III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.7. Định loại chủng xạ khuẩn
A. Định loại bằng đặc điểm sinh học
Cấy các chủng xạ khuẩn thành từng khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch YS. Sau khi nuôi từ 4 – 5 ngày ở 30ºC lấy ra quan sát hình thái khuẩn lạc. Các đặc điểm hiển vi như từng phần của hệ sợi cơ chất, hình thái của hệ sợi khí sinh, cấu trúc của các chuỗi bào tử và các dạng bào tử được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi liên kết với một máy ảnh và một phần mềm lưu trữ ảnh.
Chủng xạ khuẩn được cấy trên đĩa petri chứa môi trường YS, gài lamel vào thạch chếch 45º. Sau đó nuôi 4 – 5 ngày ở 30ºC rồi đem soi các lamel có xạ khuẩn dưới kính hiển vi (Sakiyama et al, 2009).
B. Định loại bằng các đặc tính hóa sinh
Đầu tiên, nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trường ISP9 dịch thể (150 vòng/phút ở 20oC) khoảng 2 ngày để xạ khuẩn phát triển. Thành phần môi trường ISP9 dịch thể gồm có:
(NH4)2SO4 2.64 g
KH2PO4 2.38 g
K2HPO4. 3H2O 5.65 g
MgSO4. 7H2O 1 g
H2O 1000 ml
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 27 Tiếp theo, nó sẽ được cấy vạch sang các môi trường đường khác nhau và nuôi trong tủ ấm (30oC) 7 ngày. Các môi trường này có thành phần cơ bản là môi trường ISP9 và được bổ sung thêm các nguồn đường khác nhau với nồng độ 1% (m/v) (Jiang Bian et al, 2009). Các nguồn đường được sử dụng lần lượt là: D-glucose (đối chứng +), D-xylose, D-fructose, D-mannitol, L-arabinose, cellobiose, saccharose, rhamnose, inositol, rafinose. Khả năng đồng hóa đường được đánh giá bởi khả năng sống và phát triển trên các môi trường đường này so sánh với môi trường đối chứng – (ISP9 không bổ sung đường) và môi trường đối chứng + (Shirling & Gottlieb, 1966).
Để kiểm tra khả năng đồng hóa Melanin và khả năng chịu muối của xạ khuẩn, nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trường ISP4 dịch thể có thành phần cho một l nước gồm:
Tinh bột 10 g/l
Pepton 5 g/l
(NH4)2SO4 2 g/l
CaCO3 1 g/l
K2HPO4. 3H2O 1 g/l
MgSO4 1 g/l
NaCl 1 g/l
Phương pháp thử tương tự như trên nhưng thí nghiệm kiểm tra khả năng đồng hóa Melanin sử dụng môi trường thạch ISP6 và kết quả thử Melanin được đánh giá dựa trên vòng phân giải melanin màu đen xung quanh khuẩn lạc còn thí nghiệm kiểm tra khả năng chịu muối sử dụng môi trường YS bổ sung thêm NaCl có nồng độ lần lượt từ 1%-5% (Shirling & Gottlieb, 1966).
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 28 Thành phần môi trường ISP6:
Bacter pepton 15 g
Protease pepton 5 g
K2HPO4 1 g
Fe(NH4)3(C6H5O7)2 0.5 g Na2S2O3. 5H2O 0.08 g
Agar 15 g
H2O 1000 ml
C. Phương pháp phân loại dựa trên trình tự 16S - rRNA
Tách DNA từ xạ khuẩn
ADN tổng số của xạ khuẩn được tách theo phương pháp mô tả bởi Sakiyama và cộng sự (2009) .
- Xạ khuẩn được nuôi trong môi trường YS lỏng trong 3 ngày ở nhiệt độ 30ºC.
- Sau đó ly tâm dịch xạ khuẩn với tốc độ 3000 rpm trong 5 phút để thu tế bào.
- Các tế bào được làm đồng nhất bởi các que nhựa vô trùng, sau đó hoà sinh khối tế bào trong 100àl TE 1X trong 2 – 3 phỳt.
- Tế bào được phá vỡ nhờ xử lý với 0.4 mg lysozyme trộn đều, ủ ở 37ºC trong 1 giờ, trộn đều 3 phút.
- Bổ sung vào 100 àl SDS 10%, trộn đều 2 – 3 phỳt, ủ ở 37ºC trong 30 phỳt.
- Sự chiết xuất được tiến hành bằng cách thêm vào cùng một thể tích phenol:choloroform:isoamine alcohol = 25:24:1 (PCI), trộn đều và ly tâm với tốc độ 15000 rpm trong 5 phút ở 4ºC. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống eppendoft khác.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 29 - Thêm 1/10 V Natri acetat 3M và 1ml ethanol 100%, trộn đều rồi đặt trong đá 30 phút.
- Ly tâm 15.000 rpm trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên.
- Phần tủa được rửa bằng ethanol 70%.
- Sau đó làm khô ADN bằng máy cô quay chân không.
- Hoà tan ADN trong 50 – 100 àl nước hoặc TE.
- Kiểm tra các sản phẩm bằng điện di
Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2 ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1 g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 2 àl dung dịch 6X Loading buffer với 5 àl mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 àl/ml) 20 phỳt vớt ra. Quan sỏt trờn mỏy soi gel.
Phản ứng khuếch đại ADN
Mồi (trình tự)
Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.
Mồi ngược1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'
Thành phần
• 10X buffer 10 àl
• dNTP 2.0 mM 10 à
• Mồi xuụi (10 pmol/àl) 2 àl
• Mồi ngược (10 pmol/àl) 2 àl
• Taq polymerase (5u/àl) 2 àl
• ADN khuụn (50-100àg/àl) 1 – 2 àl
• H2O đủ 100 àl
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 30 Điều kiện phản
ứng
• Biến tính: 950C - 3 phút
• Tiếp đến 30 chu kỳ: 950C – 30giây, 560C – 15 giây, 720C – 1 phút
• Tổng hợp cuối cùng: 720C – 5 phút
• 40C – ∞
Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di:
Đun tan 1% agarose (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1X TAE. Trộn 2 àl dung dịch 6X Loading buffer với 5 àl mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cường độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr (nồng độ 0,5 àl/ml) 20 phỳt vớt ra. Quan sỏt trờn mỏy soi gel.
Tinh sạch sản phẩm PCR.
_ Sử dụng bộ kit QIAgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.
• Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1 rồi trộn đều.
• Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 rpm trong 1 phút.
• Đổ bỏ dịch phía dưới cột.
• Bổ sung 750 àl PE buffer lờn cột và ly tõm 10.000 rpm trong 1 phỳt
• Đổ bỏ dịch dưới cột.
• Ly tâm tiếp 10.000 rpm trong 1 phút.
• Chuyển cột sang ống eppendoft mới.
• Thờm 30àl nước. Sau đú để ở nhiệt độ phũng 5 phỳt.
• Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút rồi lấy dịch phía dưới.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 31 _ Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu: Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch : OD 260/OD 280 > 1,7.
Phản ứng khuếch đại ADN cho đọc trình tự
Mồi (trình tự)
• 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'.
• 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'.
• 780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.'
• 350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3'.
• 1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'.
• 920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'.
Thành phần
• Termix: 8àl (9 àl Buffer 5X, 18 àl Bigdye Ready Reaction premix, 9 àl H2O)
• Mồi: 1àl
• ADN khuụn: 1àl ( nồng độ ADN là 40 – 60 àg/ml)
• H2O: 10àl
Điều kiện phản ứng
• Biến tính: 960C – 1 phút
• Tiếp đến 25 chu kỳ: 960C – 10giây, 500C – 5 giây
• Tổng hợp cuối cùng: 600C – 4 phút Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự
• Chuyển 20àl sản phẩm sang ống eppendoft sạch.
• Thờm 5àl EDTA 125mM và 60àl ethanol 100%. Để khoảng 15 phỳt ở nhiệt độ phòng.
• Ly tâm 15.000 rpm trong 15phút.
• Bỏ phần dịch nổi ở trờn rồi thờm vào 60àl ethanol 70% để rửa.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 32
• Ly tâm 15.000 rpm, 10 phút và làm khô.
• Thờm 10àl HiDi Formamide.
• Để ở 960C trong 2 phút.
• Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh.
• Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự.
• Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100 Avant Genetic Analyzer.
Phân tích trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại
Mức độ tương đồng về trình tự gen mã hóa ribosome 16S của chủng nghiên cứu được so sánh với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen sử dụng công cụ tra cứu BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Mức độ tương đồng cao nhất về trình tự đoạn 16S-rRNA của chủng nghiên cứu được so sánh với các chủng chuẩn đã công bố sử dụng công cụ tra cứu Eztaxon phiên bản 2.1.
Sau khi đã xác định được tên chi của các chủng nghiên cứu, trình tự đoạn 16S- rRNA các chủng chuẩn của các loài trong chi được tải về từ ngân hàng gen. Kết hợp với trình tự của chủng được phát hiện trong nghiên cứu này, các đoạn tương đồng trong trình tự nucleotide của đoạn 16S-rRNA được sắp xếp sử dụng công cụ ClustalW trong phần mềm Mega 5.1. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining sử dụng phép toán Jukes-Cantor với độ lặp lại 1.000 lần. Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank… [Kim et al, 1999].