Khảo sát một số đặc tính của nấm men saccharomyces cerevisiae cố định trong hệ gel alginat bao chitosan

Để giải quyết các vấn đề này, nhiều nghiên cứu về việc sử dụng nấm men cố định trong sản xuất đã được nhiều nhà nghiên cứu thực hiện.. Các nghiên cứu này đều cho thấy nấm men cố định có

ALGINAT BAO CHITOSAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018

ALGINAT BAO CHITOSAN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới ThS Kiều Thị Hồng là người thầy đã truyền cho tôi tình yêu khoa học qua những giờ giảng trên lớp,

dìu dắt tôi từ những ngày đầu làm nghiên cứu khoa học, cũng là người hướng dẫn và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn người đã nhiệt tình hướng dẫn đến TS Đàm Thanh Xuân luôn giúp đỡ, giải đáp những thắc mắc, khó khăn mà tôi gặp phải trong suốt thời

gian thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô giáo và các anh, chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dƣợc, đặc biệt là Tổ Công nghệ Sinh học-những người đã luôn

giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực nghiệm và nghiên cứu

để hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội- những người đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong suốt 5 năm học tập tại đây

Và cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên khích lệ, tạo mọi điều kiều kiện thuận lợi để tôi được học tập và luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018 Sinh viên

Chork Chimy

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu chung về nấm men 2

1.2 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae 2

1.2.1 Đặc tính nấm men Saccharomyces cerevisiae 2

1.2.2 Ứng dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae trong công nghệ sinh học 3

1.3 Phương pháp cố định tế bào 3

1.3.1 Khái niệm 3

1.3.2 Phân loại phương pháp cố định tế bào 3

1.3.3 Ưu nhược điểm của cố định tế bào 4

1.4 Tổng quan về một số chất mang sử dụng trong cố định tế bào 6

1.4.1 Alginat 6

1.4.2 Chitosan 10

1.5 Phương pháp sản xuất ethanol 12

1.6 Một số nghiên cứu về phương pháp cố định tế bào trên thế giới và Việt Nam 12

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị, môi trường sử dụng 14

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất 14

2.1.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu 14

2.1.3 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 15

2.1.4 Môi trường sử dụng 15

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men S.cerevisiae cố định trong hệ gel alginat-chitosan 17

2.2.2 Khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt tế bào cố định trong hệ gel

alginat–chitosan 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm 17

2.3.2 Phương pháp giữ giống 18

2.3.3 Phương pháp nhân giống 18

2.3.4 Phương pháp cố định tế bào nấm men S cerevisiae trong hệ gel alginat-chitosan 18

2.3.5 Phương pháp lên men 19

2.3.6 Phương pháp khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt tế bào cố định 20

2.3.7 Phương pháp định lượng đường 20

2.3.8 Phương pháp đông khô 21

2.3.9 Phương pháp chụp ảnh xác định kích thước và cấu trúc tế bào nấm men

S cerevisiae 22

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men S cerevisiae cố định trong hệ gel alginat-chitosan 23

3.1.1 Tạo hạt cố định tế bào nấm men trong hệ gel alginat-chitosan 23

3.1.2 Khả năng lên men các tế bào cố định trong hệ gel alginat-chitosan 26

3.1.3 Khảo sát khả năng tiêu thụ đường 28

3.2 Khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt tế bào cố định cố định trong hệ gel

alginat-chitosan 30

3.2.1 Khả năng lên men sau khi tái sử dụng các tế bào cố định trong hệ gel alginat-chitosan 30

3.2.2 Khảo sát khả năng tiêu thụ đường sau khi tái sử dụng 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

TB Tế bào

VSV Vi sinh vật

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 14

Bảng 2.4 Hóa chất dùng trong môi trường giữ giống 15 Bảng 2.5 Hóa chất dùng trong môi trường nhân giống 16 Bảng 2.6 Hóa chất dùng trong môi trường lên men 16 Bảng 2.7 Hóa chất dùng trong môi trường giữ hạt cố định tế bào 17

Bảng 3.1 Đặc điểm hạt tế bào cố bào cố định nấm men S.cerevisaie 25

Bảng 3.2 Đặc điểm của các bình sau khi lên men 24h 26

Bảng 3.3 Nồng độ đường tiêu thụ trung bình trong 100ml(n=9) 29 Bảng 3.4 Đặc điểm của các bình sau khi lên men tái sử dụng sau 24h 31

Bảng 3.5 Nồng độ đường tiêu thụ trung bình sau khi tái sử dụng trong

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.4 Mô tả vi trứng, vị trí của ion Ca2+ trong gel và sự tạo thành

gel calci alginat

7

Hình 1.5 Cơ chế tạo gel của alginat theo phương pháp tạo gel từ bên

ngoài

8

Hình 3.2 Hạt tế bào cố định trong hệ gel alginat-chitosan 24

Hình 3.3 Kích thước hạt tế bào cố định trong hẹ gel alginat 24

Hình 3.4 Kích thước hạt tế bào cố định trong hẹ gel alginat-chitosan 24

Hình 3.5 Bình lên men nấm men S.cerevisiae trên tế bào tự do 27

Hình 3.6 Bình lên men nấm men S cerevisiae bằng alginat 27

Hình 3.7 Bình lên men nấm men S cerevisiae bằng alginat-chitosan 27

Hình 3.8 Đồ thị so sánh khả năng tiêu thụ đường sau khi lên men 24h 29

Hình 3.9 Bình lên men nấm men S.cerevisiae bằng alginat sau khi tái

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Như chúng ta đã biết, nấm men là một loài vi sinh vật có nhiều ứng dụng trong công nghệ và sản xuất Một trong những ứng dụng phổ biến của chúng là tạo ethanol trong ngành sản xuất rượu, một ngành sản xuất sản phẩm lên men có truyền thống lâu đời Loài nấm men đóng vai trò chính trong quá trình lên men tạo ethanol trong sản xuất

rượu là loài Saccharomyces cerevisiae Tuy nhiên, việc sử dụng nấm men tự do để lên

men gặp phải một số vấn đề như thời gian lên men dài, tiêu tốn nhiều năng lượng để tách nấm men ra khỏi rượu sau quá trình lên men Để giải quyết các vấn đề này, nhiều nghiên cứu về việc sử dụng nấm men cố định trong sản xuất đã được nhiều nhà nghiên cứu thực hiện Các nghiên cứu này đều cho thấy nấm men cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do như là tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men, ổn định hoạt tính của nấm men, góp phần tăng năng suất lên men Đặc biệt, việc sử dụng nấm men cố định ra đời nhằm mục đích mở rộng của các enzym và thu hồi được enzym đó để sử dụng lần sau nên không lãng phí [11]

Chính vì những lợi ích về kỹ thuật và kinh tế do việc sử dụng nấm men cố định trong sản xuất ethanol mang lại mà những nghiên cứu về chúng ngày càng được mở rộng và thu hút sự chú ý nhiều hơn [2] Từ các lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài

“Khảo sát một số đặc tính của nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định trong

hệ gel alginat bao chitosan” với các mục tiêu sau:

1 Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men S cerevisiae cố định trong hệ

gel alginat-chitosan

2 Khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt tế bào cố định trong hệ gel chitosan

alginat-2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về nấm men

Nấm men (Yeast, Levure) là tên gọi thông thường của một nhóm nấm có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có những đặc điểm sau đây: tồn tại chủ yếu ở trạng thái đơn bào, đa số sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi, cũng có khi có hình thức phân cắt tế bào, nhiều loài có khả năng lên men đường, thành tế bào có chứa mangan, thích nghi

với môi trường chứa đường cao, có tính acid cao

Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong các môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, mật mía, rỉ đường, mật ong, trong đất ruộng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có nhiễm dầu mỏ

Trong công nghệ sinh học, do các loài nấm men có các thuộc tính sinh lý học có lợi của nấm men đã dẫn tới việc sử dụng trong công nghệ sinh học Quá trình lên men các loại đường bởi men là ứng dụng lâu đời và rộng rãi nhất của công nghệ này Các ứng dụng của nấm men trong công nghệ sinh học bao gồm:

 Nấm men bia được sử dụng để sản xuất bia và nấm men cũng được dùng để sản xuất rượu vang

 Nấm men bánh mỳ dùng để sản xuất bánh mỳ

 Nấm men cũng là một trong số các vi sinh vật mẫu được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu di truyền học và tế bào sinh học [6]

1.2 Tổng quan về nấm men Saccharomyces cerevisiae

1.2.1 Đặc tính nấm men Saccharomyces cerevisiae

S cerevisiae là một loại thuộc nấm túi Ascomycetes còn gọi là men bánh mì hay

men rượu, loại nấm chủ yếu dùng trong quá trình lên men rượu Nấm me S cerevisiae

là Eukaryota đơn bào có kích thước 5-10 µm [6]

Hình 1.1 Tế bào nấm men S cerevisiae

3

1.2.2 Ứng dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae trong công nghệ sinh học

Rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất: công nghiệp sản xuất bia, rượu, nước giải khát, sinh khối phục vụ chăn nuôi, cao nấm men, lipid nấm men Các enzym như là Amylase invertase, lactase, uricase , sản xuất esgosterol, acid ribonucleic, riboflavin (Vitamin B12), và các acid amin Phần lớn nấm men được sử

dụng trong công nghiệp thuộc giống Saccharomyces trong lớp nấm túi và vài giống thuộc nấm bất toàn Giống Saccharomyces quan trọng nhất là loài S cerevisiae, được

dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm Một số chủng của nấm men này làm men nở bánh mỳ, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rượu vang, sản xuất enzym invertase hoặc sản xuất glycerin [7], [11]

1.3 Phương pháp cố định tế bào

1.3.1 Khái niệm

Phương pháp cố định tế bào là một kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là

―kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn lên một‖ vùng không gian nhất định ―nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn‖ (Karel và cộng sự 1985)

[23] Cố định thường là sự bắt chước các hiện tượng xảy ra trong tự nhiên do các tế bào có thể phát triển trên bề mặt hoặc bên trong các cấu trúc của nguyên liệu có trong

tự nhiên Nhiều vi sinh vật tự nó có khả năng gắn lên trên những bề mặt khác nhau trong tự nhiên [23]

1.3.2 Phân loại phương pháp cố định tế bào

Nhiều quá trình trong công nghệ sinh học thuận lợi hơn nhờ kỹ thuật cố định, do đó

mà nhiều kỹ thuật và chất mang được đưa ra Những kỹ thuật này có thể chia thành 4 nhóm chính như là cố định trên bề mặt chất mang rắn, nhốt trong khung mạng xốp, keo tụ tế bào, nhốt bằng phương pháp cố định học bên trong một màng chắn [23]

Hinh 1.2 Các phương pháp cố định tế bào

4

* Phương pháp nhốt trong khung mạng xốp (tạo gel):

+ Nguyên tắc: Đưa tế bào vào bên trong một mạng chặt để ngăn cản của tế bào khuếch

tán vào môi trường xung quanh trong khi vẫn cho phép sự vận chuyển tự do của các chất dinh dưỡng và sự trao đổi chất diễn ra [19], [23]

+ Ưu điểm: Có thể đạt được mật độ tế bào trong một đơn vị tích chất mang cao hơn so

với canh trường vi sinh vật tự do [25]

+ Nhược điểm: Khi tế bào tăng quá nhiều sinh khối sẽ làm giảm độ bền của mạng gel

[23] Tế bào trên bề mặt tăng lên nhiều lần và dễ thoát ra khỏi mạng gel và phát triển

trong môi trường như là các tế bào tự do

1.3.3 Ưu nhược điểm cố định tế bào

a Ưu điểm của cố định tế bào

 Hoạt động kéo dài và sự ổn định của chất xúc tác sinh học, chất mang có thể đóng vai trò như một chất bảo vệ chống lại ảnh hưởng hóa lý của nhiệt độ, pH, dung môi hoặc thậm chí là kim loại nặng

 Mật độ tế bào trên một đơn vị thể tích của thiết bị phản ứng sinh học cao hơn, thời gian phản ứng ngắn hơn và sự loại bỏ sự tăng trưởng của những tế bào vi sinh vật không có lợi

 Sự hấp thụ cơ chất tăng và năng suất được cải thiện

 Có thể thực hiện được với quá trình liên tục

 Khả năng chịu đựng được nồng độ cơ chất cao tăng và giảm sự ức chế của sản phẩm cuối

 Với quá trình lên men, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp dẫn đến cải thiện chất lượng cho một số sản phẩm

 Hoàn thiện sản phẩm dễ dàng hơn do giảm được thủ tục tách chiết và lọc, do đó giảm giá thành cho thiết bị và yêu cầu về năng lượng

 Sự tái sinh và tái sử dụng chất xúc tác sinh học cho nhiều thời của sự vận hành gián đoạn mà không phải tháo bỏ nó ra khỏi thiết bị phản ứng sinh học

 Giảm rủi ro nhiễm vi sinh vật có hại bởi vì mật độ tế bào cao

 Có thể sử dụng thiết bị phản ứng sinh học nhỏ hơn, với sự thiết kế quá trình công nghệ đơn giản hóa và do đó giảm chi phí vốn

5

 Giảm thời gian sản xuất ra sản phẩm [23]

b Nhược điểm của cố định tế bào

 Khi sử dụng tế bào vi sinh vật cố định, trong môi trường sản xuất, hiện tượng rò

rỉ hay rửa trôi tế bào ra khỏi chất mang ít hay nhiều là điều không thể tránh khỏi Do đó, việc thu nhận và tính sạch sản phẩm đôi khi cũng khá phức tạp

 Tế bào cố định đòi hỏi nhiều nguồn dinh dưỡng và năng lượng đa dạng đảm bảo khả năng phát triển và hoạt động bình thường Khi đó, trong hệ thống sử dụng tế bào cố định có thể xảy ra hiện tượng phân hủy sản phẩm để cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng và năng lượng cần thiết cho tế bào Vì thế mà hiệu suất

sử dụng tế bào cố định có thể thấp hơn hiệu suất sử dụng tế bào tự do

 Do được bao bọc bởi chất mang, thành tế bào, màng tế bào chất… có thể gây cản trở việc thẩm thấu cơ chất, sản phẩm và các cấu tử từ môi trường ra vào tế bào

 Một nhược điểm thường thấy ở những tế bào vi sinh vật được ―gói‖ trong khuôn có cấu trúc gel, nhưng cơ chất có kích thước phân tử lớn sẽ không có điều kiện tiếp xúc với tế bào vi sinh vật cố định Vì thế mà hoạt lực của những

tế bào cố định có thể sẽ thấp hơn so với những tế bào tự do

 Trong trường hợp cụ thể khi sản xuất ethanol, người ta không quan tâm đến sự

ức chế của ethanol lên hoạt động sống của nấm men khi tiến hành lên men gián đoạn, khi đó nấm men chỉ được sử dụng một lần rồi được hoạt hóa lại cho lần sản xuất tiếp theo Tuy nhiên, mức độ ảnh hưởng của ethanol đến hoạt động của nấm men là rất lớn trong quá trình lên men liên tục Sau khi lên men, hoạt tính của tế bào nấm men có thể bị ức chế bởi ethanol Tương tự như vậy, khi sử dụng phương pháp cố định nấm men để sản xuất ethanol liên tục, hoạt tính của nấm men cố định cần được duy trì và nồng độ ethanol phải thấp để không gây

ức chế đến tế bào nấm men Như thế thì hiệu suất thu nhận sản phẩm không cao Nhiều phương pháp thảo sản phẩm liên tục khỏi thiết bị lên men được nghiên cứu nhằm tránh những tác động không tốt của sản phẩm lên men đối với nấm men [11]

Nguồn alginat chủ yếu được tìm thấy ở thành tế bào và ở gian bào của tảo nâu ở

biển (thuộc họ Rhaeophyceae), tảo bẹ Macrocystis pyrifera, Nodosum ascophyllum và các loại Lamminaria nhưng nhiều nhất là ở tảo nâu, ở dưới dạng muối alginat

Alginat tồn tại dưới 2 dạng không tan là acid alginic và calci alginat và magie (kí hiệu: AlgCa, AlgMg) rất bền vững ở thành tế bào cây rong, tạo nên cấu trúc lưới gel bền trên thành tế bào rong nâu [3]

a Cấu tạo

Algiant là tên gọi chung cho các muối của acid alginic Acid alginic là một acid hữu cơ có trong họ tảo nâu (thuộc họ Rhaephyceae) Alginat là một polymer có các monomer là hai acid manunuronic (viết tắt là M) và acid guluronic (viết tắt là G) gắn với nhau bằng liên kết 1-4 glycosid [16]

Hình 1.3 Mô tả cấu trúc của alginat

7

b Đặc điểm, tính chất liên quan đến cố định tế bào

Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, rẻ tiền và được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị II, III, sự tạo thành gel được giải thích qua mô hình vỉ trứng Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+, Sr2+, ) ở nồng độ thích hợp thì sự tạo thành gel xảy ra Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần tử gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống gần như chỗ đặt trứng [3] Các ion Ca2+ khớp và các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian 3 chiều Với cấu trúc gel này khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như 1 tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng dược chất theo hướng kiểm soát được [16]

Hình 1.4 Mô tả vi trứng, vị trí của ion Ca 2+ trong gel và sự tạo thành gel calci alginat

c Cơ chế tạo gel alginat

Alginat có khả năng tạo gel khi kết hợp với các cation kim loại hóa trị cao hoặc khi phân tử alginat bị acid hóa Tuy nhiên, phương pháp tạo gel bằng cách acid hóa phân

tử alginat ít được dùng vì quy trình thực hiện rất phức tạp

Alginat có khả năng kết hợp nhanh với các action kim loại hóa trị cao để tạo thành gel đồng thể Ái lực của alginat đối với các ion hóa trị 2 khác nhau giảm theo thứ tự.Tùy thuộc vào loại ion liên kết và loại alginat mà gel tạo thành có tính chất khác nhau Thông thường, người ta thường sử dụng cacium để làm ion gel

8

Quá trình tạo gel của alginat theo phương pháp kết hợp với cation kim loại hóa trị cao có thể tiến hành theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài và phương pháp tạo gel từ bên trong [11]

* Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài:

Đây là phương pháp tạo gel phố biến nhất của alginat Phương pháp này có ưu điểm

là tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản Khi nhỏ dung dịch alginat vào dung dịch có chứa cation có khả năng tạo gel thường gặp nhất là bề mặt ngoài của hạt alginat sẽ lập tức bị gel hóa Tiếp theo đó, các cation tạo gel ở bên ngoài của hạt alginat tiếp túc khuếch tán vào bên trong hạt làm cho các phân tử alginat bên trong tiếp tục gel hóa Quá trình này xảy ra trên bề mặt hạt và phát triển vào bên trong Phương pháp này tạo gel nhanh, tuy nhiên tính đồng thể của hạt gel lại không cao [14]

ngoài Hiệu suất chữa bệnh khá cao

 Alginat dễ dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành

có độ ổn định cao Được sử dụng trong bào chế vi nang

 Natri alginat làm tăng hiệu quả chữa bệnh của penicillin vì khi có mặt natri alginat sẽ làm cho penicillin tồn tại lâu hơn trong máu

 Trong công nghệ bào chế thuốc natri alginat được sử dụng làm chất ổn định, nhũ tương hóa hay chất tạo đặc cho dung dịch, làm vỏ bọc thuốc, làm chất phụ gia chế các loại thức ăn kiêng

9

 Trong nha khoa dùng acid alginic thay thạch cao để làm khuôn răng, nó giữ được hình răng chính xác

+ Trong công nghiệp dược phẩm:

 Alginat làm tá dược rã viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng dược chất, dùng để đóng nang, bao phim

 Alginat được dùng để làm trơn, ngăn trào ngược dịch dạ dày và là yếu

tố ổn định nhũ tương, huyền phù Alginat còn được sử dụng để cố định

tế bào như một gel có nhiều ưu điểm

+ Trong công nghiệp thực phẩm:

 Natri alginat cũng được dùng trong một số thực phẩm để hạn chế tăng trọng Ví dụ: 1 g alginat natri chỉ cung cấp 1,4 Kcal

 Trong sản xuất kem, acid alginic và muối của nó có thể dùng làm chất

ổn định trong kem ly, làm cho kem mịn có mùi thơm, chịu nóng tốt, thời gian khuấy trộn lúc sản xuất ngắn

 Cho vào sữa bò với nồng độ keo natri alginat 0,1% (1,8% sẽ chống được hiện tượng các chất không hòa tan kết tủa)

 Alginat còn dùng trong sản xuất bơ, bánh kẹo, fomat, nước giải khát cũng như các mặt hàng đông lạnh

+ Trong công nghiệp dệt:

 Alginat có độ nhớt cao, tính mao dẫn kém, khi khô trong suốt, bóng và

có tính đàn hồi tốt Vì thế người ta dùng hồ vải cho sợi bền và chịu

được cọ sát, giảm bớt tỷ lệ sợi đứt và nâng cao hiệu suất dệt

 Trong công nghiệp in hoa natri alginat là chất tạo cho thuốc nhuộm có

độ dính cao đáng kể, in hoa không nhòe và rõ ràng Ngoài ra còn dùng

làm vải không thấm nước

+ Trong công nghiệp giấy:

 Alginat hồ lên giấy làm cho giấy bóng, dai, không gẫy, mức độ khô nhanh, viết trơn, giấy hồ natri alginat còn làm tăng tính chịu nóng, do

đó còn làm nguyên liệu để chế giấy chống cháy

 Ngoài ra natri alginat còn làm chất kết dính trong mực in

10

+ Trong tơ nhân tạo:

 Dung dịch natri alginat nếu phun qua những lỗ nhỏ vào muối kim loại hóa trị II hay axit thì hình thành sợi tơ

 Qua nghiên cứu người ta thấy rằng tơ nhân tạo alginat tương đối bền + Trong công nghệ mỹ phẩm:

 Cho alginat vào hỗn hợp nước và mỡ, nó sẽ làm nước và mỡ trộn đều một cách ổn định Ví dụ: kem đánh răng gồm glycerin xà phòng, bột mùi … được trộn thành dạng nhũ tương ổn định

1.4.2 Chitosan

a Nguồn gốc

Chitosan là một polyaminosaccarid sinh học tự nhiên thu được từ phản ứng deacetyl hóa của chitin, một polyme tự nhiên chuỗi dài của N-acetylglucosamine và dẫn xuất đường glucose Chitin là thành phần chính của thành tế bào nấm, xương ngoài động vật chân đốt như tôm, cua, côn trùng [28]

và phụ thuộc mức độ deacetyl hóa của chitosan Nhóm amino của chitosan có pKa xấp

Chitosan là một polymer tự nhiên có nhiều ưu điểm như không độc, có hiệu quả trong việc đưa thuốc thấm vào trong niêm mạc sinh học [29] Chitosan có tác dụng chống acid và chống ung thư, có thể ngăn ngừa hoặc làm giảm sự kích ứng thuốc trong

dạ dày [31] Ngoài ra, chitosan là một hydrogel nhạy với pH, ở pH thấp (như pH dạ dày), nhóm amin bị proton hóa (- NH3+) có thể làm cho các phân tử chitosan gắn chặt vaog bề mặt niêm mạc dạ dày làm thuốc dễ được hấp thu

d Ứng dụng

Chitosan là một polyaminosaccarid sinh học tự nhiên có vai trò bao gồm [13]: +Trong y học:

 Chỉ phẫu thuật tự hoại, chito-olygosaccarit; da nhân tạo; kem chống khô

da, kem dưỡng da ngăn chặn tia cực tím phá hoại da

 Dùng làm thuốc chữa bệnh viêm loét dạ dày – tá tràng Dùng bào chế dược phẩm; thuốc giảm béo

 Từ Chitosan vỏ cua, vỏ tôm có thể sản xuất Glucosamin, một dược chất quý dùng để giảm các triệu chứng của viêm xương khớp, chống viêm,

giảm nguy cơ ung thư phổi, là chất chống oxy…

+ Trong công nghệ thực phẩm:

 Chất làm trong ứng dụng trong công nghiệp sản xuất nước quả: trong

sản xuất nước quả, việc làm trong là yêu cầu bắt buộc Thực tế hiện nay đang sử dụng các chất làm trong như: genatin, bentonite, kali caseinat, tannin, polyvinyl pirovinyl Chitosan là tác nhân tốt loại bỏ đi đục, giúp điều chỉnh acid trong nước quả Đối với dịch quả táo, nho, chanh, cam

không cần qua xử lý pectin, sử dụng chitosan để làm trong

 Sử dụng trong thực phẩm chức năng: chitosan có khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu Nếu sử dụng thực phẩm chức năng

12

có bổ sung 4% chitosan thì lượng cholesterol trong máu giảm đi đáng

kể chỉ sau 2 tuần Ngoài ra chitosan còn xem là chất chống đông tụ máu Nguyên nhân việc giảm cholesterol trong huyết và chống đông tụ máu được biết là không cho tạo các mixen

 Ứng dụng làm màng bao (bảo quản hoa quả, thực phẩm)

+Trong các công nghiệp khác:

 Làm tăng độ bền của giấy, sử dụng trong sản xuất sơn chống mốc và chống thấm, dùng làm mực in cao cấp trong công nghệ in, bảo quản quả, hạt giống mang lại hiệu quả cao

 Dùng làm thuốc kích thích sinh trưởng cây trồng cho lúa, cây công nghiệp, cây ăn quả, cây cảnh… Xử lý nước thải công nghiệp rất hiệu quả

1.5 Phương pháp sản xuất ethanol

Như chúng ta đã biết, ethanol đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực như: Tổng hợp chất hữu cơ, dược phẩm Đặc biệt là lĩnh vực sản xuất thực phẩm Trong sản xuất thực phẩm, ethanol dùng làm nguyên liệu đồ uống có cồn, dung làm dung môi Lên men ethanol là một quy trình sản xuất đã có lịch sử lâu đời và phổ biến trên khắp thế giới Có nhiều phương pháp lên men và sử dụng nhiều loại VSV khác nhau Ứng với mỗi phương pháp, mỗi loại nấm men cho một hiệu suất và giá trị cảm quan khác nhau Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu về dòng sản phẩm này để có được sản phẩm ethanol tốt nhất về kinh tế, cảm quan

Theo nghiên cứu của Phạm Thị Hồng Nga (2007): đã sử dúng nấm men S.cerevisiae

trong quá trình lên men để sản xuất ethanol bằng phương pháp cố định tế bào [11] Theo nghien cứu của Inloes DS và cộng sự (1983): đã sản xuất ethanol bằng

phương pháp cố định tế bào và dùng nấm men S.cerevisiae [20]

1.6 Một số nghiên cứu về phương pháp cố định tế bào trên thế giới và Việt Nam

Tại Việt Nam: Theo nghiên cứu ―cố định tế bào nấm men ứng dụng trong lên men

cồn rỉ đường‖ [14]

Các điều kiện cố định tế bào nấm men phù hợp cho quá trình lên men cồn từ rỉ đường bằng phương pháp lên men liên tục đã được khảo sát, bao gồm nồng độ natri alginat, nồng độ CaCl2 2%, tốc độ dòng chảy tạo hạt, mật độ tế bào trong dung dịch

13

gel Ngoài ra đã đánh giá được việc tái sử dụng tế bào nấm men cố định trong lên men cồn trên môi trường rỉ đường qua 4 lần lên men Kết quả cho thấy điều kiện cố định tế bào thích hợp là nồng độ chất mang natri alginat 3 %, nồng độ dung dịch tạo gel CaCl22%, mật độ giống thích hợp trong dịch chất mang 109 tế bào/ml gel, tốc độ dòng chảy tạo hạt tế bào cố định cho hệ thống tạo hạt 24 kim (đường kính hạt 0,5 cm) là

200 ml/phút Ngoài ra kết quả đánh giá lên men cho thấy sau 4 lần lên men thì hạt tế bào cố định tái sử dụng vẫn có hoạt lực khá tốt, nồng độ cồn tạo ra chỉ giảm nhẹ (từ 11

%v /v xuống 10,5 % v/v) so với lần đầu sử dụng

Tại nước ngoài: Nhóm tác giả Juliana C Duarte và cộng sự đã đánh giá ảnh hưởng

của hệ gel calci alginat trong cố định tế bào lên men ethanol [21]

Các tế bào S.cerevisiae được cố định trong hệ gel calci alginat và các hạt calci

alginat bao chitosan và nghiên cứu trong quá trình lên men của glucose và sucrose để sản xuất ethanol Việc lên men theo lô được tiến hành trong máy lắc quỹ đạo và đánh giá bằng cách theo dõi nồng độ chất nền và sản phẩm bằng HPLC Sự cố định của tế bào trong hạt calci alginat và hạt calci alginat bao chitosan cho phép sử dụng lại hạt

trong tám lần lên men tuần tự 10h mỗi lần

14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị, môi trường sử dụng

2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất

Chủng VSV: Nấm men Saccharomyces cerevisiae

Bảng các hóa chất dùng trong nghiên cứu:

Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc

MgSO4.7H2O Trung Quốc Acid acetic băng Trung Quốc

2.1.2 hiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

Bảng 2.2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

Tên thiết bị Nguồn gốc Tên thiết bị Nguồn gốc

Cân kỹ thuật Đức (Satorious) Nồi hấp tiệt trùng Nhật (ALP) Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd) Tủ ấm CO2 Nhật (Sanyo) Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc (KWF) Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo) Máy ly tâm Đức (Satorious) Tủ lạnh bảo quản Hàn Quốc (LG)

15

Bình nón 100, 250, 1000ml

Cốc có mỏ Ống đong Ống ly tâm Ống nghiệm có nắp

Pipet pasteur Pipet chia vạch Pipet tips (Đầu côn) Pipet Eppendort Đĩa petri đường kính 9 cm

2.1.3 Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu

 Dung dịch Acid acetic 0.5 %

 Dung dịch Natri clorid 0.9%, pH = 3

 Dung dịch Natri Thiosunfat 0.1N

 Dung dịch Acid Sulfuric 25%

 Dung dịch thuốc thử School A và School B

 Dung dịch Calci Clorid 2%

 Dung dịch NaOH 1N

2.1.4 Môi trường sử dụng

a Môi trường giữ giống (g/ 100ml)

Bàng 2.4 Hóa chất dùng trong môi trường giữ giống

c Môi trường lên men (g/ 100ml)

Bảng 2.6 Hóa chất dùng trong môi trường lên men

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát khả năng tạo ethanol của tế bào nấm men S.cerevisiae cố định trong

hệ gel alginat-chitosan

 Tạo hạt cố định tế bào nấm men trong hệ gel alginat-chitosan

 Khả năng lên men 24h các tế bào cố định trong hệ gel alginat-chitosan

 Khảo sát khả năng tiêu thụ đường sau khi lên men 24h các tế bào cố định trong

hệ gel alginat-chitosan: so sánh khả năng tiêu thụ đường của tế bào tự do với tế bào cố định trong hệ gel alginat và tế bào cố định torng hệ gel algintat-chitosan

2.2.2 Khảo sát khả năng tái sử dụng của các hạt tế bào cố định trong hệ gel alginat– chitosan

 Khả năng lên men 24h các tế bào cố định trong hệ gel alginat-chitosan sau khi tái sử dụng

 Khảo sát khả năng tiêu thụ đường sau khi tái sử dụng các tế bào cố định trong

hệ gel alginat-chitosan: so sánh khả năng tiêu thụ đường của tế bào cố định trong hệ gel alginat và tế bào cố định torng hệ gel algintat-chitosan sau tái sử dụng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm

Chế phẩm, nguyên liệu cần tiệt khuẩn được gói kín trong giấy bạc hoặc cần tiệt khuẩn được đựng trong bình nón và đậy kín bằng nút bông chuyển vào nồi hấp, cài đặt ở chế độ 115o

C; 0,6 atm trong 20 phút [1]

18

2.3.2 Phương pháp giữ giống

Pha 100ml môi trường giữ giống trong bình nón dung tích 250ml, thành phần theo công thức ở mục 2.1.4(a), chia vào các ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 10ml, nút kín, hấp tiệt trùng ở 1160C trong 20 phút, để nghiêng và để nguội đến nhiệt độ phòng Lấy một vòng que cấy từ khuẩn lạc nấm men trong ống giống Sau đó đưa que cấy vào trong môi trường, cấy theo hình zig zac Nuôi trong tủ ấm ở 300

C trong 18-24h, sau 24h nấm men phát triển trên thách nghiêng và cất ống giống vào trong tủ lạnh, giữ được 2-6 tháng [1], [4]

2.3.3 Phương pháp nhân giống

Pha 100 ml môi trường nhân giống trong bình nón dung tích 250 ml, thành phần theo công thức ở mục 2.1.4(b), nút kín, hấp tiệt trùng ở 1160C trong 20 phút, để nguội

Tiến hành cấy giống S.cerevisiae trong tủ cấy vô trùng Đặt trong máy lắc ở 300C, tốc

độ 100 vòng/1 phút trong 24h Sau 24h, nấm men phát triển làm đục môi trường [1],

ở 1160C trong 20 phút cho alginat đồng nhất

 Chuẩn bị dung dịch calci clorid 2%: Cân chính xác 2.00g calci clorid vào bình nón chứa 80ml nước cất, hòa tan rồi bổ sung nước cất vừa đủ 100ml, đậy nút bông, đem hấp tiệt trùng ở 1160C trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng

 Chuẩn bị dung dịch chitosan 0.5% trong acid acetic: Cân chính xác 0.5g chitosan, hòa tan trong dung dịch có chứa 90ml nước cất và 0.5ml acid acetic băng, khuấy đều cho chitosan hòa tan hoàn toàn Điều chỉnh pH trong khoảng 5.5.-6.0 bằng dung dịch NaOH 1N Bổ sung nước cho đủ 100ml cho vào bình nón và đậy nút bông, đem hấp tiệt trùng ở 1160C trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng [22]

 Chuẩn bị dung dịch NaCl 0.9%: Cân chính xác 0.9g NaCl hòa tan trong bình nón có chứa 90ml nước cất, hòa tan rồi bổ sung nước cất vừa đủ 100ml, đậy nút bông, đem hấp tiệt trùng ở 1160C trong 20 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng