Nghiên cứu bào chế một số dược phẩm, mỹ phẩm dùng trên da bị viêm và dị ứng từ dương cam cúc di thực (matricaria chamomilla l )

CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN CV Coefficient of Variation Hệ số phân tán CO2 SCF Carbon dioxid Super Critical Fluid Phương pháp CO2 siêu tới hạn DSC Differential Scanning calorimetry N

TRẦN ANH VŨ

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ MỘT SỐ DƯỢC PHẨM, MỸ PHẨM DÙNG TRÊN DA BỊ VIÊM VÀ DỊ ỨNG TỪ

DƯƠNG CAM CÚC DI THỰC (Matricaria chamomilla L.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

TP HỒ CHÍ MINH- Năm 2011

TRẦN ANH VŨ

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ MỘT SỐ DƯỢC PHẨM, MỸ PHẨM DÙNG TRÊN DA BỊ VIÊM VÀ DỊ ỨNG TỪ

Chuyên ngành: BÀO CHẾ Mã số: 67.73.01.05

LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học

1 GS.TS Lê Quan Nghiệm

2 TS Nguyễn Thị Chung

TP HỒ CHÍ MINH-Năm 2011

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với

GS.TS Lê Quan Nghiệm và TS Nguyễn Thị Chung

những người thầy đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và luôn đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy, Cô và đồng nghiệp ở Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP HCM, đặc biệt các Bộ mơn Bào chế, Dược liệu, Dược lý, Vi sinh đã giúp đỡ thực hiện các thí nghiệm của đề tài và có những đóng góp quý báu Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Phòng Sau Đại Học của Đại Học Y Dược TP HCM đã quan tâm và chỉ dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho luận án được hoàn thành

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến quý lãnh đạo và cán bộ, nhân viên của Trung tâm trồng, nghiên cứu và chế biến cây thuốc Đà Lạt (Vimedimex), Viện Công nghệ hóa học TP HCM, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP HCM, Công ty mỹ phẩm Lan Hảo (Thorakao), Trung tâm sâm Việt Nam, Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, dược phẩm, mỹ phẩm của Sở Y tế TP HCM, Trung tâm tiêu chuẩn đo lường chất lượng III, Công ty mỹ phẩm Avene Việt Nam,… là những nơi đã có những giúp đỡ thiết thực về cơ sở vật chất, trang thiết bị và hoá chất để thực hiện luận án Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho luận án

Cuối cùng xin khắc ghi tất cả công ơn của cha mẹ, gia đình và bạn bè, những người thân yêu luôn chia sẻ mọi khó khăn trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài

Trần Anh Vũ

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả trong luận án này là trung thực và chưa từng công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Trần Anh Vũ

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn ii Lời cam đoan iii Mục lục iv Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii Danh mục các bảng ix Danh mục các hình, biểu đồ xiii Danh mục sơ đồ xvi ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nguyên liệu Dương cam cúc 3

1.1.1 Nguồn gốc - Phân bố 3

1.1.2 Đặc điểm thực vật 4

1.1.3 Điều kiện gieo trồng 4

1.1.4 Thành phần hĩa học 5

1.1.4.1 Tinh dầu Dương cam cúc 5

1.1.4.2 Flavonoid của hoa Dương cam cúc 9

1.1.5 Tác dụng dược lý và công dụng 12

1.1.5.1 Tác dụng dược lý 12

1.1.5.2 Công dụng 13

1.1.5.3 Các chế phẩm của Dương cam cúc trên thị trường thế giới 13

1.2 Da bị viêm, dị ứng và sản phẩm điều trị 13

1.2.1 Khái niệm bệnh lý về da bị viêm và dị ứng 13

1.2.2 Các phương pháp và sản phẩm điều trị dùng trên da hiện nay 15

1.3 Kỹ thuật chiết xuất bằng CO2 siêu tới hạn 16

1.3.1 Chiết xuất tinh dầu bằng CO2 siêu tới hạn 16

1.3.1.1 Nguyên lý của phương pháp chiết xuất sử dụng CO2 siêu tới hạn 16

1.3.1.2 Qui trình chiết xuất tinh dầu Dương cam cúc 17

1.3.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng lên qui trình chiết tinh dầu Dương cam cúc 18 1.3.2 Chiết xuất flavonoid bằng CO2 siêu tới hạn 19

1.3.2.1 So sánh chiết xuất flavonoid bằng CO2 siêu tới hạn với một số phương pháp khác 19

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình chiết flavonoid 20

1.4 Kỹ thuật bào chế kem thuốc 21

1.4.1 Đại cương 21

1.4.2 Tá dược 21

1.4.2.1 Yêu cầu của tá dược 21

1.4.2.2 Một số tá dược dùng điều chế kem 21

1.4.3 Kỹ thuật bào chế kem 22

1.4.4 Đánh giá chất lượng kem thuốc 24

1.4.4.1 Đánh giá các chỉ tiêu lý hóa của kem thuốc 24

1.4.4.2 Đánh giá tác dụng dược lý của kem thuốc 25

1.5 Kỹ thuật bào chế gel mỹ phẩm 26

1.5.1 Đại cương 26

1.5.2 Tá dược 26

1.5.3 Kỹ thuật bào chế gel 27

1.5.4 Đánh giá chất lượng gel mỹ phẩm 27

1.5.4.1 Đánh giá chỉ tiêu lý hóa của gel mỹ phẩm 27

1.5.4.2 Đánh giá một số tác dụng chính của mỹ phẩm dùng trên da 27

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị 31

2.1.1 Nguyên liệu 31

2.1.2 Dung môi và hoá chất 31

2.1.3 Thiết bị và dụng cụ 32

2.1.4 Súc vật thử nghiệm 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 34

2.2.1 Thẩm định tên khoa học và xây dựng tiêu chuẩn Dương cam cúc 34

2.2.1.1 Về cây Dương cam cúc 34

2.2.1.2 Về hoa khô Dương cam cúc 34

2.2.2 Điều chế sản phẩm trung gian từ Dương cam cúc 42

2.2.2.1 Tinh dầu Dương cam cúc 42

2.2.2.2 Cao toàn phần Dương cam cúc 44

2.2.3 Bào chế kem thuốc và gel mỹ phẩm 47

2.2.3.1 Bào chế kem thuốc 47

2.2.3.2 Bào chế gel mỹ phẩm 57

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Thẩm định tên khoa học và xây dựng tiêu chuẩn Dương cam cúc 62

3.1.1 Về cây Dương cam cúc 62

3.1.1.1 Thẩm định tên khoa học nguyên liệu nghiên cứu 62

3.1.1.2 Đặc điểm vi học 64

3.1.2 Về hoa khô Dương cam cúc 65

3.1.2.1 Đặc điểm vi học của bột hoa khô 65

3.1.2.2 Thành phần hóa học của hoa khô Dương cam cúc 66

3.1.2.3 Xác định độ ẩm, độ tro và tỷ lệ vụn nát của hoa khô 79

3.1.2.4 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và kiểm nghiệm Dương cam cúc 79 3.2 Điều chế sản phẩm trung gian từ Dương cam cúc 81

3.2.1 Tinh dầu Dương cam cúc 81

3.2.1.1 Phương pháp chiết xuất tinh dầu 81

3.2.1.2 Xác định hàm lượng, thành phần tinh dầu Dương cam cúc 85

3.2.1.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và kiểm nghiệm tinh dầu 88

3.2.2 Cao toàn phần Dương cam cúc 89

3.2.2.1 Phương pháp điều chế 89

3.2.2.2 So sánh chất lượng dịch chiết và cao của hai phương pháp 95

3.2.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và kiểm nghiệm cao toàn phần 96

3.3 Bào chế kem thuốc và gel mỹ phẩm 98

3.3.1 Bào chế kem thuốc 98

3.3.1.1 Bào chế kem thuốc ở qui mô phòng thí nghiệm 98

3.3.1.2 Bào chế kem thuốc ở qui mô pilot 110

3.3.2 Bào chế gel mỹ phẩm 117

3.3.2.1 Bào chế gel mỹ phẩm ở qui mô phòng thí nghiệm 117

3.3.2.2 Bào chế gel mỹ phẩm ở qui mô pilot 126

Chương 4 BÀN LUẬN 4.1 Về nguyên liệu Dương cam cúc 130

4.2 Về điều chế sản phẩm trung gian từ Dương cam cúc 134

4.3 Về bào chế kem thuốc và gel mỹ phẩm 139

4.3.1 Ở qui mô phòng thí nghiệm 139

4.3.2 Ở qui mô pilot 144

4.3.3 Về độ ổn định kem thuốc và gel mỹ phẩm 146 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN ÁN

CV Coefficient of Variation Hệ số phân tán

CO2 SCF Carbon dioxid Super Critical Fluid Phương pháp CO2 siêu tới hạn DSC Differential Scanning calorimetry Nhiệt lượng kế quét vi sai

EuPhar European Pharmacopeia Dược điển châu Âu

FMI Flower Maturity Index Chỉ số trưởng thành của hoa FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại qua phép

GC/MS Gas Chromatography/ Mass Spectrometry Sắc ký khí khối phổ

INCI International Nomenclature Danh pháp quốc tế các thành

of Cosmetic Ingredients phần mỹ phẩm

LC/MS Liquid Chromatography /Mass Phổ khối lượng sắc ký lỏng

Spectrometry

MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

NMR Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OPE Olive Oil PEG-7 Ester

PEG Poly Ethylen Glycol

RBCT Red Blood Cell Test Phương pháp thử tế bào hồng cầu RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SEM Standard Error of Mean Sai số chuẩn của trung bình

SLES Sodium Lauryl Ether Sulphat Natri Lauryl Ether Sulphat

SPOC Sodium PEG-7OliveOil Carboxylat Natri PEG-7OliveOil Carboxylat

TGA Thermogravimetric Analysis Phân tích nhiệt trọng lực

USP United States Pharmacopeia Dược điển Mỹ

UV-Vis UltraViolet-visible Quang phổ tử ngoại-khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh năng suất hoa, chất lượng tinh dầu Dương cam cúc

của một số nước 7

Bảng 1.2 So sánh định tính tinh dầu theo USP 25 và BP 2005 9

Bảng 1.3 So sánh định tính flavonoid theo BP 2005 và Eu Phar 2002 10

Bảng 1.4 So sánh tinh dầu Dương cam cúc cất kéo hơi nước và CO2 siêu tới hạn bằng GC/MS 18

Bảng 1.5 Tiêu chuẩn điểm đối với phản ứng da trên Patch Test 28

Bảng 2.1 Dung môi và hóa chất 31

Bảng 2.2 Chất chuẩn, sản phẩm đối chiếu 32

Bảng 2.3 Tá dược bào chế 32

Bảng 2.4 Dụng cụ 32

Bảng 2.5 Thiết bị 33

Bảng 2.6 Chương trình gradient chạy sắc ký định lượng apigenin-7-glucosid trong hoa 38

Bảng 2.7 Hàm lượng hoạt chất phối hợp với hai hệ tá dược 48

Bảng 3.1 Hàm lượng tinh dầu theo cất kéo hơi nước 68

Bảng 3.2 Khảo sát hàm lượng tinh dầu ở các thời điểm hoa nở khác nhau 69

Bảng 3.3 So sánh hàm lượng tinh dầu và bisabolol oxid A, B theo mùa 69

Bảng 3.4 Khảo sát hàm lượng tinh dầu của hoa ở cách sơ chế khác nhau 70

Bảng 3.5 Kết quả theo dõi chất lượng hoa ở các điều kiện bảo quản khác nhau 71

Bảng 3.6 Hàm lượng flavonoid toàn phần trong hoa Dương cam cúc 72

Bảng 3.7 Dữ liệu phổ 1H NMR và 13C NMR của mẫu phân lập 78

Bảng 3.8 Độ ẩm, độ tro, tỷ lệ vụn nát của hoa khô Dương cam cúc 79

Bảng 3.9 Tiêu chuẩn hoa khô Dương cam cúc 79

Bảng 3.10 Tiêu chuẩn apigenin-7-glucosid làm chất đối chiếu 80

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tốc độ dòng theo thời gian đến

hàm lượng tinh dầu (phương pháp CO2 siêu tới hạn) 82 Bảng 3.12 Các mức cơ bản và khoảng biến đổi (tối ưu hoá chiết tinh dầu) 83 Bảng 3.13 Kết quả tiến đến vùng cực trị bằng

phương pháp Box-Willson (tối ưu hoá chiết tinh dầu) 84 Bảng 3.14 Hàm lượng chamazulen và bisabolol oxid A, B

trong tinh dầu Dương cam cúc theo phương pháp cất kéo hơi nước 85 Bảng 3.15 Kết quả hàm lượng trung bình tinh dầu Dương cam cúc 87 Bảng 3.16 Hàm lượng chamazulen và bisabolol oxid A, B trong

tinh dầu Dương cam cúc theo phương pháp CO2 siêu tới hạn 87 Bảng 3.17 So sánh tinh dầu chiết xuất bằng

cất kéo hơi nước và CO2 siêu tới hạn 88 Bảng 3.18 Tiêu chuẩn tinh dầu Dương cam cúc chiết bằng CO2 siêu tới hạn 88 Bảng 3.19 Biến đổi hàm lượng flavonoid theo kích thước bột dược liệu 89 Bảng 3.20 Biến đổi hàm lượng flavonoid theo hàm lượng ethanol 90 Bảng 3.21 Biến đổi hàm lượng flavonoid theo

tỷ lệ dược liệu: dung môi (phương pháp ngấm kiệt) 90 Bảng 3.22 Kết quả tỷ lệ cắn khô và hàm lượng flavonoid

của dịch chiết ngấm kiệt 92 Bảng 3.23 Kết quả hàm lượng flavonoid trung bình

của cao Dương cam cúc (phương pháp ngấm kiệt) 92 Bảng 3.24 Biến đổi hàm lượng flavonoid

theo tỷ lệ dung môi: dược liệu (phương pháp đun hồi lưu) 93 Bảng 3.25 Kết quả tỷ lệ cắn khô và hàm lượng flavonoid

của dịch chiết đun hồi lưu 94 Bảng 3.26 Kết quả hàm lượng flavonoid trung bình trong

cao Dương cam cúc theo phương pháp đun hồi lưu 94

Bảng 3.27 So sánh chất lượng dịch chiết

theo đun hồi lưu và ngấm kiệt 95

Bảng 3.28 So sánh hiệu quả hai phương pháp chiết 95

Bảng 3.29 Tiêu chuẩn cao toàn phần Dương cam cúc 96

Bảng 3.30 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hai hệ tá dược A/B trên độ sưng phù chân chuột so với lô chứng 98

Bảng 3.31 Kết quả khảo sát độ sưng phù trung bình chân chuột trong 6 ngày thử nghiệm trên 2 nền tá dược A, B của các thuốc thử nghiệm ở hai liều khảo sát 99

Bảng 3.32 Khảo sát các thông số kỹ thuật trong qui trình bào chế kem ở qui mô thí nghiệm 100

Bảng 3.33 Các yếu tố khảo sát (xác định tỷ lệ hoạt chất kem thuốc) 102

Bảng 3.34 Ma trận bố trí thí nghiệm và kết quả (xác định tỷ lệ hoạt chất kem thuốc) 102

Bảng 3.35 Kết quả tiến đến vùng cực trị bằng phương pháp Box-Willson (xác định tỷ lệ hoạt chất kem thuốc) 102

Bảng 3.36 Các yếu tố khảo sát (xác định tỷ lệ tá dược kem thuốc) 103

Bảng 3.37 Ma trận bố trí thí nghiệm (xác định tỷ lệ tá dược kem thuốc) 104

Bảng 3.38 Kết quả tiến đến vùng cực trị bằng phương pháp Box-Willson 104

Bảng 3.39 Tiêu chuẩn chế phẩm kem thuốc 105

Bảng 3.40 Kết quả đo pH kem thuốc ở qui mô phòng thí nghiệm 106

Bảng 3.41 Kết quả độ bền kem thuốc ở qui mô phòng thí nghiệm 106

Bảng 3.42 Kết quả tác dụng kháng khuẩn của kem thuốc 110

Bảng 3.43 Kết quả kiểm nghiệm lô kem thăm dò 111

Bảng 3.44 Kết quả hiệu chỉnh nhiệt độ pha dầu của kem 112

Bảng 3.45 Kết quả hiệu chỉnh tốc độ đồng nhất hoá của kem 112

Bảng 3.46 Kết quả hiệu chỉnh thời gian đồng nhất hoá của kem 113

Bảng 3.47 Kết quả so sánh độ bền của 3 lô C1, C2, C3 114

Bảng 3.48 Kết quả so sánh hàm lượng apigenin-7-glucosid

của 3 lô C1, C2, C3 115

Bảng 3.49 Kết quả theo dõi độ ổn định ở điều kiện lão hoá cấp tốc 116

Bảng 3.50 Kết quả theo dõi độ ổn định kem thuốc 116

Bảng 3.51 Kết quả thông số kỹ thuật qui trình bào chế gel qui mô phòng thí nghiệm 117

Bảng 3.52 Các yếu tố khảo sát (công thức gel) 119

Bảng 3.53 Ma trận bố trí thí nghiệm kiểu yếu tố từng phần (công thức gel) 119

Bảng 3.54 Kết quả tiến đến vùng cực trị bằng phương pháp Box-Willson (công thức gel) 119

Bảng 3.55 Tiêu chuẩn chế phẩm gel mỹ phẩm 120

Bảng 3.56 Kết quả đo pH gel ở qui mô phòng thí nghiệm 121

Bảng 3.57 Kết quả độ bền gel ở qui mô phòng thí nghiệm 121

Bảng 3.58 Kết quả độ dàn mỏng gel ở qui mô phòng thí nghiệm 121

Bảng 3.59 Kết quả đánh giá tính kích ứng da của gel so với mẫu đối chiếu 122

Bảng 3.60 Kết quả đánh giá sạch da của gel bằng miếng thử có sẵn 124

Bảng 3.61 Kết quả đánh giá sạch da của gel bằng sebum 124

Bảng 3.62 Kết quả đánh giá độ ẩm tương đối (%) của da 125

Bảng 3.63 Kết quả kiểm nghiệm lô gel thăm dò 126

Bảng 3.64 Kết quả hiệu chỉnh tốc độ đồng nhất hóa theo thời gian tách lớp sau khi tạo gel đặc bằng triethanolamin 127

Bảng 3.65 Kết quả độ bền của 3 lô G1, G2, G3 128

Bảng 3.66 Kết quả độ dàn mỏng 3 lô G1, G2, G3 129

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hoa Dương cam cúc Đức 3

Hình 1.2 Hoa Dương cam cúc La mã 3

Hình 1.3 Sự biến đổi của matricin thành chamazulen 6

Hình 1.4 Công thức cấu tạo các thành phần hóa học chính trong tinh dầu Dương cam cúc 6

Hình 1.5 Công thức cấu tạo flavonoid chính trong Dương cam cúc 10

Hình 1.6 Giản đồ pha của CO2 siêu tới hạn 16

Hình 1.7 So sánh tương tác của SLES với SPOC và OPE trong RBCT 28

Hình 1.8 Cách đo trên máy đo độ nhờn da (Sebumeter) và kết quả 30

Hình 3.1 Cánh đồng hoa Dương cam cúc tại Cam Ly, Vạn Thành, TP Đà Lạt 62

Hình 3.2 Bộ phận dùng: Hoa phơi khô (Flos Chamomillae) 62

Hình 3.3 Đặc điểm hình thái cây và hoa Dương cam cúc 64

Hình 3.4 Đặc điểm vi phẫu thân (Dương cam cúc) 65

Hình 3.5 Đặc điểm vi phẫu lá (Dương cam cúc) 65

Hình 3.6 Đặc điểm bột hoa khô Dương cam cúc .66

Hình 3.7 Sắc ký đồ tinh dầu (Dương cam cúc) .67

Hình 3.8 Sắc ký đồ dịch chiết (Dương cam cúc) 72

Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu chuẩn apigenin-7glucosid 73

Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu dược liệu Dương cam cúc 73

Hình 3.11 Phổ UV-Vis của apigenin-7- glucosid chuẩn 73

Hình 3.12 Phổ UV-Vis của apigenin-7-glucosid trong hoa Dương cam cúc 73

Hình 3.13 Sắc ký đồ các phân đoạn 1, 2, 3, 4 thu từ cột silica gel khi soi đèn UV 254 76

Hình 3.14 Sắc ký đồ chất phân lập 76

Hình 3.15 Tinh thể chất phân lập kết tinh 77

Hình 3.16 Cấu trúc của apigenin-7-glucosid 77

Hình 3.17 Sắc ký đồ SKLHNC mẫu chuẩn apigenin-7-glucosid (USP) 81

Hình 3.18 Sắc ký đồ SKLHNC mẫu phân lập apigenin-7-glucosid 81

Hình 3.19 Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ dòng theo thời gian đến hàm lượng tinh dầu 82

Hình 3.20 Sắc ký đồ tinh dầu (chiết bằng CO2 siêu tới hạn) 86

Hình 3.21 Sắc ký đồ cao Dương cam cúc 97

Hình 3.22 Kết quả độ sưng phù chân chuột (X%) trong 6 ngày thử nghiệm ở các lô chứng, tá dược A và tá dược B 99

Hình 3.23 Kết quả khảo sát độ sưng phù trung bình chân chuột trong 6 ngày thử nghiệm trên 2 nền tá dược A, B của các thuốc thử nghiệm ở hai liều khảo sát 100

Hình 3.24 Sắc ký đồ apigenin-7-glucosid trong kem 106

Hình 3.25 Sắc ký đồ tinh dầu trong kem 107

Hình 3.26 Sắc ký đồ curcumin trong kem 107

Hình 3.27 Sắc ký đồ curcumin trong kem 107

Hình 3.28 Sắc ký đồ mẫu chuẩn apigenin-7glucosid 108

Hình 3.29 Sắc ký đồ mẫu kem 108

Hình 3.30 Phổ UV-Vis của apigenin-7-glucosid chuẩn 108

Hình 3.31 Phổ UV-Vis của apigenin-7-glucosid trong mẫu kem 108

Hình 3.32 Độ sưng phù chân chuột của kem thử nghiệm so với kem đối chiếu và lô chứng 109

Hình 3.33 Sắc ký đồ tinh dầu trong mẫu gel 122

Hình 3.34 Biểu đồ đánh giá sự kích ứng của gel so với mẫu đối chiếu 122

Hình 3.35 Kết quả đánh giá khả năng chống nhờn của gel 123

Hình 3.36 Kết quả đo và phân tích trên máy 123

Hình 3.37 Biểu đồ đánh giá độ nhờn của da trước và sau dùng gel 124

Hình 3.38 Biểu đồ đánh giá độ ẩm của da

trước và sau khi dùng sản phẩm 125 Hình 3.39 So sánh độ bền của các lô G1, G2, G3 128 Hình 3.40 So sánh thể chất của các lô G1, G2, G3 129

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Qui trình chiết tách bằng dung môi siêu tới hạn 17

Sơ đồ 2.1 Qui trình chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn 42

Sơ đồ 2.2 Khảo sát tác dụng chống viêm trên chuột gây phù bằng carrageenin .49

Sơ đồ 2.3 Khảo sát tác dụng chống viêm trên chuột gây phù bằng formalin 55

Sơ đồ 3.1 Qui trình điều chế cao khô Dương cam cúc 75

Sơ đồ 3.2 Qui trình phân lập một flavonoid 75

Sơ đồ 3.3 Qui trình chiết xuất tinh dầu bằng cất kéo hơi nước 82

Sơ đồ 3.4 Qui trình chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn 84

Sơ đồ 3.5 Qui trình điều chế cao toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt 91

Sơ đồ 3.6 Qui trình điều chế cao toàn phần bằng phương pháp đun hồi lưu 93

Sơ đồ 3.7 Qui trình điều chế kem qui mô phòng thí nghiệm 101

Sơ đồ 3.8 Qui trình sản xuất lô kem ở qui mô pilot 114

Sơ đồ 3.9 Qui trình bào chế gel qui mô phòng thí nghiệm 118

Sơ đồ 3.10 Qui trình sản xuất lô gel ở qui mô pilot 128

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, các bệnh lý về da bị viêm và dị ứng gia tăng rất nhanh với mức độ tái phát cao do nhiều nguyên nhân khác nhau như môi trường sống ô nhiễm, các bệnh nghề nghiệp phải tiếp xúc với hoá chất, sử dụng thường xuyên mỹ phẩm và áp dụng các biện pháp làm đẹp như lột da mặt, tắm trắng,… Bệnh nhân mắc bệnh này thường phải dùng thuốc kéo dài và lặp lại nhiều lần Các thuốc dùng trên da có nguồn gốc hóa chất hay gây tác dụng phụ như khô da, sạm da, teo da,… Chính vì vậy cần các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên chất lượng cao nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng của xã hội [21], [27]

Trong dòøng sản phẩm ngoại nhập săn sóc và điều trị da bị viêm và dị ứng từ nguồn gốc thiên nhiên có các chế phẩm từ Dương cam cúc, có tác dụng dược lý tốt lại an toàn cho da [2]

Tại Việt Nam, Dương cam cúc đã được di thực từ những năm 60 và tỏ ra thích nghi tốt với khí hậu mát Năm 1978, Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã bước đầu nghiên cứu thành công kỹ thuật trồng Dương cam cúc di thực nhưng chưa nhân rộng được vì chưa có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng Cho đến nay ở Việt Nam chưa thấy công trình nào được công bố về nghiên cứu hoá học, chiết xuất, bào chế các dược phẩm, mỹ phẩm từ Dương cam cúc [25] Trong khi đó, các sản phẩm từ Dương cam cúc trên thị trường thế giới rất phong phú và đa dạng từ nguyên liệu như hoa khô, trà, cao toàn phần, tinh dầu đến các dược phẩm, mỹ phẩm Đặc biệt giá thành của mỹ phẩm từ Dương cam cúc rất đắt, như một ống dung dịch trích tinh 3 ml Azulen serum dùng một lần tốn khoảng 300.000 VNĐ Các mỹ phẩm này được xem là sản phẩm có chất lượng và có hiệu quả cao trong hỗ trợ điều trị bệnh lý về da vì được áp dụng các phương

pháp đánh giá khoa học với phương tiện hiện đại, chính xác trước khi đưa ra thị trường Đây là một lĩnh vực mà nhiều nhà sản xuất mỹ phẩm Việt Nam hầu như chưa chú ý tới Điều này có thể là một trong những nguyên nhân làm người tiêu dùng chưa tin tưởng mỹ phẩm Việt Nam [56 ], [71], [91]

Hơn nữa, một số cơ sở trong nước muốn sản xuất các chế phẩm từ Dương cam cúc nhưng lại có xu hướng nhập khẩu nguyên liệu do trong nước chưa đáp ứng được, làm giá thành sản phẩm cao mà không tận dụng được nguồn nguyên liệu sẵn có

Xuất phát từ thực tế trên, luận án “Nghiên cứu bào chế một số dược phẩm,

mỹ phẩm dùng trên da bị viêm và dị ứng từ Dương cam cúc di thực (Matricaria chamomilla L.)” được thực hiện với mục tiêu điều chế được các sản phẩm trung

gian là tinh dầu và cao toàn phần từ Dương cam cúc di thực đã được chuẩn hóa, làm nguồn nguyên liệu sản xuất ra các dược phẩm, mỹ phẩm chất lượng cao để có thể dần thay thế các sản phẩm ngoại nhập trong hỗ trợ và điều trị các bệnh lý về da bị viêm và dị ứng, phù hợp với định hướng phát triển chung của ngành dược Việt Nam hiện nay

Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu được thực hiện gồm:

1 Thẩm định tên khoa học và xây dựng tiêu chuẩn Dương cam cúc

2 Điều chế các sản phẩm trung gian từ Dương cam cúc

3 Bào chế kem thuốc, gel mỹ phẩm ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot từ sản phẩm trung gian

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NGUYÊN LIỆU DƯƠNG CAM CÚC

1.1.1 Nguồn gốc – Phân bố

Trong hệ thống phân loại thực vật, cây DCC được xếp vào lớp 2 lá mầm (Dicotyledonee), phân lớp cúc (Asterydae), bộ cúc (Asterales), họ cúc (Asteraceae), phân họ giống hoa cúc (Asteroideae) chi Matricaria

Có 2 loại DCC là DCC Đức (Matricaria chamomilla L., Matricaria recutita

L hay Chamomilla recutita L.) (hình 1.1) và DCC La Mã (Roman chamomile hay

Chamaemelum nobile L.) (hình 1.2)

Tên nước ngoài: Chamomile flower, German chamomile, Hungarian chamomile, feverfew (Anh), Herbe aux charpentiers, Matricaire, Camomille allemagne (Pháp) [78]

Tên Việt Nam khác: Mẫu cúc, Xuân bạch cúc, Ca-mô-mi [2]

Bộ phận dùng là hoa phơi hoặc sấy khô

Hình 1.2 Hoa DCC La mã [72]

Hình 1.1 Hoa DCC Đức [72]

Dương cam cúc ban đầu xuất phát từ châu Âu, Đông Bắc Á, sau đó được di thực và trồng ở nhiều nước trên thế giới Có nhiều nơi trồng qui mô lớn cho mục đích thương mại như châu Âu (Đức, Pháp, Hungary, Slovakia, Bulgaria), châu Á (Iran, Pakistan), châu Úc (Úc, NewZealand), châu Mỹ (Mỹ, Brasil),… [81]

Dương cam cúc Đức thường được trồng ở Hungary, Bungari, Đức, Tây Bắc

Á còn DCC La mã hay được trồng ở các nước Tây Nam châu Phi, châu Âu, châu Mỹ [71], [81]

Ở Việt Nam, DCC được di thực vào Việt Nam từ đầu những năm 60, đến năm 1978 được trồng thử ở Đà Lạt, sau đưa giống đi trồng ở một số nơi khác có khí hậu mát lạnh như Sapa, Tam Đảo, Cao Bằng Hiện nay Đà Lạt là nơi trồng

DCC nhiều nhất nước [2]

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Dương cam cúc là cây thân thảo, hàng năm, mùi thơm đặc trưng, chiều cao khoảng 30- 60 cm, thân mọc thẳng đứng, phân cành nhiều Lá mọc so le, xẻ 2-3 lần, hình lông chim rất sâu vào tận gân lá thành những mảng rất hẹp giống như những cây kim Cụm hoa hình đầu nằm ở ngọn các cuống mảnh, đường kính của đầu hoa là 1-1,5 cm [2] Dương cam cúc là loại thụ phấn chéo (thụ phấn tự do) [81] Sự khác nhau về đặc điểm thực vật, đặc biệt là cấu trúc hoa của 2 loài DCC cũng được nhiều tài liệu đề cập [11], [72]

1.1.3 Điều kiện gieo trồng

Điều kiện gieo trồng là một vấn đề được các nước trồng DCC có mục đích sản xuất kinh doanh rất chú ý nghiên cứu vì điều này quyết định rất lớn đến sản

lượng và chất lượng của hoa

Dương cam cúc được trồng từ hạt Giống cây này thích hợp với nhiều loại đất như đất bùn, đất mặn, đất đầm lầy và ngay cả đất sét, đất khô cằn Các yếu tố

hóa, lý, sinh học, đất trồng, các yếu tố môi trường như nhiệt độ, không khí, điều kiện chiếu sáng, độ ẩm, chất dinh dưỡng, phân bón có tác động đến sự tích lũy hoạt chất trong hoa [30], [61], [81], [87]

Tại Việt Nam, Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã áp dụng thành công kỹ thuật trồng DCC bằng hạt trên các vùng đất đồi Đà Lạt với qui mô nhỏ khoảng 1000-2000 m2 chủ yếu để giữ giống và chỉ cung cấp cho một số nơi làm hương liệu trà [25]

1.1.4 Thành phần hóa học

Chủ yếu gồm tinh dầu và các polyphenol

1.1.4.1 Tinh dầu Dương cam cúc

Thành phần - Hàm lượng tinh dầu Dương cam cúc

Tinh dầu DCC tích lũy nhiều trong đế hoa và bầu hoa Hàm lượng tinh dầu khoảng 0,2-1,5% Tinh dầu có màu xanh dương do thành phần quan trọng là chamazulen được tạo thành từ sự biến đổi lacton sesquiterpen là matricin trong

quá trình gia nhiệt (hình 1.3) [2], [89]

Hàm lượng chamazulen của các loại DCC khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc, điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng Tác giả Falzari và Menary [55] đã dùng kỹ thuật GC/MS xác định được 10 thành phần chính trong tinh dầu DCC là β-farnesen, germacren-D, bicyclogermacren, α-farnesen, bisabolol oxid B, bisabolon oxid, α-bisabolol, chamazulen, bisabolol oxid A và dicycloether (còn gọi là cis-spiroether, cis-bicycloether)

Tác giả Habersang cũng khẳng định rằng hoạt tính sinh học dựa vào hai thành phần chính là chamazulen và α-bisabolol [60] Một số thành phần hóa học

chính trong tinh dầu DCC được ghi ở hình 1.4.

Các yếu tố ảnh hưởng đến năng suất hoa và chất lượng tinh dầu

Năng suất hoa thu hoạch và chất lượng tinh dầu tùy thuộc nhiều vào khí

hậu, thổ nhưỡng, quốc gia… [81] được tóm tắt ở bảng 1.1

CH2C

a Bisabolol oxid A b Bisabolol oxid B

Hình 1.4 Công thức cấu tạo các thành phần hóa học chính trong tinh dầu Dương cam cúc

Bảng 1.1 So sánh năng suất hoa, chất lượng tinh dầu Dương cam cúc của một số nước

STT Vùng, quốc gia Hàm lượng (%)tinh dầu Hàm lượng (%) bisabolol oxid

A, B

Hàm lượng (%) chamazulen

Năng suất hoa DCC (kg/ha)

Ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch hoa Dương cam cúc

Thời điểm thu hoạch đúng được xác định dựa trên chỉ số FMI Hoa được phân làm 6 giai đoạn: Giai đoạn 1 - chồi hoa (buds), giai đoạn 2 - nụ hoa hé mở (rays opening), giai đoạn 3 - hoa bắt đầu nở (disc opening), giai đoạn 4 - hoa nở (50% of disc florets open), giai đoạn 5 - hoa nở rộ (100% of disc florets open), giai đoạn 6 - hoa đang tàn (flower senescing)

FMI flowerstag e i N i trong đó N

Tỷ lệ của FMI trong từng giai đoạn là số hoa nhân với số thứ tự giai đoạn rồi chia cho FMI tổng số Hoa trưởng thành ở các mức độ khác nhau nên cùng một lúc hoa sẽ ở nhiều giai đoạn Vì đặc tính này nên hoa DCC thường được thu hoạch nhiều đợt thay vì chỉ một đợt Một thử nghiệm khác đã phát hiện ra việc tích lũy chamazulen và bisabolol của hoa đặc biệt tăng dần và nhiều nhất ở giai đoạn 3 rồi giảm dần ở giai đoạn 4 trở đi [55]

Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản hoa Dương cam cúc

Để bảo quản hoa sau thu hoạch được tốt, các thử nghiệm được tiến hành trên các mẫu hoa tươi, hoa đông lạnh, hoa sấy khô ở 30 oC Các mẫu trên được xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước và các thành phần tinh dầu bằng sắc ký khí Thí nghiệm khác đã kiểm tra các thành phần thay đổi trong tinh dầu, mức độ α-farnesen của hoa đông lạnh thấp hơn nhiều so với hoa tươi, bicyclogermacren giảm 2,2% trong hoa đông lạnh, 1,7% trong hoa khô và 0,35% trong hoa tươi, chamazulen trong hoa khô có hàm lượng cao nhất Việc lưu giữ trong 6 tháng ở nhiệt độ phòng làm giảm hàm lượng hoạt chất hoa [55] Trung tâm trồng và chế biến cây thuốc Đà Lạt đã bảo quản hoa khô bằng bao nylon dày hàn kín, bên ngoài là bao lát tránh ánh sáng

Định tính - Định lượng tinh dầu Dương cam cúc

Các phương pháp định tính, định lượng tinh dầu DCC được đề cập trong USP, BP, Eu Phar [38], [52], [53], [92], [93], [94]

Định tính bằng phản ứng hóa học

Định tính tinh dầu DCC với thuốc thử dimethylaminobenzaldehyd trong hỗn hợp acid phosphoric, acid acetic và nước, quan sát sự thay đổi màu trong lớp dung môi hữu cơ (hexan, petroleum) [92], [93]

Định tính, định lượng bằng sắc ký khí

Ứng dụng sắc ký khí để xác định thành phần, hàm lượng các chất chính của tinh dầu DCC [14], [24], [49], [63] Tác giả Levy J.M, Storozynsky E đã sử dụng detector ion hóa ngọn lửa, khí mang là nitrogen hay helium, cột sắc ký vật liệu là silica nung chảy dài 30-60 m (có thể sử dụng bề dày màng phim khoảng 1-2

μm, đường kính 0,25-0,53 mm, điều chỉnh nhiệt độ phù hợp), tốc độ dòng 1-2

ml/phút, tiêm mẫu 1 μl Mẫu được pha loãng trong cyclohexan [67]

Dựa trên các đỉnh và thời gian lưu thu được của α–bisabolol và chamazulen trong sắc ký đồ của mẫu thử so với sắc ký đồ của mẫu chuẩn [28], [51], [94]

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Bảng 1.2 So sánh định tính tinh dầu theo USP 25 và BP 2005

Dung dịch thử Tinh dầu trong toluen

Dung dịch chuẩn Borneol, bornyl acetat, guaiazulen trong toluen

Dung môi khai triển Cloroform Ethyl acetat-toluen (5:95)Thuốc thử phát hiện Anisaldehyd

Quan sát Ánh sáng thường

Sắc ký đồ (SKLM) SKĐ chuẩn có 3 vết tương ứng là guaiazulen, bornyl

acetat, borneol

SKĐ mẫu thử có 5-7 vết trong đó 3 vết có Rf và màu sắc

tương tự SKĐ mẫu chuẩn Định tính tinh dầu DCC bằng sắc ký lớp mỏng trong BP, USP đều có điều kiện và kết quả gần như tương tự nhau [38], [93]

1.1.4.2 Flavonoid của hoa Dương cam cúc

Thành phần flavonoid

Fabiana phân tích thành phần dịch chiết hoa DCC, xác định được 11 hợp chất phenolic gồm coumarin (herniarin, umbellieron), phenylpropanoid (chlorogenic acid, caffeic acid), flavon (apigenin, apigenin-7-o-glucosid, luteolin, luteo-7-o-glucosid), flavonol (quercetin, rutin), flavonon (narigenin) [54]

Công thức cấu tạo của một số thành phần hoá học chính trong DCC được

trình bày ở hình 1.5

O O

H

f Apigenin

e Apigenin-7-glucosid

Định tính – Định lượng flavonoid của hoa Dương cam cúc

Hình 1.5 Công thức cấu tạo flavonoid chính trong Dương cam cúc

Phương pháp định tính, định lượng được đề cập trong USP, BP, Eu Phar

Định tính bằng phản ứng hóa học

Định tính thành phần flavonoid trong dịch chiết bằng thuốc thử chung [19]

Định tính bằng sắc ký lớp mỏng

Bảng 1.3 so sánh định tính flavonoid theo BP 2005, Eu Phar 2002 [38], [52]

Định tính flavonoid bằng sắc ký lớp mỏng trong các BP, Eu Phar có điều kiện khác nhau Trong USP không thấy đề cập đến phương pháp này

Bảng 1.3 So sánh định tính flavonoid theo BP 2005 và Eu Phar 2002

Dung dịch thử Dịch chiết methanol

Dung dịch chuẩn Clorogenic acid, hyperoxid, rutin trong methanol Apigenin, apigenin-7-glucosid trong methanol Dung môi khai

triển

Acid formic khan-acid acetic băng-nước-ethyl acetat (7,5:7,5:18,67)

Acid acetic băng-nước-butanol (17:17:66)

SKĐ chuẩn có 3 vết

SKĐ thử có các vết tương ứng, thêm các vết màu xanh lá phát quang phía trên vết màu vàng nâu

SKĐ chuẩn có vết phía trên là apigenin, vết giữa là apigenin-7-glucosid

SKĐ thử có nhiều vết trong đó có

2 vết tương đương mẫu chuẩn

Định tính, định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (SKLHNC)

Ứng dụng phương pháp này để định tính những hợp chất flavonoid trong dịch chiết DCC qua thời gian lưu các mẫu khảo sát so với mẫu đối chiếu [16] Trong USP, BP đã định lượng apigenin-7-glucosid dựa vào diện tích hay chiều cao đỉnh của mẫu khảo sát so với mẫu chuẩn trong điều kiện thực nghiệm Dùng hệ thống sắc ký có bộ phận phát hiện ở bước sóng 335 nm, cột 125 mm x 4

mm, tốc độ dòng 1 ml/phút Pha động sử dụng hỗn hợp khác nhau gồm dung dịch kali hydro phosphat 0,005M, điều chỉnh bằng dung dịch acid phosphoric loãng đến pH = 2,55 ± 0,1 và hỗn hợp acetonitril-methanol (65:35) trong hệ thống sắc ký [45], [53], [68], [73], [92]

Phân lập, tinh chế apigenin, apigenin-7-o-glucosid bằng sắc ký cột

Phương pháp phân lập

Phân lập riêng từng flavonoid như apigenin, apigenin-7-o-glucosid [33] bằng phương pháp SKC với chất hấp phụ polyamid, cellulose, silicagel… Để thu được flavonoid tinh khiết cần phải SKC vài lần hay dùng sắc ký chế hóa.Svehelikova, V., Redaeli, C [82], [95] đã phân lập, tinh chế và nghiên cứu tính ổn định các dẫn xuất acetyl hóa của apigenin-7-o-glucosid từ hoa DCC Đức bằng cách kết hợp chiết pha rắn polyamid và SKLHNC Qua kết quả LC/MS và dữ liệu NMR của các glucosid, chất được xác định là apigenin-7-o-glucosid

Một số phương pháp tinh chế

Phương pháp kết tinh lại: Áp dụng đối với hợp chất rắn có thể hoà tan một dung môi hay hỗn hợp dung môi ở nhiệt độ cao

Phương pháp tinh chế dịch chiết từ dược liệu bằng SKC

Phương pháp dùng dung môi: Dùng một hay hỗn hợp nhiều dung môi để

tách chiết, tinh chế hoạt chất dựa vào độ hoà tan và phân bố khác nhau của các chất trong các dung môi [24]

Phương pháp phân tích bằng quang phổ

Dùng quang phổ tử ngoại, quang phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân [15], [37], [82] để đánh giá cấu trúc chất phân lập

1.1.5 Tác dụng dược lý và công dụng

1.1.5.1 Tác dụng dược lý

Cao DCC và α-bisabolol đều có hoạt tính hạ sốt Cao nước - cồn DCC ức

chế sự phát triển in vitro của Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans,

Leptospira icterohemorrhagiae, Strepsalivarius, Bacillus megatherium Tinh dầu

DCC ức chế in vitro Staph aureus, Bacillus subtilis, ức chế vi khuẩn gram dương

mạnh hơn so với vi khuẩn gram âm, ức chế mốc và nấm da thử nghiệm

Cao DCC ức chế in vitro cả cyclooxygenase và lipoxygenase và do đó ức

chế sự sản sinh prostaglandin và leukotrien là những chất gây viêm đã được biết Bisabolol và bisabolol oxid đã được chứng minh là có tác dụng ức chế 5 - lipoxygenase nhưng bisabolol có tác dụng mạnh hơn [2]

Tác dụng chống viêm của các hợp chất đã được chứng minh trên những mô hình thí nghiệm ở các động vật khác nhau (gây phù bàn chân chuột cống trắng với carrageenin, gây viêm da bằng dầu bã đậu ở chuột nhắt trắng) Cao toàn phần DCC và phân đoạn flavonoid có hiệu quả giảm viêm khi dùng tại chỗ [2] Các chế phẩm DCC được chứng minh có hiệu quả trong điều trị viêm niêm mạc do chiếu tia ở đầu và cổ, do liệu pháp hóa học toàn thân [2], [74] Kobayashi

Y chứng minh tinh dầu DCC có tác dụng ngăn chặn kích ứng da là do bisabolol oxid A [81] DCC có tác dụng tốt trong điều trị viêm, loét miệng [70]

1.1.5.3 Các chế phẩm của Dương cam cúc trên thị trường thế giới

Hiện nay rất nhiều chế phẩm trung gian, dược phẩm, mỹ phẩm đang lưu hành trên thị trường có nguồn gốc từ DCC Có thể kể một vài sản phẩm tiêu biểu từ nguyên liệu hoa khô DCC (Organic Chamomile Dry Flower- Yogi Botanicals Ấn Độ), cao DCC (Barlowe’s Herbal Chamomile Extract 1,2% Apigenin; Chamomile Powder Extract- Sunrises Nutrachem Group Co Trung Quốc), tinh dầu DCC (Chamomile Oil- NOW’s; Pure Chamomile Oil German- R.K Sons & Company Ấn Độä), Eyecare series (Shanghai Brightol Int Co Trung Quốc), Tonic Extra (HARE- Thái Lan), mỹ phẩm (Herbal Cleasing Gel hãng Dr Spiller; Avon Naturals, D Adair’s Cosmetics- Mỹ)…

1.2 DA BỊ VIÊM, DỊ ỨNG VÀ SẢN PHẨM ĐIỀU TRỊ

1.2.1 Khái niệm bệnh lý về da bị viêm và dị ứng

Viêm là một đáp ứng bảo vệ cơ thể của hệ miễn dịch trước sự tấn công của

tác nhân bên ngoài (vi sinh vật, tác nhân hoá, lý) hoặc của các tác nhân bên trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự miễn) Đây là một đáp ứng miễn dịch tự nhiên, gồm 4 triệu chứng điển hình là sưng, nóng, đỏ, đau

Da bị viêm: Là tình trạng da bị đỏ, ngứa, có thể có nhiều mụn nước [10]

Dị ứng là hậu quả của sự phản ứng đối với các tác nhân dị ứng của một

trong số ba thành phần chủ yếu trong hệ miễn dịch là lympho bào, tương bào và dưỡng bào; các loại protein đặc biệt gọi là kháng thể; chất hóa học trung gian

Da bị dị ứng biểu hiện qua các hiện tượng: da đỏ, ngứa, nổi mẩn, phồng rộp,

tróc vảy, phát ban… có liên quan đến phản ứng dị ứng của cơ thể

Da bị viêm và dị ứng biểu hiện qua một số bệnh lý như:

Viêm da thể tạng (chàm sữa ở trẻ em, chàm thể tạng ở người lớn): Là bệnh

da mạn tính, hay tái phát Đặc điểm chính là các mụn nước ở nhiều vị trí khác nhau, ngứa, tiến triển từng đợt, phân bố ở mặt và nếp gấp ở trẻ em, da thường dày lên tại vùng duỗi ở người lớn…

Viêm da tiếp xúc (hay chàm tiếp xúc): Do tác dụng kích thích hoặc dị ứng

với các chất tiếp xúc trong sinh hoạt hoặc trong nghề nghiệp

Da nhạy cảm - dị ứng mỹ phẩm (hội chứng da không dung nạp): Tình trạng

nhiều loại mỹ phẩm dùng cho da gây ra cảm giác se da, bỏng rát, ngứa

Bệnh tổ đĩa: Là một thể eczema đặc biệt Triệu chứng chính là các mụn

nước màu trắng, nằm sâu, khó vỡ, thường tập trung thành vùng trên mặt da

Một số trường hợp bị tắc nang lông do tuyến bã nhờn hoạt động quá mức lâu ngày gây viêm da như:

Viêm da tiết bã: Là bệnh viêm da mạn tính do vi nấm Pityrosporu ovale

gây nên, thường gặp ở người da nhờn Da xuất hiện những mảng hồng ban, có vảy màu trắng hoặc vàng đỏ, thường đóng mỡ, đóng mày nhờn và ướt

Viêm tắc nang lông: Biểu hiện bằng nổi sẩn màu như màu da hoặc hơi

sậm, đôi khi đen, nổi cao hơn mặt da, trên có thể có vảy nhỏ, không ngứa, không

đau ở chân các sợi lông

Mụn trứng cá: Do sự tăng tiết bã từ tuyến bã nhờn, chất bã ứ đọng lại đầu

lỗ nang lông, kết hợp với tế bào sừng đã tróc ra, tạo nút nhỏ ở đầu nang lông, chất nhờn không thông thoáng dễ nhiễm trùng gây mụn mủ [10], [21], [27]

1.2.2 Các phương pháp và sản phẩm điều trị dùng trên da hiện nay

Ngày nay, có nhiều phương pháp và sản phẩm điều trị các bệnh về da nhưng đều dựa trên một số nguyên tắc chung Trước hết phải loại bỏ dị nguyên, tránh tiếp xúc hay có biện pháp bảo vệ khi phải tiếp xúc với chất nghi ngờ gây kích thích Dùng các dược phẩm, mỹ phẩm trên da có khả năng điều trị (dược phẩm), bảo vệ, chăm sóc điều chỉnh sự mất cân bằng sinh lý da (mỹ phẩm)

Các hoạt chất dùng trên da thường gặp:

Hoạt chất tổng hợp: Thuốc kháng dị ứng (clorpheniramin, calamin),

corticoid (betamethason, hydrocortison,…), thuốc kháng khuẩn (bacitracin, gentamicin…), thuốc trị tăng tiết bã (benzalkonium chlorid, selenium sulfid…), chất bảo vệ da (ceramid, glycerin, acid lactic…), thuốc khử trùng và sát trùng da

Hoạt chất chiết xuất thiên nhiên: Là các chiết xuất từ cây cỏ như tinh dầu

Hoa hồng, tinh dầu Cỏ thi, tinh dầu Dương cam cúc,… các dịch chiết toàn phần từ cây Lô hội, Cà chua, Dương cam cúc, Dưa leo, Yến mạch, Đậu nành,…

Ngoài ra còn có những biện pháp giữ ẩm cho da dùng kem giữ ẩm, tắm dầu, sản phẩm làm mềm da Phối hợp điều trị bằng nhiều phương pháp (thuốc uống, sản phẩm dùng trên da, thủy liệu pháp, quang liệu pháp, chiếu laser, điện di ion,…), phối hợp nghỉ ngơi và có chế độ ăn uống phù hợp [46] Dùng thử nghiệm dán hay châm kim trên da có thể giúp tìm ra các nguyên nhân gây dị ứng do tiếp xúc hay thử máu tìm IgE [10]

1.3 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT BẰNG CO2 SIÊU TỚI HẠN

1.3.1 Chiết xuất tinh dầu bằng CO2 siêu tới hạn

1.3.1.1 Nguyên lý của phương pháp chiết xuất sử dụng CO 2 siêu tới hạn

Nguyên lý chiết xuất sử dụng CO2 SCF có thể được giải thích bằng biểu đồ

pha (hình 1.6) [13], [31], [40], [47], [75]

Nhiệt độ ( o C) 31,1 o C

Áp

Suất

pha của CO 2 siêu tới hạn [12]

Vượt quá điểm tới hạn CO2 tồn tại ở trạng thái siêu tới hạn, nó có đặc điểm của cả chất lỏng và chất khí Ở trạng thái này, CO2 có khả năng khuếch tán và độ nhớt của một chất khí, trong khi tỉ trọng của nó vẫn tương đương với tỉ trọng của một chất lỏng, đây là đặc tính lý tưởng để tạo ra một dung môi ưu việt có thể thích hợp để chiết xuất các hoạt chất [13], [39], [41], [76], [77], [79]

Phương pháp CO2 SCF được dùng nhiều trong công nghệ dược phẩm [64]

1.3.1.2 Qui trình chiết xuất tinh dầu Dương cam cúc

Sơ đồ qui trình chiết tinh dầu Dương cam cúc bằng CO 2 siêu tới hạn

Sơ đồ 1.1 Qui trình

chiết tách bằng dung môi siêu tới hạn [12]

Nguyên lý chiết xuất tinh dầu Dương cam cúc

Bột hoa DCC được chuyển vào bình chiết chịu áp, áp suất bình chiết tăng dần Khí CO2 cũng được bơm vào bình chiết bằng thiết bị chuyên dụng Điều chỉnh các thông số nhiệt độ (từ 30-40 oC), áp suất lần lượt là (100, 120, 160, 230 bar), tốc độ dòng lần lượt là (1,67x10-5 kg/s, 3,33x10-5 kg/s), thời gian thực hiện

10 giờ

Sau thời gian qui định, CO2 lỏng thẩm thấu vào nguyên liệu và chiết xuất hoạt chất Van giới hạn được mở chuyển CO2 lỏng cùng hoạt chất được chiết vào bình thu Hoạt chất thu được là hỗn hợp tinh dầu và sáp Sử dụng tách phân đoạn để tách tinh dầu ra khỏi sáp CO2 được thu hồi [80]

Scalia, S và cộng sự (Ý) [85] đã so sánh thành phần và hàm lượng của các chất chính trong tinh dầu DCC với hai phương pháp chiết xuất tinh dầu là cất kéo hơi nước và CO2 SCF Kết quả được thể hiện qua bảng 1.4

Bảng 1.4 So sánh tinh dầu Dương cam cúc cất kéo hơi nước và CO 2 siêu tới hạn bằng GC/MS [48], [85]

Hàm lượng tinh dầu (%) Chất chiết CO2 SCF Cất kéo hơi nước β-farnesen 9,6 12,8 Germacrene-D 1,0 2,6

Các thành phần trong tinh dầu chiết xuất bằng 2 phương pháp cơ bản là

giống nhau chỉ khác nhau về tỷ lệ các thành phần

1.3.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình chiết tinh dầu Dương cam cúc

Ảnh hưởng của áp suất và nhiệt độ

Trong thực tế dung môi CO2 siêu tới hạn dùng để chiết tách thường trong khoảng nhiệt độ lớn hơn nhiệt độ tới hạn 1-2 lần, áp suất lớn hơn áp suất tới hạn khoảng 3,5 lần Vậy có thể điều chỉnh áp suất và nhiệt độ để thay đổi tỉ trọng nhằm thay đổi khả năng hòa tan của dung môi siêu tới hạn

Khả năng nén cao của CO2 siêu tới hạn làm cho việc thay đổi tỉ trọng dễ dàng, điều này giúp cho việc tách chiết có lựa chọn một hay nhiều thành phần ra khỏi dược liệu [12], [57], [62], [75], [83]

Ảnh hưởng của thời gian chiết xuất

Việc bảo đảm sự tiếp xúc tối đa của nguyên liệu chiết xuất và dung môi là rất quan trọng trong quá trình chiết xuất với dung môi siêu tới hạn

Povh, P N và cộng sự [80] đã xác định thành phần và hàm lượng các chất trong tinh dầu chiết được bằng sắc ký khí tại 100 bar, 30 oC và 1,67x10-5 kg/s theo thời gian 30 phút hàm lượng α–bisabolol là 10%, 300 phút là 10,62%, 600 phút lên tới 20,89%

Ảnh hưởng của tốc độ dòng dung môi

Tốc độ chảy của dung môi siêu tới hạn thấm vào tế bào dược liệu có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất chiết Tốc độ dòng phù hợp, dung môi vừa thấm sâu vào tế bào nguyên liệu, giúp tăng hiệu suất chiết, vừa tiết kiệm thời gian [76]

Ảnh hưởng của chất hỗ trợ

Chất hỗ trợ cho thêm vào dung môi chiết xuất với một số mục đích như gia tăng tính thẩm thấu của dung môi vào dược liệu hay làm thay đổi tính tan của hoạt chất trong dung môi vì thay đổi tính phân cực của dung môi [85]

Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu

Nói chung, việc giảm kích thước nguyên liệu trong qui trình chiết với dung môi siêu tới hạn có thể làm tăng diện tích tiếp xúc giữa dược liệu và dung môi, tuy nhiên cũng không loại trừ khi kích thước quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng vón cục làm giảm hiệu suất chiết [80]

1.3.2 Chiết xuất flavonoid bằng CO2 siêu tới hạn

1.3.2.1 So sánh chiết xuất flavonoid bằng CO 2 siêu tới hạn với một số phương pháp khác

Scalia S và cộng sự (Ý) [85] đã nghiên cứu và so sánh việc chiết xuất các flavonoid từ DCC bằng dung môi siêu tới hạn với các phương pháp chiết xuất truyền thống như phương pháp ngâm, chiết Soxhlet, kết quả cho thấy, hàm lượng flavonoid (apigenin) thu được bằng phương pháp CO2 SCF ở điều kiện áp suất

200 atm, nhiệt độ 40 oC trong 30 phút là 71,4% so với phương pháp chiết bằng Soxhlet thực hiện trong 6 giờ và gấp 124,6% so với phương pháp ngâm thực hiện trong 3 ngày Các số liệu này được xác định bằng phương pháp SKLHNC

1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến qui trình chiết flavonoid

Nhiều thông số ảnh hưởng lên quá trình chiết flavonoid TP khi dùng phương pháp CO2 SCF (xem mục 1.3.1.3), nhưng yếu tố dung môi hỗ trợ là ảnh hưởng quan trọng nhất

Ảnh hưởng của các dung môi hỗ trợ

Khả năng hòa tan trong dung môi siêu tới hạn tăng lên khi thêm một lượng nhỏ chất hỗ trợ (1-5% mol) Vai trò của chất này làm tăng độ phân cực của dung môi và độ tương tác mà không thay đổi tỉ trọng và khả năng nén của dung môi siêu tới hạn ban đầu [62]

S Scalia và cộng sự (Ý) [85] cũng đã chiết xuất apigenin-7-glucosid với CO2 SCF cho thấy không có hiệu quả cao khi chiết xuất bằng CO2 tinh khiết Hiệu suất được cải thiện rõ rệt khi bổ sung methanol 5% vào bình chiết vì tăng độ hoà tan của apigenin và apigenin-7-glucosid Thử nghiệm được tiến hành

ở 200 atm, 45 oC, 5% methanol trong CO2 SCF Kết quả hàm lượng glucosid tăng từ 1,1% (không có methanol) tăng lên 19,5% Qui trình có thể thay đổi bằng ethanol, propylen glycol

apigenin-7-Ảnh hưởng của nước

Nước chứa trong mẫu dược liệu thường có ảnh hưởng đến quá trình chiết Theo một nghiên cứu, lượng nước mặc dù chỉ hòa tan với tỷ lệ ≈ 0,3% trong CO2 SCF nhưng có khả năng làm tăng tính phân cực của dung môi và làm tăng hiệu suất chiết những hoạt chất tan tốt trong dung môi tương đối phân cực [66]

1.4 KỸ THUẬT BÀO CHẾ KEM THUỐC

1.4.1 Đại cương

Kem bôi da là dạng thuốc mỡ có thể chất mềm, mịn do trong thành phần có hàm lượng lớn các chất lỏng, thường có cấu trúc nhũ tương D/N hay N/D [5] Yêu cầu của kem thuốc dùng trên da là phải có khả năng điều trị các bệnh lý trên da, không gây kích ứng da, làm dịu da Thể chất phải thích hợp, tạo cảm giác tốt, không gây cảm giác trơn nhờn, rít khi bôi, thấm tốt và dễ rửa

1.4.2 Tá dược

1.4.2.1 Yêu cầu của tá dược

Phải có tính an toàn trên da, không gây kích ứng da, không có thành phần gây nhân mụn, tắc tuyến bã Có khả năng giữ độ ẩm và độ đàn hồi cho da

Một số tá dược tiêu biểu là dẫn xuất từ dầu oliu dùng trong sản phẩm trên

da được ưa chuộng vì có tính chất làm dịu chứng viêm da, có tính giữ ẩm bằng cách hút ẩm từ môi trường bên ngoài mà không làm ảnh hưởng đến các chức năng như bài tiết và thay da [1]

Trong thực tế, khi thiết kế xây dựng công thức, cần chú ý tới đặc tính tá dược vì có ý nghĩa lớn đối với mức độ, tốc độ giải phóng dược chất cũng như hấp thu qua da Tuỳ thuộc vào bản chất của tá dược có thể làm thay đổi sinh khả dụng của thuốc [5], [36], [84], [98]

1.4.2.2 Một số tá dược dùng điều chế kem

Tá dược olivem 1000, chất ổn định pha dầu đều là dẫn chất của dầu oliu

Ưu điểm kỹ thuật của các tá dược

Chất nhũ hoá đơn cho hệ dầu trong nước với cấu trúc tinh thể lỏng Khi

phân tán trong nước, những mạch nguyên tử dài có thể tạo thành một mạng lưới loại matrix tương tự như việc tạo hệ keo, dầu không bị bao bọc lại mà được giữ trong hệ thống, không phân tán giống như các hệ nhũ hoá trước đây nhờ những liên kết hydro bên trong phân tử Giữ và giải phóng hoạt chất tốt Olivem 1000 tạo thể chất gel trong nước

Chất ổn định pha dầu trong hệ D/N, có cấu trúc tinh thể lỏng, có khả năng sắp xếp lại cấu trúc nhũ tương, có tính lưu biến cao, kết hợp tốt với các tá dược Thích hợp với những hoạt chất khác nhau trong một khoảng pH rộng từ khoảng 3-12 Kết hợp tốt với tá dược mỡ, sáp khác

Các kết quả thử nghiệm cho thấy các tá dược nêu trên có độ an toàn cao không làm kích ứng da, làm dịu da qua thử nghiệm tế bào hồng cầu (phòng thí nghiệm), thử nghiệm dán trên người tình nguyện cho kết quả tốt

1.4.3 Kỹ thuật bào chế kem thuốc

Có nhiều phương pháp bào chế kem dạng nhũ tương nhưng phương pháp hay được sử dụng là phương pháp nhũ hóa trực tiếp Việc chọn chất nhũ hóa và sử dụng lực gây phân tán thích hợp được chú ý trong phương pháp này [5]

Chất lượng của kem bị ảnh hưởng nhiều của các yếu tố kỹ thuật trong bào chế Phương pháp bào chế có ý nghĩa rất căn bản đối với tốc độ giải phóng của dược chất ra khỏi tá dược Các điều kiện sản xuất, máy móc như nhiệt độ, thời gian nóng chảy của pha dầu, thời gian và tốc độ đồng nhất hoá (khuấy trộn), thời gian làm mịn, máy hút không khí, có ý nghĩa đối với quá trình phân tán hay hòa tan dược chất vào trong hệ đồng nhất [5]

Các yếu tố kỹ thuật ảnh hưởng đến quá trình bào chế kem

Nhiệt độ

Nhiệt độ nóng chảy của pha dầu và pha nước có thể ảnh hưởng đến tính chất

kem, đặc biệt nếu pha dầu có nhiệt độ nóng chảy gần với nhiệt độ đông đặc thì có thể dẫn đến sự kết tinh các thành phần trong pha dầu khi kết hợp với pha nước Mặt khác, sự dễ kết tinh này có thể làm mất đi một số thành phần các chất trong công thức qua các ống dẫn (trong hệ thống sản xuất) làm thay đổi số lượng cũng như chất lượng thành phẩm được hình thành Nhiệt độ nóng chảy cao trong thời gian dài có thể làm phân huỷ một số thành phần các chất, làm thay đổi sự bền vững hóa học của pha dầu

Grossmann A và cộng sự (Đức) [58] thực hiện trên 2 lô kem placebo thử nghiệm (PEG-5-glycerylstearat (Arlatone 983S), hỗn hợp của glycerylstearat, cetearylalcohol, cetylpalmitat và cocoglycerid (Cutina CBS) và cetearyl octanoat), mỗi lô khối lượng 1 kg, được làm ở qui mô phòng thí nghiệm ở hai điều kiện nóng chảy 65 oC trong 30 phút và 90 oC trong 210 phút Ở điều kiện đầu sự nóng chảy không hoàn toàn, điều kiện sau đạt được sự nóng chảy hoàn toàn nhưng lại có sự phân hủy hóa học Nhiệt độ nóng chảy thường được đề nghị là 70-75 oC cho nhiều loại tá dược

Một yếu tố khác cần lưu ý là thiết bị đun chảy pha dầu cần bộ phận điều nhiệt đều để tạo sự đồng nhất và đảm bảo các thành phần tan chảy hoàn toàn

Tốc độ khuấy trộn, làm mịn

Đây là yếu tố quan trọng trong việc phân tán pha dầu vào pha nước, quyết định hình thành kem, gel nhũ tương đạt yêu cầu có độ mịn, độ bền thích hợp

Tốc độ khuấy phụ thuộc vào qui mô bào chế như ở qui mô phòng thí nghiệm, qui mô pilot, qui mô sản xuất công nghiệp Ví dụ ở qui mô phòng thí nghiệm 1 kg thành phẩm có độ nhớt 1460 cPs, tốc độ khuấy trộn 1000-2000 vòng/phút, tốc độ làm mịn 5-10 m/s Ở qui mô pilot cho 40 kg có độ nhớt khoảng 1520-1550 cPs, tốc độ khuấy trộn 3000-5000 vòng/phút, tốc độ làm mịn khoảng