng xạ khuẩn có triển vọng

 Mục tiêu: nhằm xác định khả năng tiết enzyme amylase của các chủng xạ khuẩn triển vọng

 Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 5 lặp lại, mỗi nghiệm thức là 1 chủng xạ khuẩn vùng rễ có triễn vọng

 Cách thực hiện:

Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Santos et al (2012)

Xạ khuẩn vùng rễ được nhân nuôi trong ống nghiệm chứa môi trường MS để mặt nghiêng trong 5 ngày

 Xạ khuẩn được cấy thành 3 điểm, mỗi điểm là một khoanh giấy thấm (5 mm)

có tẩm huyền phù xạ khuẩn trên đĩa petri có chứa môi trường tinh bột

 Chỉ tiêu theo dõi

Tiến hành đo bán kính vòng phân giải tinh bột sau 4, 6, 8 ngày sau thí nghiệm

2.2.8 Xử lý số liệu

Các chỉ tiêu theo dõi được nhập và xử lý bằng phần mềm Excel Tính toán số liệu thống kê theo chương trình MSTATC, dùng phép thử Duncan

21

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xác định Gram âm/Gram dương của các chủng xạ khuẩn vùng rễ có triển vọng

Hình 3.1 Kết quả nhuộm Gram của các chủng xạ khuẩn có triển vọng

Tiến hành nhuộm Gram và quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại 100X, kết quả thu được cho thấy tất cả các chủng xạ khuẩn khảo sát đều bắt màu tím xanh Với kết quả này có thể khẳng định 8 chủng xạ khuẩn khảo sát đều thuộc vi khuẩn Gram dương (Hình 3.1)

CT6 T-CT6

CT7

22

3.2 Màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS) và khuẩn ty cơ chất (KTCC)

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau để quan sát khả sinh trưởng và màu sắc của hệ khuẩn ty Kết quả cho thấy các chủng xạ khuẩn khảo sát đều đa dạng về màu sắc và phát triển tốt trên các môi trường và tùy vào thành phần của môi trường nuôi cấy mà khả năng tiết ra sắc tố hòa tan khác nhau

 Chủng CT6

Khi nuôi cấy trên các môi trường ISP2, ISP4 và ISP5 chủng này có màu sắc hệ sợi khí sinh màu trắng, màu hệ sợi cơ chất màu vàng nhạt Trên môi trường ISP3 chủng CT6 có màu sắc hệ sợi khí sinh màu trắng cam, màu hệ sợi cơ chất màu vàng nhạt Chủng CT6 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy (Hình 3.2)

Hình 3.2 Màu sắc của chủng xạ khuẩn CT6 ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy trên

các môi trường ISP

23

 Chủng CT7

Màu sắc hệ sợi khí sinh màu trắng, màu sắc hệ sợi cơ chất màu vàng nhạt Trên môi trường ISP3 chủng này có màu sắc hệ sợi khí sinh màu trắng hồng và màu sắc hệ sợi cơ chất màu vàng và khi nuôi cấy trên môi trường ISP5 chủng này

có màu sắc hệ sợi khí sinh màu trắng xám, màu hệ sợi cơ chất màu vàng nhạt Chủng CT7 không hình thành sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy (Hình

3.3)

Hình 3.3 Màu sắc của chủng xạ khuẩn CT7 ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy trên các

môi trường ISP

Bảng 3.1 Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn CT6 và CT7 Môi

trường

KTKS KTCC Sắc tố tan KTKS KTCC Sắc tố tan ISP2 Trắng Vàng nhạt Không có Trắng Vàng nhạt Không có

ISP3 Trắng cam Vàng nhạt Không có Trắng hồng Vàng Không có

ISP4 Trắng Vàng nhạt Không có Trắng Vàng nhạt Không có

ISP5 Trắng Vàng nhạt Không có Trắng xám Vàng nhạt Không có

24

 Chủng CT8

Kết quả nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.2 Màu sắc KTKS thể hiện ở 3 nhóm màu là trắng, xám và nâu, màu sắc KTCC thuộc nhóm màu vàng Chủng này không tạo sắc tố hòa tan trên các môi trường nuôi cấy (Hình 3.4)

Hình 3.4 Màu sắc của chủng xạ khuẩn CT8 ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy trên các

môi trường ISP

 Chủng ĐT4

Đối với chủng ĐT4, màu sắc KTKS thuộc nhóm màu xám ở các môi trường ISP2, ISP3 và ISP4, nhưng thể hiện màu vàng ở môi trường ISP5 Màu sắc KTCC thuộc nhóm màu vàng trên cả 4 môi trường Chủng này tạo sắc tố hòa tan không màu trên môi trường ISP4 (Hình 3.5)

25

Hình 3.5 Màu sắc của chủng xạ khuẩn ĐT4 ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy trên các

môi trường ISP

Bảng 3.2 Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn CT8 và ĐT4

ISP4 Vàng trắng Vàng Không có Xám nâu Vàng nâu Không màu

ISP5 Vàng trắng Vàng Không có Trắng Vàng nhạt Không có

ISP5

ISP3 ISP2

ISP4

26

 Chủng ĐT6

Kết quả nuôi cấy chủng xạ khuẩn ĐT6 được trình bày ở bảng 3.3 Màu sắc của KTKS thuộc nhóm màu trắng, màu KTCC thể hiện nhóm màu vàng Chủng này không tiết ra sắc tố hòa tan trên các môi trường nuôi cấy (Hình 3.6)

Hình 3.6 Màu sắc của chủng xạ khuẩn ĐT6 ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy trên các

môi trường ISP

 Chủng ST15

Màu sắc KTKS có 2 nhóm màu chính là xám và trắng, màu KTCC biểu hiện ở nhóm màu vàng trên tất cả các môi trường Đặc biệt ở chủng ST15, có sự hiện diện của sắc tố tan không màu trên môi trường ISP4 (Hình 3.7)

27

Hình 3.7 Màu sắc của chủng xạ khuẩn ST15 ở thời điểm 7 ngày sau khi cấy trên các

môi trường ISP

Bảng 3.3 Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn ĐT6 và ST15 Môi

trường

KTKS KTCC Sắc tố tan KTKS KTCC Sắc tố tan ISP2 Vàng trắng Vàng Không có Xám trắng Vàng Không có

ISP3 Vàng trắng Vàng nhạt Không có Xám nâu Vàng nhạt Không có

ISP4 Vàng trắng Vàng nhạt Không có Xám Vàng nhạt Không màu

ISP5 Vàng trắng Vàng Không có Xám vàng Vàng Không có

ISP5 ISP4

ISP3 ISP2