BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẢN THƠ
ĐẶNG THỊ KIM UYÊN
KHẢO SÁT MƠI TRƯỜN G NUƠI CẤY VÀ HIEU
QUA CUA XA KHUAN Streptomyces sp CHUNG
SOFRI 1 DOI VOI BENH DO NAM Fusarium solani TREN CHANH VOLKA
(Citrus volkarmeriana)
LUAN VAN CAO HOC
CHUYEN NGANH BAO VE THUC VAT
Trang 2Luận án kèm theo đây, với đề tựa là “KHẢO SÁT MƠI TRƯỜNG NUƠI
CAY VA HIỆU QUA CUA XA KHUAN Streptomyces sp ching
SOFRI 1 DOI VOI BENH DO NAM Fusarium solani TREN CHANH
VOLKA (Citrus volkarmeriana)”, do DANG TH] KIM UYEN thuc hién va
báo cáo, và đã được Hội đồng chấm luận án thơng qua
Ủy Viên | Thu ky
yd
(lạ ~ — ¬ |
PGS.TS Trần Thị Thu Thủy TS Nguyễn Thị Thu Nga
Phan bién I Phan Bién 2
— | |
=ố
PGS.TS Phạm Văn Kim PGS.TS Trần Thị Cúc Hịa
Cần Thơ, ngày 27 tháng I1 năm 2010
Chủ Tịch Hội Đồng
Trang 3LOI CAM DOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân Các số liệu, kết quả trình
bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình luận văn nào trước đây
Tác giả luận văn
Trang 4LY LICH KHOA HOC I LY LICH SO LUOC:
Ho va tén: Dang Thi Kim Uyén _ Giới tính: Nữ
Ngày, tháng, năm sinh: 09/08/1979 Nơi sinh: Cái Bè — Tiền Giang
Quê quán: Hậu Thành — Cái Bè — Tiền Giang Dân tộc: Kinh
Chức vụ, đơn vị cơng tác trước khi đi học tập, nghiên cứu: Viện Cây ăn quả
miền Nam
Chỗ ở riêng hoặc địa chỉ liên lạc: Ấp Đơng — xã Long Dinh — Chau Thanh — Tién Giang
Điện thoại cơ quan: 073.3893129 Điện thoại riêng: 097.331.657
Fax: 0733.893129 E-mail: hoauyen28052005(@yahoo.com
II QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO
1 Trung học chuyên nghiệp:
Hệ đào tạo: Thời gian đào tạo từ / đến / Nơi học (trường, thành phố):
Ngành học:
2 Đại học:
Hệ đào tạo: Chính quy Thời gian đào tạo từ 09/2000 dén 04/2004
Nơi học (trường, thành phố): Đại học Dân Lập Cửu Long
Ngành học: Nơng học
Tên đồ án, luận án hoặc mơn thi tốt nghiệp: HIỆU QUA MOT SO LOAI
'THUĨC TRONG VIỆC PHỊNG TRỪ BỆNH THÁN THU (Colletotrichum
gloeosporiodes) TREN XOAI CAT HOA LOC TRONG DIEU KIEN NHA
LUOI VA NGOAI DONG
Ngày và nơi bảo vệ đồ án, luận án hoặc thi tốt nghiệp:
Người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Hịa
3 Thạc sĩ:
Hệ đào tạo: Chính quy Thời gian đào tạo từ 09/2008 đến 09/2010
Noi học (trường, thành phố): Đại học Cần Thơ
Ngành học: Bảo vệ thực vật
Tên luận văn: KHẢO SÁT MƠI TRƯỜNG NUƠI CÁY VÀ HIỆU QUÁ
CUA XA KHUAN Streptomyces-SOFRI 1 DOI VOI BENH DO NAM
Fusarium solani TREN CAY CHANH VOLKA (Citrus volkarmeriana)
Ngày và nơi bảo vệ luận văn: tại Hội trường Khoa Nơng Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng
Người hướng dẫn: PGs.TS Trần Thị Thu Thủy
5 Trình độ ngoại ngữ (biết ngoại ngữ gì, mức độ): C Anh Văn
Trang 56 Học vị, học hàm, chức vụ kỹ thuật được chính thức cấp; số bằng, ngày và nơi
câp: Kỹ sư nơng học
II QUÁ TRÌNH CƠNG TÁC CHUYÊN MƠN KỂ TỪ KHI TĨT NGHIỆP ĐẠI
HỌC:
Thời gian Nơi cơng tác Cơng việc đảm nhiệm
05/2004 - đến nay | Viện Cây ăn Quả miền Nam | Nghiên cứu viên
IV CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CƠNG BĨ:
XÁC NHẬN CỦA CƠ QUAN CỬ ĐI HỌC Ngày thắng năm
(Ký tên, đĩng dâu) Người khai ký tên
Trang 6LOI CAM TA
Để hồn thành luận văn này, Chúng tơi đã nhận được sự hướng dẫn tận tình của quý thầy cơ và xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến:
PGs.TS Trần Thị Thu Thủy, Trưởng Bộ mơn Bảo vệ thực vật, Khoa Nơng
nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình hướng dẫn và giúp
tơi trong suốt quá trình thực hiện và hồn thành luận văn này
TS Nguyễn Văn Hịa, Phĩ viện trưởng, Viện Cây Ăn Quả miền Nam đã truyền
đạt những kinh nghiệm và giúp đỡ tơi để hồn thành luận văn này
PGs.IS Phạm Văn Kim Bộ mơn Bảo vệ thực vật, Khoa Nơng nghiệp và Cơng nghệ sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã giảng dạy và truyền đạt những
kinh nghiệm vơ cùng quí báu trong nghiên cứu
TS Nguyễn Minh Châu, Viện trưởng Viện Cây Ăn Quả miền Nam đã cho phép
và tạo điều kiện cho tơi được đi học
Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban chủ
nhiệm Khoa nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng, Phịng Quản lý Khoa học và Đào tạo
Sau Đại học, Bộ mơn Bảo vệ thực vật; đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tơi tiến
hành nghiên cứu và thực hiện luận văn
Trong quá trình thực hiện luận văn, tơi luơn nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị em của Bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật, Viện cây ăn quả miền Nam
Xin tỏ lịng biết ơn đến Lãnh đạo Viện, các anh chị, em của các phịng ban Viện Cây ăn quả miền Nam, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khĩa học này
Các anh, chị và các bạn lớp Cao học Bảo Vệ Thực Vật khĩa 15 và bạn Phan Hà lớp Cao học Bảo Vệ Thực Vật khĩa 14 đã cùng tơi chia sẽ những khĩ khăn, động viên,
giúp đỡ trong suốt quá trình học tập tại Trường Đại học Cần Thơ
Cuối cùng, tơi xin bảy tỏ lịng biết ơn đến gia đình, anh chị đồng nghiệp và
những bạn bè thân thiết đã hết lịng động viên, giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực
hiện luận văn này
Tiền Giang, ngày tháng năm 2010
Trang 7TĨM LƯỢC
Trong những năm qua, cây cĩ múi ở Đồng bằng sơng Cửu Long đang bị nhiễm
bệnh vàng lá thối rễ nặng, tác nhân gây bệnh là do nắm Ƒsarim solani gây ra cùng VỚI SỰ ngập úng nước hệ thống rễ (Phạm Văn Kim, 1998; Dương Minh va ctv, 2003) Xa khuan Streptomyces spp duge biết là vi khuẩn hoại sinh co kha nang đối kháng nắm tốt, đặc biệt là nấm Ƒsariưm solani, chúng là vi sinh vật sống ở vùng rễ Trong nghiên cứu này chúng tơi đã khảo sát được mơi trường thích hợp cho Streptomyces — SOFRI 1 la YCEDM (Casamino Acids Yeast Extract Glucose Agar Modified) va pH
thích hợp cho xạ khuẩn này phát triển là từ pH= 6,5 - 7,5 va pH thich hop nhat là pH =7 Khi khảo sát khả năng đối kháng cho thấy ở điều kiện phịng thí nghiệm bằng 2
phương pháp là chủng xạ khuẩn 1⁄2 đĩa, rồi cay nam ở giữa của đĩa Petri và phương pháp khác là pha xạ khuẩn vào mơi trường và cây nắm vào giữa đĩ ia, thi cả hai phương
pháp đều cho kết quả khi cĩ sự hiện diện xạ khuẩn thì khống chế tốt sự phát triển của
nắm #Ƒ' solani Khi khảo sát ảnh hưởng cia xa khudn Streptomyces - SOFRI 1 đối với
khả năng gây hai nam F solani trén cay chanh Volka trong ly nhựa ở điều kiện phịng
thí nghiệm bằng cách chúng xạ khuẩn và nắm cùng lúc hay ngâm xạ khuẩn vào hat 5 gid trước khi chủng nắm, kết quả cho thấy xạ khuẩn cĩ khả năng ảnh hưởng rất tốt đến
tỷ lệ nây mầm của hạt chanh Volka, ngay cả trong trường hợp cĩ chủng nắm gây bệnh
F solani, kết quả thấy rằng xạ khuẩn cĩ sự ảnh hưởng tốt đến khả năng phát triển của cây con cả chiều cao thân, chiều dài rễ, đặc biệt là xạ khuẩn cịn làm cho cây cĩ số
lượng rễ phụ nhiều hơn, trong lượng rễ tươi cao hơn đối chứng và nghiệm thức chỉ ching F solani Trong nghién cứu khác chúng tơi cũng đã đánh giá ảnh hưởng của xạ
khuẩn đối với bệnh thối rễ do nắm Ƒsariưm solani gây ra trên cây cam sành phép trên gốc chanh Volka trong điều kiện nhà lưới, kết quả cho thấy là SfrepfOmyces cĩ ảnh hưởng tốt làm giảm chỉ số bệnh, tăng khả năng phát triển chiều cao cây, rễ, số lượng rễ mới, chiều dài rễ, đặc biệt là giảm số lượng rễ thối so với nghiệm thức chỉ chủng #ˆ so/ani Cho nên cĩ thể nĩi /repfomyces — SOERI 1 khơng chỉ cĩ tác dụng
tốt trong việc khống chế nắm Ƒ so/ani phát triển và gây bệnh trên cây chanh mà cịn
cĩ tác dụng kích thích khả năng nây mắm và phát triển của cây chanh Volka, thích hợp
cho việc sử dụng chúng như một vi sinh vật đối kháng trong việc quản lý bệnh thối rễ
do F solani gay ra
Trang 8Abstract
Recently, in the Mekong River Delta, citrus trees have been heavily infected by yellow decline disease, which caused by Fusarium solani, especially under water
logging conditions (Pham Van Kim, 1998, Duong Minh et al., 2003) Streptomyces
spp., the rhizosphere microorganism, was well known as an affective antagonistic
agent to fungal pathogens, particularly Fusarium solani In this investigation, we
aimed to determine the suitable media for laboratory culture of Streptomyces — SOFRI
1 and result shown that YCEDM (Casamino Acids Yeast Extract Glucose Agar
Modified), was best medium and on this medium, we determined that the pH of 6,5 —
7,5 was the best range and pH 7 was the most suitable one for it culture When it tested
for antagonic ability under laboratory conditions by two different methods, one was
streaked Streptomyces on one side of the plate and a piece (0.5 cm’) of PDA medium containing actively growing Fusarium mycelium on the center of the plate, the second method was to dilute Streptomyces solution to melting media just before pouring to the plate and then inoculate a pieces of F solani on the center of the plate, both the two
gave similar results that Streptomyces could control the growth of F solani We also
observed the antagonic ability of Streptomyces - SOFRI 1 to the growth and infection ability of F solani to Citrus volkameriana seedlings grown in plastic pots under
laboratory conditions, two experiements were carried out, one inoculated both
Streptomyces and F solani at the same time, another one which Streptomyces was soaked to citrus seeds 5 hours before, results shown that at both the two expriements,
the Streptomyces could provide better germination ratio for citrus seeds event at the
present of F solani In addition, Streptomyces gave much better effect to the growth of the seedlings, it root system, especially the fine root system of citrus trees in
comparison that of the check and the F solani treatment In another experiment, we
tested for antagonistic capacity of Streptomyces — SOFRI | to root rot disease caused
by Fusarium solani on King Mandarin grafted on C volkameriana in pots under
greenhouse conditions, we found that Streptomyces provided good effect to the tree growth, number of fine roots, length of the roots, particularly reduced number of rotted
roots in comparison with that of the treatment of F solani In this study, we found that
Streptomyces — SOFRI | not only gave good effect to reduce the infection propotion of F solani, but also stimulated the germination percentage of seeds and plant growth
of Volka trees This microorganism is suit to promote to be the F solani antagonic
agent
Trang 9MUC LUC
Trang
Trang phu bia
Chấp nhận luận văn i
Lời cam đoan ii
Ly lich khoa hoc lil Trang cam ta V Tĩm lược VI Abstract Vii Muc luc Vili Danh sách hình # Danh sách bảng xii Chương - MỞ ĐẦU 1
Chương 1 - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3
1.1 SOLUGQC VE BENH HAI RE TREN CAY CO MUI 3
1.2 DAC DIEM CUA NAM FUSARIUM 4
1.2.1 Dac điểm hình thái của ndm Fusarium solani 4
1.2.2 Đặc điểm và điều kiện gây hại của nắm Ƒsarium đối 5 với cây trồng 1.2.3 Độc tính và điều kiện gay hai cla ndm Fusarium ắi với cây trồng 6 13 _ SƠ LƯỢC VỀ S7TREPTOMYCES VÀ VIỆC SỬ DỤNG 7 CHÚNG TRONG PHỊNG TRỪ BỆNH HAI RE
1.3.1 Đặc điểm và sự phân bố xạ khuẩn 7
1.3.2 Vai trị cĩ lợi của xạ khuẩn Streptomyces 9 1.3.3 Đặc điểm đối kháng 10 1.3.4 Các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của Xạ 14 khuẩn 1.4 BIỆN PHÁP PHỊNG TRỪ BỆNH HAI RE TREN CAY 14 CO MUI 1.4.1 Biện pháp hĩa học 15 1.4.2 Biện pháp giống 15 1.43 Str dung Trichoderma 16 1.44 Sử dụng Streptomyces 17
1.5 SƠ LƯỢC VE CHANH VOLKA (Citrus volkarmer iana) 17
Chuong 2 - PHUONG TIEN VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU 20
2.1 PHƯƠNG TIEN THUC HIEN 20
2.2 PHUONG PHÁP THỰC HIỆN 22
2.2.1 Khảo sát mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự De phát triển của xạ khuẩn Streptomyces —SOFRI 1
2.2.2 Xác định pH thích hợp trong điều kiện mơi trường 22
YCEDM
223 Khao sát khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với 23 nam Fusarium solani trong dia Petri ở điều kiện
phịng thí nghiệm
Trang 102.2.4 Khao sát khả năng ảnh hưởng của xạ khuẩn
Sfreptomyces — SOFRI 1 đối với nẫm Fusarium
solani trên cây chanh Volka con trong ly nhựa ở điều
kiện phịng thí nghiệm
2.2.5 Đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đối với bệnh thối
rễ do nắm Fusarium solani gay ra trén cay cam sanh ghép trên gốc chanh Volka trong điều kiện nhà lưới
Chương 3 - KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5
Mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự sinh trưởng của xạ
khuẩn Streptomyces —SOFRI 1
3.1.1 Mức độ sinh trưởng của xạ khuẩn trên các mơi
trường khác nhau
3.1.2 Khả năng phát triển khuẩn lạc của xạ khuẩn trên các
mơi trường khác nhau
Khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn /rzepfomyces LÌ SOERI
1 trên các mức pH khác nhau
3.2.1 Mức độ sinh trưởng của xạ khuẩn trên các mức độ
pH khác nhau
3.2.2 Khả năng sinh trưởng khuẩn lạc trên mơi trường
'YCEDM với các mức pH khác nhau
Khả năng đối kháng của Srepfomyces — SOFRI 1 đối với nam Fusarium solani
3.3.1 Mite d6 déi khang cia Streptomyces 0 SOFRI I déi
với nấm Fusarium solani theo phương pháp Zarandi
va ctv, 2009
3.3.2 Đường kính khuẩn lạc của ndm F solani trong điều
kién pha dung dich chtra Streptomyces — SOFRI 1
vào mơi trường trước khi đỗ vào đĩa
Khảo sát ảnh hưởng của xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1
đối với khả năng gay hai nam F solani trên cay chanh Volka 6 diéu kién phong thi nghiệm
3.41 Ảnh "hưởng của mật số xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1 đối với nấm F solani trén cây chanh Volka sau khi
chủng
3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của xạ khuẩn Streptomyces-
SOFRI 1 đối với nắm Fusarium solani trên cây chanh
Volka ở điều kiện ngâm hạt 5 giờ trước khi gieo
Đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đối với bệnh thối rễ do
nam Fusarium solani gay ra trên cây cam sành ghép trên
Trang 11ps Sr Ss
DANH SÁCH HÌNH
Hình Tựa hình Trang
3, Su phat triên của xạ khuẩn trên các mơi trường khác nhau ở thời điểm 30
96 giờ sau khi cấy; (a) mặt trên đĩa; (b) mặt dưới đĩa
32 Khuân lạc của S/repfomyces phát triển trên mơi trường YCEDM ở thời 30
l điểm 96 giờ sau khi cấy (a) mặt trên đĩa; (b) mặt dưới đĩa
33 Sự sinh trưởng xạ khuẩn trên mơi trường pHE= 7 ở 96 giờ sau khi nuơi cây 32
l (a) Mặt trên đĩa, (b) mặt dưới đĩa
34 Khuẩn lạc phát triển tốt ở mơi trường cĩ pH khác nhau ở 120 giờ sau khi 33
` chủng;
3.5 Mứcc độ đối kháng của xạ khuẩn với ndm Fusarium solani ở 48 giờ 34
, SKC(nủa phải cấy Srepformyces)
3.6 Đối kháng véi F solani (a) Đối kháng xạ khuẩn 10” ở 96 giờ; (b) Đối chứng 35
3.7 Khả năng ức chế ndm Fusarium solani 6 cdc mat s6 khdc nhau 6 96 gid SKC 37 3.8 Ucchénam Fusarium solani so d6i chứng ở 120 giờ 37 3.9 Khả năng ức chế nam Fusarium solani ở các mật số khác nhau & 120 gis SKC 38 3.10 Khả năng sinh trưởng của chanh Volka; (a) Chủng xạ khuẩn 10° 41
" CFU/ml (b) Đối chứng
3.11 Thân và rễ cây chanh Volka (a) Chủng xạ khuẩn (b) Đối chứng 42
3.12 Trọng lượng thân và rễ (a) trước khi sấy (b) sau khi sấy 43
3.13 Ngâm hại trước khi gieo (a) Strep 10” (b) Strep 10° (c) F solani 10° 46
3.14 (a) Ngam 6 10° CFU/ml (b) Đối chứng 46
3.15 _ Sinh trưởng của cây ở mật độ Streptomyces 105 CFU/ml 47 3.16 Chanh Volka cĩ xử lý hạt (a) trước khi sấy (b) sau khi sấy 49
3.17 _ Tổng quan các nghiệm thức thí nghiệm 49
3.18 _ Nhiễm nắm lá bị vàng của NT 6 và NT 1 lá khỏe 51
3.19 Một số hình ảnh thể hiện ở rễ 52
Trang 12DANH SACH BANG
eee 1
Bằng Tựa bảng Trang
_— 5 1 ., ._ _ "55ƠơƠ Ơ
2.1 Chất kháng sinh do một số lồi xạ khuẩn tiết ra 10
31 Mức độ sinh trưởng của xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1 trên 28 ` một số loại mơi trường khác nhau
3.2 Số lượng khuẩn lạc của xạ khuẩn Streptomyces -SOFRT 1 trên các 29 " mơi trường 3 Mức độ sinh trưởng của xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1 trén 1 a: các mức độ pH khác nhau 4 Kha năng sinh trưởng của xạ khuan Streptomyces - SOFRI1 ở 5 2 các mức pH 3
3.5 Mức độ đối kháng của xạ khuẩn Streptomyces - SOFRI 1 1 déi 34
` voi nam Fusarium solani
3.6 Đường kính khuẩn lạc của nắm F solani trong sự đối kháng của 36 l Streptomyces - SOFRI 1
37 Ảnh hưởng của mật số xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 40 1 va nam F solani déi với cây chanh Volka
Anh hưởng của xạ khuẩn Streptomyces - SOF RI 1 va nam
3.8 Fusarium solani đối với trọng lượng thân và rễ cây chanh 43
Volka con trồng trong ly nhựa
Ảnh hưởng của xạ khuẩn Streptomyces-SOFRI 1 được ngâm
3.9 5 giờ trước gieo đối với khả năng gây hại của ndm Fusarium 45 solani trén su sinh truéng của trên cây chanh Volka co
Ảnh hưởng của xạ khuẩn Streptomyces-SOFRI 1 được ngâm 5 gid
3.10 trước khi chủng nắm #i usarium solani đối với trọng lượng thân và 48 rễ cây chanh Volka con trồng trong ly nhựa
Hiệu quả xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1 đối với bệnh thối rễ
3.11 do nam Fusarium solani gây ra trên cây cam sành ghép trên gốc 50 chanh Volka trong diéu kién nhà lưới
Hiệu quả xạ khuẩn đối với bệnh thối rễ do nam Fusarium solani
3.12 gay ra trén cay cam sanh ghép trên gốc chanh Volka trong điều 53
kiện nhà lưới thơng qua số lượng TẾ, trọng lượng thân và rễ
Trang 13Chương 1
MO DAU
Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm qua, cây cĩ múi ở Đồng bằng sơng Cửu Long đang bị nhiễm bệnh
vàng lá thối rễ nặng, bệnh gây thiệt hại đáng kế đến các vùng trồng cây cĩ múi Nhiều
nghiên cứu về tác nhân gay bénh cho rang bénh do ném Fusarium solani gay ra cung với sự ngập úng nước hệ thong ré (Pham Van Kim, 1998; Duong Minh va ctv, 2003)
Việc sử dụng nơng dược trong phịng trừ tỏ ra kém hiệu quả và làm ơ nhiễm mơi
trường đất và nước, ảnh hưởng khơng tốt đến sức khỏe người sản xuất
Xạ khuẩn Actinomycetes, dic biét 1a Streptomyces spp được biết là vi khuẩn hoai sinh cĩ thể phân hủy chất hữu cơ, các polymer chuyên biệt như lignocellulose, tỉnh
bột và kitin trong đất (Crawford và chy, 1993) Những kết quả nghiên cứu cho thấy xạ
khuẩn cĩ khả năng đối kháng với nắm tốt, chúng là vi sinh vật sống ở vùng rễ Các
lồi S/repfomyces và một số xạ khuẩn khác cho thấy cĩ thể bảo vệ nhiều loại cây trồng
tránh khỏi nhiều loại nấm đất gây bệnh cây trồng, cả đối với các thí nghiệm trong nhà
lưới và ngồi đồng ruộng, (Tahvonen, 1982) Cac loai Streptomyces spp co thé ky sinh
hoặc tấn cơng các nấm gây thối rễ như Fusarium, Rhizoctonia, Pythium,
Phytophthora, Phytomatotricum, Aphanomyces, Monosprascus, Armillaria,
Sclerotinia, Verticillium, Geotrichum Dich tiét tir ré cay cé thé kich thich su tăng
trưởng của xạ khuẩn Actinomycetes để khong chế nắm bệnh, trong khi đĩ xạ khuẩn sử dụng dịch tiết từ cây để tăng trưởng và tổng hợp hợp chất kháng nắm Ngồi ra, xạ khuẩn cịn tổng hợp nhiều loại men phân giải như chitinases (Blaak và c#w, 1993), glucanases (Harchand va Singh 1997; Thomas va Crawford, 1998), peroxidases (Ramachandra va ctv, 1988) va nhitng men phan gidi khac cĩ thể phân hủy nắm hại
Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu: “ Khảo sát mơi trường nuơi cấy và hiệu quả của ca
xạ khudn Streptomyces - SOFRI 1 déi với bệnh do nấm Fusarium solani trên cây
Chanh VOLKA (Cirus volkarmeriana” đã được tiễn hành nhằm mục đích tìm hiểu
đặc tính sinh học của chủng Streptomyces — SOFRI 1, kha nang déi khang cia chúng
với nắm Ƒsarium solani trong điều kiện phịng thí nghiệm và nhà lưới trên cây chanh Citrus volkameriana (Volka) va tim mơi trường thích hợp để nhân mật số xạ khuẩn
* Nội dung nghiên cứu
v Khảo sát mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn Sfrepfomyces — SOFRI 1
Trang 14v Khảo sát khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với nắm Ƒsariưm solani ở
điêu kiện phịng thí nghiệm
v Khảo sát khả năng ảnh hưởng của xạ khuẩn $/zepfomyces-SOFRI 1 đối với
nam Fusarium solani trén cây chanh Volka con ở điều kiện phịng thí nghiệm
Trang 15Chương 1
MO DAU
Tính cấp thiết của đề tài
Trong những năm qua, cây cĩ múi ở Đồng bằng sơng Cửu Long đang bị nhiễm bệnh
vàng lá thối rễ nặng, bệnh gây thiệt hại đáng kể đến các vùng trồng cây cĩ múi Nhiều
nghiên cứu về tác nhân gay bénh cho rang bénh do nam Fusarium solani gay ra cùng
với sự ngập úng nước hệ thống rễ (Phạm Văn Kim, 1998; Dương Minh và cty, 2003)
Việc sử dụng nơng dược trong phịng trừ tỏ ra kém hiệu quả và làm ơ nhiễm mơi
trường đất và nước, ảnh hưởng khơng tốt đến sức khỏe người sản xuất
Xạ khuẩn Actinomycetes, đặc biệt là S/repfomyces spp được biết là vi khuẩn hoại
sinh cĩ thể phân hủy chất hữu cơ, các polymer chuyên biệt như lignocellulose, tỉnh
bét va kitin trong dat (Crawford va crv, 1993) Những kết quả nghiên cứu cho thấy xạ khuẩn cĩ khả năng đối kháng với nấm tốt, chúng là vi sinh vật sống ở vùng rễ Các
loai Streptomyces va mét sé xa khudn khác cho thấy cĩ thể bảo vệ nhiều loại cây trồng
tránh khỏi nhiều loại nắm đắt gây bệnh cây trồng, cá đối với các thí nghiệm trong nhà
lưới và ngồi đồng ruộng, (Tahvonen, 1982) Cac loai Streptomyces spp cé thé ky sinh hoặc tấn cơng các nấm gây thối rễ như Fusarium, Rhizoctonia, Pythium, Phytophthora, Phytomatoficum, Aphanomyces, Monosprascus, Armillaria,
Sclerotinia, Verticillium, Geotrichum Dich tiét tir ré cây cĩ thể kích thích sự tăng
trưởng của xạ khuẩn Actinomycetes để khống chế nấm bệnh, trong khi đĩ xạ khuẩn sử dụng dịch tiết từ cây để tăng trưởng và tổng hợp hợp chất kháng nấm Ngồi ra, xạ
khuẩn cịn tổng hợp nhiều loại men phân giải như chitinases (Blaak và cv, 1993),
glucanases (Harchand va Singh 1997; Thomas va Crawford, 1998), peroxidases
(Ramachandra vd ctv, 1988) va nhiing men phân giải khác cĩ thể phân hủy nấm hại
Chính vì vậy, đề tài nghiên cứu: “ Khảo sát mơi trường nuơi cấy và hiệu quả của của xạ khuẩn Streptomyces - SOFRI 1 đối với bệnh do nấm Fusarium solani trén cây Chanh VOLKA (Cirus volkarmeriana” đã được tiễn hành nhằm mục đích tìm hiểu dac tinh sinh hoc cua ching Streptomyces — SOFRI 1, kha năng đối kháng của chúng với nắm Fusarium solani trong điều kiện phịng thí nghiệm và nhà lưới trên cây chanh
Citrus volkameriana (Volka) và tìm mơi trường thích hợp để nhân mật số xạ khuẩn
* Nội dung nghiên cứu
vKhảo sát mơi trường dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn
Streptomyces — SOFRI 1
Trang 16v Khao sat kha nang d6i khang cia xa khuan déi véi ndm Fusarium solani 6 diéu kién phong thi nghiém
v Khảo sát khả năng ảnh hưởng cia xa khudn Streptomyces-SOFRI 1 đối với
nam Fusarium solani trén cay chanh Volka con 6 diéu kién phong thi nghiém
v4 Đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đối với bệnh thối rễ do nắm Fusarium solani
Trang 17Chuong 1
LƯỢC KHẢO TÀI LIEU
1.1 SƠ LƯỢC VÉ BỆNH HAI RE TREN CAY CO MUI
Hiện nay, dịch bệnh vàng lá thối rễ trên cây cĩ múi đã và đang gây hại trầm trọng cho các vườn cây ở khu vực Đồng bằng sơng Cửu Long Năm 2000, cĩ khoảng trên 1.300
ha quýt Tiều tại Lai Vung, tinh Đồng Tháp bị chết do bệnh thối rễ gay ra Trong các
năm 2001 đến 2004, vùng trồng Cam Mật tại hai huyện Trà Ơn và Tam Bình, tỉnh
Vĩnh Long cũng đang bị bệnh thối rễ và chết dần Theo đánh giá của cán bộ địa
phương số cây bị chết cĩ thể lên đến 40% diện tích cam của hai huyện Tại thành phố
Cần Thơ và tỉnh Hậu Giang bệnh thối rễ cũng gây hại khá nghiêm trọng ở các vườn
trồng cam và quýt Đường (Phạm Văn Kim, 2004)
Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Kim và c# (1997), đã chứng minh bằng qui
tắt Koch bệnh vàng lá thối rễ trên cây cam Mật và quyt Tiéu 1a do nam Fusarium
solani gay ra trong diéu kién dat bi oi nuéc trong thời gian dài Theo kết quả nghiên cứu của Dương Minh và cv (2003) cũng cĩ kết luận Ƒsariưm solani là tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên cây cĩ múi tại Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang, Đồng Tháp
và Tiền Giang Theo Phạm Văn Kim (2004), đất trồng bị oi nước liên tục sẽ làm rễ
non bị tồn thương và tạo điều kiện cho ndm Fusarium solani sin cé trong đất cĩ cơ
hội xâm nhập vào cây trồng qua những vết thương trên rễ, thơng thường bệnh sẽ biểu hiện triệu chứng vào đầu mùa nang, sau thoi gian ủ bệnh kéo dài trong vài tháng Theo
Lê Thị Thu Hing va ctw (2002) đã nghiên cứu bệnh vàng lá chết nhanh trên cây quýt
Tiéu tai Lai Vung, Đồng Tháp la do nam Fusarium spp., Phytophthora sp., Pythium sp và cĩ sự xuất hiện của tuyến trùng gay ra trong d6 Fusarium solani la tác nhân
quan trong Theo két qua diéu tra va phân lập ở các vườn tại huyện Châu Thành, Cái Bè (Tiền Giang), huyện Tam Bình, Trà Ơn, Bình Minh (Vĩnh Long), phường Long
Tuyền (Tp Cần Thơ) và Lai Vung (Đồng Tháp) cho thấy hầu hết các vườn bị vàng lá
Trang 18gây hại nặng trong điều kiện bất lợi kéo dài (Stress) Bệnh thối rễ do ndm Fusarium
solani s& nang hon trong điều kiện ngập nước, bĩn nhiều phân urê, tính bột dự trữ
trong rễ giảm và cĩ sự hiện diện của tuyến trùng 73 yienchulus semipenetrans Theo
nhận định của Koizumi (2006) bệnh vàng lá thối rễ do nấm Phytophthora tin céng
gây hại trước, rồi Ƒsariưm là nắm mới tấn céng va gay hai sau nhung nam Fusarium lại phát triển nhanh và mạnh hơn nắm Phytophthora nén gay hai chu luc lam cay suy
kiét va biéu hién triéu chimg 14 do nim Fusarium
_ 1.2 DAC DIEM CUA NAM FUSARIUM
_ Theo Vũ Triệu Man, Lé Ivong Té (1998), Pham Van Kim (2003) Nấm Fusarium
solani Link Berl thuéc: Nganh nam Mycota, Lớp nắm bất tồn Deuteromycetes, B6
nam béng Moniliales, ho T; uberculariaceae, Chi Fusarium Link ex Fr., Loai Fusarium
solani Link Berl
1.2.1 Đặc điểm hinh thai cia nam Fusarium solani
Vii Trigu Man va Lé Luong Té (1998) báo cáo rằng bệnh do nam Fusarium gây ra xuất hiện khắp nơi từ đồng bằng đến trung du và miền núi Nắm gây hại suốt thời kỳ
sinh trưởng của cây nhưng chủ yêu tân cơng ở giai đoạn cây con
Nam Fusarium solani (Mart) được biết cĩ giai đoạn hữu tính (teleomorph) là Wecfria
haeimatococca Berk & Br (Burgess, 1994) Nam Fusarium solani c6 3 dạng bào tử
thường thấy là tiểu bào tử, đại bào tử và bào tử áo Kích thước tiểu bào tử là 18,1 x 4,0
(micromet), đại bào tử cĩ 3-5 vách ngăn cĩ kích thước trung bình là 29,4 x 3,9
(micromef) (Barreto và c/v, 2003), bào tử áo là bào tử cĩ vách dầy, nhìn chung cả 3
dang bao tir chia nam Fusarium được sinh ra trong mơi trường nuơi cấy và mơi trường
đất (Agrios, 1997) Theo Bùi Xuân Đồng (1986) nắm Fusarium solani (Mart) (Nectria
haemaftococca Berk) mọc trên mơi trường thạch - khoai tây ở 27 ”C trong 7 ngày tuổi cĩ đường kính khuẩn ty 3-4cm, hệ khuẩn ty xốp bơng màu trắng xám, bào tử trần cĩ 3-4 vách ngăn ngang, bào tử hình trứng cĩ kích thước 4-5,5um x 32-56um Nam
Trang 19Trên mơi trường PDA thi tan ndm Fusarium solani cĩ màu trắng tới màu kem cịn trên
mơi trường CLA bào tử nhỏ cĩ kích thước lớn, thường cĩ 1 đến 3 vách ngăn và được
hình thành trong bọc giả gắn trên các tế bào sinh bào tử rất dài hoặc trên các cành bào
tử phân sinh phân theo nhánh (Burgess, 2008) Theo Cook và Baker (1983) cho rằng
nguồn carbon rất cần thiết cho sự mọc mam cua dai bao tir va bao tit Ao cla Fusarium
solani, nén ham lugng glucose dap tmg dé gia tang su mọc mầm của nắm và mầm của mét s6 ching Fusarium solani mọc trong khoảng 10-20 giờ sau khi bỗ sung năng
lượng Nhiệt độ ảnh hưởng đến nắm Fusarium solani, theo nghiên cứu của Burgess
(1994) nhiệt độ nuơi cấy nắm cĩ ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm và đường kính
khuẩn lạc nắm Fusarium solani chỉ 2,1-2,9 cm & 25°C, nhưng ở 30C cĩ đường kính
2,6-3,6 cm Phạm Văn Kim (2003), nắm F solani dé tan cơng và gây hại nghiêm
trọng khi pH đất thấp (4,3 — 4,5) kết hợp với tình trạng cây trồng bị Stress kéo dài
Nguồn đạm (Nitrogen) là yếu tố giới hạn, nitrogen cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của nam Fusarium solani vì đạm cần cho sự mọc mầm và sự thâm thấu của tế bào nắm (Dasgupta, 2000; Mehrotra 2000)
1.2.2 Đặc điểm và điều kiện gây hại của nẫm Fusarium déi véi cay tréng
Nam F solani hién dién khắp nơi trong dat va la nam ky sinh cơ hội Khi rễ cây trồng
bị tổn thương, chúng cĩ thể tấn cơng và gây hại nặng nề (Phạm Văn Kim, 1998)
Điều kiện đất và nước rất đặc trưng cho vùng ĐBSCL giữ vai trị rất quan trọng
đối với bệnh thối rễ cây ăn trái Đất cĩ thành phần sét cao trong sa cấu tạo ra tình
trạng tế khơng trong đất rất nhỏ, làm cho đất khĩ thốt nước sau các đợt mưa dài ngày vào giữa và cuối mùa mưa Đất bị nước chiếm các tế khơng lâu dài nên rơi vào tinh
trạng yếm khí do oi nước Tình trạng này kéo dài làm cho rễ cây trồng cạn phải hơ hấp yếm khí lâu dài, các chất độc do các tiến trình sinh hĩa trong tế bào rễ sinh ra, khơng được oxít hố để giải độc, tích lãy trong tế bảo và gây ngộ độc cho tế bào Từ đĩ các tế bao & phan rễ non, nơi các tiến trình sinh hĩa diễn ra mạnh nhất, sẽ bị chết dần từng tế bào và tạo ra các mảng thối ở rễ non (Phạm Văn Kim, 2004) Olsen va ctv (2000)
Trang 20hỏng mạch nhựa (Phạm Văn Kim, 1999) Theo Olsen va ctv, 2000 Fusarium solani la
tác nhân gây bệnh thối rễ nguy hiểm nhất trên diện rộng đối với đậu, cà chua
Bệnh gây hại ở rễ và cổ rễ giáp mặt đất Trên cổ rễ lúc đầu là một chấm nhỏ
màu nâu sau chuyển sang nâu đen và lan rộng bao quanh phần vỏ cỗ rễ, vỏ bị thối khơ, nứt và bong trĩc ra để trơ phần gỗ phía trong Nấm cĩ thể ăn sâu vào thân làm
thân bị khơ đen, các rễ phía dưới cũng bị thối đen Cây mới bị bệnh cĩ biểu hiện sinh
trưởng kém, lá bị vàng và rụng dần dần, cây cịn nhỏ cĩ thể bị chết khơ hồn tồn
Cây bệnh dễ bị đỗ ngã do bộ rễ đã bị hại Rễ bị thối, vỏ rễ dễ dàng tuột khỏi phần gỗ,
mạch gỗ của rễ hĩa nâu lan dần lên phần rễ chính Lá vàng từ thịt đến gân, gân lá cĩ
màu vàng trắng, phiến lá ngả màu vàng xanh và sau đĩ rụng đi Lúc đầu chỉ cĩ vài
cành bị bệnh sau đĩ tồn bộ tán lá bị vàng và rụng (Nguyễn Thị Thu Cúc và ctv,
2002) Chính vì vậy bệnh làm cho cây cịi cọc và lá thưa thớt, các cành nhánh bị khơ
và chết dần Khi cây ra trái, trái rất dé bị rụng vì vậy làm giảm năng suất rất lớn (Lê Thị Thu Hồng, 2002) Bệnh vàng lá thối rễ cũng xuất hiện trên cây bưởi, tuy nhiên
mức độ bệnh ít hơn so với cam sành và quýt tiêu
1.2.3 Độc tính và điều kiện gây hại của nấm Fusarium déi với cây trồng
Theo Agrios (2005) cĩ 3 nhĩm độc tố do Fusarium spp tiết ra là Zearelenones, Trichothecenes (thường được biết ở các dang vivotoxin hay Deoxynivalenol (DON), HT-2,T-2) va Fumonisins, nhttng độc tỗ này thường gây hại phơ biến trên cây trồng,
động vật hoang dã, gia cẦm và ngay cả trên người (Burgess và cv, 2009) Riêng đối
v6i loai Fusarium solani, cĩ nhiều chủng sinh ra nhiều loại độc tố khác nhau như
Diacetoxyscirpenol, Furanoterpenoids, Fusaric acid, đơc tổ H-T2, T2, Neosolaniol,
Zearalenone va cac loai sac t6 nhu marticin, isomarticin, fusarubin (Marasas va ctv,
1984) Vũ Triệu Mân và Lương Lê Té (1998) cho biết độc tố Fusarinic, Fumonisis BI,
Fumonisis B2 do Fusarium tiết ra đã kiềm hãm hoạt động của hệ thống enzyme và
hoạt động hơ hap, phá vở quá trình trao đổi chất, giảm tính thấm của màng tế bào và
làm giảm sức đề kháng của cây trồng Các độc tố của Ƒsarium cũng ức chế nây mầm
của hạt cây cải và cam quýt, ức chế sự sinh trưởng của cây quýt con (JingJing va ctv,
1993) Ƒsarium cũng cĩ khả năng tiết ra độc tố Naptharazin như dihydrofusarubin,
marticin và methyljavanicin Loại độc tố này cĩ khả năng làm thay đổi hoạt động trao
Trang 21phá vở hệ thống vận chuyển vận chất trong cây và cuối cùng là phá vở chức năng sinh lý của rễ cây (Nemec,1995) Độc tính của nắm Ƒ1sarium Spp tiết ra được biết nhiều
nhất la Acid Fusaric (15-n-butyl pyridine -2 cacboxylic acid) CyyH,30,N thudc dang
déc t6 Vivotoxin (Dasdupta, 1998; Pham Van Kim, 2000), Fusaric acid con được gọi
là độc tố gây bệnh héo vì ngay khi nắm Ƒsarim cịn giới hạn ở rễ nhưng lại biểu
hiện rõ triệu chứng bệnh ở bĩ mạch và hiện tượng héo trên lá, đĩ là do chất độc đã di chuyển đến các cơ quan khác xa nơi nhiễm bệnh, tạo ra một số triệu chứng ngộ độc
đặc trưng Riêng đối với lồi Ƒsariưm solani, trong quá trình ký sinh chúng sinh ra nhiều loại độc tế khác nhau như Diacetoxyscirpenol, Furanoterpenoids, Fusaric acid,
déc t6 H-T2, T2, Neosolaniol, Zearalenone va cdc loai sac t6 nhu Marticin,
Isomarticin, Fusarubin (Marasas va ctv, 1984)
1.3 SO LUQC VE STREPTOMYCES VA UNG DUNG CHUNG TRONG
PHONG TRU BENH HAI RE
1.3.1 Đặc điểm và sự phân bỗ xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhĩm vi khuẩn nhân thật (Eubacteria) Phần lớn xạ khuẩn là tế bào Gram dương, hiếu khí, hoại sinh, cĩ cấu tạo dạng sợi phân nhánh
(khuẩn tỉ), xạ khuẩn được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên như trong đất, trong
nước, rác, phân chuồng, bùn và thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc
khơng phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, thành phần đất, điều kiện canh tác và loại thảm thực vật (Nguyễn Lân Ding va ch, 2002)
Trong số 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do
xạ khuẩn sinh ra Xạ khuẩn cịn được dùng để sản xuất nhiều loại enzyme, một số vitamin và axit hữu cơ Một số ít xạ khuẩn ky khí hoặc hiếu khí cĩ thể gây ra các bệnh
cho người, cho động vật và cho cây trồng Một số xạ khuẩn (thuộc chỉ Frankia) cĩ thể tạo nơt sân trên rễ một số cây khơng thuộc họ đậu và cĩ khả năng cơ định đạm (nitơ)
Thế giới vi sinh vật cĩ lợi trong tự nhiên như nắm, xạ khuẩn, virus thì vi khuẩn đối kháng là nhĩm sinh vật đơn bào cĩ cấu tạo đơn giản nhưng giữ vai trị vơ cùng quan trọng Chúng tồn tại khắp nơi trong đât, nước, trên bề mặt cây trơng v.v Chúng cĩ khả
Trang 22(antibiotic), canh tranh về dinh dưỡng và nơi ở, nĩ hạn chế sự phát triên của nhĩm vi sinh vật khác gĩp phần tạo cân bằng sinh thái trong tu nhién (Mukerji & Garg 1993)
Actinomycetes là nhĩm khơng roi, dạng sợi Trước kia được xếp vào Tản thực vật
(tức nắm), nhưng ngày nay chúng được xếp vào vi khuẩn (Schizomycetes) Các lồi
Streptomyces cĩ thể tạo ra bào tử từ những ống sợi nhỏ gọi là sporophores Những
phân vách tế bào từ một ống đạng sợi, cách phân cắt này khác với sự hình thành bào tử của vi khuẩn Theo Waksman (1961) thì trong một gam đất cĩ khoảng 29.000 -
2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số vi sinh vật và một đặc tính quan
trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, khoảng 60-70% xạ
khuẩn được phân lập từ đất cĩ khả năng tiết chất kháng sinh
Khoảng 8000 chất kháng sinh được xạ khuẩn tiết ra Trong đĩ cĩ trên 15 lồi cĩ
nguồn gốc từ các lồi xạ khuẩn hiếm như Streptosporanggium, Micromonospora,
Actinomadura, v.v (Vi Thi Doan Chinh, 2000)
Sự phân bố của xạ khuẩn cịn phụ thuộc nhiều vào độ pH mơi trường, chúng cĩ nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yéu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn cĩ rất ít
trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ
khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm Một trong những đặc tính
quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất khang sinh, 60 - 70% xa
khuẩn được phân lập từ đất cĩ khả năng sinh chất kháng sinh
Cac loai Streptomyces dugc tim thay rong rai 6 khap noi trong đất và nĩ đĩng vai trị
rất quan trọng trong hệ sinh thái đất Phần lớn các đặc tính về mùi của đất xuất phát từ
các hĩa chất phĩng thích bởi các lồi Sreptomyces goi la geosmens Streptomycetes 1a
dang trao déi chat da dạng và cĩ thể ăn bất cứ thứ gì, bao gồm đường, rượu, amino
acids, acid hữu cơ, và cả những hợp chất thơm Chúng cĩ thể sản sinh ra men thủy
phân (Extracellulaz hydrolytic enzymes)
Đa số xạ khuẩn cĩ khuẩn ty khơng cĩ vách ngăn, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại là một loại cấm sâu vào mơi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất
substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề
mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ
Trang 23sinh Khi đĩ hợp chất kháng sinh vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh
dưỡng (Nguyễn Lân Dũng và cw, 1978)
Màu sắc của khuẩn ty của xạ khuẩn hết sức phong phú Cĩ thể cĩ các màu trắng,
vàng, da cam, đỏ , lục, lam, tím, nâu, đen Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ti
cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong
khơng khí thành những khuẩn tỉ khí sinh Sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn
ty khí sinh sẽ xuất hiện các sợi bào tử Sợi bào tử cĩ thể cĩ nhiều loại hình dạng khác
nhau: thắng, lượn sĩng, xoắn, mọc đơn, mọc vịng Một số xạ khuẩn cĩ sinh nang bào
tử bên trong cĩ chứa các bào tử nang
Khuân lạc của xạ khuân rât đặc biệt, nĩ khơng trơn ướt như ở vi khuẩn hoặc nắm men
mà thường cĩ dạng thơ ráp, dạng phân, khơng trong suốt, cĩ các nêp toả ra theo hình
phĩng xạ, vì vậy mới cĩ tên xạ khuẩn Chúng là những vi sinh vật được xem như tác
nhân sinh học cĩ tác dụng chữa bệnh - bioremediation
1.3.2 Vai trị cĩ lợi của xạ khuẩn Streptomyces
Streptomycetes co ich rất lớn trong y học và đĩng vai trị quan trọng trong các ngành
cơng nghiệp vì chúng cĩ khả năng tổng hop chat khang sinh - antibiotics Cĩ rất nhiều
giả thuyết khác nhau cĩ thể giải thích quá trình sản sinh kháng sinh của xạ khuẩn, trong đĩ giả thuyết được nhiều người chấp nhận nhất là chất kháng sinh của xạ khuẩn cĩ khả năng giúp các vi sinh vật đối kháng lại được các vi sinh vật khác liên quan đến
việc lấy hết đinh dưỡng liên quan trong mơi trường nào đĩ và như vậy làm giảm khả
năng cạnh tranh của đối phương Cĩ trên 50 loại kháng sinh phổ biến khác nhau được
ly trích từ các lồi xạ khuẩn Sirepfomycefes, trong đĩ phải kể là Streptomycin,
Neomycin, Chloramphenicol và Tetracyclines
Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn
Streptomyces sp TP — A0356 bang phuong phap sac ky cét Chat khang sinh này cĩ
khả năng kiềm hãm sự phát triển của nắm Aspergillus fumigalus va Candida albicans
Ngồi ra chất này cịn cĩ khả năng chống lại các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01-
Trang 24Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được lồi xa khuan Streptomyces sp C684 sinh chat khang sinh Laidlomycin, chất này cĩ thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng Methicillin và các cầu khuẩn kháng Vancomycin (Yoo va ctv, 2007)
Bảng 2.1: Chất kháng sinh do một số lồi xạ khuẩn tiết ra
mm _." ` ` â_ .,
Loại bệnh hay tác nhân Chất khángsinh Lồi xạ khuẩn tiết kháng
sinh
mm Lá 5
Typhoid Chloramphenicol Streptomycesvenezuelae
TB and leprosy Rifampicin Amycolatopsis (tén cu
Streptomyces) mediterranei
Methicillin-resistant Vancomycin Amycolatopsis (tén cu
Staphylococcusaureus (MRSA) Streptomyces) orientalis
Riverblindness Avermectin Streptomycesavermitilis
Cancer Daunomycin Streptomyces coeruleorubidus
Pathogens with transmissible Clavulanic acid Streptomyces clavuligerus penicillin resistance
ease a era 55
Nguén: Keith F.Chater, 2006)
Kháng sinh do xa khuẩn tiết ra dùng làm thuốc điều trị bệnh cho người và gia súc và
cây trồng Xạ khuẩn cịn cĩ khả năng sinh ra các vitamin thuộc nhĩm B, một số acid
amin và các acid hữu cơ Xạ khuẩn cịn cĩ khả năng tiết ra các enzym (protease,
armylaze ) và trong tương lai cĩ thể dùng xạ khuẩn để chế biến thực phẩm thay cho
nắm và vi khuẩn vì nấm cĩ thể sinh ra aflatoxin độc cho người và gia súc Những
nghiên cứu về Šzp/omyces cho thấy khơng cĩ hiệu ứng cĩ hại cho sức khỏe con
người khi sử dụng Srepfomyces iydicus Khơng cĩ chứng cứ xác định cĩ độc tính
hoặc xâm nhiễm được tìm thấy trong phịng thí nghiệm nghiên cứu động vật (Trejo-
Estrada và ctv, 1998)
1.3.3 Đặc điểm đối kháng
Sfreptoinyces violaceusniger dịng YCED-9 là 1 tác nhân kiểm sốt sinh học kháng
nắm đối kháng với nhiều loại nắm gây bệnh khác nhau Dịng VYCED-9 sản xuất 3 hợp
chất kháng với hoạt tính kháng nắm Những hợp chất này đã được tỉnh lọc và định danh, bao gồm: AFA (hoạt tính kháng nắm), 1 phức hợp thuốc diệt nắm của hợp chất
Trang 25giống với polyene tương tự như Guanidylfungin A và hoạt tính kháng lại hầu hết các nắm ngoại trừ nấm nỗn; nigericin, l polyester kháng nấm; và geldanamycin, 1
benzoquinoid polyketide ức chế khá cao sự phát triển hệ sợi nắm của Pythium va
Phytophthora spp (Trejo-Estrada vd ctv, 1997)
Nhĩm xạ khuẩn (Streptomyces) ciing tiét ra nhiéu men phan hiy thanh phan glucan Cĩ hơn 200 chủng được phân lập cĩ tiết ra enzym befa -1,3 và beta - 1,4- glucanase phân hủy vách tế bào của nắm Phytopthora gây thối rễ trên cây ăn trái và người ta tìm
được I1 chủng cĩ khả năng làm giảm chỉ số bệnh thối rễ do nấm này khi chủng chúng
lên cây con trong vườn ươm (Valois vd cty 1996)
Năm 2002, ở An Dé đã phân lập duge ching Streptomyces sp 201 cĩ khả nang sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, chất kháng sinh này cĩ khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F solani
Cac loai Streptomyces va mét sé xa khuan khac cho thay cĩ thể bảo vệ nhiều loại cây
trồng tránh khỏi nhiều loại nắm đất gây bệnh cây trồng, cả đối với các thí nghiệm
trong nhà lưới và ngồi đồng ruộng (Tahvonen, R 1982; Rothrock và Gottlieb, 1984;
Crawford va ctv, 1993) Cac loai Streptomyces spp cé thé ký sinh hoặc tấn cơng các
nắm gây thối rễ như F usarium, Rhizoctonia, Pythium, Phytophthora, Phytomatotricum, Aphanomyces, Monosprascus, Armillaria, Sclerotinia, Postia,
Verticillium, Geotrichum Nghiên cứu trong phịng thí nghiệm cĩ khoảng 80% kháng
sinh clla Streptomyces pulcher hoặc Strepfomyces canescens đã ức chế đáng kế khả
năng nay mầm của bào tử, sự phát triển của sợi nắm và sự hình thành bào tử Fusarium
oxysporum f.sp lycopersici (El-Abyad và cm, 1992) Nhiều lồi xạ khuẩn
Actinomycetes, đặc biệt là lồi thuộc chỉ Š#repfomyces, được biết đến như là một biện pháp sinh học đối kháng đối với nhiều loại nắm bệnh hại cây trồng như Scierotinia
minor (El — Tarabily va ctv, 2000), Sclerotium rolfsii gay bénh chét rap cay con trén
cu cai duong (Errakhi vd ctv, 2007), nim Phytophthora capsici gay bénh trén 6t cay
(Joo, 2005) hay nam Phytophthora gay théi géc trén cay đậu nành (Xiao, 2002) Hoặc
động đối kháng của Streptomyces d6i véi nam gây bệnh thường liên quan đến việc sản xuất các hợp chất kháng nắm như S violaceusniger strain G10 tao chất khang sinh chéng lai ndm Fusarium oxysporium f.sp.cubense race 4 (Getha va Vikineswary,
Trang 262002) và tương tự như vậy cũng được báo cáo bởi nhiều tác gia (Fguira vd ctv, 2005;
Ouhdouch va ctv, 2001; Taechowisan va ctv, 2005 va Trejo — Estrada va ctv, 1998) va
tao ra men thir phan ngoai bao - extracellular hydrolytic enzymes (Trejo — Estrada va
ctv, 1998;), tao men chitinase cia S lydicus WYEC 108 (Mahadevan va Crawford,
1997; Mukhejee va Sen, 2006), men glucanase (Valois va ctv, 1996) Hai loai men
Chitinase va B-1,3-glucanase duge xem như là men thủy phân quan trong trong viéc
làm tiêu hủy vách tế bào của nắm bệnh, ví dụ như, vách té bao cha Fusarium
oxysporum (Singh va ctv, 1999), Sclerotinia minor (El — Tarabily va ctv, 2000) va S
rolfsii (El — Katatny, 2001) Kết quả nghiên cứu của Benjaphorn va ctv (2008) dong
Streptomyces hygroscopicus — SRA 14 c6 hiéu qua déi khang tét voi Colletotrichum gloeosporiodes va Sclerotium rolfsii, dong SRA 14 c6 kha nang san sinh ra chitinase
va B-1,3-glucanase rat cao, chinh cdc hop chat nay lam thay đổi hình thái sợi nắm như làm sợi nắm cĩ hình dạng bất bình thường Tiềm năng kháng việc trao đổi chất ngoại
bào của Streptomyces đối với một số nắm đã được báo cáo như Joo (2005), Fguira và
ctv (2005), Chamberlain va Crawford (1999), Elabyad vd ctv (1993), Rothrock và
Gottlieb (1984)
Theo Crawford va ctv (2005) bao cáo xạ khuẩn Streptomyces lydicus WYEC108 la vi
khuẩn gram dương sống trong đất, chúng được phân lập từ cây linseed (hạt lanh) ở
Anh Quốc Xạ khuẩn sống hoại sinh và cộng sinh trên vùng rễ cây, chúng cĩ tác dụng
kích thích tăng trưởng và kháng nắm tốt Streptomyces lydicus WYEC 108 cé nam diac tính hoặc là chức năng phịng trừ nắm bệnh tăng cường khả năng sinh trưởng cây
trồng: (1) cĩ tiềm năng ở vùng rễ; (2) sự kháng sinh; (3) ký sinh lên nấm; (4) tạo men
phân giải cellulose và chitin và (5) tạo vùng siderophore cơ lập phân tử lượng của Sắt
(iron) Những kết quả nghiên cứu cho thấy xạ khuẩn cĩ khả năng đối kháng nắm tốt,
chúng là vi sinh vật sống ở vùng rễ Dong Streptomyces lydicus WYEC108 cho thay
khả năng đối kháng mạnh mẽ chống lại nhiều tác nhân nắm gây bệnh cây trồng, trên đĩa petri trong phịng thí nghiệm bằng việc sản xuất ra những chất chuyển hĩa kháng nắm ngoai bao nhu Pythium ultimum hay Rhizoctonia solani duge nudi cay trong méi trudng léng voi Streptomyces lydicus WYEC108, su tre ché sinh trưởng nắm đã được
quan sát (Yuan và Crawford, 1994) Xạ khuẩn lồi Streptomyces lydicus WYEC108
thé hién kha năng đối kháng mạnh trong điều kiện phịng Lab đối với các nắm gây
Trang 27get?
bệnh bằng cách tạo ra các chất kháng nấm ngoại bào (extracellular antifungal
metabolites) trên các dia Petri khảo sát Khi nuơi cấy Pythium ultimum hay
Rhizoctonia solani trên mơi trường lỏng với S Iydicus WYEC108, sw giới hạn khả
năng sinh trưởng của nấm được quan sát Khi sử dụng bào tử hay tơ nấm của S
ÿdicus dịng WYEC108 để áo xung quanh vỏ hạt đậu, thì hạt đậu được bảo vệ chống
sự xâm nhiễm của nắm P ultimum trong khi đĩ 100% những hạt khơng được áo với S lydicus bi nhiễm P ultimum trong vịng 48 giờ sau khi trồng, cĩ ít hơn 40% hạt được
áo bị nhiễm Khi những hạt được áo với xạ khuẩn được gieo vao trong dat 24 gid
trước khi chủng bệnh, thì ở 96 giờ sau đĩ, cĩ ít hơn 30% cây nẩy mầm bị nhiễm bệnh
Một thí nghiệm khác được thực hiện trong điều kiện điều khiển ẩm, nhiệt độ, khi xạ
khuẩn WYECI08 được áp dụng dưới dạng bào tử (10% CEU/g) để chống lại P
ultimum trén hat dau va hat cay béng gon, két qua cho thay lam tăng đáng kể số cây cịn đứng (khơng bị chết rap, chiều đài cây và trong lượng cây so với nghiệm thức khơng chủng xạ khuẩn ở cùng điều kiện Khuẩn ty của xạ khuẩn WYECI08 cĩ thể
định cư và đi chuyển đến các đầu mút của các rễ cây khi rễ mọc dài ra Sau thời gian
là 30 ngày, thì mật số của xạ khuẩn WYEC108 định vị tại các rễ khi chúng nay mam
và duy trì bền vững với mật số 10” CFU/g ở vùng rễ, trong khi đĩ khơng phải vùng rễ
thì mật số giảm đi 100 lần (từ 10” cịn 10” CEU/g)
Ngồi ra, nĩ cịn tắn cơng nấm gây bệnh mốc sương, sương mai, phấn trắng và những
bệnh trên lá khác (Walter và Crawford, 1995: Crawford và ctv, 2005) Một số lồi
thuốc Actinomycetes cịn cho thấy cĩ tác dụng như một loại thuốc trir c6 (De Frank va Putnam 1985) và thuốc trir sau (Hayashi va cn, 1991) Dịch tiết từ rễ cây cĩ thể kích thích sự tăng trưởng của xạ khuẩn Actinomycete để khống chế nấm bệnh, trong khi đĩ
xạ khuẩn sử dụng dịch tiết từ cây để tăng trưởng và tong hợp hợp chất kháng nắm
Ngồi ra, xạ khuẩn actinomycetes cịn tổng hợp nhiều loại men phân giải như
chitinases (Blaak va ctv, 1993; Gupta va ctv, 1995; Mahadevan va Crawford 1996),
glucanases (Harchand va Singh 1997; Thomas va Crawford, 1998), peroxidases
(Ramachandra, Crawford va Hertel, 1988) va nhitng men phân giải khác cĩ thể phân
hủy nâm hại
Trang 28Su dung Streptomyces griseoviridis tuéi vào đất đối với những cây giống bị bệnh Douglas-fir, giúp chống lại khả nang cu tri cua Fusarium Streptomyces griseoviridis đã làm giảm sự nhiễm bénh Fusarium khoảng 61% (Kasten Dumroese va ctv, 1998)
Chat kháng sinh được tiết ra bởi Sirepfomyces được thử nghiệm đã làm giảm đáng kể đối với bệnh thối rễ do nắm ở cỏ linh lăng và đậu nành (Xiao và e, 2001) Theo
Crawford và cv, 1993 đã phân lập và nghiên cứu đặc tính đối kháng của xạ khuẩn
Actinomycete đối với bệnh hại trong đất, đối với việc phân lập, mơi trường ít dinh
dưỡng được xác định là mơi trường phân lập tốt nhất, giảm nhiễm tạp, pH thích hợp
nhất cho xạ khuẩn phát triển là 6,5 — 8,0 Trong mơi trường thích hợp, xạ khuẩn cĩ khả năng đối kháng rất tốt với nắm Pythium ulfimum, khi chủng vào hạt giống trước
khi gieo cho thấy khơng anh hưởng xấu đến khả năng nây mầm mà lại cĩ tác dụng
phịng bệnh cao
Rafik và c/ (2007) đã nghiên cứu khả năng đối kháng của 10 dong Streptomyces spp
đối với nắm ®$ciefofium roj/Sii trên cây củ cải đường cho thấy khả năng đối kháng tốt
và xạ khuân phát triên rât tơt với mật sơ cao ở vùng rể của củ cải đường
1.3.4 Các điêu kiện ảnh hưởng đền sự phát triển của Xạ khuẩn
Xạ khuẩn cĩ thể sống được trong một khoảng biến động của điều kiện mơi trường
trong các hệ thống sản xuất nơng nghiệp với độ pH biến động từ 4 đến 8, nhiệt độ biến
động từ 45 đến 140 °F ( 7 đến 60 °C) điều kiện mơi trường bắt lợi xạ khuẩn sẽ hình
thành bảo tử Tuy nhiên, chúng sẽ chết nếu nhiệt độ vượt quá 160 °E (80 °C) Xạ
khuẩn thuộc chỉ Streptomyces hiéu khi, di dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu
thường là 25 — 30°C, pH tối ứu là 6.8-8, riêng xạ khuẩn ưa nhiệt hay ưa lạnh cĩ thể
phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn Chất kháng sinh chúng tạo ra ức chế vi
khuẩn, nắm sợi, các tế bào ung thư V.V
1.4 BIỆN PHÁP PHỊNG TRỪ BỆNH HAI RE TREN CAY CO MUI
Việc quản lý bệnh trong đất thường rất khĩ và kém hiệu quả, trong khi đĩ trên cây cĩ
múi lại cĩ nhiều bệnh khác nhau với nhiều tác nhân được nhiêu tác giả báo cáo rất
khác nhau, vì vậy việc quản lý bệnh chưa đồng bộ và hiệu quả chưa thật thuyết phục
Trang 29Muốn phịng trừ bệnh thối rễ do nấm Fusarium solani tt thi biện pháp rất quan trọng
là phải giảm Stress cho cây, tạo điều kiện đất thích hợp cho cây phát triển, tránh để đất
quá dẻ chặt vì bệnh nặng thường do cĩ sự tác dong gitta ndm Fusarium solani, tuyén tring va Phytophthora, nén viéc khéng ché cac tac nhan khac cũng sẽ làm giảm được
bénh do F; usarium solani gay ra va tao déu kién thuận lợi cho tác nhân gây bệnh trên
cây cĩ múi
1.4.1 Biện pháp hĩa học
Để phịng trừ bệnh thối rễ do ndm Fusarium solani, Labuschange va ctv (1996) báo cáo rằng việc sử dụng thuốc Prochloraz và Thiabendazole để xử lý đất cho cây con trong bầu đất cĩ tác dụng phịng trừ bệnh lên đến 92 và 80% Tuy nhiên ngồi đơng việc sử dụng thuốc khơng mang lại hiệu quả cao
Đề phịng trừ bệnh hại rễ trên cây cĩ múi như đối với bệnh do nấm Ewsariưm
‘solani, Timmer vd ctv (2003) dai khuyến cáo sử dụng Benomyl để tưới vào đất, tuy
nhiên hiệu quả xử lý khơng cao
Kết quả nghiên cứu biện pháp phịng trừ bệnh thối rễ trên cây cĩ múi của
Nguyễn Ngọc Anh Thư vờ cứ (2005) trong phịng thí nghiệm cho cả 3 loại thuốc Nustar, Bendazol, Ridomyl và nắm đối khang Trichoderma déu ngăn cản được sự
phát triển của đại bào tử và tiểu bào tử của nắm Ƒ1sarimm solani Kết quả thử nghiệm ngồi vườn cây cam sành cho kết quả số khuẩn lạc của nim Fusarium solani cé trong
1g đất sau khi xử lý thuốc giảm rất nhiều so với trước khi xử lý thuốc Ở các nghiệm
thức xử lý thuốc, số khuẩn lạc cĩ trong 1g đất giảm rất nhiều so với đối chứng và sự
khác biệt này rất cĩ nghĩa Cả 3 loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm như: Nustar, Bendazol, Ridomyl đều cĩ tác dụng gia tăng số rễ tươi giúp cây cĩ khả năng phục hồi
nhanh khi kết hợp thuốc với bĩn 7ichoderma, kết quả cũng cho thấyT*ichoderma và
phân hữu cơ nên xử lý sau khi xử lý thuốc trừ nằm từ 20 -30 ngày thì mới cĩ hiệu quả
cao
1.4.2 Biện pháp giỗng
Để phịng bệnh thối rễ do Ƒsarium, Labuschange và cv (1996) báo cáo là giống gốc
Trang 30dụng gốc ghép kháng nấm Phytophthora gây bệnh thối rễ cho thấy nhĩm gốc ghép như cam chua, cam pineapple, quít Cleopatra và Carrizo citrange cĩ khả năng chống
chịu bệnh nhưng khơng bằng khả năng chống chịu bệnh của gốc ghép thuộc nhĩm
Trifoliate orange va Swingle citromelo
1.4.3 Si dung Trichoderma
Chaurasia va Bhatt (2000) bao cdo rang nắm Phytopthora parasitica var piperina va Fusarium solani gay ra 1a nhitng loai bénh quan trọng ảnh hưởng đến giá trị kinh tế
khá cao Bộ rễ bị thối dẫn đến thân cây bị khơ héo và lá bị thối sẽ huỷ hoại bộ lá của
cây Nhưng khi giải quyết bằng cách sử dụng chất hố học thì rất nguy hiểm đến sức
khoẻ con người nên kể từ đĩ quản lý bệnh bằng biện pháp sinh học được thực hiện bang cach sit dung Trichoderma viride Nam duoc nhan én trong hữu cơ và được
cung cấp trước và sau giĩ mùa và khoảng 3 tháng cung cấp 1 lần Điều này đã cải
thiện bệnh một cách đáng kể
Trichoderma harzianum được phân lập, sử dụng như là tác nhân phịng trừ sinh học
và quản lý bệnh héo rũ trên cây tiêu, bệnh thối rễ cây gừng, bệnh thối rễ cây cam
Coorg, Ân Độ, bệnh trong vườn ươm và bệnh trên nhiều loại hạt và trong đất bị nhiễm
bệnh 7 harzianum được nhân lên nhiều lần trong đĩa lớn để dùng phân huỷ vỏ cây cà
phê và khoảng 4 tấn loại thuốc sinh học này được tiêu thụ trên thị trường trong những
nam gan day Trichoderma được cung cấp dưới dạng hỗn hợp, phối trộn giữa bánh
dầu neem hoặc chất hữu cơ từ vườn ruộng lkg/100kg và được ủ trong 2 ngày Cung
cấp hỗn hợp này khoảng 5kg/cây cho những cây dưới 10 năm tuổi và 10kg/cây cho
những cây trên 10 năm tuổi thì quản lý rất tốt bệnh thối rễ trên cây cam Coorg Trộn
Trichoderma harzianum v6i bánh đầu neem cĩ nhiều ích lợi trong việc quản lý bệnh thối rễ do nắm 7: harzianum duge nhân lên nhiều lần trong bánh dau neem, khi phân tích về đinh dưỡng trong khống chất đã thấy rằng sự tăng lên trong N, K, Ca, Mg, S,
Fe, Mn, Zn và Cu với sự tăng lên của pH Sử dụng 7: 2arziawm như là tác nhân
phịng trừ sinh học thì bên cạnh đĩ việc cung cấp tác nhân bảo vệ hệ thống rễ cũng
như cung cấp thêm chất dinh dưỡng cho cây là điều cần thiết Chất nền bằng xơ dừa
cũng kích thích sự phát triển nắm 7: #arzianum tắt t6t (Girija va ctv, 2000)
Trang 31Đặng Thùy Linh & Nguyễn Văn Hồ (2004) Đã sử dụng chế phẩm nắm Trichoderma
trộn chung với phân hữu cơ (tỉ lệ 1:100) để phịng trừ bệnh hại trong đất trên cây sầu
riêng, cây nhãn và cây cam sành, kết hợp với biện pháp canh tác và bĩn hai lần trong
năm (trước và sau mùa mưa) cho kết quả phịng trừ bệnh tốt Trường hợp bệnh trong
vườn đã bộc phát nặng nên tưới thuốc hố học trước 2-3 lần để giảm thiểu mật số mầm bệnh trong đất cũng như chặn đứng bộc phát bệnh trước sau đĩ 20- 30 ngày mới
sử dụng chế phẩm nắm Trichoderma két hợp phân hữu cơ
Theo Dương Minh (2010) nghiên cứu sử dụng sản phẩm Tricơ — ĐHCT trên 11 ha
Cam sành tại huyện Tam Bình và 8,5 ha cam sành tại Trà Ơn — Vĩnh Long đã giúp nhà
vườn phục hồi 60-70% rễ tùy theo điều kiện canh tác, cây cho năng suất ổn định và
đạt chất lượng và phẩm chat tét NAm Trichoderma c6 tac động chặn đứng bệnh thối
rễ trén cam sanh do ndm F solani gây ra, giúp rễ phục hồi nhanh sau 3 tuần
I 4.4 Sie dung Streptomyces
Theo Nguyễn Văn Hịa và Nguyễn Ngọc Anh Thư (2006), việc sử dụng thuốc hĩa học
trong đất cĩ thể làm ảnh hưởng khơng tốt đến mơi trường và hiệu quả khơng cao Chính vì vậy việc sử dụng thuốc cĩ nguồn gốc sinh học Antino — vate và Antino — lron (cĩ chứa S/zepfomyces spp) cĩ ý nghĩa thực tiển rất lớn trong sản xuất nơng
nghiệp bền vững, kết quả khảo nghiệm trên cây cam sồn để phịng trừ bệnh thối rễ
cho thấy việc sử dụng hai sản phẩm này cho kết quả phịng trừ khơng thua kém gi so
với sử dụng thuốc Ridomyl Gold mà nĩ cịn giúp hệ thống rễ phát triển tốt hơn
1.5 SO LUQC VE CHANH VOLKA (Citrus volkarmeriana)
Giéng géc ghép Volkameriana (Citrus Volkameriana) là giỗng lai giữa chanh lemon
và cam chua, cĩ nguồn gốc từ Ý Chanh Volkamer gần đây được quan tâm như là một
giống gốc ghép triển vọng nhờ tính chống chịu bệnh malsecco và tính chống chịu
bénh théi ré Phytophthora (do P parasitica) Cây cĩ múi ghép trên gốc ghép Volka
cĩ sinh trưởng mạnh, cho năng suất cao nhưng phẩm chất trái khơng ngon bằng ghép trên chanh nhám mặc dù chịu lạnh tốt hơn Gốc Volka cũng chống chịu được virus
tristeza và ít nhiều chịu mặn Tương tự như cam chua, chanh Volka mọc tốt trên đất
kiềm, tuy nhiên nĩ rất mẫn cảm với tuyến trùng (James và ctv, 1990)
Trang 32Ban dau, loai gốc ghép này được chú ý do khả năng kháng bệnh Malsecco của nĩ
Đây là loại gốc ghép “đa năng” nhất là khi ghép với chanh, chanh lime và một vài loại cây cĩ múi khác Gốc ghép được chọn vì đây là gốc ghép sinh trưởng tốt, dễ
ghép, dễ nhân giống, tỷ lệ nầy mầm cao và phải dễ giâm cành, Gốc ghép phải tạo nên
tơ hợp với giống được ghép, độ đồng dều cao: giống phải đa phơi; thích ứng điều
kiện nơi trồng như đất đai, nguồn nước, thời tiết và cuối cùng là kháng và chống chịu với một số dịch hại nguy hiểm (Castle vờ ctv, 1989)
Theo Laduschagne va ctv (1992) Chanh Volka 1a giống rất mẫn cảm với nấm
Fusarium solani, day 1a nam c6 chira nhiều độc tố nhưng chủ yếu là fusaric acid,
độc tố này kềm hãm hoạt động của hệ thống Enzyme cây ký chủ phá vở độ thẩm thấu
của màng tế bào và kềm hãm hoạt động hơ hấp của cây làm giảm mức độ đề kháng của cây
Các giống cây cĩ múi thuộc nhĩm chanh, quýt và cam cĩ khả năng tiếp hợp rất tốt
với gốc ghép Volka với điểm kiểu hình tiếp hợp trung bình là 4 (Aubert và Vullin,
1998) Các kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Võ Hữu Thoại và cộng
sự năm 2004 khi sử dụng phương pháp đánh giá nhanh khả năng tiếp hợp cam quýt
trên một số gốc phép bằng cách ghép trao vịng vỏ, nhĩm tác giả khang định Gốc
ghép Volka tiếp hợp tốt với nhĩm cam và quít Các giống cây cĩ múi thuộc nhỏm
bưởi và tangelo cĩ khả năng tiếp hợp khá tốt với gốc ghép Volka với điểm kiểu hình
tiếp hợp là 3-4, mức độ tiếp hợp này vẫn cĩ thể chấp nhận được cho các giống bưởi
sinh trưởng tốt trên gốc ghép Volka (Nguyễn Thanh Bình và ctv, 2005)
Citrus voikarmeriana cĩ khả năng chịu đựng muối Clorua, thích ứng tốt với vùng đất
khơ hạn nhưng cần các loại đất thống khí Nĩ chịu đựng trung bình ở đất nặng và
chịu đựng kém các loại đất yếm khí, khơng thơng thống Hạt nây mầm dễ dang, cay
con dồi dào sinh lực và khả năng đâm rễ tốt Ghép dễ và trồng lại khá tốt Đây là một
gốc ghép đáng quan tâm trong trường hợp các nước chưa phát triển hệ thống nghiêm
ngặt cấp giấy chứng nhận hoặc gặp phải các vấn đề về đá vơi hoặc nhiễm mặn, như
trường hợp ở các nước như Ai Cập hay là các quốc gia vùng Trung Đơng
Thơng thường trong một vườn cây, các cây cĩ múi được trồng cách nhau 6m x 4m,
với mật độ trung bình khoảng 400cây/ha Một số đữ liệu về các năng suất hạt/quả và
Trang 33nang suat quả trên cây ghi nhận được trong điều kiện khí hậu Á nhiệt đới vùng Địa Trung hải tại đảo Corse: Năng suất đạt 60kg/cây, hạt 0,7kg/cây, cĩ khoảng 10 — 12
hạt /cây Tuy nhiên những quả đầu tiên xuất hiện vào năm thứ 3 hoặc thứ 4 sau khi trồng và nếu các cây được nhân giống bằng lối gieo hạt thì đến khoảng năm thứ 15 sẽ cĩ vụ thu, hoạch đầy đủ Tuy nhiên, nếu những cây dùng lấy hạt giống gốc phép là
những cây trồng bằng ghép thì cho quả sớm (Nguyễn Minh Châu và ctv, 1990)
Trang 34Chuong 2
PHUONG TIEN VA PHUONG PHAP THUC HIEN 2.1 PHUONG TIEN THUC HIEN
- Thời gian: Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2010 đến tháng 10/2010 |
- Nơi thực hiện: Phịng thí nghiệm và nhà lưới Bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Cây
Ăn Quả Miền Nam
- Vật liệu và thiết bị:
+ Đĩa Petri, ống nghiệm, micropippet, lam đếm bao tử Thoma, nước cất khử
trùng, bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, bơng gịn khơng thấm nước, bơng gịn thấm nước, ống chích y tế, viết, thước, số theo dõi thí nghiệm, dụng cụ đo nhiệt độ,
âm độ, ly nhựa, hạt chanh Volka, hỗn hợp đất, cây cam sành, chậu nhựa K;HPO¿,
MgSO,, tinh bot tan, CaCO v.v
+ Tủ cấy vi sinh, máy lắc đều cĩ điều chỉnh nhiệt độ, tủ lạnh dùng trữ mẫu, tủ
sấy, nồi hấp tiệt trùng, máy xay sinh tố, cân 4 số, cân điện tử, máy do pH, kính hiển vi soi nổi, kính hiểm vi huỳnh quang, kính hiển vi cho ảnh ngược, máy đếm khuẩn, máy khuấy từ, lị vi ba, cân bàn, máy nước cất, tủ điều chỉnh nhiệt độ âm độ, cân kỹ thuật 2
số lẻ,
- Mơi trường sử dụng:
a PDA (Potato Dextrose Agar)
b Low Nutrient Mineral Salts Agar Modified (LNMSM) (Kuster vd ctv, 1964) c Inorganice Salt Starch agar medium ISS (Yoshida va ctv, 1994)
d Casamino Acids Yeast Extract Glucose Agar Modified (YCEDM) (Hardission
va ctv, 1978)
e Water Yeast Extract Agar (WYE) (Williams vd ctv, 1982)
f MSSCM (Mineral Salts Starch Casein Agar Modified) Yoshida vd ctv, 1994)
g CYD (Casamino acids Yeast Extract Glucose Agar) (Hardission va ctv, 1978)
Trang 35
- Nguồn vi sinh vat: Dong xa khudn STREPTOMYCES — SOFRI 1 va Fusarium
solani được Bộ Mơn BVTV, Viện CAQ miền Nam phân lập và tồn trữ — Viết tắt là Streptomyces — SOFRI 1
(b) Hinh dang bao tir
Hình 2.2: Nguén nam Fusarium solani - (a) nguén ném được tơn trữ, (b) Bao tir nam Fusarium solani
- Các cơng thức mơi trường:
* Mơi trường PDA: Khoai tây - 200g; Thạch — 18g; đường — 20g: H;O - 1 lít
* Moi truong WYE: Yeast Extract — 0,25g; Agar — 18g; KsHPO, — 0,5 g; H,O - 1 lit
* Méi truong YCEDM: Yeast Extract — 0,3g; Casamino Acid — 0,3g; D-glucose —
0,3g; Agar — 18g; KzZHPO, — 2g; H20 - 1 lit
* Mơi trường LNMS: NaCL — 0,2g; MgSO,.7H20 — 0,05g; CaCO; — 0,02g;
_ FeSO,4.7H,0 — 0,01g; tinh bét tan — 0,1g; Yeast extract — 0,1g; Agar — 18g; K,HPO,-— 2g; HạO - 1 lít
Trang 36* Mơi trường MSSCM: NaCL — 2g; MgSO,.7H20 — 0,05g; CaCO; — 0,02g; EFeSOx.8HO — 0,01g; KNO; — 2g; Tỉnh bột tan — 10g; Casein ~0,3g; Agar — l8g;
K;HP0a _ 2g; HạO - 1 lit
* Mơi trường ISS: Tỉnh bột tan — 10g; (NH4) ;SO;— 2g; KạHPOx-— 1,0g; MgSO¿ 7
HạO - lg; NaCL — lg; CaCO; - 2g: FeSO¿ 7HạO ~ lg; MnCl, 4H,O — 1g; ZnSO,
7HO - lg; Agar — 12g HạO - 1 lít
* Mơi trường CYD: Casamino Acids — 0,5g; Yeast extract — 0,8g; D-glucose — 0,4g;
K HPO, — 0,5g va KH,PO, — 0,5g; H20 - 1 lit 2.2 PHUONG PHAP THUC HIEN
2.2.1 Khảo sát mơi trường dinh dưỡng nuơi cấy thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn Streptomyces —SOFRI 1
* Muc dich: Nham xac định mơi trường dinh dưỡng thích hợp nhất cho việc nhân mật
số xạ khuẩn Streptomyces ~ SOFRI 1, tir dé cd thé ap dung dé nhan mật số phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo
* Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức
tương ứng 6 loại mơi trường với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại được thực hiện trên 3 đĩa
Petri
* Chuẩn bị Xạ khuẩn: (Theo phương pháp của Aoki và cív, 2007):
Lay 10ml nước cất đổ vào đĩa Petri chứa Streptomyces đã được nuơi cấy 10 ngày
trước đĩ, bào tử và sợi khuẩn ty được cạo khỏi mơi trường nuơi cấy Dung dịch này
được lọc qua 2 lớp bơng gịn thấm nước thơng qua áp lực bơm của xi lanh Dung dịch cuối cùng được sử dụng cho các thí nghiệm sau
* Cách thực hiện: Cho 0,2 ml huyền phù chứa xạ khuẩn ở nồng độ 105CFU/ml vào
đĩa petri chứa 8 ml mơi trường như trên (6 loại) đã chuẩn bị sẵn, dùng que thủy tinh
chà đều trên bề mặt mơi trường rồi đặt tất ca dia petri trong tủ úm ở 28C và điều kiện
sáng tối xen kẻ nhau trong 120 giờ
* Chỉ tiêu ghỉ nhận: Ghi nhận mức độ phát triển của khuẩn lạc ở các thời điểm 24,
48, 72 và 96 giờ sau khi nuơi cấy theo phương pháp của Crawford và cfv (1993) và
điểm số lượng khuẩn lạc ở 48, 72 và 96 giờ sau khi chủng
> Đánh giá mức độ phát triển khuẩn lạc:
(-): Khơng cĩ sự sinh trưởng; (+): Sinh trưởng rất yếu; (++): Một số khuẩn lạc sinh
trưởng; (+++): Sinh trưởng khuẩn lạc tốt
> Đếm số lượng khuẩn lạc: Đếm khuẩn lạc mọc riêng lẻ rõ ràng trên mơi trường
nuơi cây
Trang 372.2.2 Xác định pH thích hợp cho xạ khuẩn phát triển trên mơi trường YCEDM
* Mục đích: Nhằm xác định pH nào thích hợp nhất cho việc nhân mật số xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1, tir đĩ cĩ thể áp dụng để nhân mật số phục vụ cho những
nghiên cứu tiếp theo
* Phương pháp: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên gồm 6 nghiệm thức
tương ứng với 6 mức độ pH khác nhau (5,5 — 6,0 — 6,5 — 7,0- 7,5 và 8,0), với 3 lần lập
lại và mỗi lần lặp lại thực hiện trên 3 đĩa
* Các bước tiến hành:
- Pha và điều chỉnh pH của mơi trường: Tất cả thành phần mơi trường được
hịa tan đều, sau đĩ chia làm 6 phần để chỉnh về 6 mức độ pH khác nhau (5,5 — 6,0 — 6,5 — 7,0- 7,5 và 8,0), sao cho thành phần dinh dưỡng giống nhau giữa các nghiệm
thức Sau đĩ đo và điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N để đạt mức pH theo yêu
cầu và sau đĩ đem thanh trùng bằng Aufoclave ở 121°C trong 20 phút
- Chuẩn bị nguồn xạ khuẩn: Xạ khuẩn được nuơi trên mơi trường với pH
=7,0trong 10 ngày trong tủ úm cĩ điều chỉnh sáng tối xen kẽ nhau ở 28°C
- Cách thực hiện: Cho 0,2 mÌ huyền phù chứa xạ khuẩn ở nồng độ 10°CFU/ml
cho vào đĩa petri chứa 8 ml mơi trường YCED (ở 6 mức pH khác nhau) đã chuẩn bị
sẵn, dùng que thủy tính chà đều trên bề mặt mơi trường rồi đặt đĩa petri trong tủ úm
trong 120 giờ cĩ điều chỉnh sáng tối xen kẻ nhau ở 28°C
* Chỉ tiêu ghi nhận: Mức độ phát triển của khuẩn lạc ở các thời điểm 24giờ, 48 giờ,
72 giờ, 96 giờ sau khi nuơi cây theo phương pháp của Crawford va ctv (1993) va đếm
mật số khuẩn lạc hiện diện ở thời điểm 48giờ, 72giờ, 96 giờ và 120 giờ sau khi nuơi cay
>_ Đánh giá mức độ phái triển khuẩn lạc:
(-): Khơng cĩ sự sinh trưởng; (+): Sinh trưởng rất yếu; (++): Một số khuẩn lạc sinh truéng; (+++): Sinh trưởng khuẩn lạc tốt
> Đếm số lượng khuẩn lạc: Đếm khuẩn lạc mọc riêng lẻ rõ ràng trên mơi trường
nuơi cấy
2.2.3 Khảo sát khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối với nắm Fusarium solani
trong điều kiện phịng thí nghiệm
* Mục đích: Khảo sát khả năng đối kháng của xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1 với
nam Fusarium solani trong dia Petri
* Chuẩn bị nấm Fusarium solani: Nam Fusarium solani dugc chuan bj sẵn trên mơi
trường PDA sẵn sàng để sử dụng
Trang 38* Chuan bj nguén xa khuan: Xa khuan Streptomyces — SOFRI 1 dugc nhan nudi va tạo bào tử trên mơi trường YCEDM, nuơi được 10 ngày, tiếp theo thu thập bào tử theo
phương pháp của Aoki va ctv (2007), sau đĩ được pha lỗng ở các nồng độ thích hợp
khác nhau 10Ỷ, 10%, 10°, 10°CFU/ml
* Bồ trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức
tương ứng 4 nồng độ xạ khuẩn (10, 10', 10”, 105 CFU/ml) và 1 nghiệm thức đối
chứng chủng nước sạch với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 3 đĩa
* Phương pháp thực hiện:
+ Cách thực hiện I Phương pháp Zarandi va ctv, 2009: Cho 0,1 m1 huyền
phù chứa xạ khuẩn ở mỗi nồng độ (10”, 10f, 107, 10” CEU/ml) cho vào 1 bên đĩa petri
chứa § ml mơi trường PDA đã chuẩn bị sẵn, chà đều trên 1⁄2 bề mặt mơi trường, ủ ở
28°C trong 5 ngày sau đĩ đục khoanh khuẩn ty nấm #⁄sarim solani (đã được nuơi
cấy 7 ngày trên mơi trường PDA ) và đặt vào giữa đĩa petri chứa xạ khuẩn
Các chỉ tiêu ghỉ nhận: Khả năng đối kháng của xạ khuẩn đối véi ndm Fusarium
solani ở các thời điểm 24giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ sau khi chủng thơng qua sự phát triển của tơ nắm Ghi nhận đối kháng theo phương pháp của Zarandi và cứv, 2009:
(-): Khơng giới hạn sự phát triển của nam = Nắm phát triển khơng khác biệt
so với đối chứng: (+): Sự ức chế yếu: Bán kính tản nắm từ 5-9mm; (++): $w ức chế trung bình: Bán kính tản nắm từ 1-4mm; (+++): Sự ức chế hồn fồn = Nam khơng mọc được
+ Cách thực hiện 2: Mơi trường PDA đã được chuẩn bị sẵn, đưa vào lị viba
khoảng 3 — 5 phút cho mơi trường lỗng và chờ, lấy ra và đợi đến khi nhiệt độ hạ xuống cịn khoảng 50°C, sau đĩ cho 2ml bào tử S/zèfomyces — SOFRI 1 ở các nồng
d6 nhu 10° CFU/ml; 10* CFU/ml; 10° CFU/ml; 10° CFU/ml vao méi binh méi trudng,
dùng tay lắc nhẹ sau đĩ đỗ ra đĩa Petri, tiếp theo đục khoanh khuẩn ty nấm Fusarium
soÏani (đã được nuơi cấy 7 ngày trên mơi trường PDA ) và đặt vào giữa đĩa petri chứa
xạ khuẩn
Ghi nhận chỉ tiếu: Đo đường kính của nắm Ƒsarium solani ở các thời điểm 24
gid, 48 gid, 72 gid, 96 gid va 120 giờ sau khi chủng
2.2.4 Khảo sát khả năng ảnh hưởng của xạ khuẩn ,S/repømyces - SOFRI1 đối
Trang 39- Khao sat kha nang doi khang cia xa khudn déi voi ndm Fusarium solani gay
bệnh trên chanh Volka ở các mật độ khác nhau
* Chuẩn bị: Ly nhựa cĩ đường kính miệng 9cm cĩ đục lỗ xung quanh đáy ly, hỗn
hợp đất đã được khử trùng, hạt chanh Volka đã được thu thập và được xử lý sạch sẽ,
Xạ khuẩn Streptomyces — SOFRI 1 chuẩn bị ở mật số 10', 105, 10° CFU/ml, Fusarium solani c6 mat s6 10° bao ti/ml
* Phuong phap: Thi nghiém duoc bé tri hoan toan ngẫu nhiên với 6 nghiệm thức trong đĩ, 3 nghiệm thức tương ứng với 3 mật số xạ khuẩn 10', 10°, 10° véi cung mot nong d6 Fusarium solani mật số 10 bào tử/ml; một nghiệm thức chỉ chủng Ƒsarium
solani 10°bao tit/ml; một nghiệm thức chỉ chủng xạ khuẩn với nồng độ 10”CFU/ml và nghiệm thức đối chứng chủng nước sạch, 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại trên 1 ly
nhựa
+ Cách thực hiện 1: (Theo phương pháp ctia Lynch vd ctv, 1992)
Cho hỗn hợp đất vào từng ly nhựa, hạt chanh Volka sau khi được khử trùng bề mặt Ca(CLO) 1% và rửa lại 3 lần với nước cất vơ trùng 9 hạt chanh Volka được tưới
với 18 ml xạ khuẩn ở các mật sé (10*, 10°, 10° CFU/ml), sau đĩ gieo hạt đều trên bề
mặt ly và phủ 1 lớp hỗn hợp đất mõng lên trên, tưới 18 ml huyền phù chứa F1sariưm
solani 10° bao té/ml, một nghiệm thức chỉ chủng Ƒsariưmn solani 10° bao tử/ml, một
nghiệm thức chỉ chủng xạ khuẩn 10 CFU/ml cũng được thực hiện tương tự, riêng
nghiệm thức đối chứng thực hiện tương tự nhưng chỉ sử dụng nước sạch
+ Cách thực hiện 2: Thực hiện giỗng như cách thực hiện 1 nhưng khác là hạt chanh
Volka được ngâm với các mật số xạ khuẩn khác nhau khoảng 5 giờ sau đĩ mới thực
hiện các bước tiếp theo
Tat ca cdc ly nhựa được đặt trong phịng đến 25 ngày
* Ghỉ nhận chỉ tiêu ở thời điểm 25 ngay sau khi gieo:
> Tỷ lệ hạt nây mầm thành cây (%)
> Chiều cao cây, chiều dài rễ, số lượng rễ tươi, rễ phụ (cm)
> Trọng lượng tươi, trọng lượng khơ của thân, lá cây (g)
> Trọng lượng tươi, trọng lượng khơ của rễ cây (g)
* Trọng lượng khơ thân và rễ được ghỉ nhận bằng cách: Sau khi cân trọng lượng
tươi xong, để từng phần vào giấy bạc cĩ ký hiệu rõ ràng gĩi lại và sau đĩ đem tất cả để vào tủ sấy (sấy ở 60°C đến khi nào lấy ra cân mà trọng lượng của nĩ khơng thay
đổi là được)
Trang 40Hình 2.3: Hình bồ trí thí nghiệm trong ly nhựa (a) khơng ngâm hạt (b) cĩ ngâm hạt
5 giờ sau khi gieo
2.2.5 Đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đối với bệnh thối rễ do ndm Fusarium
soÏani trong điều kiện nhà lưới
* Mục đích:
Xác định mật số và đánh giá hiệu quả phịng trừ nắm Fusarium solani trén cam
sành ghép trên gơc ghép chanh Volka ở điều kiện nhà lưới
* Chuẩn bị cây: Cây cam sành được ghép trên gốc ghép Chanh Volka 4 tháng tuổi
trong chậu cĩ kích thước cao 60 cm, đường kính gốc ghép 1.2 phân, mỗi chậu 1 cây
* Chuẩn bị xạ khuẩn: Dịng xạ khuẩn được nuơi và tạo bào tử trên mơi trường YCED sau đĩ thu thập và được pha lỗng ở các mật số khác nhau 10', 10°, 105
-_ 10CFƯ/mI
_ * Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được tiến hành theo thể thức hồn tồn ngẫu nhiên
` với?7 nghiệm thức tương ứng 4 ngiệm thức chủng xạ khuẩn với mật số 10, 10°, 105
_ 10’CFU/ml cing véi Fusarium solani mat số 105 bào tử/ml, một nghiệm thức chủng
‘ Streptomyces — SOFRI 1 mat sé 10°CFU/ml, mét nghiém thirc tao Stress và cuối cùng
4 là một nghiệm thức đối chứng chủng nước sạch (khơng tạo Stress) và 4 lần lặp lại mỗi
lần lặp lại 3 cây
* Cách thực hiện:
Tạo Síress: Dùng tay lắc nhẹ cây cam sành theo 4 hướng của chậu Các chậu cam
sành (trừ nghiệm thức đối chứng) đặt trong điều kiện oi nước với mỗi chậu cho vào túi
nylon, cho thêm vào mỗi chậu là 3lít nước cất vơ trùng lấy dây thắt túi nylon lại và để
khoảng 10 ngày lấy túi nylon ra sau đĩ lần lượt lấy ống xi lanh loại lớn bơm 200ml
Streptomyces — SOFRI 1 vao 4 huéng của mỗi chậu gần gốc cây ở các mật số khác
nhau tương ứng với các nghiệm thức khác nhau, khoảng 15 ngày sau tiếp tục bơm
;