Tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPSCs) bây giờ có thể được sản xuất từ nhiều tế bào soma (SC) dòng bằng cách biểu hiện ngoài tử cung trong bốn yếu tố phiên mã. Mặc dù các thủ tục đã được chứng minh để tạo ra sự thay đổi toàn cầu trong gen và biểu microRNA và thậm chí sửa đổi biểu sinh, nó vẫn là một bí ẩn lớn như thế nào yếu tố gây ra phiên mã này reprogramming ảnh hưởng đến tổng số tiết mục polisacarit thể hiện trên các tế bào. Ở đây chúng ta thực hiện một phân tích toàn diện polisacarit sử dụng 114 loại iPSCs con người tạo ra từ năm khác nhau SC và so glycomes của họ với những tế bào gốc phôi người (ESCs; chín loại tế bào) bằng cách sử dụng một mật độ cao lectin microar ray. Trong phân tích cụm không giám sát các kết quả thu được bằng lectin microarray, cả iPSCs không phân định ESCs được nhóm là một nhóm lớn. Tuy nhiên, họ rõ ràng đã sepa đánh giá từ các nhóm SCS biệt, trong khi tất cả bốn SCS có hồ sơ glycome dường như khác biệt với nhau, chứng minh rằng SC với hồ sơ ban đầu polisacarit biệt đã thu được những giống ESCs khi cảm ứng
TIỂU LUẬN Glycome Chẩn đoán người Induced Cells Pluripotent Stem Sử dụng lectin Microarray TỔNG QUAN Tế bào gốc đa cảm ứng (iPSCs) sản xuất từ nhiều tế bào soma (SC) dòng cách biểu tử cung bốn yếu tố phiên mã Mặc dù thủ tục chứng minh để tạo thay đổi toàn cầu gen biểu microRNA chí sửa đổi biểu sinh, bí ẩn lớn yếu tố gây phiên mã reprogram- ming ảnh hưởng đến tổng số tiết mục polisacarit thể tế bào Ở thực phân tích toàn diện polisacarit sử dụng 114 loại iPSCs người tạo từ năm khác SC so glycomes họ với tế bào gốc phôi người (ESCs; chín loại tế bào) cách sử dụng mật độ cao lectin microar- ray Trong phân tích cụm không giám sát kết thu lectin microarray, iPSCs không phân định ESCs nhóm nhóm lớn Tuy nhiên, họ rõ ràng sepa- đánh giá từ nhóm SCS biệt, tất bốn SCS có hồ sơ glycome dường khác biệt với nhau, chứng minh SC với hồ sơ ban đầu polisacarit biệt thu giống ESCs cảm ứng ripotency plu- Ba mươi tám lectins phân biệt đối xử SC iPSCs / ESCs lựa chọn thống kê, tính đặc trưng nhà nước đa sau thu cấp độ glycome lar cellu- Các biểu gen có liên quan đồng ý glycosyltransferaza tốt với kết thu lectin microarray Trong số 38 lectin, rBC2LCN tìm thấy để phát undiffer- entiated iPSCs / ESCs SCS không phân biệt Do đó, mật độ cao lectin microarray chứng minh có hiệu lực không com- phân tích toàn diện polisacarit mà chẩn đoán tế bào gốc theo khái niệm glycome di động Tăng ý trả tiền để iPSCs ESCs pluripotency họ ứng dụng y tế (1, 2) nhiên thành lập hệ thống đánh giá mạnh mẽ tài sản họ, bao gồm phân biệt xu hướng nguy tamination góp xenoantigens chí khả sis tumorigene-, bị cản trở thiếu phương pháp toàn diện trực tiếp áp dụng để nhắm mục tiêu tế bào gốc, điều vấn đề lên cần thiết cho việc sử dụng an toàn iPSCs y học tái tạo Từ nhiều khía cạnh, polisacarit bề mặt tế bào xem xét việc đến khía cạnh mục tiêu lý tưởng để phân tích xác định loại pheno- tế bào cách trực tiếp lý sau (3,4) (a) polysacarit nằm bề mặt tế bào (b) Tổng tiết mục polysacarit bề mặt tế bào khác cấp tổ chức sinh học (tức loài, mô, loại tế bào, ecules mol-) (c) thay đổi toàn cầu glycome di động xảy trình phát triển, hoạt hoá tế bào, phân biệt, chuyển đổi Nant malig-, viêm Do đó, lon gly- bề mặt tế bào gọi "chữ ký di động" phản ánh chặt chẽ nguồn gốc điều kiện di động, có lẽ họ thực hoạt động tế bào-to-cell trung gian tượng sinh học sive mở rộng cho Tính chất polysacarit nên hiểu với thực tế họ không mã hóa trực tiếp hệ gen tạo hệ thống phức tạp số glycosidases glycosyltransferases, mà biểu thức hoạt động bị ảnh hưởng đáng kể hai thay đổi môi trường nội bào ngoại bào Thật vậy, phân tử bề mặt tế bào, chẳng hạn gens giai đoạn cụ thể phôi chống (SSEA1 -3/4) (5) kháng nguyên khối u từ chối (Tra-1-60 Trà-1-81) (6-8) sử dụng rộng rãi glycobiomarkers để đánh giá pluripotency Đáng ý, nhiên, "đại diện quyền lợi kịp thời" glycomarkers xác định sau phát triển itous thay fortu- kháng thể đặc hiệu họ, hầu hết cấu trúc carbohydrate kháng nguyên mam- mals Trong bối cảnh này, hệ thống tìm kiếm cần thiết để vẽ tranh toàn cảnh glycome tế bào gốc khai thác hiệu sinh học tế bào gốc (8, 9) Ví dụ, phát triển biệt hóa đạo tế bào gốc để hệ cháu dòng dõi cụ thể tế bào có vấn đề Hiểu tế bào gốc liên lạc với tế bào trung chuyển qua polisacarit bề mặt tế bào dẫn đến thiết kế hợp lý hệ thống văn hóa cụ thể Tuy nhiên, glycome mục tiêu khó khăn để ngăn dict dựa sở liệu gen trình thetic biosyncủa gốc thuốc polisacarit glycoprotein mẫu định hướng phụ thuộc vào nhiều đường enzyme petitive cạnh Trong ý nghĩa này, hệ thống nhanh chóng nhạy cảm cho phép giám sát trực tiếp polysacarit bề mặt tế bào điều cần thiết Một số phương pháp phát triển để phân tích polisacarit dựa nguyên tắc hóa lý, chẳng hạn tography chroma- lỏng khối phổ (10 -12) Lectin microarray công nghệ thay cho glycomics cấu trúc, nơi bảng điều khiển lectin với nhiều đặc điểm riêng polisacarit ràng buộc in microarray, cung cấp tảng linh hoạt cho việc phân tích thông nhanh cao cấu trúc polisacarit mà không eration lib- glycan (13, 14 ) Lectin lớp giải mã mole- cules polysacarit bề mặt tế bào phân bố khắp sinh vật, mà trung gian chức khác thông qua định nghĩa recogglycan cụ thể Giao thức phân tích sử dụng lectin microarray phát triển với nhiều loại mẫu khác nhau: oligosaccharides miễn phí (14,15), phần mô (16), màng tế bào phân số kỵ nước (17, 18), chí toàn tế bào (19, 20) Công nghệ vừa bắt đầu áp dụng cho loạt nghiên cứu sinh học, bao gồm virus profiling (21) hồ sơ di động (17, 20), phát triển ung thư glycobiomarkers (22-24) Đối với tế bào nộp đơn trình, 100 ng protein phần kỵ nước đủ cho phân tích (25, 26) Xử lý liệu thủ tục malization chuẩn tắc tối ưu hóa để đảm bảo việc giải thích đắn liệu (25, 26) Gần đây, dem- onstrated lectin microarray áp dụng để ngăn chặn tế bào (27, 28), chưa đạt kết luận rõ ràng cách thay đổi glycome di động cảm ứng tency pluripo- Hơn nữa, khả ứng dụng thực tế công nghệ để kiểm soát chất lượng tế bào gốc chưa biết rõ Ở đây, phát triển tảng tiên tiến mật độ cao lectin microarray với số lượng tăng lên lectin thăm dò (96 lectin) để mở rộng phạm vi bảo hiểm glycome để so sánh xác glycomes tế bào gốc khác Một khảo sát có hệ thống glycome di động sau thực 135 loại tế bào tổng số, bao gồm iPSCs (114 loại tế bào) ESCs (chín loại tế bào) Thông qua phân tích toàn diện này, có chứng mạnh mẽ tất bốn SCS với hồ sơ ban đầu polisacarit biệt thu giống ESCs tion induc- pluripotency Chúng nhận thấy đặc điểm cấu trúc com- mon để iPSCs ESCs, tương ứng tốt với kết phân tích biểu gen glycosyltransferases Cuối cùng, chứng minh khả áp dụng lectin microarray chẩn đoán tế bào gốc nhiều yếu tố, có phân biệt đối xử tế bào không phân biệt khác biệt phát ô nhiễm xenoantigen, Gal epitope Các tế bào nội mạc tử cung-(UTE) (29), động mạch thai endothe- lium (PAE) (30), màng ối (AM) (31, 32) thành lập cách độc lập UTE, AM, MRC5 tế bào trì thời gian trung POWEREDBY10 (MED SHIROTORI CO., Ltd) Các tế bào nuôi cấy PAE EGM-2mV BulletKit (Lonza) có chứa 5% FBS IPSCs người từ UTE, PAE, AM tế bào quát erated theo thủ tục mô tả Yamanaka đồng nghiệp (1) có sửa đổi chút (27, 28, 33) Các iPSCs bắt nguồn từ MRC5, Ute, PAE, AM tế bào trì iPSellon trung bình (Cardio Inc.) bổ sung với 10 yếu tố ng / ml tái tổ hợp người tăng trưởng nguyên bào sợi (Wako Tinh Khiết Chemical Industries, Ltd) tế bào trung chuyển MEF chiếu xạ tế bào hiPS201B7 hiPS253G1 trì DMEM / F-12 vừa (Invitrogen) có bổ sung 20% KSR (InvitRogen), 0,1 mM 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), axit tối thiểu cần thiết vừa không cần thiết amin (Invitrogen), 5-10 ng / ml tái tổ hợp người FGF (Wako) tế bào nguyên bào sợi trung chuyển phôi chuột Mycin mito- C điều trị ESCs tạo trì mô tả trước (34) Lectin-lectin từ nguồn tự nhiên (58 lectin) pur- đuổi từ J-DẦU MILLS, Vector Laboratories, EY Laborato- Ries, Seikagaku Corp (xem danh sách lectin Bảng bổ sung S2) Lectins tái tổ hợp chuẩn bị sau Một thời gian ngắn, gen lĩnh vực nhận dạng carbohydrate nhân vô tính thành pET27b (Stratagene) biểu mức Escherichia coli BL21CodonPlus (DE3) -RIL căng thẳng kiểm soát isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (Fermentas Hanover) nhiệt độ thích hợp Tất lectins tái tổ hợp tinh chế sắc ký lực sử dụng phù hợp đường cố định Sepharose 4B-CL (GE Healthcare) dựa đặc tính ràng buộc polisacarit lectin Sau họ thẩm tách chống pha loãng PBS (nồng độ cuối 2.5 mM phate phospho đệm chứa 0.015 M NaCl) Tion nồng độ protein xác định xét nghiệm protein BCA (Bio-Rad) Lectin đông khô bảo quản nhiệt độ ° C sử dụng Độ tinh khiết kiểm tra SDS-PAGE sắc ký lọc gel Shodex PROTEIN KW-802,5 (Shodex) Các hoạt động ràng buộc glycan độ đặc hiệu phân tích hoạt động hemagglutinating sử dụng 4% hồng cầu thỏ, lực trán tography chroma- (35), glycoconjugate microarray (36) Lectin Microarray Sản xuất-The microarray lectin sản xuất mô tả trước với thay đổi nhỏ (14, 15) Năm mươi tám lectins tự nhiên 38 lectins tái tổ hợp (xem Bảng bổ sung S2 cho danh sách lectin) hòa tan nồng độ 0,5 mg / ml dung dịch đốm (Matsunami Glass) phát lên lam kính epoxysilane-kẽm (Schott) ba lần sử dụng không tiếp xúc in microarray robot (MicroSys4000, Genomic Solutions) Các slide kính sau ủ 25 ° C qua đêm phép lectin immobi- lization Sau slide kính lectin-cố định rửa với thăm dò đệm (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 140 mM NaCl (TBS) có chứa 2,7 mM KCl, mM CaCl2, mM MnCl2, 1% Triton X-100) ủ với chặn thuốc thử N102 (NOF Co.) 20 ° C Cuối cùng, slide kính lectin-cố định rửa với TBS có chứa 0,02% NaN bảo quản nhiệt độ ° C sử dụng Chất lượng chỗ tái sinh chip sản xuất kiểm tra trước sử dụng, sử dụng đầu dò kiểm tra Cy3-dán nhãn có chứa 250 g / ml asialofetuin (SigmaAldrich), 25 ng / ml Sia 2-3Gal 1- 4GlcNAc-BSA (Dextra), 10 ng / ml Fuc 1-2Gal 1-3GlcNAc 1-3Gal 1- 4Glc-BSA (Dex- tra), 10 ng / ml GlcNAc-BSA (Dextra), 10 ng / ml GalNAc 1-3 (Fuc 1-2) Gal-BSA (Dextra), 10 ng / ml Gal 1-3Gal 1-4GlcNAc-BSA (Dextra), 10 ng / ml Man 1-3 (Man 1- 6) Man- BSA (Dextra ), 10 ng / ml Fuc-BSA (Dextra), 10 ng / ml GalNAcBSA (Dextra), 10 ng / ml Sia 2- 6Gal 1- 4Glc-BSA (Dextra) hòa tan thăm dò đệm Phân số lectin Microarray Phân tích-kỵ chuẩn bị cách sử dụng CelLytic chiết protein trung bình cần thiết tối thiểu (Sigma-Aldrich) phù hợp với thủ tục turer manufac (25, 27) Sau định lượng protein cách sử dụng thử nghiệm BCA (Thermo Fisher Scientific), phần kỵ nước huỳnh quang dán nhãn với Cy3 nhuộm monoreactive (GE Healthcare), dư thừa Cy3 gỡ bỏ với Sephadex G-25 cột -khử muối (GE Healthcare) Sau điều chỉnh nồng độ protein đến g / ml với PBST (10 mM PBS, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% Triton X-100), phần nhỏ kỵ dán nhãn với Cy3 NHS este (GE Healthcare ) Sau pha loãng với thăm dò đệm 0,5 g / ml, phần kỵ nước Cy3-dán nhãn áp dụng cho microarray lectin ủ 20 ° C qua đêm Sau rửa với prob- ing đệm, hình ảnh huỳnh quang thu thập cách sử dụng máy quét nescent eva- trường kích hoạt huỳnh quang (GlycoStationTM đọc 1200; GP BioSciences) Các tín hiệu huỳnh quang vị trí định lượng cách sử dụng mảng Pro Analyzer phiên 4.5 (Media khiển học, Bethesda, MD), giá trị tảng trừ Các giá trị lấy từ khu vực mà không lectin cố định Các tín hiệu lectin điểm cate tripli- tính trung bình bình thường hóa với giá trị trung bình 96 lectins bất động mảng Một xét nghiệm ức chế thực cách ủ Cy3-dán nhãn phân màng tế bào MEF (# 1) MRC5-iPS # 25 (P22) (# 13) với mảng vi lectin trường hợp có mặt 100 g / ml Gal 1-3Gal 1- 4GlcNAc-PAA (danh mục 01-079, Gly- COTECH) PAA tiêu cực kiểm soát (không có danh mục 01-000, Glycotech) Phân tích biểu gen-RNA tổng số tách chiết từ mẫu cách sử dụng ISOGEN (NipponGene) Các mô hình biểu gen toàn cầu theo dõi cách sử dụng Agilent toàn bộ gen chip microarray người (G4112F) với màu (cyanine 3) thuốc nhuộm Microarray bao gồm 41.000 gen người trưng ized bảng điểm Trong số 41.000 tàu thăm dò, 16.483 tàu thăm dò đại diện tương ứng với gen kiểm soát chất lượng độc đáo microarray sử dụng để phân tích sau (37) Cụm kê-có giám sát thực cách sử dụng phương pháp trung bình liên kết cách sử dụng cụm 3,0 đồ mềm Các đồ nhiệt với phân nhóm mua lại cách sử dụng Java Treeview Sự khác biệt hai liệu tùy ý đánh giá t kiểm tra học sinh để tín hiệu lectin sử dụng SPSS kê 19 (SPSS) Đáng kể tín hiệu lectin khác biểu glycosyltransferaza lựa chọn họ thỏa mãn tỷ lệ lỗi familywise (FWER) theo phương pháp Bonferroni 0,001 Phân tích ImmunocytochemistryImmunocytochemical thực mô tả trước (29, 33, 38) IPSCs người cố định với 4% paraformaldehyde PBS 10 phút nhiệt độ ° C Sau rửa với 0,1% Triton X-100 PBS (PBST), tế bào prehybridized việc ngăn chặn đệm cho 1-12 h ° C sau ủ -12 h ° C với kháng thể sau: chống -SSEA4 (1: 300 pha loãng; Chemicon), anti-TRA-1-60 (1: 300; Chemicon), anti-Oct4 (1:50; Santa Cruz Biotech-nology, Inc.), anti-Nanog (1: 300; ReproCELL), chống Sox2 (1: 300; Chemicon) Các tế bào sau ủ với chống thỏ IgG, chống chuột IgG IgM anti-chuột liên hợp với Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 546 (1: 500; dò phân tử) việc ngăn chặn đệm cho h nhiệt độ phòng Các tế bào counterstained với DAPI sau gắn đèn antifade SlowFade (đầu dò phân tử) Hình thành u quái-Teratoma thực de- tả trước (1, 2) 1: hỗn hợp iPSC đình tầng hầm màng ma trận người (BD Biosciences) cấy da mức 1.0 107 tế bào / trang web vào suy giảm miễn dịch, không bị béo phì mắc bệnh tiểu đường / nặng kết hợp chuột nodeficiency miễn dịch U quái phẫu thuật mổ xẻ -12 tuần sau thụ tinh cố định với 4% formaldehyde para- PBS nhúng parafin Các phần củaM dày 10 nhuộm màu với hematoxylin-eosin.Glycoconjugate Microarray Phân tích-Glycoconjugate mi- croarray sản xuất phân tích thực mô tả trước (36) Một thời gian ngắn, glycoprotein hợp chất amide glycosidepolyacryl- hòa tan dung dịch đốm Matsunami nồng độ cuối 0,5 0,1 mg / ml, respec- nhiễm Sau lọc, họ phát epoxy- Schott tráng slide kính cách sử dụng Microsys không tiếp xúc in microarray robot Lectins Cy3-dán nhãn hòa tan dung thăm dò (10 g / ml) áp dụng cho buồng microarray glycoconjugate (100 l / giếng) ủ 20 ° C qua đêm Sau rửa phòng với giải pháp thăm dò, hình ảnh huỳnh quang mua lại cách sử dụng trăm trường kích hoạt máy quét huỳnh quang evanes-, GlycoStationTM đọc 1200, chế độ Cy3 Dữ liệu phân tích với phiên Pro Mảng phân tích 4.5 (Media khiển học, Inc.) Giá trị cường độ net cho vị trí xác định cường độ tín hiệu trừ giá trị Các tín hiệu lectin điểm cate tripli- tính trung bình bình thường với cường độ tín hiệu cao số 98 glycoconjugates bất động mảng KẾT QUẢ Phát triển mật độ cao lectin Microarray-Để tăng glycome bảo hiểm phạm vi lựa chọn lectins phù hợp để đánh giá tế bào gốc, trước tiên tăng số lượng lectins cố định 43-96, num lượng lớn lectin cố định báo cáo ( 39) Với mục đích này, tins lec- với cấu trúc xác định lần phân loại thành gia đình lectin với giàn giáo protein khác Chúng sau chọn hộp lec- từ gia đình lectin khác nhau, có ý định để trang trải phạm vi rộng đặc điểm riêng ràng buộc polisacarit Đặc biệt, tăng lectins cụ thể để sửa đổi thiết bị đầu cuối, Sia Fuc, mà thường xuyên thay đổi đáng kể tùy thuộc vào tính chất tế bào Đối với sản xuất lectin tái tổ hợp, hệ thống biểu E coli lựa chọn để tránh glycosyl hóa hộp thiếc đựng lecsản xuất, mà gây không đặc hiệu ràng buộc để ecules mol- lectin giống mẫu khách quan Các lectins tái tổ hợp tạo tinh chế sắc ký lực cách sử dụng đường cố định Sepharose thích hợp Các đặc glycanbinding 96 lectin sử dụng nghiên cứu phân tích lyzed glycoconjugate microarray (bổ sung hình S1 Bảng S1; Cũng thấy "Thủ tục Experimental") (36) số lượng nhiều hơn, mối quan hệ trực diện sắc ký (xem sở liệu lectin Frontier Trang Web) (35, 40) Ificities phổ kế họ đánh giá theo hai phương pháp phân tích tóm tắt ngắn gọn bổ sung Bảng S2 96 lectins phát lên lam kính epoxy-kích hoạt trinh sát không tiếp xúc (bổ sung hình S2), chất lượng họ đánh giá rộng rãi sử dụng đầu dò kiểm tra Cy3-dán nhãn (25) Lô-to-nhiều sai (hệ số biến đổi) nước phát triển mật độ cao lectin microarray xác nhận thấp (0.14) sau hóa normal- trung bình (25) Tái lập trình yếu tố chép gây Dẫn đến toàn cầu đảo chiều xuống cho Nhà nước Pluripotent Cellular Glycome Cấp Well-Sử dụng lectin microarray phát triển, phân tích 135 mẫu tế bào tổng số, có 114 iPSCs,11 SC, chín ESCs, tất từ nguồn gốc người, nguyên bào sợi phôi chuột (MEF) IPSCs người nhìn chung ated từ bốn dòng SC khác nhau: MRC5, AM, Ute, PAE (Bảng bổ sung S3) (28) Chúng phân tích iPSCs người tạo từ nguyên bào sợi da người với bốn (201B7) (1) ba yếu tố phiên mã (253G1) (41) ba dòng tế bào người ESCs (42) Tất iPSCs sử dụng nghiên cứu có hình thái tương tự ESCs, pluripotency họ xác nhận cách nhuộm với dấu mốc thành lập undifferentia- tion (SSEA4, Tra1- 60, Oct4, Nanog, Sox2) DNA microarray (28) Màng tế bào phân số kỵ nước chuẩn bị, glycoprotein chiết xuất sau dán nhãn với Cy3-N-hy- droxysuccinimide ester phân tích lectin microarray (25) Chúng phân tích phần phân đoạn màng tế bào chúng lưu trữ tủ lạnh sử dụng dễ dàng để xử lý, cho phép phân tích toàn diện số lượng lớn mẫu (25, 26) Sau bình-bình thường, liệu thu được phân tích không giám sát cụm phân cấp (Fig 1) Kết là, phân biệt SCS không phân biệt iPSCs / ESCs phân chia rõ ràng thành hai cụm lớn, bốn SCS tách thêm theo nguồn gốc họ Điều SCS (MRC5, AM, Ute, PAE) với hồ sơ polisacarit khác mua lại hồ sơ giống với khác chí để ESCs cảm ứng pluripotency Như vậy, việc tái lập trình phiên mã yếu tố gây tìm thấy để dẫn đến thâu hồi toàn cầu xuống tới trạng thái đa mức glycome tế bào (27, 28) Các tính đặc trưng Glycome Alteration tion Induc- pluripotencyChúng sau kiểm tra chi tiết cách cấu trúc polisacarit thay đổi cảm ứng pluripotency Các liệu trung bình-bình thường xử lý cách t kiểm tra học sinh để chọn lectins thăm dò ý nghĩa phân biệt đối xử SC iPSCs / ESCs (Bảng bổ sung S4) Kết là, 38 lectins lựa chọn với FWER 0.001 Trong số đó, chín cho tín hiệu cao iPSCs SCS, 29 trưng bày tín hiệu thấp Trong số 38 lectin, 35 lectin sau phân thành sáu nhóm dựa đặc điểm riêng ràng buộc polisacarit họ, từ thay đổi polisacarit xảy cảm ứng pluripotency ước tính (Hình 2)., Trong ba lectin với đặc trưng lớn (mầm lúa mì agglutinin ( WGA), chất kết dính Sia; rRSIIL aleuria lectin aurantia (AAL), chất kết dính Fuc rộng) không đưa vào phân loại Ở đây, hộp thiếc đựng lec- với tín hiệu cao iPSCs / ESCs SCS hiển thị bên dòng màu xám, tín hiệu thấp hiển thị bên đường màu đen Các tính đặc trưng cấu trúc polisacarit iPSCs ferentiated undif- / ESCs so với SCS phân biệt tóm lược sau marized 1) Các tín hiệu lectins 6Siaràng buộc (SNA, SSA, TJAI, rPSL1a) tăng lên, người Lectins 2-3Sia-ràng buộc (MAL, rACG, ACG) giảm tương ứng (28) Điều đồng ý với báo cáo trước vious 2- 6-sialylated biểu polisacarit cao không biệt hoá (nhân ESCs) so với tế bào khác biệt (cơ thể embryoid) (43) 2) Trong điều kiện fucosylation, tín hiệu Lectins 1-2Fuc cụ thể (rGC2 rBC2LCN) tăng lên, người 1- lectins 6Fuc cụ thể (LCA, PSA, rPTL) giảm Điều phù hợp với báo cáo gần ESCs người nhuộm màu với chống Globo H (Fuc 1-2Gal 13GalNAc 1-3Gal 1- 4Gal 1- 4Glc) anti-H loại1 (Fuc 1-2Gal 1-3GlcNAc), có kháng nguyên chứa 1-2Fuc (9) 3) Các tín hiệu loại LacNAc (Gal 1-3GlcNAc) -binding lectin (BPL) tăng lên, loại LacNAc (Gal 1- 4GlcNAc) -binding lectin (rLSLN, ECA, RCA120, rCGL2) giảm Điều đồng ý với phát gần loại LacNAc epitope polisacarit công nhận dấu pluripotency tiếng Trà-160 Trà-1-81 (7) 4) Các tín hiệu lectin cụ thể để cắt đôi GlcNAc (Phae), tetra-anten- nary N-glycan (Phal), loại mannose N-glycan cao (Heltuba, rRSL, VVAII, rHeltuba, Heltuba, rBanana, rGRFT, CCA), O-glycan (MPA, HEA, WFA, Jacalin, ABA, Raba, rSRL, rCNL, rDiscoidin II) giảm.Các biểu glycosyltransferases tổng hợp polisacarit đồng ý với kết thu lectin microar- ray (Hình Bảng bổ sung S5.); biểu 2- 6- sialyltransferases (ST6GAL1 -2) (28), ferases 1-2fucosyltrans- (FUT1 -2), glycosyltransferaza yếu tham gia vào trình tổng hợp loại LacNAc (B3GALT5) (28), MGAT5, glycosyltransferaza tham gia vào trình tổng hợp tetra-anten- nary N-glycan, tăng lên, transferases 2-3-sialyl(ST3GAL1, -3, -4, -5), 1- 6- ferase fucosyltrans- (FUT8), glycosyltransferaza liên quan đến việc tổng hợp loại LacNAc (B4GalT1) giảm tương xứng spondingly iPSCs / ESCs so với SC Dựa kết thu lectin DNA microarray, hiểu biểu 2- 6-sialylation, 1-2-fucosylation, loại LacNAc tăng lên, 2-3-sialylation tetra-antennary N -glycans giảm cảm ứng pluripotency (Fig 4) Lựa chọn lectin Probe tốt để phân biệt pluripotency-Chúng sau giải thách thức để phát triển thủ tục lectin dựa cách phân biệt phân biệt SCS không phân biệt iPSCs / ESCs, mà sử dụng để theo dõi trạng thái khác biệt Như mô tả, rGC2, rBC2LCN, SNA, TJAI, SSA, rPSL1a, rRSIIL, BPL, AAL cho tín hiệu cao đáng kể iPSCs / ESCs SCS với FWER 0,001 (Bảng 1) Trong số đó, rBC2LCN cho thấy hiệu suất tốt thăm dò để phát có chưa phân hóa iPSCs / ESCs không phản ứng với phân biệt SCS MEF, lectins khác phản ứng với SCS (Bảng 1) Cụ thể, rGC2 cho thấy số điểm tốt FWER (110 21) rBC2LCN (2 10 19), cựu phản ứng mạnh với MEF (Fig 5) Tương tự vậy, SNA (4 10 11), đại diện 2- 6Sia-binding lectin, cho thấy ý nghĩa phản ứng chéo với phần SCS có nguồn gốc từ PAE MEF (Fig 5) Giám sát ô nhiễm Xenoantigen, Gal epitope-Từ quan điểm thực tế, giám sát tamination dựng kháng nguyên xenotransplantation iPSCs / ESCs điều cần thiết cho sử dụng an toàn y học tái tạo Một binant MOA nghị (rMOA) công nhận chống xenotransplantation gen Gal 1-3Gal 1- 4GlcNAc (44) diện hầu hết tế bào từ khỉ New World động vật có vú phi linh trưởng bao gồm chuột, người Thật vậy, rMOA liên kết mạnh với MEFs không để người SCS (Fig 6) Do đó, tín hiệu rMOA không nên phát iPSCs người Tuy nhiên, triplicate mẫu hai dòng tế bào iPS MRC5-# 25 (P22) (# 13-15) UTE-iPSB05 (P13) (# 6466) trưng bày tín hiệu quan trọng rMOA Để xác minh xem ràng buộc rMOA qua trung gian miền nhận dạng carbohydrate rMOA, sau thực ức chế khảo nghiệm Như thể hình 6B, ing bind- rMOA đến việc tế bào phân màng MEF MRC5- iPS # 25 (P22, # 13) bãi bỏ diện 100 g / ml tương tác cụ thể thông qua rMOA carbohydrate miền thừa nhận Theo dự kiến, tác dụng ức chế Gal 3Gal 1- 4GlcNAc-PAA lectin Fuc-ràng buộc, rAAL, xenoantigen Gal epitope, hai dòng tế bào trên, mà có lẽ hầu hết bị nhiễm MEF THẢO LUẬN Sử dụng phát triển mật độ cao lectin microarray, thực phân tích có hệ thống polisacarit bề mặt tế bào tập hợp lớn iPSCs người (114 loại tế bào) ESCs (chín loại tế bào) Kết là, sở cho hệ thống đánh giá tế bào gốc hợp lý thành lập, tiết lộ hai trạng thái undifferentiation bao gồm Gal epitope (một xenoantigen đại diện) Như phân tích toàn diện nhắm glycome iPSCs ESCs chưa thực Có ba lợi quan trọng việc sử dụng microarray lectin 1) Một hồ sơ polisacarit tổng thể loại tế bào dễ dàng thu cách sử dụng số lượng tương đối nhỏ tế bào (1 103), đó, phương pháp áp dụng rộng rãi cho tế bào gốc 2) Việc đánh giá hệ thống đề xuất bao gồm lựa chọn tàu thăm dò tốt chiến lược thống kê số lectins, cố định mảng Như thăm dò ứng cử viên, kháng thể carbohydrate-binding soạn thảo bao gồm 3) Các tài sản khác tế bào gốc đánh giá đồng thời (tức với "một-chip" kỹ thuật điều khiển) Phương pháp đánh giá cách sử dụng chiến lược mô tả nghiên cứu này, dựa lectin- nhắm mục tiêu khối u ferentiation xu hướng lệch tế bào gốc phát triển Dựa tín hiệu lectin biểu cosyltransferases gly-, kết luận biểu 2- 6- sialylation, 1-2-fucosylation, loại LacNAc tăng, 2-3-sialylation tetra-antennary lon N-gly- giảm tương ứng theo cảm ứng tency pluripo- Những thay đổi phù hợp với báo cáo gần polisacarit có liên quan (tức biểu Globo H H loại với 1-2Fuc 2- 6Sia người ESCs) cao so với thể embryoid biệt (9, 43) Thật thú vị, biểu tăng 1-2Fuc loại LacNAc, tổng hợp hành động FUT1 / B3GalT5, tương ứng, liên quan chặt chẽ đến tổng hợp dấu hiệu tiếng pluripo tency, SSEA3 / Trà-1 -60/81 (cho chương trình, xem hình bổ sung S4) Trong nghiên cứu này, rBC2LCN lựa chọn thăm dò lectin tốt để đánh giá pluripotency số 96 lectins BC2LCN phân tử lectin TNF-như xác định từ vi khuẩn gram âm Burkholderia cenocepacia (45) Phân tích microarray Glycoconjugate tiết lộ rBC2LCN gắn đặc hiệu để Fuc 1-2Gal 1-3GlcNAc (GalNAc) -containing polisacarit, H type (Fuc 1-2Gal 1-3GlcNAc), H type (Fuc 1-2Gal 1-3GalNAc), Lewis b (Fuc 12Gal 1-3 (Fuc 1-4) GlcNAc), bao gồm hai đặc điểm cấu trúc liên quan đến pluripotency (1-2Fuc loại LacNAc) mô tả (bổ sung hình S3) Quan sát phù hợp với báo cáo trước (45) Sulak et al nghiên cứu đặc polisacaritràng buộc BC2LCN chi tiết sử dụng microarray glycan chuẩn độ microcalorimetry Họ chứng minh lectin liên kết với Globo H (Fuc 1-2Gal 1-3GalNAc 1-3Gal 1- 4Gal 1- 4Glc), mà gần đề xuất dấu hiệu loại glycosphingolipid pluripotency (bổ sung hình S4) (9, 45 ) Những kết giải thích chế lectin sử dụng thăm dò để phân biệt pluripotency rBC2LCN sử dụng để thăm dò glycoprotein tất glycoconjugates mang Fuc 1-2Gal 13GlcNAc (GalNAc), chống SSEA3 chống SSEA4 nhắm glycosphingolipids Từ quan điểm tical người thực hiện, rBC2LCN chi phí-hiệu sản xuất với số lượng lớn E coli thường biểu hệ thống sion (84 mg / lít) Như vậy, lectin đầu dò đa để đánh giá pluripotency Ngược lại, Globo H báo cáo overex- ép khối u tế bào biểu mô (46) Hơn nữa, 2- 6Sia up-regulated iPSCs / ESCs báo cáo overex- ép nhiều loại ung thư người, sion biểu cao tích cực tương quan với di khối u chẩn tiên lượng (47) Như vậy, thay đổi polisacarit cảm ứng pluripotency quan sát nghiên cứu dường tương tựnhững xảy biến đổi ác tính, ngụ ý gần (9) Mặc dù lý cho tương đồng để làm sáng tỏ, thay đổi glycan đặc trưng nên liên quan đến khả tăng sinh tế bào bảo trì vĩnh cửu, tính chung cho hai tế bào ung thư tế bào gốc đa Polisacarit đặt bề mặt tế bào cùng, nơi var- kiện ới diễn sở công nhận tương tác tế bào-to-cell Lectins nội sinh, ecules đối lớn mol- polisacarit, cần đóng vai trò quan trọng kiện (ví dụ cách điều chỉnh số đường tín hiệu) Trong bối cảnh này, tương tác xảy tions polisacarit bề mặt tế bào lectins nội sinh coi cần thiết cho việc trì pluripotency, tự đổi mới, khác biệt iPSCs / ESCs (48) Thật vậy, proteoglycans sulfate heparan báo cáo để điều chỉnh tự đổi pluripotency tế bào gốc phôi (49) Hơn nữa, giảm sulfat sulfate heparan chondroitin sulfate chứng minh để đạo khác biệt hóa thần kinh ESCs chuột iPSCs người (50) Gần đây, chất tổng hợp polisacarit bề mặt tế bào nhận báo cáo để tạo thuận lợi cho văn hóa lâu dài tế bào gốc đa (48) Như vậy, phân tích toàn cầu glycomes tế bào iPSCs ESCs thực nghiên cứu cần thiết để cung cấp sở để khám phá chức ứng dụng tế bào gốc glycobi- ology Họ bao gồm thiết kế hợp lý chất có hiệu điều kiện nuôi cấy để hỗ trợ công tác tuyên truyền lâu dài ESCs iPSCs (48) Tất nhiên, kết thu nghiên cứu dễ dàng áp dụng cho nhuộm (đặc điểm kỹ thuật nơi xảy kiện), làm giàu (ví dụ Turing cap- lectin-hỗ trợ tế bào cần thiết), mục tiêu tế bào cụ thể (ví dụ loại bỏ không mong muốn tế bào không phân biệt) Về vấn đề này, tế bào gốc glycoengineering với trợ giúp microarray lectin vấn đề quan trọng việc thực y học tái sinh tương lai gần