KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG Bacillus subtilis B20.1 LÀM CƠ SỞ CHO VIỆC SẢN XUẤT PROBIOTIC PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG Bacillus subtilis B20.1 LÀM CƠ SỞ CHO VIỆC SẢN XUẤT PROBIOTIC PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA Họ tên sinh viên: NGUYỄN NỮ TRANG THÙY Ngành : NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Niên khóa : 2007-2011 Tháng năm 2011 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG Bacillus subtilis B20.1 LÀM CƠ SỞ CHO VIỆC SẢN XUẤT PROBIOTIC PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA Tác giả NGUYỄN NỮ TRANG THÙY Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp kỹ sư ngành Nuôi trồng thủy sản ( chuyên ngành ngư y) Giáo viên hướng dẫn Ths HỒ THỊ TRƯỜNG THY Ths VÕ MINH SƠN Tháng 8-2011 i LỜI CẢM ƠN Để hồn thành tốt khóa luận , tơi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, Ban chù nhiệm khoa Thủy sản, tất q thầy giáo tận tình dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho suốt khoảng thời gian học trường Viện Nuôi Trồng Thủy Sản II tạo điều kiện cho tất bạn sinh viên thực hồn thành khóa luận Đặc biệt, xin gởi lời cảm ơn sâu sắc đến anh Võ Minh Sơn, cô Hồ Thị Trường Thy tận tình giúp đỡ, hướng dẫn động viên tơi suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn chị Thúy, bạn học ngành công nghệ sinh học trường Đại Học Nông Lâm TPHCM, Đại Học Công Nghệ TPHCM, Đại Học Mở TPHCM đồng hành giúp đỡ khoảng thời gian qua Và xin gởi lời tri ân chân thành đến ba mẹ , người nuôi nấng dạy dỗ tôi, tạo cho sức mạnh để phấn đấu đường học tập, cảm ơn anh chị em tất bạn bè quanh tôi, bạn lớp DH07NY cổ vũ, động viên lúc tơi phải gặp khó khăn Sinh viên thực NGUYỄN NỮ TRANG THÙY ii TÓM TẮT NGUYỄN NỮ TRANG THÙY, Đại Học Nông Lâm TPHCM, tháng 8-2011.” KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHỦNG Bacillus subtilis B20.1 LÀM CƠ SỞ CHO VIỆC SẢN XUẤT PROBIOTIC PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA Giáo viên hướng dẫn : Th.s Hồ Thị Trường Thy Ths Võ Minh Sơn Nhằm tạo sản phẩm probiotic tốt ứng dụng rộng rãi thị trường, khắc phục hậu bệnh gan thận mủ cá Tra, tiến hành chọn vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 để tiến hành thí nghiệm: khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào (amylase, lipase, protease, cellulase), khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp pH nồng độ pH (4,5,6,7,8,9,10), nhiệt độ (25oC, 30oC, 35oC, 40oC ), muối(0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% , 6%), khảo sát khả chịu đựng pH thấp (pH=2,3), muối mật (0.5%, 1%, 2%), khảo sát khả phân hủy phân tử tín hiệu HHL, khả ức chế E.ictaluri Bacillus subtilis B20.1 điều kiện nuôi chung Kết đạt được: Xác định vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 có khả sinh loại enzyme cellulase, amylase caseinlase Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp, vi khuẩn phát triển tốt đối kháng mạnh khoảng pH=6, nồng độ muối 3% nhiệt độ 35oC Vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 chịu đựng tốt với pH thấp 2-3 dày chịu muối mật nồng độ cao 2% Có khả phân hủy HHL, bẻ gãy trình quorum sensing vi khuẩn Xác định chất đối kháng Bacillus subtilis B20.1 E.ictaluri cạnh tranh sinh dưỡng, mà không tiết chất đối kháng Bacillus subtilis B20.1 có khả ức chế mạnh mẽ phát triển E ictaluri iii MỤC LỤC ĐỀ MỤC Trang LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH CÁC BẢNG viii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x CHƯƠNG GIỚI THIỆU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Nội dung đề tài .2 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hiện trạng nuôi cá tra đồng sông Cửu Long 2.2.Bệnh gan thận mủ cá tra nuôi 2.2.1 Tác nhân gây bệnh 2.2.2 Lịch sử bệnh 2.2.3 Triệu chứng .6 2.2.4 Phòng trị 2.3 Tổng quan probiotic 2.3.1 Định nghĩa probiotic 2.3.2 Đặc điểm probiotic 10 2.3.3 Cơ chế tác động probiotic .10 2.3.3.1 Sản sinh hợp chất ức chế 10 2.3.3.2 Cạnh tranh chất dinh dưỡng hay lượng sẵn có 11 2.3.3.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại 12 2.3.3.4 Đóng góp mặt dinh dưỡng enzyme tiêu hóa 13 2.3.3.5 Cải thiện chất lượng nước 13 iv 2.3.3.6 Tăng cường đáp ứng miễn dịch 14 2.3.4 Vai trò probiotic ni trồng thủy sản 15 2.3.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng probiotic Việt Nam giới 16 2.4 Quá trình quorum sensing – cách tiếp cận việc kiểm sóat hệ vi sinh nuôi trồng thủy sản 18 2.4.1 Định nghĩa trình quorum sensing 18 2.4.2 Sự phân hủy sinh học trình quorum sensing vi khuẩn gây bệnh 19 2.4.3 Bẻ gãy hệ thống quorum sensing vi khuẩn gây bệnh – phương pháp việc kiểm soát bệnh .20 2.4.4 Những triển vọng việc bẻ gãy trình quorum sensing .20 2.4.5 Hệ thống quorumsensing vi khuẩn Edwardsiella spp 21 2.5 Tổng quan Bacilus subtilis 21 2.5.1 Đặc điểm chung chi Bacillus subtilis 21 2.5.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm có vi khuẩn Bacillus subtilis 24 2.6 Tổng quan enzyme ngoại bào Bacillus .25 2.6.1 Các enzyme thường gặp Bacillus .25 2.6.2 Ứng dụng enzyme amylase protease ngoại bào 25 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 3.2 Vật liệu nghiên cứu 28 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 28 3.2.2 Mơi trường hóa chất 28 3.2.3 Thiết bị, dụng cụ 29 3.3 Phương pháp nghiên cứu 29 3.3.1 Khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào 29 3.3.2 Khảo sát điều kiện ni thích hợp pH, nhiệt độ, NaCl lên khả đối kháng với E ictaluri .32 3.3.3 Khảo sát khả chịu pH thấp muối mật .33 3.3.4 Khả phân huỷ phân tử tín hiệu N-Hexanoyl hemoserine lactone 35 3.3.5 Khảo sát khả ức chế Bacillus B20.1 lên phát triển E ictaluri phương pháp nuôi chung (co-culture) xác định chất đối kháng chúng .38 v CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1 Kết khảo sát enzyme ngoại bào .39 4.2 Kết khảo sát điều kiện ni thích hợp pH, nhiệt độ, NaCl lên khả đối kháng với E ictaluri 43 4.2.1 Phương trình đường chuẩn Bacillus subtilis B20.1 43 4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng độ mặn lên tăng trưởng khả đối kháng Bacillus subtilis B20.1 với E ictaluri .43 4.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên tăng trưởng khả đối kháng Bacillus B20.1 với E Ictaluri .46 4.2.4 Ảnh hưởng pH lên tăng trưởng khả đối kháng vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 với E ictaluri 48 4.3 Kết khảo sát khả chịu đựng pH thấp 50 4.4 Kết khảo sát khả chịu đựng muối mật 52 5.Kết khảo sát khả phân hủy phân tử tín hiệu quorum sensing 54 4.5.1 Xây dựng đường chuẩn mối tương quan nồng độ C6-HHL đường kính vòng sắc tố violacein 54 4.5.2 Kết trình phân hủy HHL 54 4.7 Kết khảo sát khả ức chế Bacillus subtilis B20.1 lên phát triển E ictaluri phương pháp nuôi chung (co-culture) xác định chất đối kháng chúng .56 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59 5.1 Kết luận 59 5.2 Đề nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO .60 PHỤ LỤC 60 vi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AHL N-acyl homoserine lactone C6-HHL N-Hexanoyl homoserine lactone CMC Carbonyl methyl cellulose CV026 Chromobacterium violaceum TCA Tricloric acetic acid DSM Difco Sporulation Medium BHIA Brain Heart Infusion Agar BHIB Brain Heart Infusion Broth , BA Blood agar BNP Bacillary Necrosis of Pangasius NA Nutrient Agar WWF Word Wide Fund for Nature vii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 4.1 : Kết khảo sát enzyme ngoại bào Bacillus subtilis B20.1 .41 Bảng 4.2 Ảnh hưởng độ mặn lên tăng trưởng khả đối kháng 44 Bảng 4.3 Ảnh hưởng nhiệt độ lên tăng trưởng khả đối kháng với E ictaluri vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 46 Bảng 4.4 Ảnh hưởng pH lên tăng trưởng khả đối kháng với E ictaluri Bacillus subtilis B20.1 .49 Bảng 4.5 Tỉ lệ sống Bacillus B20.1 nuôi môi trường có pH thấp- số liệu biểu thị giá trị trung bình lần lập lại với sai số chuẩn (SE) 51 Bảng 4.6 Tỉ lệ sống Bacillus subtilis B20.1 nuôi môi trường muối mậtSố liệu biểu thị giá trị trung bình lần lập lại với sai số chuẩn (SE) .52 Bảng 4.7 Khảo sát khả ức chế Bacillus subtilis B20.1 phát triển E.ictaluri phương pháp nuôi chung 56 Bảng 4.8 Khảo sát tính chất đối kháng Bacillus subtilis B20.1 E ictaluri .57 viii DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ Biểu đồ 3.1 : Sơ đồ tiến hành phương pháp giếng khuếch tán (well diffusion method) (Chythanya et al., 2002; Hai et al., 2007) 33 Biểu đồ Thử khả chịu đựng acid dày .34 Biểu đồ 3: Thử khả chịu đựng muối mật 35 Biểu đồ 3.4: Sơ đồ khảo sát khả phân hủy phân tử tín hiệu HHL 37 Biểu đồ 4.1 : Phương trình đường chuẩn Bacillus subtilis B20.1 43 Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng độ mặn lên tăng trưởng khả đối kháng Bacillus subtilis B20.1 với E ictaluri 44 Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng nhiệt độ lên tăng trưởng khả đối kháng với E ictaluri vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 47 Biểu đồ 4: Ảnh hưởng pH lên tăng trưởng khả đối kháng với .48 Biểu đồ 4.5: Khả chịu đựng pH thấp vi khuẩn Bacillus subtilis B20.1 50 Biểu đồ 6: Khả chịu đựng muối mật 53 Biểu đồ 4.7 Đường chuẩn tương quan nồng độ phân tử HHL đường kính vòng tròn sắc tố violacein 54 Biểu đồ 4.8 : Khả phân hủy HHL Bacillus subtilis B20.1 .55 ix 48 Jean Fioramonti, Vassilia Theodorou and Lionel Bueno (2003).Probiotics: what are they? What are their effects on gut physiology? Best Pract Res Clin Gastroenterol 17(5): 711-724 49 Kamei, Y., Yoshimizu, M., Ezura, Y., Kimura, T., 1988 Screening of bacteria with antiviral activity from fresh water salmonid hatcheries Microbiol Immunol 32, 67–73 50 Kelly, D., T King, and R Aminov (2007) Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 622:58-69 51 Kim, D.-H and B Austin (2006) Innate immune responses in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) induced by probiotics Fish & Shellfish Immunology 21:513-524 52 Lilly, D.M and Stillwell, R.H.( (1965) Probiotics Growth promoting factors produced by micro-organisms Science 147, 747-748 53 Maloy Kumar Sahu, N S Swarnakumar, K Sivakumar, T Thangaradjou, L Kannan (2008), Probiotics in aquaculture: importance and future perspectives Indian J Microbiol 48:299- 308 54 Manefield, M., Harris, L., Rice, S.A., de Nys, R., Kjelleberg, S (2000) Inhibition of luminescence and virulence in the black tiger prawn (Penaeus monodon) pathogen Vibrio harveyi by intercellular signal antagonists Appl Environ Microbiol 66: 2079-2084 55 Maryam Mirlohi (2009) Investigation of acid and bile tolerance of native Lactobacilli isolated from fecal samples and commercial probiotics by growth and survival studies, iranian journal of biotechnology 7: 233-240 56 Merritt, J., Qi, F.X., Goodman, S.D., Anderson, M.H., Shi, W.Y (2003) Mutation of luxS affects biofilm formation in Streptococcus mutants Infect Immun 71: 1972-1979 57 Miller, M.B., and Bassler, B.L (2001) Quorum sensing in bacteria Ann Rev Microbiol 55: 165-199 58 Nikoskelainen, S., A Ouwehand, S Salminen, and G Bylund (2001) Protection of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from furunculosis by Lactobacillus rhamnosus Aquaculture 198:229-236 59 Nikoskelainen, S., Ouwehand, A., Bylund, G., Salminen, S., Lilius, E.M., 2003 Immune enhancement in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by potential 64 probiotic bacteria (Lactobacillus rhamnosus) Fish Shellfish Immunol 15, 443–452 60 Nogami, K., Hamasaki, K., Maeda, M., Hirayama, K., 1997 Biocontrol method in aquaculture for rearing the swimming crab larvae Portunus trituberculatus Hydrobiologia 358, 291–295 61 Nogami, K., Maeda, M., 1992 Bacteria as biocontrol agents for rearing larvae of the crab Portunus trituberculatus Can J Fish Aquat Sci 49, 2373–2376 62 Park, S.C., I Shimamura, M Fukunaga, K.-I Mori, and T Nakai (2000) Isolation of Bacteriophages specific to a fish pathogen, Pseudomonas plecoglossicida, as a candidate for disease control Applied and Environmental Microbiology 66:1416-1422 63 Parker, R.B 1974 Probiotics The other half of the antibiotics story Anim Nutr Health 29:4–8 64 Reid.G J Jass MT Sebulsky and J.K McCormick 2003 Potential uses of probiotic in clinical practice Clin Microbios Rev 16: 658-672 65 Rengpipat, S., Phianphak, W., Piyatiratitivorakul, S., Menasaveta, P., 1998 Effects of a probiotic bacterium in black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth Aquaculture 167, 301–313 66 Ringø, E., Vadstein, O., 1998 Colonization of Vibrio pelagius and Aeromonas caviae in early developing turbot (Scophthalmus maximus L.) larvae J Appl Microbiol 84, 227–233 67 Robertson, P.A.W., C O'Dowd, C Burrells, P Williams, and B Austin (2000) Use of Carnobacterium sp as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss, Walbaum) Aquaculture 185:235-243 68 Rosenfeld, W.D., Zobell, C.E., 1947 Antibiotic production by marine microorganisms J Bacteriol 54, 393–398 69 Rumbaugh, K.P., Griswold, J.A., Hamood, A.N (2000) The role of quorum sensing in the in vivo virulence of Pseudomonas aeruginosa Microb & Infect 2: 1721-1731 70 Sakai, M., Yoshida, T., Astuta, S., Kobayashi, M., 1995 Enhancement of resistance to vibriosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) by oral administration of Clostridium butyricum bacteria J Fish Dis 18, 187–190 65 71 Sakata, T., 1990 Microflora in the digestive tract of fish and shellfish.In: Lesel, R (Ed.), Microbiology in Poecilotherms, Elsevier, Amsterdam, pp 171–176 72 Schauder, S., and Bassler, B.L (2001) The languages of bacteria Genes & Development 15: 1468-1480 73 Teruo Higa Technology of Effective Microorganisms : Concept and Phisiology Royal Agricultural College, Cirencester, UK 2002 74 Uroz, S., D’ Angelo-Picard, C., Carlier, A., Elasri, M., Sicot, C., Petit, A., Oger, P., Faure, D., Dessaux, Y (2003) Novel bacteria degrading N-acyl homoserine lactones and their use as quenchers of quorum sensing-regulated functions of plant-pathogenic bacteria Microbiology 149: 1981-1989 75 Vendrell, D., J Luis Balcazar, I de Blas, I Ruiz-Zarzuela, O Girones, and J Luis Muzquiz (2008) Protection of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) from lactococcosis by probiotic bacteria Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases 31:337-345 76 Verdenelli, M., F Ghelfi, S Silvi, C Orpianesi,C Cecchini an 77 Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P, Verstraete W (2000), Probiotic Bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture, Microbiology and molecular biology reviews 64 ,pp 655–671 78 Whitehead, N.A., Barnard, A.M.L., Slater, H., Simpson, N.J.L., Salmond, G.P.C (2001) Quorum-sensing in Gram-negative bacteria FEMS Microbiol Rev 25: 365-404 79 Yin, X.-T., Xu, L., Fan, S.-S., Xu, L.-N., Li, D.-C., Liu, Z.-Y (2010) Isolation and characterization of an AHL lactonase gene from Bacillus amyloliquefaciens World J Microbiol Biotechnology 80 Zhang, H.B., Wang, L.H., Zhang, L.H (2002) Genetic control of quorum-sensing signal turnover in Agrobacterium tumefaciens Proc Natl Acad Sci USA 99: 4638-4643 81 Zhou, Y., Ye, W.X., Zhu, C.G., Sun, M., Yu, Z (2006) Ethanol tolerance, yield of melanin, swarming motility and growth are correlated with the expression levels of aiiA gene in Bacillus thuringiensis Enzyme Microb Technol 38: 967974 C Tài liệu internet http://pangasius-vietnam.com truy cập 23-3-2011 66 PHỤ LỤC Phụ lục :Kết phân tích thống kê khảo sát điều kiện nuôi cấy nồng độ muối khác So sánh mật độ trung bình nghiệm thức Nồng độ Số mẫu( muối N) 0.5 Trung bình Độ lệch Sai số chuẩn chuẩn 0.49866667 0.111217505 0.064211456 0.68133333 0.074036027 0.63466667 0.039259818 0.022666667 3 0.71333333 0.069407012 0.040072157 0.57266667 0.040066611 0.023132469 0.51466667 0.060706946 0.035049172 Total 0.629 0.04274472 0.015 0.008660254 21 0.60633333 0.094341578 0.02058702 So sánh đường kính trung bình nghiệm thức Nồng độ Số muối mẫu(N) 0.5 Total Trung bình Độ lệch Sai số chuẩn chuẩn 17.6666667 0.577350269 0.333333333 18 0 18.6666667 0.577350269 0.333333333 3 20.3333333 0.577350269 0.333333333 18.6666667 0.577350269 0.333333333 18.6666667 0.577350269 0.333333333 18.3333333 0.577350269 0.333333333 21 18.6190476 0.920662287 0.200904982 67 Mật độ vi khuẩn đường kính vòng vơ khuẩn sau 24 ủ nồng độ muối khác a Mật độ vi khuẩn Nguồn Tổng Độ tự Phương biến BPĐL(SS) (df) sai(MS) Mức ý nghĩa F Giữa NT 0.118556667 0.019759444 4.653191291 0.008380511 Trong NT 0.05945 Tổng 14 0.004246429 0.178006667 20 b Đường kính vòng vơ khuẩn Nguồn Tổng Độ tự Phương biến BPĐL(SS) (df) sai(MS) Mức ý nghĩa F Giữa NT 12.95238095 2.158730159 7.555555556 0.000924083 Trong NT Tổng 16.95238095 14 0.285714286 20 Bảng so sánh khác biệt nghiệm thức a Mật độ vi khuẩn trung bình Nghiệm Số thức mẫu(N) alpha = 05 d 0.5 c b a 0.498666667 d 0.514666667 0.51466667 cd 0.572666667 0.57266667 0.572666667 bcd 3 3 Ý nghĩa 0.629 0.629 0.629 abc 0.63466667 0.634666667 0.634666667 abc 0.681333333 0.681333333 ab 0.713333333 a 0.207509557 0.05507746 0.079282419 0.164905893 68 b Đường kính vòng vơ khuẩn trung bình Nghiệm thức Số mẫu (N) alpha = 05 0.5 17.66666667 b 18 b 18.33333333 b 18.66666667 b 18.66666667 b 18.66666667 b 3 Ý nghĩa 20.3333333 a 0.058413737 Phụ lục 2: Kết phân tích thống kê khảo sát điều kiện nuôi cấy nhiệt độ khác So sánh mật độ vi khuẩn đường kính vòng vơ khuẩn nghiệm thức a Mật độ vi khuẩn Số Nghiệm Độ lệch mẫu?(N) Trung bình chuẩn Sai số chuẩn thức Total 25 0.18333333 0.017009801 0.009820613 30 0.28733333 0.060277138 0.034801022 35 40 0.20933333 0.027592269 0.015930404 12 0.532 0.043863424 0.02532456 0.303 0.147880787 0.042689506 69 b Đường kính vòng vơ khuẩn Nghiệm Số Độ lệch thức mẫu(N) chuẩn Trung bình Sai số chuẩn 25 16.6666667 0.577350269 0.333333333 30 17.3333333 0.288675135 0.166666667 35 40 17.6666667 0.577350269 0.333333333 Total 18.5 0.5 0.288675135 12 17.5416667 0.810676859 0.234022251 Kết mật độ vi khuẩn đường kính vòng vơ khuẩn nghiệm thức sau 24 ủ điều kiện nhiệt độ khác a Mật độ vi khuẩn Nguồn biến Tổng Độ tự Phương BPĐL(SS) do(df) sai(MS) F Giữa Ý nghĩa 2.19215E- NT 0.22734 Trong NT 0.013216 Tổng 0.240556 11 0.07578 45.8716707 05 0.001652 c Đường kính vòng vơ khuẩn Nguồn biến Tổng Độ tự Phương BPĐL(SS) do(df) sai(MS) F Ý nghĩa Giữa NT Trong NT Total 5.229166667 1.743055556 6.972222222 0.012716503 7.229166667 11 0.25 70 So sánh khác biệt mật độ vi khuẩn đường kính vòng vơ khuẩn nghiệm thức a Mật độ vi khuẩn Nghiệm Số thức mẫu(N) 25 0.183333333 c 40 0.209333333 c 30 35 alpha = 05 0.28733333 b 0.532 a Ý nghĩa 0.455926041 1 b Đường kính vòng vơ khuẩn Ngiệm Số thức mẫu(N) alpha = 05 25 16.66666667 c 30 17.33333333 17.3333333 bc 40 35 ý nghĩa 17.6666667 17.66666667 ab 18.5 a 0.141113281 0.43785162 0.075528167 Phụ lục 3: Kết thống kê khảo sát điều kiện nuôi cấy pH khác So sánh mật độ vi khuẩn đường kính vòng vơ khuẩn nghiệm thức a Mật độ vi khuẩn Nghiệm thức Trung bình Độ lệch chuẩn Sai số chuẩn 0.02266667 0.54666667 0.081543444 0.656 0.081902381 0.047286362 0.552 0.063592452 0.39666667 0.012055428 0.006960204 10 Tổng Số mẫu(N) 0.108 0.00305505 0.001763834 0.04707913 0.03671512 0.004 0.002309401 0.02533333 0.004618802 0.002666667 21 0.32961905 0.261314844 0.057023574 71 b Đường kính vòng vơ khuẩn Nghiệm Độ lệch Số mẫu(N) Trung bình 13.5 17.1666667 0.763762616 0.440958552 19.8333333 0.288675135 0.166666667 17.8333333 0.288675135 0.166666667 17.1666667 0.288675135 0.166666667 10 13.3333333 0.577350269 0.333333333 thức Tổng chuẩn Sai số chuẩn 0.5 0.288675135 17.5 0.5 0.288675135 21 16.6190476 2.285305023 0.498694441 Kết mật độ vi khuẩn đường kính vòng vơ khuẩn sau ủ 24 a Mật độ vi khuẩn Nguồn Tổng Độ tự Phương biến BPĐL(SS) do(df) sai(MS) F Giữa NT Ý ngĩa 2.59203E- 1.330522286 NT 0.035186667 14 Tổng 1.365708952 20 0.221753714 88.2309208 10 Trong 0.002513333 b Đường kính vòng vơ khuẩn Nguồn Tổng Độ tự Phương biến BPĐL(SS) do(df) sai(MS) F Giữa NT 1.14665E101.1190476 3.333333333 14 104.452381 20 16.8531746 70.78333333 Trong NT Tổng Ý ngĩa 0.238095238 72 09 Kết khác biệt nghiệm thức a Mật độ vi khuẩn α = 05 Nghiệm Số thức mẫu(N) 4 0.022666667 d 10 0.025333333 d d 0.5466667 b 0.552 b Ý nghĩa 0.108 0.396667 c 0.656 a 0.066766431 0.8981886 b Đường kính vòng vơ khuẩn Nghiệm Số thức mẫu(N) 10 Ý nghĩa alpha = 05 3 13.33333333 c c 17.16667 b 17.16667 b 17.5 b 17.83333 b 13.5 19.833333 a 0.682051982 0.144015 73 Phụ lục 4: Kết thống kê khảo sát khả sống sót pH thấp So sánh tỉ lệ sống trung bình nghiệm thức Nghiệm thức pH2 Total Độ lệch bình chuẩn Sai số chuẩn 88.24325 0.451553688 0.260704643 91.53321 1.206130292 0.696359649 3 90.67426 1.249535292 0.721419537 90.91917 0.665004879 0.383940746 24 87.92246 0.551670672 0.318507211 15 89.85847 1.706928787 0.440727118 87.34583 0.297199595 0.171588266 89.69228 0.468745501 0.270630341 3 98.62911 0.655396623 0.378393417 99.93581 0.463487855 0.267594838 24 89.32127 0.364738384 0.210581804 Total pH4 Trung Total pH3 N 15 92.98486 5.417401763 1.39876712 94.85451 0.462126216 0.266808695 97.74961 0.247161805 0.142698934 3 97.86654 0.926810499 0.535094291 100.4546 0.203064672 0.117239443 24 85.88398 0.807272444 0.466078963 15 95.36184 5.262042366 1.358653497 74 Khả sống sót vi khuẩn Tổng Phương BPĐL(SS) df sai(MS) F Ý nghĩa Giữa pH2 NT 32.85735942 8.214339855 10.35448 0.001399 Trong NT 7.933122957 10 0.793312296 Tổng 14 40.79048238 Giữa pH3 NT 408.7044865 102.1761216 470.6626 2.46E-11 Trong NT 2.170899515 10 0.217089952 Tổng 14 410.875386 Giữa pH4 NT 383.9941553 95.99853882 262.7863 4.42E-10 Trong NT 3.653102717 10 0.365310272 Tổng 14 387.647258 Phụ lục 5: Kết thống kê khảo sát tỉ lệ sống điều kiện nồng độ muối mật cao Nghiệm Số Trung Độ lệch thức mẫu bình chuẩn 0.3% 94.13663 1.050204279 0.606335723 98.50434 0.739977486 0.427226201 3 92.28475 1.332564366 0.769356395 83.95513 1.067776716 0.616481174 24 82.47769 0.549607264 0.317315902 Total 0.5% Sai số chuẩn 15 90.27171 6.391807832 1.650357686 92.13727 1.029150518 0.594180329 98.22711 3 92.68257 0.215096279 0.124185895 81.74477 1.15857192 0.66890181 24 81.52775 1.23934384 0.7155355 75 0.50355574 0.290728042 Total 15 89.2639 6.858146063 1.770765699 93.68835 0.744731356 0.429970849 100.2603 0.77298309 0.446281995 3 93.37195 1.00610554 0.580875304 94.10409 1.279455602 0.738694036 24 88.21149 0.835317609 0.482270847 1% Total 15 93.92723 4.040146817 1.043161423 95.52181 0.245261369 0.141601717 101.1442 0.7783543 0.449383065 3 95.95115 0.896637 0.517673613 96.08118 0.431319589 0.249022481 24 89.95661 0.406723851 0.234822125 2% Total 15 95.73099 3.705462647 0.956746341 Khả sống sót vi khuẩn Nguồn Tổng biến BPĐL(SS) Giữa 562.236025 NT 0.30% Phương sai df 140.559006 9.73687751 Trong NT Ý F nghĩa 144.357 8.46E4 09 0.97368775 10 571.972903 Tổng Giữa NT 0.50% 14 650.003848 162.500962 8.47449525 Trong NT 2.1E191.753 09 0.84744952 10 658.478343 Tổng 1% Giữa NT 14 219.520731 54.8801829 76 60.9896 5.49E6 07 8.99827630 Trong NT 10 0.89982763 228.519008 Tổng Giữa 14 188.583533 NT 47.1458833 2% 3.64281468 Trong NT Tổng 129.421 1.44E6 0.36428146 10 192.226348 14 Phụ lục 6: Kết thống kê khả phân hủy HHL Nghiệm Số thức mẫu(N) Total Trung bình chuẩn Sai số chuẩn 2.791797371 0.249065636 0.143798112 12 1.684475118 0.168243472 0.097135414 18 1.324083667 0.067222821 0.038811114 24 1.028867967 0.22476667 0.129769097 12 1.707306031 0.716182935 0.206744205 3.432523535 0.179529171 0.103651215 12 3.000167264 0.076758366 0.044316463 18 2.913469592 0.130057308 0.075088622 24 2.625808687 0.13733606 0.079291011 B20.1 Total DC Độ lệch 12 2.99299227 77 0.323469528 0.09337761 08 Khả phân hủy HHL vi khuẩn Tổng BPĐL(SS) Phương df sai(MS) F Ý nghĩa Giữa NT 5.351340912 Trong NT 0.290757041 5.642097953 11 1.00316056 0.334386853 18.09975 0.000634 Trong NT 0.147797333 0.018474667 Tổng 1.150957894 11 B20.1 Tổng 1.783780304 49.07961 1.7E-05 0.03634463 Giữa NT DC 78 ... E.ictaluri phương pháp nu i chung chất đối kháng chúng CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hiện trạng nu i cá tra đồng sông Cửu Long Trên thực tế, năm gần cá Tra trở thành nghề nu i truyền thống vùng... gan thận mủ gây thiệt hại kinh tế nhiều cho người nu i (Loan ctv., 2007) 2.2.Bệnh gan thận mủ cá tra nu i Hiện bệnh gây thiệt hại lớn cho người nu i cá tra thâm canh tỉnh đồng sông Cửu Long Tỷ... Bắc cực (Salvelinus alpinus L.) Một số chủng Bacillus (Bacillus licheniformis, B subtilis, B polymixa, B laterosporus B circulans) thúc đẩy tăng trưởng ấu trùng cá tầm Acipenser nudiventris: tăng