Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn ưa nhiệt để tạo chế phẩm vi sinh vật dùng cho xử lý chất thải chăn nuôi lợn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VŨ DŨNG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

VŨ DŨNG

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG

XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT ĐỂ TẠO CHẾ PHẨM VI SINH VẬT DÙNG CHO XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI LỢN

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS TĂNG THỊ CHÍN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tên tôi là: Vũ Dũng – Học viên lớp cao học K3b - ĐH Khoa Học - Đại Học Thái Nguyên cam đoan những kết quả nghiên cứu trong luận văn tốt nghiệp là kết quả do chính tôi thực hiện trong quá trình thí nghiệm theo hướng dẫn của TS Tăng Thị Chính có được, và không sao chép từ bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học đã được công bố

Hà nội, ngày 20 tháng 10 năm 2012

Học viên thực hiện

VŨ DŨNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS Tăng Thị Chính – Trưởng phòng Vi sinh vật

môi trường – Viện Công nghệ môi trường và TS.NCVC Trần Văn Tựa – chủ nhiệm

đề tài, đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn KS Hoàng Thị Dung và các cán bộ nghiên cứu, các bạn đồng nghiệp trong phòng Vi sinh vật môi trường – Viện Công nghệ môi trường đã giúp đỡ và có những góp ý bổ ích cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại Viện

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo trong khoa Khoa học sự sống , cũng như các thầy, cô giáo của Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tại đây

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên và tạo điều kiện tốt nhất để cho tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng 11năm 2012 Học viên

VŨ DŨNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN III MỤC LỤC IV DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT VII DANH MỤC HÌNH ẢNH VIII DANH MỤC BẢNG IX

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu: 1

3 Ý nghĩa khoa học của luận văn: 2

4 Nội dung nghiên cứu: 2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi 3

1.1.1 Đặc điểm của chất thải chăn nuôi lợn 3

1.1.2 Hiện trạng ô nhiễm môi trường do chăn nuôi lợn trên thế giới, Việt Nam 7

1.1.3 Khả năng gây ô nhiễm của chất thải chăn nuôi 9

1.2 Xạ khuẩn 11

1.2.1 Đại cương về xạ khuẩn 11

1.2.2 Đặc điểm hình thái và kích thước của xạ khuẩn 12

1.2.3 Cấu tạo tế bào xạ khuẩn 13

1.2.4 Bào tử và sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 14

1.2.5 Đặc điểm phân loại xạ khuẩn 15

1.2.6 Khả năng phân hủy xenluloza, tinh bột và protein của xạ khuẩn 15

1.2.7 Ý nghĩa thực tiễn của xạ khuẩn 16

1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza, amylaza và proteaza của các chủng vi sinh vật 17

1.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 17

1.3.2 Ảnh hưởng của pH 18

1.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối 19

1.3.4 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon 20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

1.3.5 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ 20

1.4 Giới thiệu về chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải rắn chăn nuôi lợn 21

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 23

2.2 Nguyên vật liệu và hóa chất 23

2.2.1 Nguyên vật liệu 23

2.2.2 Hóa chất 23

2.2.3 Môi trường 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 24

2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 24

2.3.3 Phương pháp giữ giống 24

2.3.4 Phương pháp phân loại xạ khuẩn 25

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt lực enzym ngoại bào (xenlulaza, amylaza) bằng phương pháp khuếch tán trên thạch 26

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng và phát triển của các chủng xạ khuẩn 27

2.3.7 Các phương pháp dùng để xử lý phân lợn bằng chế phẩm vi sinh quy mô phòng thí nghiệm 28

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp xenlulaza, amylaza, proteaza 32

3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 35 3.2.1 Đặc điểm phân loại 35

3.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng xạ khuẩn 37

3.2.3 Kết quả phân loại 38

3.3 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym xenlulaza, amylaza và proteaza của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 38

3.3.1 Nhiệt độ 38

3.3.2 pH ban đầu 41

3.3.3 Nguồn cacbon 44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.3.4 Nguồn nitơ 47

3.3.5 Động thái sinh trưởng và sinh tổng hợp xenlulaza, amylaza và proteaza của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 51

3.3.6 Xác định tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 52

3.4 Đánh giá hiệu quả xử lý chất thải chăn nuôi lợn của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn ở qui mô phòng thí nghiệm 54

3.4.1 Đánh giá cảm quan các mẫu thí nghiệm trong quá trình ủ 56

3.4.2 Biến động vi sinh vật trong quá trình ủ 61

3.4.3 Hiệu quả xử lý 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

1 Kết luận 67

2 Kiến nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

PHỤ LỤC 73

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ

CFU Colony Forming Unit ( Đơn vị hình thành khuẩn lạc) G+ Gram dương

ISP Chương trình xạ khuẩn quốc tế

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Sơ đồ xử lý chất thải chăn nuôi lợn 9

Hình 1.2 Một số chi xạ khuẩn: A-Microtetraspora; B- streptomyces……… 12

Hình 1.3 Hình dạng khuẩn lạc xạ khuẩn 13

Hình 1.4 Bào tử xạ khuẩn 14

Hình 3.1 Hoạt tính xenlulaza của các chủng XK tuyển chọn 33

Hình 3.2 Hoạt tính enzym xenlulaza, amylaza của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 34

Hình 3.3 Bào tử của các chủng xạ khuẩn dưới kính hiển vi điện tử 36

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của cácchủng xạ khuẩn tuyển chọn 39

Hình 3.5 Hoạt tính enzym amylaza của chủng C3 và C14 ở nhiệt độ 300 C, 450C 40

Hình 3.6 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sinh trưởng 42

Hình 3.7 Hoạt tính amylaza của chủng xạ khuẩn C3 và C14nuôi trên môi trường pH khác nhau 44

Hình 3.8 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 45

Hình 3.9 Hoạt tính của các chủng xạ khuẩn tuyển chọntrên môi trường CMC và Xenluloza 47

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 49

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh tổng hợp amylazacủa chủng C3 và sinh tổng hợp proteaza của chủng C14 50

Hình 3.12 Động thái sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 52

Hình 3.13 Tính đối kháng của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 53

Hình 3.14 Các mẫu thí nghiệm ủ trong tủ ấm 55

Hình 3.15 Các mẫu thí nghiệm sau 5 tuần ủ 59

Hình 3.16 Sự thay đổi của nhiệt độ trong qúa trình ủ 60

Hình 3.17 Sự thay đổi thể tích trong quá trình ủ 60

Hình 3.18 Mật độ VSV tổng số hiếu khí trong mẫu TN sau 1 tuần ủ 61

Hình 3.19 Biểu hiện của các vi khuẩn Samonella trong đĩa thạch 63

Hình 3.20 Mật độ Salmonella trong quá trình ủ 63

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số thành phần VSV trong chất thải chăn nuôi lợn 3

Bảng 1.2 Thành phần các chất vô cơ (%) của phân một số loại vật nuôi 4

Bảng 1.3 Lượng nước tiểu thải ra hàng ngày của một số loại gia súc 5

Bảng 1.4 Thành phần trung bình (%) của nước tiểu một số loại gia súc 5

Bảng 1.5 Tính chất của nước thải chăn nuôi lợn 6

Bảng 1.6 Nồng độ một số khí thải tại trang trại chăn nuôi 7

Bảng 1.7 Phân nhóm vi sinh vật theo khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau 17

Bảng 1.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thời gian phân cắt của vi sinh vật 17

Bảng 1.9 Ảnh hưởng pH đối với một số vi sinh vật 19

Bảng 3.1 Hoạt tính xenlulaza của các chủng Xạ Khuẩn đã phân lập 32

Bảng 3.2 Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩnnghiên cứu sau 48h lên men ở 45°C 34

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 35

Bảng 3.4 Khả năng sử dụng các nguồn đường của các chủngxạ khuẩn tuyển chọn 36

Bảng 3.5 Đặc điểm sinh lý - sinh hoá của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 37

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của cácchủng xạ khuẩn tuyển chọn 39

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh tổng hợp enzymcủa các chủng xạ khuẩn tuyển chọn (đường kính vòng phân giải D-d, mm) 40

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sinh trưởngcủa các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 42

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của pH lên sinh tổng hợp enzym của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn (đường kính vòng phân giải D-d, mm) sau 48h lên men ở 45°C 43

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng củacác chủng xạ khuẩn tuyển chọn 45

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh tổng hợp enzym của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn (đường kính vòng phân giải D-d, mm)sau 48h lên men ở 45°C 46

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng củacác chủng xạ khuẩn

tuyển chọn 48

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh tổng hợp enzyme của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn (đường kính vòng phân giải D-d, mm) sau 48h lên men ở 45°C 49

Bảng 3.14 Động thái sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn 52

Bảng 3.15 Kết quả phân tích mẫu phân lợn ban đầu 54

Bảng 3.16 Kết quả theo dõi các mẫu thí nghiệm sau 1 tuần ủ 56

Bảng 3.17 Kết quả theo dõi các mẫu thí nghiệm sau 2 tuần ủ 56

Bảng 3.18 Kết quả theo dõi các mẫu thí nghiệm sau 3 tuần ủ 57

Bảng 3.19 Kết quả theo dõi các mẫu thí nghiệm sau 4 tuần ủ 58

Bảng 3.20 Kết quả theo dõi các mẫu thí nghiệm sau 5 tuần ủ 58

Bảng 3.21 Mật độ vi sinh vật tổng số hiếu khí trong quá trình ủ, (CFU/g) 61

Bảng 3.22 Mật độ vi sinh tổng số kỵ khí trong quá trình ủ, (CFU/g) 62

Bảng 3.23 Mật độ xạ khuẩn trong quá trình ủ, (CFU/g) 62

Bảng 3.24 Mật độ nấm mốc trong quá trình ủ, (CFU/g) 64

Bảng 3.25 Chỉ số T - colifom và F - coliform trong quá trình ủ, (MPN/g) 65

Bảng 3.26 Kết quả so sánh mẫu phân lợn ban đầu với mẫu phân sau 5 tuần ủ 66

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Như chúng ta đã biết Việt Nam là một nước nông nghiệp lạc hậu nhưng

trong những năm gần đây do sự phát triển của khoa học kỹ thuật nên nông nghiệp Việt Nam đã có những bước tiến lớn trong việc bảo vệ môi trường cũng như áp dụng khoa học kỹ thuật vào sản xuất Tuy nhiên trong các hoạt động sản xuất nông nghiệp đặc biệt là chăn nuôi luôn tiềm ẩn những nguy cơ gây ô nhiễm môi trường rất cao do đặc thù về nguồn chất thải trong chăn nuôi chưa qua xử lý.Thông thường những nguồn chất thải từ chăn nuôi: gia súc, gia cầm thường chỉ được người dân thu dọn sơ sài, rồi đổ xuống ao hồ gây ô nhiễm nguồn nước, không khí Điều này không những gây ảnh hưởng lớn về sức khỏe cho người dân và còn là nơi phát sinh những nguồn dịch bệnh nguy hiểm

Thành phần của chất thải trong chăn nuôi nhất là chăn nuôi lợn có chứa rất nhiều chất hữu cơ như xenluloza, tinh bột, protein… Đây là nguồn chất hữu cơ phong phú nếu được qua xử lý sẽ được tái sử dụng phục vụ cho hoạt động sản xuất nông nghiệp Điều này vừa tránh được ô nhiễm môi trường vừa mang lại giá trị kinh

tế cao Tuy nhiên việc ủ phân thường diễn ra rất lâu vì môi trường ủ có nhiệt độ cao

và pH thấp cho nên vi sinh vật kém phát triển Để giải quyết vấn đề trên chúng tôi

chọn đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn ưa nhiệt để tạo chế phẩm vi sinh vật dùng cho xử lý chất thải chăn nuôi lợn”

2 Mục tiêu nghiên cứu:

Tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn ưa nhiệt có sẵn từ bộ chủng giống của phòng Vi sinh vật môi trường - Viện Công nghệ môi trường Qua đó nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng nên quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp các enzym phân giải xenluloza, proteaza, amylaza để tạo cơ sở cho việc sản xuất chế phẩm vi sinh

xử lý phân lợn, và qua đó đánh giá hiệu quả của chế phẩm này

3 Ý nghĩa khoa học của luận văn:

- Góp phần nghiên cứu phát triển thêm giải pháp sử dụng vi sinh vật làm tác nhân sinh học phân hủy hợp chất hữu cơ giầu hợp chất cacbon nhằm đa dạng hóa sản phẩm vi sinh vật ứng dụng trong xử lý chất thải chăn nuôi dạng rắn

- Bổ sung thêm dữ liệu về khả năng sử dụng xạ khuẩn trong xử lý nhanh phế thải chăn nuôi lợn nói riêng và môi trường nói chung

4 Nội dung nghiên cứu:

- Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp xenlulaza, amylaza, proteaza

- Nghiên cứu một số đặc điểm sinh hoá của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

- Sử dụng chế phẩm vi sinh để xử lý phân lợn và qua đó đánh giá khả năng

xử lý của chế phẩm này ở quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi

1.1.1 Đặc điểm của chất thải chăn nuôi lợn

Chất thải chăn nuôi chứa nhiều thành phần có khả năng gây ô nhiễm môi trường, làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của lợn và sức khoẻ của con người Chất thải chăn nuôi lợn được phát sinh trong quá trình chăn nuôi bao gồm:

- Chất thải rắn: Phân, chất độn, lông, chất hữu cơ tại các lò mổ…

- Chất thải lỏng: nước tiểu, nước rửa chuồng, tắm rửa gia súc, vệ sinh lò mổ…

- Chất thải khí: CO2, NH3, CH4, H2S…[1], [14]

 Chất thải rắn

Chủ yếu là phân, rác, lông, thức ăn thừa của vật nuôi, ngoài ra còn là các vật dụng chăn nuôi, thú y bị loại ra trong quá trình chăn nuôi, bệnh phẩm Chất thải rắn chăn nuôi lợn có độ ẩm từ 56-83%, tỷ lệ các chất vô cơ điển hình như: N, P, K cao và chứa nhiều hợp chất hữu cơ như protit, acid amin, xenluloza, chất béo, hydratcarbon và các dẫn xuất của chúng, và một lượng lớn vi sinh vật gây bệnh cho người và vật nuôi như: vi trùng, virut, và trứng ấu trùng giun, sán [1], [2], [5]

Bảng1.1 Một số thành phần VSV trong chất thải chăn nuôi lợn

(Nguồn: Nguyễn Thị Hoa Lý, 2004) [6]

Phân lợn là những thành phần thức ăn mà cơ thể gia súc không thể hấp thụ được và bị đào thải ra bên ngoài Mỗi ngày cơ thể lợn thải ra 1 lượng chất rắn bằng tương đương từ 6-8% trọng lượng cơ thể của vật nuôi Trong thành phần của phân lợn bao gồm những dưỡng chất không tiêu hóa được của quá trình tiêu hóa vi sinh như các chất xơ, tinh bột, protein dư thừa, các men tiêu hoá, các axit amin, các chất

khoáng (K2O, P2O5, CaO, MgO…) Các chất cặn bã của dịch tiêu hóa (trypsin, pepsin,…), các mô tróc ra từ các niêm mạc của ống tiêu hóa và chất nhờn theo phân

ra ngoài Ngoài ra trong phân còn có chứa nhiều loại vi khuẩn, virut, trứng ký sinh trùng Trong 1 kg phân có chứa từ 2000-5000 trứng giun sán Vi khuẩn thuộc họ

Enterobacterriacea chiếm đa số với các giống điển hình như Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Klebsiella Vì vậy, ở các nước phát triển như Nhật

Bản, Hồng Kông… trước khi sử dụng phân gia súc để bón cho cây trồng đều phải qua giai đoạn ủ để phân hủy các thành phần hữu cơ khó phân hủy thành các chất dễ hấp thu đối với cây trồng, khử mùi hôi và tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh để tránh lây lan bệnh tật vào môi trường [14], [17], [36]

Thành phần các chất trong phân lợn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thành phần dưỡng chất của thức ăn và nước uống, độ tuổi của lợn vì mỗi độ tuổi có khả năng tiêu hóa là khác nhau và tình trạng sức khỏe vật nuôi và nhu cầu cá thể

Bảng 1.2 Thành phần các chất vô cơ (%) của phân một số loại vật nuôi

TT Loại gia súc Thành phần trong phân (%)

Nước Nitơ P 2 O 5 K 2 O CaO MgO

Bảng 1.3 Lượng nước tiểu thải ra hàng ngày của một số loại gia súc

TT Loại gia súc Lượng nước tiểu (kg/ngày)

Bảng 1.4 Thành phần trung bình (%) của nước tiểu một số loại gia súc

TT Gia súc Thành phần trong nước tiểu (%)

Nước CHC Nitơ P 2 O 5 K 2 O CaO MgO Cl 2

1 Trâu bò 92,5 3,0 1,0 0,01 1,5 0,15 0-0,1 0,1

2 Ngựa 89,0 7,0 1,2 0,05 1,50 0,02 0,24 0,2

3 Lợn 94,0 2,5 0,5 0,05 1,0 0-0,2 0-0,1 0,1

(Nguồn: Viện chăn nuôi, 2006 [23])

Nước phân chuồng là nước từ các đống phân chảy ra, phần lớn là nước tiểu

gia súc hòa lẫn nhiều chất hòa tan của phân đặc và có chứa thêm một lượng nước

rửa chuồng Nước phân chuồng rất giàu dinh dưỡng, dễ tiêu và có giá trị lớn về mặt

phân bón Nước phân chuồng nghèo lân, giàu đạm và kali Đạm trong nước phân

chuồng ở 3 dạng chủ yếu: urê, acid uric và acid hippuric Khi để ngỏ một thời gian

hay bón vào đất thì bị VSV phân giải acidt uric và acid hippuric chuyển thành urê

và urê chuyển thành amoni cacbonat

Trong nước thải, hợp chất hữu cơ chiếm 70-80% gồm xenluloza, protit, acid

amin, chất béo, hydrat carbon và các dẫn xuất của chúng Hầu hết các chất hữu cơ dễ

phân hủy, các chất vô cơ chiếm 20-30% gồm cát, đất, muối, urê, amonium, muối

chlorua Quá trình phân hủy các chất hữu cơ trong điều kiện hiếu khí sẽ cho các sản

phẩm CO2, H2O, NO2-, NO3-, trong quá trình kị khí là CH4, N2, NH3, H2S [2], [5]

Bảng 1.5 Tính chất của nước thải chăn nuôi lợn

(Nguồn: Viện chăn nuôi, 2006 [23])

Nhìn chung, nước thải chăn nuôi không chứa các chất độc hại như nước thải của các ngành công nghiệp khác nhưng chứa nhiều ấu trùng, vi trùng, trứng giun

sán Điển hình là nhóm vi khuẩn đường ruột như Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Proteus, Arizona Theo nghiên cứu của A.Kigirov (1982), Nanxena (1978)

và Bonde (1967) vi trùng gây bệnh đóng dấu cho lợn tồn tại trong nước thải 92

ngày, Brucella từ 74-108 ngày, Salmonella từ 3-6 tháng, Leptospira 3-5 tháng, Virus FMD trong nước thải 2-3 tháng Các loại vi trùng có nha bào như Bacillus

anthracis tồn tại 10 năm (gần đây có tài liệu đến 20 năm), Bacillus tetani tồn tại có

khả năng gây bệnh 3-4 năm Trứng giun sán trong nước thải với những loại điển hình

, có thể phát triển đến giai đoạn gây nhiễm sau 6-28 ngày ở nhiệt độ và khí hậu nước

ta và có thể tồn tại được 2-5 tháng Nhiều loại mầm bệnh có khả năng xâm nhập vào

mạch nước ngầm như B anthracis, Salmonella, E coli, [42]

 Chất thải khí

Chăn nuôi phát thải nhiều loại khí thải: CO2, NH3, CH4, H2S… là các khí nhà kính chính Sự phát thải này là do các hoạt động hô hấp, tiêu hóa của vật nuôi, do ủ phân, chế biến thức ăn

Bảng1.6 Nồng độ một số khí thải tại trang trại chăn nuôi

Khu lấy mẫu Nồng độ khí độc (mg/m

(Nguồn: Tạp chí khoa học và công nghệ - tập 46- số 6A- 2008- trang 65)

Theo tổ chức nông lương thế giới (FAO) vừa thừa nhận, chăn nuôi đang được coi là một ngành gây ô nhiễm lớn, hơn cả mức gây ô nhiễm của ngành vận tải Chất thải của gia súc toàn cầu tạo ra tới 65% lượng N2O trong khí quyển Động vật nuôi còn thải ra 9% lượng khí CO2 toàn cầu, 37% lượng khí methane CH4 – khí có khả năng hấp thụ nhiệt cao gấp 23 lần khí CO2 và là tác nhân chính làm tăng hiệu ứng nhà kính, chăn nuôi gia súc còn đóng góp tới 64% khí amoniac NH3 – gây hiện tượng mưa axit Ngoài ra nhu cầu thức ăn nước uống, tập tính bầy đàn, nhu cầu bãi chăn thả của gia súc cũng đang được coi là một trong những tác nhân chính gây thoái hóa đất nông nghiệp, ô nhiễm nguồn nước và làm mất cân bằng sinh thái [1], [2], [5]

1.1.2 Hiện trạng ô nhiễm môi trường do chăn nuôi lợn trên thế giới, Việt Nam

Ở các nước phát triển, quy mô trang trại hàng trăm hecta, trong trang trại ngoài chăn nuôi lợn quy mô lớn (trên 10.000 con lợn)[1] , phân lợn và chất thải lợn chủ yếu làm phân vi sinh và năng lượng Biogas cho máy phát điện, nước thải chăn nuôi được sử dụng cho các mục đích nông nghiệp Hiện nay, ở Việt Nam chủ yếu vẫn là chăn nuôi nhỏ lẻ, tự phát vì thế việc quản lý chất thải chăn nuôi lợn gặp khá nhiều khó khăn, việc sử dụng phân lợn để bón cho cây trồng trong nông nghiệp vẫn còn bị hạn chế do phân lợn không giống phân gia súc khác, phân lợn ướt và hôi thối, phân lợn là (phân nóng) nên khó thu gom và vận chuyển và khó sử dụng, nếu

sử dụng trực tiếp không qua ủ để bón cho cây trồng sẽ làm cho cây bị chết hoặc làm giảm năng suất cây trồng (sầu riêng mất mùi, nhãn không ngọt…) Trong những năm gần đây, chăn nuôi phát triển theo xu hướng trang trại, tập trung sản xuất hàng

hóa Tính đến tháng 10/2006 cả nước có 17.720 trang trại [19] và chủ yếu phát triển

ở các tỉnh vùng Đông Nam Bộ, Đồng bằng sông Cửu Long và Đồng bằng sông Hồng Các khu chăn nuôi phát triển tự phát, chưa theo quy hoạch, chủ yếu trên đất vườn nhà, đất mua hoặc thuê tại địa phương Nhiều trang trại xây dựng ngay trong khu dân cư, gây ô nhiễm môi trường, nguy cơ dịch bệnh cho vật nuôi, con người và ảnh hưởng lớn đến sự phát triển bền vững của ngành chăn nuôi [38]

Theo điều tra tình hình quản lý chất thải chăn nuôi ở một số huyện thuộc TP HCM và một số tỉnh lân cận chỉ có 6% số hộ nuôi lợn có bán phân cho các đối tượng

sử dụng để nuôi cá và làm phân bón, khoảng 29% số hộ chăn nuôi lợn sử dụng phân cho bể biogas và 9% hộ dùng phân lợn để nuôi cá [12]

Theo kết quả điều tra đánh giá hiện trạng môi trường của Viện Chăn nuôi (2006) [23] tại các cơ sở chăn nuôi lợn có quy mô tập trung ở Hà Nội, Hà Tây (cũ), Ninh Bình, Nam Định, Quảng Nam, Bình Dương, Đồng Nai, kết quả điều tra cho thấy 100% số cơ sở chăn nuôi đều chưa tiến hành xử lý chất thải rắn trước khi chuyển ra ngoài khu vực chăn nuôi Các cơ sở này chỉ có khu vực tập trung chất thải ở vị trí cuối trại, chất thải được thu gom và đóng bao tải để bán cho người tiêu thụ làm phân bón hoặc nuôi cá Các bao tải này được tái sử dụng nhiều lần, không được vệ sinh tiêu độc nên nguy cơ gây ô nhiễm môi trường và lây nhiễm lan truyền dịch bệnh từ trang trại này sang trang trại khác là rất cao Toàn bộ chất thải, bao gồm phân, nước tiểu, nước rửa chuồng được hòa lẫn và dẫn về bể biogas Mặt khác, lượng nước thải chăn nuôi quá lớn, không thể sử dụng hết cho diện tích được thải của các cơ sở chăn nuôi lợn bao gồm nước tiểu, rửa chuồng, máng ăn, máng uống

và nước tắm rửa cho lợn Cả 10 cơ sở chăn nuôi lợn được điều tra đều chỉ có hệ thống xử lý chất thải lỏng bằng công nghệ biogas [19], [38]

Kết quả điều tra cho thấy hệ thống xử lý nước thải tại các trang trại trên là:

Hình 1.1 Sơ đồ xử lý chất thải chăn nuôi lợn (Nguồn: Viện Chăn Nuôi, 2006, [23])

Nhìn chung, việc quản lý chất thải chăn nuôi lợn đang gặp nhiều khó khăn Nhu cầu sử dụng chất thải chăn nuôi lợn trong nông nghiệp còn rất thấp Vì vậy cần

có nhiều biện pháp tích cực kết hợp để giải quyết vấn đề quản lý và khắc phục sự ô nhiễm môi trường do một lượng chất thải chăn nuôi gây ra Một trong những đóng góp vào việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường do chăn nuôi lợn gây ra là việc sản xuất và sử dụng các chế phẩm vi sinh để xử lý phân lợn thành phân bón hữu cơ đem lại sản phẩm thiết thực thân thiện với môi trường được sử dụng rộng rãi [5]

1.1.3 Khả năng gây ô nhiễm của chất thải chăn nuôi

Hiện nay, do còn nhiều hộ, trang trại chăn nuôi lợn hàng ngày thải ra một lượng lớn chất thải không được xử lý và đổ trực tiếp vào hệ thống thoát nước, kênh mương làm nhiều hộ dân không có nước sinh hoạt (nước giếng trong vùng có váng, mùi hôi tanh), tỷ lệ người dân bị mắc bệnh tiêu chảy, mẫn ngứa và ghẻ lở cao Trong chất thải chăn nuôi luôn tồn tại một lượng lớn vi sinh vật hoại sinh Ô nhiễm

do chất thải chăn nuôi không chỉ ảnh hưởng nặng tới môi trường sống dân cư mà còn gây ô nhiễm nguồn nước, môi trường không khí, tài nguyên đất và ảnh hưởng lớn đến kết quả sản xuất chăn nuôi Chất thải chăn nuôi khi chưa xử lý mang đi sử dụng cho trồng trọt như tưới, bón cho cây rau, củ, quả,… sau đó các sản phẩm này

Nước thải

Bể Biogas

Hồ sinh học Thải ra môi trường

dùng làm thức ăn cho người và động vật là không hợp lý Nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng tồn tại của mầm bệnh trong đất, cây, cỏ … có thể gây bệnh cho người

và gia súc, đặc biệt là các bệnh về đường ruột như thương hàn, phó thương hàn, viêm gan, giun đũa, sán lá,…

Các hoạt động gây ô nhiễm do chăn nuôi vẫn đang tiếp tục diễn ra ở nhiều nơi trên cả nước Tình trạng chăn nuôi thả rông, chăn thả trên đất dốc, đầu nguồn nước v.v còn khá phổ biến đã làm tăng diện tích đất xói mòn, suy giảm chất lượng nước, giảm thiểu khả năng sản xuất nông nghiệp trên vùng rộng lớn Ô nhiễm môi trường còn làm phát sinh dịch bệnh, ảnh hưởng lớn đến hiệu quả chăn nuôi Trong mười năm qua, từ 1997 đến nay, dịch lở mồm, long móng trên gia súc đã diễn ra thường xuyên và đến nay chưa được khống chế triệt để Từ cuối năm 2003, dịch cúm gia cầm đã bùng phát Từ năm 2003 đến nay, dịch đã tái phát 5 đợt, đã phải tiêu huỷ trên 51 triệu gia cầm các loại, thiệt hại ước tính lên đến hàng ngàn tỷ đồng [11] Từ đầu năm 2007 đã bùng phát hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (bệnh tai xanh - PSSR) trên lợn, gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi, gây mất an toàn thực phẩm và còn có nguy cơ lây nhiễm sang người nguy hiểm không kém bệnh cúm gia cầm, bệnh lở mồm, long móng [38]

Rõ ràng ngành chăn nuôi phát triển nếu không đi kèm với các biện pháp xử

lý chất thải sẽ làm môi trường sống của con người xuống cấp nhanh chóng Môi trường bị ô nhiễm lại tác động trực tiếp vào sức khoẻ vật nuôi, phát sinh dịch bệnh, gây khó khăn trong công tác quản lý dịch bệnh, giảm năng suất không thể phát triển bền vững

Tuy nhiên phân lợn vẫn được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu tận dụng do hàm lượng các chất dinh dưỡng trong phân khá cao, đặc biệt là nitơ (N) Nếu không được quản lý và sử dụng đúng đắn, chất thải chăn nuôi là nguồn gây tiêu tốn cho các cơ sở chăn nuôi, ngược lại nếu được tận dụng đúng cách nó lại trở thành nguồn tài nguyên

1.2 Xạ khuẩn

1.2.1 Đại cương về xạ khuẩn

Theo hệ thống phân loại hiện nay thì xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc ngành

Tenericutes (gồm có vi khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật (Eubacteria) và siêu giới nhân sơ (Prokaryota) Xạ khuẩn thuộc lớp Actinobacteria,

dưới lớp Actinobacteridae, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi

và 1000 loài trong đó có 478 loài thuộc chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc các

chi còn lại được xếp vào nhóm xạ khuẩn hiếm (minh họa hình 1.2) Xạ khuẩn có nhiều nét khác với nấm nhưng giống vi khuẩn Chúng có đặc điểm như sau: có cấu tạo đơn bào và đa bào, kích thước rất nhỏ, nhân giống với vi khuẩn, không có màng nhân và tiểu hạch, vách tế bào không chứa xenluloza hoặc kitin, giống với vi khuẩn, phân chia tế bào giống với vi khuẩn (kiểu Amitoz) Xạ khuẩn không có giới tính (không có tế bào đực cái), hoại sinh và ký sinh [9], [26], [45]

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể tìm thấy trong hầu hết các môi trường: đất, nước, không khí, thậm chí cả những môi trường mà cả vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Xạ khuẩn phân bố nhiều nhất trong đất, chúng sử dụng acid humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong đất, đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Mật độ xạ khuẩn trong đất chiếm từ 20-40% tổng số các VSV có trong đất và trong 1g đất có khoảng 29.000-24.000.000 CFU (Colony Forming Unit - Đơn vị hình thành khuẩn lạc) Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc vào nhiệt độ, độ ẩm, độ pH của môi trường Đa số xạ khuẩn là các vi sinh vật hiếu khí, ưa ấm, nhiệt độ tối thích cho sự sinh trưởng và phát triển là 20-450C, và nhiệt độ sinh trưởng thấp nhất là 15-200C, nhiệt độ sinh trưởng cao nhất là khoảng 450C Một số khác có thể phát triển ở những nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn Vi sinh vật ưa nhiệt sinh trưởng tốt nhất là khoảng 33-650C và vi sinh vật ưa lạnh có thể sinh trưởng ở 00C, sinh trưởng tốt nhất

ở 150C hay thấp hơn, nhiệt độ cao nhất chỉ khoảng 200C Độ ẩm thích hợp từ 55%, giới hạn pH nằm trong khoảng 6,8-7,5 Xạ khuẩn thường sống trong đất có nồng độ muối NaCl (0,5-1 g/l) [8], [24], [29]

40-Hình 1.2 Một số chi xạ khuẩn: A-Microtetraspora; B- streptomyces

1.2.2 Đặc điểm hình thái và kích thước của xạ khuẩn

Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết dính với nhau tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám, Màu sắc của

xạ khuẩn là một đặc điểm phân loại quan trọng Đường kính sợi của xạ khuẩn khoảng từ 0,1-0,5µm Có thể phân biệt hai loại sợi khác nhau: Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt khuẩn lạc xạ khuẩn, từ đây phát sinh

ra bào tử Sợi cơ chất là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng Một số xạ khuẩn không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, loại sợi này làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra khi cấy truyền Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc ra khỏi môi trường [8]

Hệ sợi của xạ khuẩn phát triển rất mạnh tạo thành các khuẩn lạc Khuẩn lạc của xạ khuẩn không trơn ướt như vi khuẩn hay nấm men mà thường có dạng thô ráp, không trong suốt, xù xì, dạng lông tơ, dạng nhung, dạng màng dẻo với nhiều màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, trắng, xanh , có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu vào thạch và được minh họa ở hình 1.3 Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng có thể thay đổi phụ

thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm, ) Khuẩn lạc thường

có đường kính 0,5-2mm, nhưng cũng có khuẩn lạc có đường kính đạt tới 1cm hoặc lớn hơn nữa, đường kính khuẩn lạc thường lớn gấp 10 lần đường kính của khuẩn ty Khuẩn lạc thường có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau, một số có dạng

những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định [8], [45]

Hình 1.3 Hình dạng khuẩn lạc xạ khuẩn

1.2.3 Cấu tạo tế bào xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự các vi khuẩn G+ Dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rõ các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân, các thể ẩn nhập Thành tế bào có kết cấu dạng lưới, dày khoảng 10-20nm, gồm có 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60-120A0, lớp giữa dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0 Thành tế bào có tác dụng duy trì hình dạng khuẩn ty và bảo vệ tế bào Thành tế bào được cấu tạo từ các lớp glucopeptid, gồm có các gốc N-axetylglucozamin liên kết với acid N-axetylmuzamic bằng liên kết 1,4-δ glucozit Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết này bị phá vỡ, thành tế bào

bị phá hủy, cấu trúc sợi bị mất đi, màng sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào và tạo thành bào trần Cấu trúc sợi cũng bị phá hủy khi xử lý bằng hỗn hợp cồn và ete, clorofooc và các dung môi hòa tan lipid khác Khác với nấm, thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenluloza và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào Màng tế bào chất dày

khoảng 50nm và có cấu trúc tương tự như màng tế bào chất của vi khuẩn,vách tế bào không chứa xenluloza hoặc kitin, giống với vi khuẩn Nhân không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể và nhân không có màng rõ rệt [8]

Khuẩn lạc thường có cấu tạo gồm 3 lớp: lớp vỏ ngoài gồm các sợi khuẩn ty quấn chặt vào nhau, lớp trong tương đối xốp và lớp ở giữa có dạng tổ ong Hệ sợi

cơ chất có thể tiết vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, hống, nâu, đen có sắc tố tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ

1.2.4 Bào tử và sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Xạ khuẩn sinh sản bằng bào tử, bào tử được hình thành trên các nhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn

có nhiều hình dạng khác nhau như: thẳng, lượn sóng, vòng hở có móc hoặc xoắn Kích thước cuống sinh bào tử dài ngắn khác nhau, thường nằm trong khoảng từ 20-

30 nm đến 100-200 nm Trên mỗi cuỗng thường có khoảng từ 30 đến 100 bào tử,

nhưng cũng có khi chỉ có một hoặc hai bào tử (chi Saccharomonosprora, chi

Microbispora) Trong một số trường hợp do tác động cơ học hệ sợi của xạ khuẩn bị

đứt thành từng đoạn ngắn giống như bào tử nếu gặp điều kiện thuận lợi cũng có thể phát triển thành cơ thể mới

Hình 1.4 Bào tử xạ khuẩn

Hình dạng kích thước của bào tử không giống nhau tùy thuộc vào loài, từng

cá thể trong loài, thậm chí trên cùng một cuống cũng khác nhau Bề mặt bào tử có thể nhẵn, có gai, khối u, nếp nhăn Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300-400A0

gồm 3 lớp giúp cho

bào tử tránh được những ảnh hưởng bất lợi của ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm, pH Hình dạng, kích thước của chuỗi bào tử và cấu trúc màng có thể thay đổi khi nuôi cấy trên những môi trường có nguồn nitơ khác nhau [8]

1.2.5 Đặc điểm phân loại xạ khuẩn

Tính chất nuôi cấy: bao gồm khả năng sinh trưởng phát triển trên các môi trường phân loại, màu sắc khuẩn ty khí sinh (phân vào 7 nhóm màu), màu sắc khuẩn ty cơ chất, sắc tố hòa tan

Đặc điểm hình thái: hình dạng cuống sinh bào tử (thẳng, lượn, sóng, móc, xoắn, chùm), hình dạng bào tử (tròn, ovan, que, nhẵn, xù xì, gai và tóc), phương trình hình thành bào tử (cắt khúc, kết đoạn) và khả năng sinh melanin

Đặc điểm sinh lý hóa: khả năng đông kết và pepton hóa sữa (có proteaza); khả năng phân giải tinh bột (có amylaza); khả năng phân giải xenluloza (có xenlulaza); khả năng sử dụng đường: glucose, arabinose, galactose, xylose, fructose, mannose, và khả năng đối kháng các chủng sinh vật

1.2.6 Khả năng phân hủy xenluloza, tinh bột và protein của xạ khuẩn

Trong thiên nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ xenluloza nhờ có hệ enzym xenlulaza ngoại bào Người ta thường sử dụng xạ khuẩn, đặc biệt

là chi Streptomyces trong việc phân huỷ rác thải sinh hoạt, chất thải chăn nuôi,

Những xạ khuẩn này thường thuộc nhóm ưa nóng, sinh trưởng và phát triển tốt nhất

ở nhiệt độ 45-500C rất thích hợp với quá trình ủ Trong bể ủ chất thải có nhiều loại

vi sinh vật có khả năng phân giải tinh bột Một số vi sinh vật có khả năng tiết ra môi trường đầy đủ các loại enzym trong hệ enzym amylaza Ví dụ như một số vi nấm

bao gồm một số loại trong các chi Aspergillus, Fusarium, Rhizopus Trong nhóm vi khuẩn có một số loài thuộc chi Bacillus, Cytophaza, Pseudomonas

Enzym proteaza là nhóm enzym xúc tác cho quá trình phân hủy protein Dưới tác dụng của vi sinh vật protein bị phân hủy: protein => pepton => polypeptid => acid amin Vi sinh vật tiết proteaza vào môi trường và nhờ đó mà protein có cấu trúc phức tạp được chuyển thành những hợp chất đơn giản mà tế bào có thể sử dụng được Proteaza ngoại bào của vi sinh vật tham gia các quá trình phân giải ngoại bào các

protein để tạo ra các acid amin để tham gia tổng hợp sinh khối hoặc giải phóng năng lượng và sản phẩm bậc hai Proteaza nội bào của vi sinh vật tham gia quá trình cải biến protein, enzym, tạo ra các quá trình cung cấp năng lượng, vật liệu xây dựng và

sự tạo thành bào tử của vi sinh vật Ngoài ra proteaza nội bào còn phân hủy các protein không còn tác dụng trong quá trình sinh lý của vi sinh vật Nhiều vi sinh vật

sản sinh proteaza như: Bacillus subtilis, Aspergillus flavum, Aspergillus oryzae,

Aspergillus wenti, Mucor delemar, một số loài Penicillum… Chúng sinh ra hai dạng

enzym có khả năng phân hủy khác nhau: proteaza phân hủy protein thành polypeptid, pepton và peptiaza chuyển các hợp chất này thành các acid amin [6], [8], [44]

Xạ khuẩn cũng có một số chi có khả năng phân huỷ tinh bột Đa số các vi sinh vật không có khả năng tiết đầy đủ hệ enzym amylaza phân huỷ tinh bột Chúng chỉ có thể tiết ra môi trường một hoặc một vài men trong hệ đó Ví dụ như các loài

Apergillus candidus, Pasteurianum, Bacillus sublitis, Clostridium, chỉ có khả

năng tiết ra môi trường một loại enzym α-amylaza Một số loài khác chỉ có khả năng tiết ra môi trường enzym gluco amylaza Các nhóm này cộng tác với nhau trong quá trình phân huỷ tinh bột thành đường Trong sản xuất người ta thường sử dụng các nhóm vi sinh vật có khả năng phân huỷ tinh bột Trong quy trình xử lý chất thải chăn nuôi người ta cũng sử dụng những chủng vi sinh vật có khả năng

phân huỷ tinh bột để phân huỷ tinh bột có trong thành phần chất thải chăn nuôi [44]

1.2.7 Ý nghĩa thực tiễn của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có ý nghĩa thực tiễn rất lớn Xạ khuẩn là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể tìm thấy hầu hết trong các môi trường: đất, nước, không khí, thậm chí cả những môi trường mà cả vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Xạ khuẩn phân bố nhiều nhất trong đất, chúng tham gia vào các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất như xenluloza, tinh bột, protein góp phần khép kín hệ tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Đặc tính này còn được ứng dụng trong quá trình chế biến phân hủy rác thải, hay dùng để sản xuất chế phẩm phục vụ nông nghiệp xử lý chất thải chăn nuôi, bảo quản thực phẩm Ngoài ra do

xạ khuẩn có khả năng tiết kháng sinh (antibiotic) nên được dùng để sản xuất các

chất kháng sinh dùng trong y học làm thuốc điều trị bệnh cho người và gia súc và cây trồng Xạ khuẩn còn có khả năng sinh ra các vitamin thuộc nhóm B, một số acid amin và các acid hữu cơ, tiết ra các enzym (proteaza, amylaza ) và trong tương lai

có thể dùng xạ khuẩn để chế biến thực phẩm thay cho nấm và vi khuẩn vì nấm có thể sinh ra aflatoxin độc cho người và gia súc

1.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzym xenlulaza, amylaza và proteaza của các chủng vi sinh vật

1.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Phần lớn vi sinh vật chịu tác động của nhiệt độ trong 1 giới hạn hẹp, khoảng từ -10 đến 90 oC Trong phạm vi này, nhiệt độ ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng, nhu cầu dinh dưỡng, cả đến thành phần enzym và thành phần hóa học của tế bào (Kiều Hữu Ánh & Ngô Tự Thành, 1985) Theo Nguyễn Đức Lượng & Nguyễn Thị Thùy Dương (2003), khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi sinh vật, các nhà khoa học chia chúng ra thành các nhóm khác nhau Tuy nhiên, sự phân chia quan hệ các nhóm vi sinh vật với nhiệt độ chỉ có tính chất tương đối [8]

Bảng1.7 Phân nhóm vi sinh vật theo khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau

(Kiều Hữu Ánh và Ngô Tự Thành, 1985)

Nếu thay đổi trong khoảng nhiệt độ phát triển của vi sinh vật thì chính nhiệt

độ là yếu tố thuận lợi, nó sẽ kích thích các hoạt động sống của vi sinh vật và làm tăng tốc độ phản ứng hóa học, sinh học trong vi sinh vật Thời gian phân cắt của xạ khuẩn thường chịu ảnh hưởng của nhiệt độ, nếu ở nhiệt độ gần với các điểm cực tiểu, cực đại của nhiệt độ phát triển thì vi sinh vật có sự thay đổi hình thái rất rõ rệt

Và khi nhiệt độ tăng thường làm ngắn lại thời gian phân cắt, tăng nhanh quá trình trao đổi chất, đồng thời còn tăng nhanh quá trình tự phân của vi sinh vật Mỗi loại

xạ khuẩn thường phát triển tốt ở 1 nhiệt độ nhất định [13], [32]

1.3.2 Ảnh hưởng của pH

Phản ứng pH môi trường tác động trực tiếp lên vi sinh vật Ion hydro nằm trong thành phần môi trường làm thay đổi trạng thái điện tích của thành tế bào Tuỳ theo nồng độ của chúng mà làm tăng hoặc giảm khả năng thẩm thấu của tế bào đối với những ion nhất định Mặt khác chúng cũng làm ức chế phần nào các enzym có mặt trên thành tế bào Sự phát triển của vi sinh vật chỉ có thể rất nghiêm ngặt ở acid hay kiềm Đối với vi khuẩn thuận lợi nhất là chúng phát triển trong môi trường trung tính hoặc kiềm yếu Đối với nấm men và nấm mốc thì phát triển ở môi trường axit yếu Nếu nồng độ hydro trong dung dịch vượt quá mức độ bình thường đối với vi sinh vật nào đó thì sự sống bị ức chế Thí dụ như trong quá trình làm dưa chua, độ acid dần dần tăng lên làm tiêu diệt những vi khuẩn gây thối, sau đó những

vi khuẩn lactic Sự thay đổi pH môi trường có thể gây ra thay đổi kiểu lên men hay đặc tính lên men Trong điều kiện phòng thí nghiệm phần lớn chúng ta sử dụng những môi trường có pH đối với xạ khuẩn 6-8, vi khuẩn 7-7,6, đối với nấm men và nấm mốc 3-6 [8], [28]

Bảng 1.9 Ảnh hưởng pH đối với một số vi sinh vật

Loài Vi sinh vật

pH môi trường

Độ axit tối thiểu Tối ưu

Kiềm tối thiểu

muối thấp hơn 2%, nhưng cũng có một số loại xạ khuẩn sinh trưởng tốt trong môi trường chứa nồng độ muối trên 30%

1.3.4 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon

Ảnh hưởng của nguồn Cacbon là rất qua trọng trong việc nuôi cấy xạ khuẩn, thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tính của enzym và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp Có nhiều chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh

ra enzym có hoạt lực cao Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonospora

vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp proteaza cao ở môi trường có tinh bột Tăng

nồng độ tinh bột từ 0,25- 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu xuất tổng hợp enzym Nếu tăng nồng độ tinh bột hơn nữa sẽ không thu được kết quả dương tính Tỷ

số giữa cacbon và nitơ cần phải là 4: 1 Trên môi trường có maltoza (0,5- 2%) vi sinh vật phát triển bình thường, nhưng tổng hợp proteaza ngoại bào bị ức chế Với hàm lượng Glucoza, manoza, fructoza, xyloza có trong môi trường (0,2- 5%) làm ức chế

sinh trưởng của xạ khuẩn và sinh tổng hợp enzym [3], [8], [28]

1.3.5 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ

Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ Đối với

một số loài nấm mốc thuộc họ (A oryzae, A awamori, A niger, A flavus) trên môi

trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp tổ hợp enzym trên cao Trên môi trường Czapek NaNO3 được thay bằng cả môi trường Cazein hoạt lực proteaza của nấm mốc được tăng lên 3,5 lần, còn khi thay tinh bột bằng glucoza và bổ sung pepton hoạt lực enzym tăng 6 lần Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzym được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ Chẳng hạn cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzym proteaza tăng 22- 74% Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp

proteaza nói chung Trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn, trong đó có B subtilis và B

mesentericus, các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ được dùng phối hợp trong môi

trường sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sinh tổng hợp proteaza Trong số các nguồn nitơ

vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt hơn cả Những muối khác NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3, KNO3, Ca(NO3)2 làm giảm hoạt lực proteaza tới 30- 50% , còn amylaza giảm 7- 10 lần Còn trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ hoạt lực proteaza và amylaza cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng (NH4)2HPO4 và nước chiết đậu

tương Đối với xạ khuẩn ưa nhiệt Actynomyces vulgaris U2 thì pepton là chất cảm

ứng để sinh tổng hợp enzym proteaza là tốt nhất Các axit amin như glyxin, alanin, metionin và lơxin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzym bằng vi sinh vật Nhiều axit amin có tác dụng ức chế đến sinh tổng hợp enzym, valin, axit glutamic,

izolơxin và valin ức chế tổng hợp enzym ở B megaterium 60% Còn đối với B

subtilis các axit amin ức chế trong quá trình này là glyxin, metionin, axit glutamic,

alanin, lơxin,…Ngoài ra, các bazơ purin như A(adenin), G(guanin) và các dẫn xuất của chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp enzym xenlulaza, amylaza và proteaza vi sinh vật [3], [8], [28]

1.4 Giới thiệu về chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải rắn chăn nuôi lợn

Hiện nay ở nước ta cũng đã có một số nghiên cứu sử dụng chế phẩm vi sinh vật để xử lý môi trường chăn nuôi gia súc hay trong xử lý rác thải, như sử dụng chế phẩm vi sinh vật EM (Effective microorganism) có nguồn gốc từ Nhật Bản do Trung tâm chuyển giao công nghệ Việt – Nhật, Bộ Khoa học - Công nghệ đưa vào thử nghiệm ở Việt Nam Chế phẩm xạ khuẩn của Trung tâm nghiên cứu vi sinh vật ứng dụng - Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, chế phẩm Sagi Bio của Viện Công nghệ môi trường… đã mang lại một số kết quả tốt Các chế phẩm đã có tác dụng ngăn chặn mùi hôi trong chuồng trại, làm giảm quần thể các vi sinh vật gây bệnh, kích thích khả năng tiêu hóa cho gia súc, giảm nguy cơ lây lan bệnh, rút ngắn được thời gian phân hủy so với phương pháp ủ truyền thống và tăng hiệu suất thu hồi mùn [2], [4]

Việc nghiên cứu sử dụng chế phẩm vi sinh để xử lý chất thải chăn nuôi ở nước

ta cũng đã được 1 số địa phương quan tâm và đầu tư kinh phí: ví dụ Sở KHCN Hà Tây năm 2008 đã cấp kinh phí cho Công ty cổ phần công nghệ sinh học đã thực hiện

đề tài: Xử lý môi trường phân thải của các trang trại chăn nuôi tập trung tại Hà Tây

để sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh do cấp kinh phí, hoặc Sở KHCN Vĩnh Phúc năm 2007-2008 cấp kinh phí cho Viện Công nghệ môi trường, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện đề tài: Ứng dụng chế phẩm vi sinh vật xử lý phế thải nông nghiệp thành phân bón hữu cơ - vi sinh, làm sạch môi trường nông thôn Nghiên cứu

sử dụng chế phẩm Openamix - LSC để ủ xử lý chất thải chăn nuôi của Trần Thanh

Nhã cũng đã rút ngắn được thời gian phân hủy và chất lượng phân bón tốt hơn [5] Các kết quả thu được đều cho thấy tác dụng của các chế phẩm vi sinh vật trong quá trình ủ xử lý chất thải, tăng cường hiệu quả phân huỷ, khử mùi hôi, nâng cao chất lượng của phân bón thu được tạo được nguồn phân bón an toàn chất lượng cao cho nông nghiệp Tuy nhiên các nghiên cứu trên mới chỉ là bước đầu chưa thật sự đưa ra được 1 quy trình công nghệ thực sự hiệu quả và có thể triển khai nhân rộng [12]

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm

- Nồi khử trùng - Tủ sấy khô

- Tủ ấm ổn nhiệt - Tủ lạnh -

- Máy đo pH - Máy lắc ổn nhiệt

- Tủ cấy vô trùng - Kính hiển vi quang học

- Máy đo mật độ quang - Cân phân tích

- Lò vi sóng - Ống đong: 100ml, 500ml

- Cốc đong: 200ml, 1lít, 2lít - Máy sục khí

- Bình nhựa: 5lít, 10lít, 30 lít - Hệ thống lên men

- Các dụng cụ vi sinh khác: ống nghiệm, hộp petri, ống facol, que cấy, que trang, lam kính, đèn cồn…

2.2 Nguyên vật liệu và hóa chất

2.2.1 Nguyên vật liệu

- Các chủng xạ khuẩn ưa nhiệt lấy từ bộ chủng giống vi sinh của phòng Vi

sinh vật - Viện Công nghệ môi trường để tiếp tục nghiên cứu để lựa chọn ra những chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải nhanh đồng thời các chất hữu cơ (xenluloza, tinh bột, protein) để sản xuất chế phẩm vi sinh vật phục vụ cho việc xử lý chất thải

rắn chăn nuôi lợn Các chủng được ký hiệu như sau: Từ C1  C30

- Phân lợn lấy từ các trạng trại nuôi tập trung ở Hưng Yên

- Các phế phẩm của nông nghiệp (rơm, trấu ) và than bùn

2.2.2 Hóa chất

- Thạch (Agar) - Cao thịt

- Pepton - Cao nấm men

- Bột xenluloza - Tinh bột tan

- Các hoá chất vô cơ khác: NaCl, NaOH, KH2PO4, K2HPO4, KNO3 , KCl, MgSO4.7H2O, FeSO4, phenol

- Tinh bột tan, các loại đường: D-glucoza, saccaroza

2.2.3 Môi trường

Môi trường dinh dưỡng sử dụng để phân lập, nuôi cấy, và thử các hoạt tính

hoá lý của các chủng VSV sử dụng trong luận văn: Gause I, MPA, Czapek, môi

trường Xenluloza, môi trường ISP1, môi trường ISP6, Cazein, môi trường phân lập

Salmonella, môi trường phân lập E coli và Coliform (Thành phần các môi trường

xem phần phụ lục )

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Để có kết quả phân tích đáng tin cậy thì phải lấy mẫu cẩn thận, chính xác và điển hình Phải chọn mẫu trung bình để phân tích với mẫu có số lượng lớn Một số phương pháp chọn mẫu trung bình phụ thuộc vào quy mô thí nghiệm, điều kiện và đặc điểm của mẫu định lấy thí nghiệm Ở đề tài cần lấy mẫu chế phẩm sau khi sản xuất để kiểm tra mật độ vi sinh vật có trong chế phẩm Lấy mẫu chế phẩm vi sinh theo phương pháp đường chéo ở các vị trí, độ sâu khác nhau, sau đó trộn đều và đem đi phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật cũng như các chỉ tiêu lý hóa khác Mẫu được bảo quản lạnh ở 0 - 4oC và phân tích trong 24 h

2.3.2 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật

Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm cần chọn giống thuần chủng,

đã được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hóa sinh, vi sinh, nuôi cấy và cần đặc biệt lưu ý đến điều kiện bảo quản giống (nhiệt độ, độ ẩm, ) Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do

đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu

2.3.3 Phương pháp giữ giống

Các chủng xạ khuẩn sau khi phân lập, được tách ra và cấy chuyển vào các ống thạch nghiêng chứa môi trường Gause1 để giữ giống và tiếp tục nghiên cứu

Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, đem khử trùng ướt

ở chế độ 1 atm/30’, sau đó để nghiêng ống nghiệm chờ thạch đông Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng lấy sinh khối xạ khuẩn cấy rích rắc trên bề mặt thạch nghiêng Đem nuôi trong tủ ấm 45oC sau 3-5 ngày các chủng xạ khuẩn phát triển mạnh thì đem bảo

quản ống giống trong tủ lạnh 4oC để giữ giống Chúng tôi sử dụng ống thạch nghiêng này cấy chuyển liên tục để thu được chủng thuần khiết và giữ giống Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống

2.3.4 Phương pháp phân loại xạ khuẩn

 Quan sát đặc điểm hình thái

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP3 và ISP4 có cắm lam kính nghiêng trên mặt môi trường Sau khi xạ khuẩn phát triển tốt, lam kính được lấy ra quan sát dưới kính hiển vi quang học để xác định dạng và cuống sinh bào tử: S-thẳng, RF-l-

gợn sóng, RA-hình móc câu hay xoắn và xoắn hoàn toàn [18]

 Đặc điểm nuôi cấy

Quan sát mầu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan: Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường Gause 1, Gause 2, ISP2 và ISP4 ở nhiệt

độ thích hợp trong 7, 14, 12 ngày Lấy ra quan sát khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty khí sinh và sắc tố tan tiết ra môi trường theo phương pháp Shirling và Gobied trên bảng màu của Tresnes và Backus

Khả năng hình thành melanin: xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP6 ở nhiệt độ thích hợp Quan sát sự thay đổi màu của môi trường từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 14 Nếu sinh melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ màu vàng sang màu nâu đậm và màu đen

 Đặc điểm sinh lý- sinh hoá

Thuỷ phân xenluloza: Được xác định bằng cách cấy xạ khuẩn trên môi trường xenlulozasau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, thử bằng thuốc thử lugol

Thuỷ phân tinh bột: Đựơc xác định bằng cách lấy xạ khuẩn trên môi trườngGause1 sau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, thử bằng thuốc thử lugol

Thủy phân protein: được xác định bằng cách lấy xạ khuẩn trên môi trường cazein sau 7 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, thử bằng thuốc thử lugol

Khả năng sử dụng nguồn đường: Quan sát sự sinh trưởng của xạ khuẩn trên môi trường ISP9 có bổ sung 1% các nguồn đường khác nhau Quan sát dự sinh

trưởng của các chủng xạ khuẩn ở nhiệt độ thích hợp từ 2-7 ngày Trong đó môi trường ISP9 là đối chứng âm và có Glucoza là đối chứng dương

Xác định tính đối kháng của xạ khuẩn: Chuẩn bị đĩa petri môi trường

Gause1, dùng que cấy lấy sinh khối các chủng giống xạ khuẩn khác nhau, cấy mỗi chủng giống thành 1 hàng trên môi trường sao cho chúng giao nhau Nuôi trong tủ

ấm 45o

C, sau 3-4 ngày lấy ra quan sát

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt lực enzym ngoại bào (xenlulaza, amylaza) bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

Để xác định khả năng thủy phân xeluloza, tinh bột của các chủng xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành thử sơ bộ theo phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch

Cách tiến hành: Pha các môi trường phân giải xenluloza, tinh bột, Sau khi thanh trùng 1atm/30’,đổ môi trường vào đĩa petri Chờ cho môi trường nguội và đông lại, sau đó dùng khuyên đục lỗ (đường kính khoảng - 1 cm) đã được khử trùng để đục lỗ trên bề mặt môi trường tạo thành các giếng thạch Dùng pipetman hút dịch enzym thu được sau khi ly tâm nhỏ vào các giếng thạch trong đĩa petri

Để đĩa vào tủ lạnh 2 tiếng để dịch khuyếch tán đều vào môi trường Sau đó để vào

tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp Sau khoảng 24h thử bằng thuốc thử Xác định vòng phân giải bằng thuốc thử lugol Dùng thuốc thử đổ lên bề mặt môi trường, cho vào mỗi hộp petri 10 ml thuốc thử, tráng đều lên mặt, gạn hết dịch thuốc thử, để 5’, vùng hoạt tính enzym phân giải xenluloza hoặc tinh bột là vùng phân giải không màu xung quanh lỗ đục Phương pháp này không cho phép xác định chính xác hoạt độ của các enzym amylaza, xenluloza, nhưng cho phép định tính sự có mặt của các enzym này nhanh và đơn giản

Đánh giá khả năng sinh enzym để tuyển chọn những chủng có hoạt tính enzym cao: dùng thước đo đường kính vòng phân giải là D (D – d) càng lớn thì khả năng sinh enzym càng cao (d là đường kính giếng, d =1cm)

2.3.6 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng và phát triển của các chủng xạ khuẩn

 Nhiệt độ

Các chủng xạ khuẩn được cấy vào môi trường Gause 1 ở các thang nhiệt độ

phòng (< 25oC), 30oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC, 60oC Sau 3-5 ngày lấy ra quan sát

 pH của môi trường

Xác định khả năng sinh trưởng và phát triển của các chủng xạ khuẩn trên môi trường Gause1 lỏng (không có thạch) Chuẩn bị 16 bình tam giác 250 ml, mỗi bình cho 20 ml môi trường vào với điều kiện pH thay đổi từ 4-10 (ở mỗi môi trường

có điều kiện pH khác nhau, ta làm 8 bình rồi cho 8 chủng xạ khuẩn đã tuyển chọn)

Sử dụng HCl 1N và NaOH 1N để điều chỉnh pH của môi trường Cấy các chủng xạ khuẩn nghiên cứu vào các bình môi trường Gause1 lỏng, đem nuôi lắc ở nhiệt độ

45oC/48h Lọc thu sinh khối và dịch lọc enzym Sinh khối đem sấy khô đến trọng lượng không đổi để xác định ảnh hưởng của pH lên khả năng sinh trưởng của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn Dịch enzym dùng để nhỏ vào các giếng thạch chứa môi trường xenluloza, tinh bột và cazein để kiểm tra hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn

 Nguồn cacbon

Xác định khả năng phát triển và sinh tổng hợp enzym trên cơ sở thành phần của môi trường Gause1, chỉ thay thế tinh bột bằng các nguồn cacbon khác nhau với nồng độ như nhau: CMC (Cacboxylmethyl cellulose) (0,2%), Tinh bột (1%), Xenluloza (0,2%), Glucoza (1%), Saccaroza(1%), Lactoza (1%) Mỗi môi trường có chứa nguồn cacbon khác nhau thì ta pha mỗi loại 100ml Chia đều môi trường vào các bình tam giác (mỗi bình 25ml môi trường) Sau khi khử trùng ướt (1atm/30’) ta tiến hành cấy các chủng xạ khuẩn tuyển chọn vào các bình với số lượng sinh khối bằng nhau rồi đem đi lắc trong thời gian 48h ở điều kiện nhiệt độ thích hợp cho các chủng phát triển Tiếp theo tiến hành tương tự như thử ảnh hưởng của pH

2.3.7 Các phương pháp dùng để xử lý phân lợn bằng chế phẩm vi sinh quy mô phòng thí nghiệm

Cách tiếp cận tổng hợp theo mối tương tác gắn bó chặt chẽ giữa các yếu tố môi trường sinh thái: con người - đất - nước - động thực vật

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các loại xạ khuẩn ưa nhiệt dùng để tạo chế phẩm vi sinh Để kết quả có độ tin cậy cao, chúng tôi đã sử dụng các phương pháp hiện đại và thông dụng để phân tích đánh giá hiệu quả của quá trình xử lý

Các phương pháp nghiên cứu chủ yếu:

- Các phương pháp xử lý chất thải ô nhiễm bằng chế phẩm vi sinh vật

- Phương pháp quan trắc đánh giá động, trong qúa trình xử lý và sau khi xử

lý để đánh giá tác động của chế phẩm lên chất thải chăn nuôi

- Phương pháp đo, thống kê, phân tích, so sánh với các tiêu chuẩn qui định

- Các phương pháp lấy mẫu, phân tích, đánh giá mật độ Vi sinh vật gây bệnh, theo tiêu chuẩn Standards method (USA)

 Phương pháp phân tích vi sinh vật

Xác định thành phần và số lượng vi sinh vật theo phương pháp pha loãng:

- Cân chính xác 10g mẫu chất thải vào bình tam giác chứa 90ml nước máy đã

vô trùng, rồi lắc đều cho mẫu tan Khi đó mẫu được pha loãng đến nồng độ 10-1

- Đặt các ống nghiệm chứa 9 ml nước máy đã vô trùng vào giá đựng và ghi

rõ ký hiệu mẫu và nồng độ pha loãng

- Sau đó dùng pipet hút chính xác 1 ml mẫu pha loãng ở nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm có sẵn 9ml nước đã vô trùng ta được mẫu pha loãng đến nồng độ 10-2

- Làm tương tự cho đến nồng độ pha loãng cần thiết

- Dùng pipet vô trùng lấy 0,1ml dung dịch pha loãng ở các nồng độ pha loãng khác nhau (mỗi nồng độ lặp lại 3 lần) lên trên bề mặt môi trường thạch đặc hiệu cho từng loại vi sinh vật trong đĩa petri vô trùng (dưới đáy đĩa ghi rõ ký hiệu mẫu, môi trường, nồng độ, ngày cấy) Dùng que gạt thủy tinh vô trùng dàn đều giọt dịch đó trên bề mặt thạch đến khô, đậy nắp hộp lại và lật ngược đĩa thạch tránh hiện tượng loang, nhiễm Gói lại sau đó đem nuôi trong tủ ấm ở 370

C Sau 1-2 ngày lấy

+ Lấy 10g mẫu chất thải cho vào bình nón chứa 90ml dung dịch đệm đã vô trùng lắc cho mẫu tan đều Khi đó mẫu được pha loãng đến nồng độ 10-1

+ Sử dụng pipet hút 1ml mẫu đã pha loãng ở nồng độ 10-1

vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch đệm đã vô trùng, ta được độ pha loãng 10-2 Tiếp tục cho tới khi dịch mẫu được pha loãng tới nồng độ thích hợp

+ Bổ sung 0,5 ml (hoặc 1 ml) dịch mẫu đã pha loãng vào các ống nghiệm

chứa môi trường Coliform

- Làm ở 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ lặp lại 10 lần

- Ở mỗi nồng độ: nuôi 5 ống ở 37oC (xác định total Coliform), 5 ống ở 45oC

(Fecal Coliform), sau 24h lấy ra quan sát khả năng sinh hơi (lên men) trong các ống

nghiệm, ghi lại các ống dương tính (các ống có sinh hơi lên men lactoza) ở các

nồng độ khác nhau, đối chiếu với bảng chỉ số MPN để xác định số lượng E coli

xuất hiện trong 1g mẫu vật nghiên cứu [18]

- Kiểm tra mật độ Coliform theo TCVN 4882- 2007- Phương pháp phát hiện

và định lượng Coliform Kỹ thuật đếm có xác suất lớn nhất [22]

 Phương pháp phân tích N, P tổng số trong mẫu

- Xác định nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl:

Mẫu được vô cơ hoá bằng H2SO4đđ ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Các phản ứng của quá trình vô cơ hoá mẫu xảy ra như sau:

2H2SO4 → 2 H2O + 2SO2 + O2Oxy tạo thành trong phản ứng lại oxy hoá các nguyên tố khác Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3 Các protein bị thuỷ phân thành axit amin Cacbon và hydro của axit amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với axit H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch

2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4Các nguyên tố khoáng khác như P, K, Ca, Mg,…chuyển thành dạng oxit:

P2O5, K2O, CaO, MgO…tuy tồn tại trong dung dịch mẫu nhưng không ảnh hưởng đến kết quả phân tích

Đuổi amoniac ra khỏi dung dịch bằng NaOH

(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + H2O + 2NH3

NH3 bay ra cùng với nước sang bình hứng Bình hứng có chứa H3BO3 do đó

NH3 bay ra sẽ tác dụng ngay với H3BO3 theo phản ứng:

2NH3 + 2H2O + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O Lượng (NH4)2B4O7 được xác định thông qua việc chuẩn độ bằng HCl 0,25N cho đến khi dung dịch chuyển sang màu hồng nhạt và không bị mất màu