Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn (actinomyces) đối kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

bộ giáo dục đào tạo trờng đại học nông nghiệp hà nội - NGUYN VN HNG TUYN CHN MT S CHNG X KHUN (ACTINOMYCES) I KHNG VI KHUN GY BNH BC L LA Luận văn thạc sỹ nông nghiệp Hà nội - 2012 giáo dục đào tạo trờng đại học nông nghiệp hà nội - NGUYN VN HNG TUYN CHN MT S CHNG X KHUN (ACTINOMYCES) I KHNG VI KHUN GY BNH BC L LA Luận văn thạc sỹ nông nghiệp Chuyên ngành : Cụng ngh sinh hc Mã số : 60.42.80 Ngời hớng dẫn khoa học : PGS.TS PHAN HU TễN TS PHAN TH PHNG HOA Hà nội - 2012 LI CAM OAN Tụi xin cam oan õy l cụng trỡnh nghiờn cu ca cỏ nhõn tụi c thc hin trờn c s nghiờn cu lý thuyt v tỡnh hỡnh thc tin di s hng dn ca PGS TS Phan Hu Tụn v TS Phan Th Phng Hoa Cỏc ni dung v kt qu nghiờn cu lun l trung thc v cha c cụng b di bt c hỡnh thc no trc trỡnh, bo v v cụng nhn H Ni, ngy thỏng nm 2012 Tỏc gi lun Nguyn Vn Hựng Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip i LI CM N Li u tiờn, tụi xin by t lũng kớnh trng v gi li cm n chõn thnh ti PGS TS Phan Hu Tụn, TS Phan Th Phng Hoa, l nhng ngi ó tn tỡnh hng dn tụi sut quỏ trỡnh thc hin ti, giỳp tụi vt qua khú khn v hon thnh tt lun ny Tụi cng xin gi li cm n sõu sc ti cỏc thy cụ giỏo Khoa Cụng ngh sinh hc, trng i hc Nụng nghip H Ni ó nhit tỡnh ging dy, hng dn tụi sut quỏ trỡnh hc tp, nghiờn cu Qua õy tụi cng mun gi li cm n sõu sc n Vin vi sinh vt v Cụng ngh sinh hc, i hc QGHN ó to iu kin v giỳp tụi hon thnh lun Tụi cng xin gi li cm n chõn thnh n CN Nguyn Kim Quy, CN KS Nguyn Th Võn nhng ngi ó nhit tỡnh giỳp tụi sut quỏ trỡnh thc hin ti ny Cui cựng, tụi xin c gi li cm n n gia ỡnh v bn bố ó luụn l ch da vng chc, l ngun ng viờn to ln cho tụi sut thi gian hc v thc hin lun ny H Ni, ngy thỏng nm 2012 Tỏc gi lun Nguyn Vn Hựng Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip ii MC LC LI CAM OAN i LI CM N ii MC LC iii BNG DANH MC CC T VIT TT v DANH MC BNG .vi DANH MC HèNH vii I M U 1.1 t .1 1.2 Mc ớch v yờu cu ca ti II TNG QUAN TI LIU Tng quan chung v x khun .3 1.1 Phõn b ca x khun t nhiờn 2.1.2 c im hỡnh thỏi ca x khun 2.1.3 S hỡnh thnh bo t ca x khun .5 2.1.4 Cu to ca x khun 2.2 Cỏc phng phỏp phõn loi x khun 2.2.1 c im hỡnh thỏi v tớnh cht nuụi cy 2.2.2 Phõn loi húa hc (Chemotaxonomy) 2.2.3 c im húa sinh 2.2.4 Phõn loi s (Numerical taxonomy) 2.2.5 Phõn loi da trờn trỡnh t gene 16s rRNA 10 2.3 Cỏc cht cú hot tớnh sinh hc t x khun 13 2.5 Bnh bc lỏ lỳa v cỏc bin phỏp phũng tr 15 2.6 Tỡnh hỡnh nghiờn cu kim soỏt bnh bng bin phỏp sinh hc 16 III VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU .18 3.1 Vt liu nghiờn cu .18 3.1.1 Cỏc chng Xoo 18 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip iii 3.1.2 Ging lỳa th nghim nghiờn cu .18 3.1.3 Cỏc chng x khun dựng cho sng lc 18 3.1.4 Vi sinh vt kim nh 18 3.2 Phng phỏp nghiờn cu 19 3.2.1 Tuyn chn cỏc chng x khun cú kh nng sinh khỏng sinh 19 3.2.2 Tuyn chn cỏc chng x khun i khỏng Xoo 19 3.2.3 Kim tra kh nng sinh c t 21 3.2.4 nh hng i vi vi sinh vt cú ớch 23 3.2.5 Chn mụi trng nuụi cy cho hiu qu khỏng cao nht .24 3.2.6 Th nghim hiu qu dit Xoo ngoi ng rung .25 3.2.7 nh loi chng x khun 26 IV KT QU V THO LUN 33 4.1 Sng lc cỏc chng x khun i khỏng bc lỏ 33 4.2 nh hng ca x khun ti mt s vi sinh vt khỏc 34 4.3 Chn mụi trng thớch hp nht tng hot tớnh i khỏng ca x khun 36 4.4 Hiu qu s dng VN08-A-12 ngoi ng rung 38 4.4.1 Hiu qu c ch Xoo 38 4.4.2 nh hng ca VN08-A-12 n nng sut lỳa 43 4.5 Xp loi chng x khun VN08-A-12 48 4.5.1 c im sinh hc .48 4.5.2 c tớnh húa sinh 48 V KT LUN V KIN NGH 55 5.1 Kt lun 56 5.2 Kin ngh 57 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip iv DANH MC CC CH VIT TT APM Antibiotic Producing Medium B Mụi trng APM dựng bó u thay th cho khụ u tng B1 Mụi trng thay th dựng bó u ngy B4 Mụi trng thay th dựng bó u ngy CT Cụng thc DNA Deoxyribonucleic acid NA Nutrient agar Xoo Xanthomonas oryzae pv oryzae YM Yeast - extract Mannitol YS Yeast - extract Soluble starch Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip v DANH MC BNG STT Tờn bng Trang 2.1 Cỏc sn phm t nhiờn t vi sinh vt v ng dng ca chỳng 14 Danh sỏch chng x khun cú kh nng i khỏng vi khun Xoo 33 (D-d, mm) 33 Kh nng i khỏng ca chng x khun i vi mt s vi sinh vt kim nh (D-d, mm) .34 Kh nng i khỏng ca chng x khun vi mt s vi sinh vt cú ớch (Dd, mm) 35 4 Hot tớnh i khỏng chng Xoo R2 ca chng x khun VN08-A-12 nuụi lc trờn cỏc mụi trng khỏc ti cỏc thi im khỏc .37 Kh nng i khỏng ca chng x khun VN08-A-12 i vi 10 chng Xoo trờn cỏc mụi trng khỏc ti thi im ngy nuụi lc (D-d, mm) 37 4.6A nh hng ca x lớ chng x khun VN08-A-12 n s c ch vt bnh ging SS1 Xoo gõy 38 6B nh hng ca x lớ chng x khun VN08-A-12 n s c ch vt bnh ging Khang dõn Xoo gõy 40 4.7A nh hng ca x lớ ch phm x khun VN08-A-12 n nng sut cỏ th (g/c) cỏc ging SS1 43 4.7B nh hng ca x lớ ch phm x khun VN08-A-12 n nng sut cỏ th (g/cõy) cỏc ging Khang dõn 45 Kh nng s dng cỏc ngun ng khỏc ca VN08-A-12 49 4.9 Kt qu Search Blast trỡnh t gen 16s rRNA trờn GenBank 54 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip vi DANH MC HèNH STT Tờn hỡnh Trang Kh nng i khỏng ca x khun vi mt s vi sinh vt cú ớch 35 Hot tớnh i khỏng chng Xoo R2 ca chng x khun VN08-A-12 nuụi trờn cỏc mụi trng khỏc 36 4.3A Biu biu hin s c ch vt bnh bc lỏ ging SS1 v xuõn 2011 39 4.3B Biu biu hin s c ch vt bnh bc lỏ ging SS1 v 2011 39 4.3C Biu biu hin s c ch vt bnh bc lỏ ging Khang dõn v xuõn2011 41 4.3D Biu biu hin s c ch vt bnh bc lỏ ging Khang dõn v 2011 41 4.4A nh hng ca x lớ ch phm x khun VN08-A-12 n nng sut cỏ th (g/cõy) ging SS1 v xuõn 2011 44 4.4B nh hng ca x lớ ch phm x khun VN08-A-12 n nng sut cỏ th (g/cõy ) cỏc ging SS1 v 2011 44 4.4C nh hng ca x lớ ch phm x khun VN08-A-12 n nng sut cỏ th (g/cõy ) cỏc ging v xuõn 2011 46 4.4D nh hng ca x lớ ch phm x khun VN08-A-12 n nng sut cỏ th (g/cõy ) cỏc ging Khang dõn v 2011 46 Hỡnh nh khun lc v t bo VN08-A-12 48 Kh nng chu mui v kh nng ng húa Melanin ca VN08-A-12 50 Kh nng ng húa cỏc ngun carbon khỏc 52 4.8 nh in di DNA tng s 53 4.9 nh in di sn phm PCR 53 4.10 Cõy phõn loi chng VN08-A12 da trờn trỡnh t gen 16S -rRNA 55 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip vii I M U 1.1 t Bnh bc lỏ lỳa vi khun Xanthomonas oryzae pv oryzae gõy l mt nhng bnh gõy hi chớnh Vit Nam cng nh cỏc vựng trng lỳa trờn th gii Bnh ó gõy gim nng sut lỳa go Chõu lờn ti 60% tng nng sut lỳa hng nm [4,8] Cú rt nhiu bin phỏp nhm ngn chn s bựng phỏt dch bnh nh :chn lc v phỏt trin cỏc dũng lỳa mang cỏc gene khỏng bnh, dựng cht húa hc dit tr vi khun gõy bnh, phũng tr dch hi tng hp [17] Tuy nhiờn, cỏc bin phỏp ny cha em li hiu qu cao X khun (Actinomycetes) l mt nhúm vi sinh vt nhõn s thuc vo gii cỏc vi khun gram dng X khun cú nhng c im quý riờng bit; ú l ngun sn xut t nhiờn cỏc cht khỏng sinh v cỏc cht cú hot tớnh sinh hc [20] Gn õy ngi ta c tớnh rng c 10000 cht khỏng sinh c khỏm phỏ t cỏc vi sinh vt, thỡ 2/3 cỏc cht ú c sn xut t x khun; v nhiu cht s ú l cỏc thuc khỏng sinh ang c ng dng v sn xut rng rói ngy Cỏc nghiờn nh cu ch rng: c 1000 chng x khun c phõn lp mt cỏch ngu nhiờn, thỡ khong 10 chng s sinh streptomycin v chng s sinh tetracycline [2,3] B su hn 3000 chng x khun {nhng chng ny c phõn lp ngu nhiờn t cỏc mu t ca Vit Nam [14]} ti Bo tng ging chun Vit Nam (Vin Vi Sinh v cụng ngh sinh hc, HQGHN) hn tim nng tỡm cỏc cht khỏng sinh v cỏc cht cú hot tớnh sinh hc mi dựng cho vic khng ch v tiờu dit vi khun X oryzae pv oryzae gõy bnh bc lỏ lỳa Vit Nam hin Vỡ th, vic s dng x khun v cỏc cht cú hot tớnh sinh hc chỳng sinh khng ch sinh hc (s dng cõn bng cỏc vi sinh vt v cỏc sn phm t nhiờn ca chỳng kỡm hóm, c ch vi sinh vt gõy bnh ú thỳc y cõy trng phỏt trin tt hn) v kim soỏt bnh bc lỏ lỳa cú trin vng l mt phng phỏp hiu qu v thõn thin v mt sinh thỏi v mụi trng Xut phỏt t thc tin trờn, chỳng tụi tin hnh ti: Tuyn chn mt s chng x khun (actinomyces) i khỏng vi khun gõy bnh bc lỏ lỳa Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip Kt qu o nng sut lỳa sau x lớ x khun c tng kt bng 4.8 v 4.9 Nhỡn chung, chng VN08-A-12 cú lm gim tỏc hi ca bnh bc lỏ lỳa Tuy nhiờn s nh hng ny tựy thuc vo ging lỳa, tng chng vi khun Xoo c s dng lõy nhim, v khỏc v thi im x lớ khỏc C th l: vi ging lỳa SS1, v xuõn nm 2011, x lớ vi chng x khun ny trờn cụng thc lõy nhim Xoo chng nng sut lỳa gim t 19.7 (x lớ ngy 1,3,7 ngy sau nhim bnh) n 36.6% (x lớ sau ngy nhim bnh) so vi i chng khụng nhim bnh) nhng nng sut ny cao hn hn so vi lỳa b bnh m khụng x lớ (gim nng sut n 58.4%); Tuy nhiờn vi chng nng sut lỳa gim ( t 21.8 29.8% so vi ging khụng b nhim bnh) v ging b nhim vi chng m khụng c x lớ x khun nng sut lỳa gim ti53.5% V nm 2011, i vi chng nng sut lỳa gim t 21.6 n 37.5%, ú ging b nhim nhng khụng x lớ nng sut cỏ th gim 58.5% Tng t, chng cú cng cho kt qu khỏc vi v xuõn nm 2011 Tuy nhiờn, i vi ging lỳa Khang dõn, vic x lớ VN08-A-12 cho kt qu kh quan hn: Cỏc cụng thc x lớ vi x khun nng sut lỳa ch gim t 4,7 n 29.8% c bit l vic x lớ sm v cụng thc x lớ nhiu ln lm cho nng sut gim rt ớt so vi i chng ging khụng b nhim bnh (ch thp hn khong 4,7-5,3% tựy thuc tng chng bnh bc lỏ v v) nh vy, x lớ x khun sm sau lõy nhim bnh, v x lớ nhiu ln s cú hiu qu gim tỏc hi ca bnh bc lỏ lỳa hn so vi x lớ mun Chỳng tụi nhn thy rng, x lớ VN08-A-12 mt ln cú kh nng lm tng nng sut lỳa lỳa khụng b nhim bnh tt c cỏc cụng thc; vic tng nng sut lỳa cú th l thnh phn dinh dng mụi trng ch phm hoc cú th cht cht cú hot cht sinh hc t x khun cú tỏc ng lờn cõy lỳa õy l nhng kt qu ỏng tin cy, v nú m tim nng ng dng chng VN08-A-12, khụng nhng tr c bnh bc lỏ lỳa m cũn lm tng nng sut lỳa Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 47 4.5 Xp loi chng x khun VN08-A-12 4.5.1 c im sinh hc Chng x khun VN08-A-12 sinh trng tt to khun lc chc, xự xỡ mu nõu vng v cú cỏc np ta theo hỡnh phúng x v n sõu vo thch Trờn b mt khun lc quan sỏt thy cỏc git tit nh (hỡnh 4.5A) Sau ci lamel ri soi di kớnh hin vi quan sỏt, kt qu nh hỡnh 4.5B, chng VN08-A-12 cú cỏc chui bo t di, cú c dng thng v dng xon (mi chui xon cú t 2-7 vũng xon) Bo t cú kh nng di ng A Khun lc VN08-A-12 B T bo VN08-A-12 Hỡnh Hỡnh nh khun lc v t bo VN08-A-12 4.5.2 c tớnh húa sinh Theo Shirling & Gottlieb (1966), kh nng ng húa v s dng cỏc ngun carbon khỏc c ỏnh giỏ theo mc: - S dng mnh ngun carbon (++) x khun phỏt trin trờn mụi trng carbon kim tra bng hoc mnh hn trờn mụi trng i chng (+) cha glucose - Cú th s dng ngun carbon (+) x khun phỏt trin trờn mụi trng carbon kim tra mnh hn rừ rt so vi mụi trng i chng (-) nhng m yu hn phỏt trin trờn mụi trng i chng (+) Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 48 - Khụng xỏc nh v kh nng s dng ngun carbon () trờn mụi trng kim tra x khun ch phỏt trin mnh hn mụi trng i chng (-) mt chỳt, khụng rừ rng v kộm hn hn so vi mụi trng i chng (+) - Khụng s dng ngun carbon (-) s phỏt trin ca x khun trờn mụi trng kim tra ngang bng hoc kộm hn so vi s phỏt trin trờn mụi trng i chng (-) Kt qu c trỡnh by bng 4.8 Bng Kh nng s dng cỏc ngun ng khỏc ca VN08-A-12 Ngun carbon D-xylose Kh nng s dng ngun carbon - D-fructose ++ Cellobiose - L-arabinose + I-inositol Rhamnose + Sucrose - D-mannitol + Raffinose Do ú, cú th thy rng chng VN08-A-12 cú th s dng D-fructose, Cellobiose, L-arabinose, Rhamnose, D-mannitol lm ngun ng ch yu; ú, kh nng s dng D-fructose l tt nht (gn bng kh nng s dng D-glucose) Bờn cnh ú, cỏc th nghim v kh nng ng húa Melanin v kh nng chu mui ca chng VN08-A-12 cho thy chng ny khụng cú kh nng ng húa Melanin v cú th chu c nng mui n 4% T cỏc kt qu phõn loi v hỡnh thỏi, sinh lớ v sinh húa ú, cú th xp loi chng VN08-A-12 thuc vo chi Streptomyces sp Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 49 Hỡnh Kh nng chu mui v kh nng ng húa Melanin ca VN08-A-12 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 50 .c (-) Mụi trng cha xylose Mụi trng cha Cellobiose .c (+) cha glucose Mụi trng cha fructose Mụi trng cha arabinose Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 51 Mụi trng cha innositol Mụi trng cha Rhamnose Mụi trng cha Sucrose Mụi trng cha Mannitol Mụi trng cha Raffinose .c (-) Hỡnh Kh nng ng húa cỏc ngun carbon khỏc Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 52 4.5.3 Trỡnh t 16S-rRNA ca chng VN08-A12: 1kb Hỡnh 4.8 nh in di DNA tng s 1.5kb Hỡnh 4.9.nh in di sn phm PCR M Marker 10kb 1,2 gen 16s -rRNA Kt qu in di DNA tng s hỡnh 4.7 cho thy ch cú mt bng nht, rừ nột ó chng t DNA khụng b t góy quỏ trỡnh tỏch chit Hm lng DNA thu c l tng i ln v sch tin hnh phn ng PCR Tin hnh phn ng PCR vi cp mi 27F v 1525R, chỳng tụi ó thu c on DNA cú kớch thc khong 1.5kb (hỡnh 4.8) theo ỳng kớch thc lớ thuyt cp mi cú th nhõn c Chng t on DNA nhõn c chớnh l gen 16s-rRNA ca x khun Chỳng tụi, tin hnh thụi gel v tinh sch DNA gii trỡnh t bng b kit tinh sch sn phm PCR ca QIAgen - Kt qu gii trỡnh t ca gen 16S rRNA chỳng tụi ó gii c mt on gen di 1387 Nu, cú trỡnh t nh sau TGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAG TAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTA ATACCGGATACGACTGCGGAAGGCATCTTCCGCGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGA AGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGA CGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCT GATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAG Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 53 CAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGT GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT AAAGAGCTCGTAGGCGGCCAGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCT CGGGTCTGCATTCGATACGGGCTGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCC TGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGG ATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATT CCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGC CGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCAT GTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGA AAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG TCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGG GGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTT GGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTG GAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCC ATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTC CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCC GGTGGCCCAACCCTTGTGGAGG Trỡnh t ny c s dng Search blast trờn GenBank xỏc nh cỏc trỡnh t tng ng, kt qu c th hin bng 4.9 Bng 4.9 Kt qu Search Blast trỡnh t gen 16s rRNA trờn GenBank Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 54 Kt qu Blast search trờn GenBank kt qu cho thy chng VN08-A12 cú trỡnh t 16S rRNA hon ton tng ng vi loi Streptomyces toxytricini vi t l 100% Chỳng tụi cng v hỡnh cõy phõn loi chng VN08-A12 da trờn cụng c Tree view trờn GenBank Kt qu th hin hỡnh 4.8 cho thy chng nghiờn cu nm cựng nhúm vi nhúm chng Streptomyces toxytricini Hỡnh 4.10 Cõy phõn loi chng VN08-A12 da trờn trỡnh t gen 16S -rRNA Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 55 V KT LUN V KIN NGH 5.1 Kt lun - Chỳng tụi ó sng lc c 11 chng x khun cú hot tớnh khỏng mt s chng vi khun gõy bnh bc lỏ lỳa Xoo, ú cú chng x khun (VN06-A1098, VN06-A-1457, VN06-A-1477 v VN08-A-12) khỏng c c 10 chng vi khun núi trờn Riờng chng VN08-A-12 khụng sinh c t v ớt hi i vi mt s vi sinh vt cú ớch - Khi th nghim chng VN08-A-12 ngoi ng rung lờn hai ging lỳa SS1 v Khang Dõn 18, cho thy VN08-A-12 cú hiu qu tr bnh bc lỏ lỳa iu ny c th hin nh sau: o Khi cõy b bnh, vic x lớ x khun lm nng sut lỳa tng v chiu di vt bnh gim so vi khụng x lớ o Vic x lớ sm, v x lớ nhiu ln cú tỏc dng chng bnh rừ rt hn nhiu so vi vic x lớ mun - Tuy nhiờn, hiu qu ny tựy thuc vo tng ging lỳa, chng Xoo v v : i vi ging SS1, vic phun x khun cú hiu qu c ch s phỏt trin ca vt bnh tt hn so vi Khang Dõn - Mụi trng bó u lm tng hot tớnh khỏng Xoo ca chng VN08-A-12 so vi hai mụi trng YS v APM Vic s dng mụi trng B4 nuụi lc chng ny thi gian ngy t cú hiu qu nht i vi kh nng i khỏng cỏc chng Xoo ca VN08-A-12 - Bng phng phỏp hỡnh thỏi hc v kim tra sinh lớ, sinh húa v phõn tớch trỡnh t gen 16S rRNA chỳng tụi xỏc nh chng VN08-A-12 l Streptomyces toxytricin.i Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 56 5.2 Kin ngh t c nhng kt qu cao hn cn thc hin rt nhiu cỏc nghiờn cu tip theo ng dng VN08-A-12 cho vic phong tr bnh Do ú, chỳng tụi xut mt vi hng nghiờn cu: Nghiờn cu bn cht cht khỏng sinh sinh t chng x khun VN08-A-12 cú th nm c c ch i khỏng ca VN08-A-12 i vi Xoo Ti u cỏc iu kin nuụi cy cú th chuyn t quy mụ phũng thớ nghim lờn nhng quy mụ ln hn v ng dng sn xut ch phm tr bnh bc lỏ lỳa gúp phn gim nhng thit hi nghiờm trng m bnh ang gõy Th nghim trờn cỏc ging lỳa khỏc kim tra mc th hin ca chng VN08A-12 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 57 TI LIU THAM KHO Nguyn Vn Cỏch (2004), Cụng ngh lờn men cỏc cht khỏng sinh, NXB khoa hc v k thut, H Ni Vi Th oan Chớnh (2000), Nghiờn cu kh nng nõng cao hot tớnh khỏng sinh ca chng Streptomyces rimosus R77 v Streptomyces hygroscopicus 5820 bng k thut dung hp t bo trn, Lun ỏn Tin s Sinh hc, Vin cụng ngh sinh hc, H Ni Nguyn Hong Chin (2001), Nghiờn cu chng x khun Streptomyces V6 sinh cht khỏng sinh chng vi khun gõy bnh hộo xanh c chua, Lun Thc s Sinh hc, H Ni Dinh, H.D.O., N K., Toan, N D., Du, P V., Loan, L C (2008), Pathotype profilce of Xanthomonas oryzae pv oryzae isolates from the rice ecosystem in Cuulong river delta, Omonrice, 16, 34-40 Nguyn Lõn Dng, on Xuõn Mu, Nguyn Phựng Tin, ng c Trch, 6 Nguyn Lõn Dng, Nguyn ỡnh Quyn, Phm Vn Ty (1977), Vi sinh vt hc, 2, Nh xut bn i hc v Trung hc chuyờn nghip, H Ni Nguyn Lõn Dng, Nguyn N Kim Tho (2006), Cỏc nhúm vi khun ch yu, Vietsiences Tn Dng & Nguyn Vn Viờn (2005), Bnh bc lỏ, Mt s bnh chớnh hi lỳa v bin phỏp phũng tr, NXB Nụng nghip, H Ni, 42-45 Nguyn Thnh t, K.A Vinogradva V.A.Poltorac (1974), Tớnh bin d b mt bo t X khun sinh choromomycin Act.A buraviensis, microbiologia, NXB Academia cccp 10 Fang, D.a.L.a (1995), Emerging concept of secondary metabolism in actinomycetes, J Actinomycetologica,, 9, 98-117 11 Furuya, N., Taura, S., Thuy, B T., Ton, P H., Hoan, N V., Yoshimura, A (2002), Experimetal technique for bacterial Blight of rice 12 Gnanamanickan, S S (2009), Biological control of rice diseases, Springer Dordrecht Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 58 13 Bựi Th H (2008), Nghiờn cu x khun thuc chi Streptomyces sinh cht khỏng sinh chng nm gõy bnh trờn cõy chố Thỏi Nguyờn, Lun thc s Sinh hc, trng i hc S phm Thỏi Nguyờn 14 Hop, D V., Kastuhiko Ando (2010), Taxonomic and Ecological studies of Microorganisms in Vietnam and the utilization, Joint research project between VNUH-IMBT, Vietnam and NITE-DOB, Japan 15 Jiang Bian, YanLi, Jian Wang, Fu-Hang Song, Mei Liu, Huan-Qin Dai, Biao Ren, Hong Gao, Xinling Hu, Zhi-Heng Liu, Wen-Jun Li and Li-Xin Zhang (2009), Amycolatopsis marina sp nov., an actinomycete isolated from an ocean sediment, International Journal of Systermatic and Evolutionary Microbiology, 59, 477-481 16 Jongsik Chun, S.B.K., Youn Kyung Oh, Goodfellow M (1999), Amycolatopsis thermoflava sp.nov, anovel soil actinomycete from Hainan Island, China, Int J, Syst Bacteriol, 49, 1369 - 1373 17 Lang, N.T.L., T T.; Khuyeu, B T D.; Vu, B C (2008), Genetics and breeding for blast and bacterial leaf blight resistance of rice (Oryza sativa L), Omonrice, 16, 41-49 18 Lo, C.W., N.S.L H-Y Cheah, N.K.I Wong and C.C Ho1 (2002), Actiomycetes isolated from soil samples from the crocker range Sabah, ASEAN Review of Biodiversity and Environmental Conservation (ARBEC), 7, 1-2 19 V Triu Mõn & Lờ Lng T (1999), Bnh vi khun, virus hi cõy trng, NXB Giỏo dc 20 Miyadoh, S Actinomycetes: Isolation and their antibiotic screening Workshop manual 2005, VNU-CBT and NITE cooperation project 21 Moncheva, P., Tishkov, Sava, Dimitrova, Nadezhda, Chipeva, Valentina, Antonova-Nikolova, Stefka, Bogatzevska, Nevena (2002), Characteristics of soil actinomycetes from Antarctica, Journal of culture collections, 3, 3-14 22 Lờ Xuõn Phng (2001), Vi sinh vt hc cụng nghip, NXB Xõy dng, H Ni Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 59 23 Mai Vn Quyn (1969-1970), nh hng ca cỏc loi phõn vụ c n s phỏt sinh, phỏt trin bnh bc lỏ vi khun, K yu kt qu nghiờn cu khoa hc Nụng nghip, NXB Nụng nghip 24 Robert D Nolan, T.C (1988), Isolation and Screeming of Actinomycetes, In Actinomycetes in Biotechnology, Academic Press, london 25 T Minh Sn (1987), Bnh bc lỏ vi khun (Xanthomonas oryzae) v to ging chng bnh, Lun ỏn tin s Khoa hc, vin Khoa hc K thut Nụng nghip Vit Nam 26 Sakiyama, Y., Nguyen, K N T., Nguyen, M G., Miyadoh, S., Duong, V H & Ando, K (2009), Kineosporia babensis sp nov., isolated from plant litter in Vietnam, Int J Syst Evol Microbiol 59, 550-554 27 Shirling, E.B & D.Gottlieb (1966) Methods for characterization of Streptomyces species Int.J Syst Bacteriol., 16, 313-340 28 Srivastava, D N (1972), Bacterial leaf blight of rice, Phytopathol 26 29 Phan Huu Ton, Bui Trong Thuy and Tong Van Hai, 2003 Pathogenicity of the Bacterial Leaf Blight Strains from Northern Vietnam The 2nd National Conference on Plant Pathology and Molecular Biology 30 H Minh Trung (1996), Hin trng v trin vng nghiờn cu bnh virus, vi khun hi cõy trng Vit Nam, Tp Bo v thc vt thỏng 31 Phm Vn Ty (1972), Mt s phng phỏp nghiờn cu vi sinh vt hc, Tp1, NXB Khoa hc v k thut, H Ni, 328 - 345 32 Waksman, S.A (1961), The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA, Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 60 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip i [...]... yêu cầu của đề tài Mục đích: Xác định được 1-2 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng vi khuẩn Xanthomonas oryzea pv oryzea (Xoo) có hiệu quả nhằm xây dựng chế phẩm sinh học diệt bệnh bạc lá lúa Yêu cầu: Tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với các chủng Xoo gây bệnh bạc lá lúa phổ biến ở miền bắc Vi t Nam Tìm ra được chủng xạ khuẩn đối kháng tốt nhất với Xoo, thân thiện với môi trường... dịch nuôi cấy xạ khuẩn để phun cho 1m2 thí nghiệm Các công thức thí nghiệm Để so sánh và đánh giá ảnh hưởng của các chủng xạ khuẩn tới khả năng kháng nhiễm của lúa đối với các chủng vi khuẩn, có các công thức đối chứng: o CT đối chứng dương (†): không lây nhiễm bạc lá và không xử lí xạ khuẩn o CT đối chứng xạ khuẩn: chỉ phun xạ khuẩn mà không lây nhiễm để đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đến lúa Tương ứng... kháng bệnh bạc lá lúa đã được định dạng [17,23] trong số đó có 3 gene: Xa4 và Xa5 và Xa7 là những gen đơn kháng hữu hiệu với một số chủng Xoo gây bệnh ở Vi t Nam Ở lúa, gene kháng Xoo này là gen kháng đơn.[25,28], Do vi c sử dụng liên tục và trên diện rộng các gene kháng bệnh đơn, dẫn đến sự chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh phá vỡ sức kháng bệnh của cây [17] Vì thế, lai tổ hợp nhiều gen kháng được cho... cảm với tất cả các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Vi t Nam; và giống Khang Dân 18: là giống hiện đang trồng phổ biến ở Vi t Nam 3.1.3 Các chủng xạ khuẩn dùng cho sàng lọc Bộ sưu tập 2490 chủng xạ khuẩn lưu dữ tại Bảo tàng giống chuẩn, Vi n Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học quốc gia Hà Nội (600 chủng VTCC; 1000 chủng VN05; 300 chủng VN06; 500 chủng VN08; và 90 chủng VN10) được sử... do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra là một trong những bệnh gây hại chính ở Vi t Nam cũng như ở các vùng trồng lúa trên thế giới Do tổn thất nặng nề của bệnh Xoo gây ra, vi c kiểm soát bệnh bạc lá lúa tập trung vào các phương pháp làm giảm sự xâm nhiễm và phát triển của vi khuẩn gây bệnh trên vật chủ cây lúa và vi c này có thể thực hiện được qua sử dụng các chất hóa học, các dòng lúa. .. nhiễm Thực hiện lây nhiễm vào giai đoạn lúa làm đòng vì đây là thời kì lúa mẫn cảm với bệnh bạc lá nhất và là giai đoạn lây nhiễm ảnh hương lớn nhất tới năng suất Dùng kéo đã khử trùng nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn (mỗi chủng vi khuẩn dùng một kéo vô trùng) cắt lên đầu lá lúa một đoạn dài 3-5cm Cắt toàn bộ lá xanh có trên cây Xử lí xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn đã được chọn lọc tại phòng thí nghiệm được nuôi... trường tối ưu cho chủng đã chọn lọc được Kiểm tra khả năng đối kháng của các chủng đã được chọn lọc trên lúa (thử nghiệm trên đồng ruộng) Định loại chủng xạ khuẩn chọn lọc được Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 2 II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1 Tổng quan chung về xạ khuẩn 2 1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinomyces) thuộc nhóm vi khuẩn nhân thật... cấy vi khuẩn và xạ khuẩn: chuyển thỏi thạch đã đục ở trên sang đĩa thạch ở bước 2 rồi chuyển vào tủ định ôn 30oC Bước 5: Quan sát kết quả sau 1 ngày Hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn đối với vi khuẩn Xoo được đánh giá bằng cách đo vòng vô khuẩn (D÷d) trên đĩa thạch đồng nuôi cấy 2 vi sinh vật trên Quá trình này được lặp lại một vài lần để chọn được những chủng xạ khuẩn có khả năng kháng được cả 10 chủng. .. (với S cerevisiae) Bước 6: Quan sát kết quả sau 1 ngày Hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn đối với vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo vòng vô khuẩn (D÷d) của mỗi mẫu Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 22 3.2.4 Ảnh hưởng đối với vi sinh vật có ích Các chủng xạ khuẩn sau khi đã tuyển chọn được dùng để đánh giá khả năng đối kháng với các vi khuẩn có... Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh Từ bộ sưu tập 2490 chủng xạ khẩn, từ năm 2006 đến 2010, chúng tôi tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính đối kháng 2 trong số 4 vi sinh vật kiểm định đã kể trên (E Coli và B substilis) Kết quả, chúng tôi chọn lọc được 353 chủng có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương (B substis) hoặc vi khuẩn Gram âm (E coli) cho ... t ca Vit Nam [14]} ti Bo tng ging chun Vit Nam (Vin Vi Sinh v cụng ngh sinh hc, HQGHN) hn tim nng tỡm cỏc cht khỏng sinh v cỏc cht cú hot tớnh sinh hc mi dựng cho vic khng ch v tiờu dit vi khun... nh hng i vi vi sinh vt cú ớch Cỏc chng x khun sau ó tuyn chn c dựng ỏnh giỏ kh nng i khỏng vi cỏc vi khun cú ớch theo phng phỏp ng nuụi cy nh ó trỡnh by trờn Hai vi khun Azotobacter (vi khun... a thch bc ri chuyn vo t nh ụn 37oC (vi B cereus, E coli, M luteus) hoc 28oC (vi S cerevisiae) Bc 6: Quan sỏt kt qu sau ngy Hot tớnh i khỏng ca x khun i vi vi sinh vt kim nh c ỏnh giỏ bng cỏch