Trong nghiên cứu này, được tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng như nguồn carbon, nguồn nito, vitamin, dịch chiết cà rốt và dịch chiết cà chua đến sự tăng trưởng tế bào cũng như sản xuất CoQ10 của các chủng vi khuẩn R. Palustris PN16, PN21 và PN31 được phân lập tại Việt Nam.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 KHẢO SÁT MƠI TRƯỜNG NI CẤY THÍCH HỢP CHO VIỆC SẢN XUẤT UBIQUINON Q10 TỪ VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA KHƠNG LƯU HUỲNH RHODOPSEUDOMONAS PALUSTRIS Lê Thị Thanh Thảo*, Nguyễn Văn Thanh*, Trần Thị Hồng Kim** TÓM TẮT Mục tiêu: Ubiquinon Q-10 (CoQ10) thuộc nhóm chất isoprenoid quinon diện tế bào sinh vật CoQ10 tham gia vào chuỗi hơ hấp tế bào có vai trò chất chống oxy hóa Hiện nay, CoQ10 sử dụng bổ sung thực phẩm chức mỹ phẩm Ở người lớn tuổi có tiền sử bệnh tim mạch, CoQ10 bổ sung liệu pháp trị liệu hổ trợ Và điều làm cho nhu cầu sử dụng CoQ10 tăng lên đáng kể CoQ10 có nhiều tổ chức sinh hoc, từ vi sinh vật vi khuẩn nấm men, loài động vật thực vật Việc sản xuất CoQ10 từ vi khuẩn có khuynh hướng phát triển mạnh trở thành nguồn cung cấp chủ yếu cho ngành công nghệ dược phẩm Phương pháp:Trong nghiên cứu này, tiến hành khảo sát yếu tố ảnh hưởng nguồn carbon, nguồn nito, vitamin, dịch chiết cà rốt dịch chiết cà chua đến tăng trưởng tế bào sản xuất CoQ10 chủng vi khuẩn R Palustris PN16, PN21 PN31 phân lập Việt Nam Kết quả: Bổ sung vào môi trường nuôi cấy mannitol, pepton, cao nấm men vitamin E làm tăng việc sản xuất CoQ10 từ chủng vi khuẩn khảo sát Chọn phương pháp chiết Q10 từ tế bào vi khuẩn chủng PN31 có hàm lượng Q10 399,8 µg/g sinh khối sau thời gian ni cấy 72 Từ khóa: Ubiquinon Q-10, môi trường nuôi cấy, Rhodopseudomonas palustris ABSTRACT STUDY ON CULTURE CONDITIONS FOR CoQ10 PRODUCTION FROM PSEUDOMONAS PALUSTRIS -A PRUPLE NON-SULFUR PHOTOTROPHIC BACTERIA Le Thi Thanh Thảo, Nguyen Van Thanh, Tran Thi Hong Kim * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 216 - 221 Objective: Coenzym Q10 (CoQ10) function in the mitochondrial respiratory chain and serves as a lipophic antioxidant There is an increasing interest in the use of CoQ10 as a nutritional supplement and cosmetic ingredient The use of coenzyme Q10 (CoQ10) as a complementary therapy in heart failure will increase in proportion to the growth of the ageing population and the expansion of statins consumption It is known that CoQ10 is produced in a wide variety of organisms, from microorganisms such as bacteria and yeast, to higher animals and plant Economical production of CoQ10 by microbes will become more important due to the growing demands of the pharmaceutical industry The bacteria strains Rhodopeudomonas palustris PN16, PN21 and PN31 - purple non-sulfur phototrophic bacteria isolated in VietNam produced CoQ10 Method: Optimimization of cultural conditions such as carbon source, vitamins, carrot juice and tomato juice in order to improved the production of CoQ10 from the bacteria strains Rhodopeudomonas palustris PN16, PN21 and PN31 - purple non-sulfur phototrophic bacteria isolated in VietNam produced CoQ10 Results: Optimal the supplements in our experiment including mannitol, peptone, 0,75 g/l yeast extract and µg/l vitamin E were added to the original culture to enhance production of Q10 The method selected for CoQ10 * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh ** Đại học Khoa học Tự nhiên TP Hồ Chí Minh ĐT: 0918634393 Email: thanhthaovn2002@gmail.com Tác giả liên lạc: ThS Lê Thị Thanh Thảo 216 Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học extraction had been demonstrated that it is a highly effective protocol for extracting CoQ10 from bacteria Bacteria can produce CoQ10 reached 399,8 µg/g dry cell weight after 72 hours Keywords: Ubiquinon Q-10, culture conditions, Rhodopseudomonas palustris (1971) Kawasaki cải tiến(1) ĐẶT VẤN ĐỀ Ubiquinon CoQ10 thuộc nhóm chất isoprenoid quinon diện tế bào sinh vật Hợp chất Q-10 có bốn chức sinh lý chủ yếu: thành phần chuỗi truyền điện tử đóng vai trò quan trọng trình sinh tổng hợp ATP; giữ hoạt lực oxy hoá khử màng tế bào; chất chống oxy hố nội sinh, ức chế q trình peroxid hoá lipid – khử gốc tự do; tham gia trì tính bền vững linh động màng tế bào Do vậy, hợp chất Q-10 nghiên cứu nguồn nguyên liệu lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm mỹ phẩm Vi khuẩn quang dưỡng tía nguồn vi sinh vật lý tưởng để thu nhận Q-10 chúng có khả tổng hợp, tích luỹ hàm lượng ubiquinon cao vi sinh vật khác, đặc biệt cho sản phẩm chủ yếu Q-10 Bên cạnh đó, vi khuẩn tía quang dưỡng tía ni cấy dễ dàng mơi trường đơn giản ánh sáng mặt trời Vì nguồn tiềm thu nhận lượng lớn chấtcó tác dụng sinh học, đặc biệt ubiquinon Q-10 Chính thế, chúng tơi tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy phù hợp cho việc sản xuất Q-10 từ chủng Rhodopseudomonas palustris phân lập Việt Nam ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng Vi khuẩn quang dưỡng tía khơng lưu huỳnh Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 PN31 phân lập Việt Nam Trung tâm Sinh học – Đại học Khoa học Tự Nhiên cung cấp Phương pháp nghiên cứu Nuôi cấy vi khuẩn Môi trường nuôi cấy tăng sinh chủng Rhodopseudomonas palustris môi trường SA (sodium acetate) Imhoff Truper thiết kế Chuyên Đề Dược Học Môi trường SA: Natri acetate, Natri K2HPO4, (NH4)2SO4, succinate, KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaCl, CaCl2.2H2O, Na2S2O3.5H2O, Dung dịch vi lượng, thêm nước cất vửa đủ Khảo sát thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn Khảo sát số thành phần môi trường ảnh hưởng đến tăng trưởng vi khuẩn nguồn carbon lên tăng trưởng bao gồm: carbon, nitơ, chất kích thích tăng trưởng, nguồn vitamin Khảo sát ảnh hưởng nguồn vitamin tiền tố tự nhiên lên sinh tổng hợp Q-10 Sau chọn vitamin cho hàm lượng Q10 cao tiến hành chọn nồng độ thích hợp sau: mg/100ml, mg/100ml, mg/100ml 7,5 mg/100ml Sử dụng môi trường SA lỏng tối ưu có bổ sung tiền tố tự nhiên (dịch ép cà chua cà rốt) có nồng độ thay đổi 25%, 50%, 75%(2,4) Dịch chiết cà rốt cà chua tự pha chế Phương pháp xác định mật độ tế bào Dịch ni cấy pha lỗng dung dịch nước muối sinh lý vô trùng Ở độ pha lỗng, lấy 200 µl cho vào đĩa petri có chứa mơi trường thạch SA, dùng que trải thủy tinh vô trùng trải vi khuẩn, đem ủ 37oC, 72 giờ, chiếu sáng đèn neon điều kiện kỵ khí Đếm số khuẩn lạc hộp có 30-300 khuẩn lạc Số vi khuẩn /ml = Số khóm × 10số thứ tự hộp +1 Chiết xuất Q10 từ vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris Phương pháp Collins cộng sự(3) Cho 200mg cắn tế bào vi khuẩn vào 100ml hỗn hợp cloroform-methanol (2:1), thêm 20g bi thủy tinh Khuấy hỗn hợp máy khuấy từ 217 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học 60 phút Lọc ly tâm, thu nhận dịch chiết có chứa Q-10 Cơ quay với tốc độ 100 vòng/phút nhiệt độ 40 oC Hỗn hợp dùng lượng nhỏ hồ tan n-hexan để định tính Phân tích sản phẩm thu Định tính sắc ký lớp mỏng Hòa mẫu vào thể tích nhỏ nhexan Chấm 10µl mẫu Q-10 chuẩn mẫu dịch chiết có chứa Q-10 lên TLC Merck 60 F254 Bản mỏng Merck 60 F254, Dung môi triển khai n-hexan:etyl acetat (4: 1) n-hexan:etyl ether (4: 1) Phát đèn UV 254 nm (3,5) Q10 chuẩn hãng Sigma Định tính phương pháp quang phổ Quét phổ hấp thụ vùng quang phổ tử ngoại 200-380 nm máy quang phổ tử ngoại Định lượng Q-10 phương pháp quang phổ hấp thu tử ngoại Pha dung dịch Q-10 chuẩn theo giai nồng độ xác định, đo mật độ quang dung dịch độ dài sóng hấp thu cực đại vừa xác định được) Sau thiết lập đường cong chuẩn nồng độ Q-10 Tiếp theo xác định mật độ quang dung dịch cần định lượng, từ đồ thị suy nồng độ dung dịch cần định lượng KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Nuôi cấy vi khuẩn môi trường SA c A B C Hình 1: Vi khuẩn R palustris quan sát kính hiển vi Chủng PN16, (b) Chủng PN21, (c) Chủng PN31 Trên môi trường lỏng SA, chủng vi khuẩn khảo sát cho màu sắc khác chủng PN16 màu vàng nâu, chủng PN21 nâu đậm Bảng Ảnh hưởng nguồn cung cấp carbon lên tăng trưởng chủng vi khuẩn PN16, PN21 PN31 Lô Nguồn carbon Chứng (SA) Glucose Xylose Mannitol Natri citrat Na benzoate chủng PN31 màu đỏ tía phù hợp với đặc điểm chung chủng vi khuẩn R palustris Nhuộm Gram quan sát kính hiển vi: chủng vi khuẩn khảo sát trực khuẩn Gram (-), có kiểu xếp tế bào đặc trưng riêng lẻ c xếp hình hoa Khảo sát điều kiện ni cấy Ảnh hưởng nguồn cung cấp carbon lên tăng trưởng chủng vi khuẩn PN16, PN21 PN31 trình bày Bảng 218 Tổng số tế bào 1ml Chủng Chủng Chủng PN16 PN21 PN31 8 1,01.10 7,3.10 6,6.10 7 3,2.10 5,6.10 3.10 7 3,5.10 3,6.10 3,5.10 1,51.10 1,04.10 1,01.10 6 10 2,7.10 3,5.10 6 3,8.10 4,5.10 3.10 Cả 03 chủng có khả sử dụng nhiều loại carbon hữu khác phát triển tốt nguồn carbon mannitol Ảnh hưởng nguồn nitơ lên tăng trưởng trình bày Bảng Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Bảng 2: Ảnh hưởng nguồn nitơ lên tăng trưởng chủng PN16, PN21 PN31 Lô TN Nguồn nitơ Chứng KNO3 (NH4)2HPO4 Ca(NO3)2 CO(NH2)2 Bổ sung Pepton Tổng số tế bào 1ml Chủng Chủng Chủng PN16 PN21 PN31 8 1,55.10 4,2 10 7,8 10 3,1.10 1,02 10 2,06 10 7 3,5.10 5,6 10 2,13 10 8 2,25.10 6,6 10 1,01 10 2,4 10 3,6 10 3,2 10 5,2 10 2,12 10 3,0 10 Nghiên cứu Y học trường bổ sung vitamin E thu sinh khối cao nhất, tiếp đến môi trường bổ sung vitamin C, môi trường SA môi trường bổ sung vitamin A cho sinh khối thấp Chiết xuất phân tích hợp chất Q10 Chiết xuất định tính Q10 phương pháp sắc ký lớp mỏng Chiết tách Q-10 từ dịch chiết vi khuẩn phương pháp sắc ký lớp mỏng pha thường Kết đánh giá Bảng cho thấy mơi trường có nguồn nito ammonium bổ sung peptone ba chủng vi khuẩn R palustris PN16, PN21 PN31 thu nhận cao Ảnh hưởng nồng độ chất tăng trưởng lên tăng trưởng chủng vi khuẩn trình bày Bảng Bảng 3: Ảnh hưởng nồng độ chất tăng trưởng lên tăng trưởng chủng PN16, PN21 PN31 Lô chất Tổng số tế bào 1ml sau 72 PN16 PN21 PN31 Chứng 7,6.10 1,05.10 6,2.10 0,25 g YE 8,7.10 1,17.10 6,8.10 8 0, g YE 1,04.10 1,35.10 7, 2.10 8 0,75 g YE 1,15.10 1,41.10 1,01.10 7 g YE 1,56.10 1,78.10 4,8.10 Ở nồng độ cao nấm men 0,75 g/lit: chủng PN16 có sinh khối cao gấp 1,5 lần môi trường chứng; chủng PN21 có tốc độ tăng trưởng cao mơi trường SA 1,4 lần chủng PN31 cao mẫu chứng 1,6 lần Ảnh hưởng vitamin lên tăng trưởng chủng vi khuẩn Bảng 4: Ảnh hưởng vitamin lên tăng trưởng chủng vi khuẩn R palustris PN16, PN21 PN31 Lô TN Vitamin Tổng số tế bào 1ml sau 72 Chủng PN16 Chủng PN21 Chủng PN31 8 Chứng 1,01.10 1,2.10 4,7.10 7 Vitamin A 3,06.10 4,8.10 2,15.10 8 Vitamin C 1,14.10 1,35.10 6,3.10 8 Vitamin E 1,35.10 1,55.10 1,04.10 Kết đếm mật độ tế bào cho thấy, môi Chuyên Đề Dược Học Vết Q-10 C Hình Sắc ký đồ dịch chiết vi khuẩn theo phương pháp Collins UV 254 (1) chủng PN16; (2) PN21, (3) PN31 (C) dung dịch Q-10 chuẩn Sắc ký lớp mỏng với pha động n-henan: ethyl ether (4v: 1v) dung dịch Q-10 chuẩn cho vạch màu nâu đậm UV254 sắc ký đồ với Rf = 0,40 Chấm 1, xuất vạch màu hồng tím có Rf với Rf vạch Q-10 chuẩn (Rf = 0,4) Thu nhận vạch dịch chiết vị trí có Rf tương đương với vạch dung dịch Q10 chuẩn hòa tan lại n-hexan để phân tích tiếp 219 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học Định tính Q10 phương pháp quang phổ Q-10 chuẩn có hai đỉnh hấp thu cực đại nằm vùng quang phổ tử ngoại gần bước sóng: λ1 = 215,4 nm λ2 = 275,2 nm Bảng 5: Quang phổ hấp thu cực đại mẫu Q10 Bước sóng hấp thu cực đại Mẫu Q-10 Đỉnh hấp thu (215,4 Đỉnh hấp thu (275,2 nm) Lần Lần Lần PN16 215,6 214,2 214 PN21 214,2 213,7 214 PN31 215 215,2 214,8 nm) TB 214,6 214 215 Lần Lần 275,6 275,2 274,8 274,4 276,4 276 Lần 275,8 274,2 275,8 TB 275,5 274,8 276,1 Kết định lượng Q10 phương pháp quang phổ Phương trình hồi quy biểu diễn phụ thuộc mật độ quang hàm lượng Q10 có dạng: yâ = 0,0171x + 0,0611 Với hệ số hồi quy bo (0,017) b (0,0611) Hệ số tương quan: R2 = 0,996 Hàm lượng Q-10 chủng vi khuẩn chiết xuất từ phương pháp Collins trình bày Bảng Bảng 6: Hàm lượng Q-10 chủng vi khuẩn chiết xuất từ phương pháp Collins Lần TN Sinh khối (g) Cắn sau chiết (mg) Hàm lượng Q10 (µg/ml) Hàm lượng Q10 (µg/g sinh khối) PN16 2 30,2 30,5 46 46,5 31 47 345 348,8 352,5 348,8 29 50 375 Ảnh hưởng nồng độ vitamin tiền tố lên tổng hợp Q10 Ảnh hưởng nồng độ vitamin E lên tổng hợp Q10 trình bày Bảng Nồng độ Vitamin E µg/ml cho tổng hợp CoQ10 cao Ở chọn khảo sát vitamin E thí nghiệm khảo sát tăng trưởng tế bào cho kết vitamin E cho sinh khối cao PN21 2 28,5 51,7 387,8 385,3 29,1 52,5 28 53,5 393 401,3 PN31 2 28,5 52,4 393 399,8 27,6 54 405 Bảng 7: Ảnh hưởng nồng độ vitamin E lên tổng hợp Q10 Lơ TN Nồng độ vitamin E (µ µg/ml) Chứng 2,5 7,5 Hàm lượng Q-10 (µ µg/g SKT) Chủng Chủng Chủng PN16 PN21 PN31 348 383 337 350 385,6 340,2 368 397,5 358 397,8 432,4 354,2 390,6 427 340,7 Ảnh hưởng tiền tố tự nhiên lên tổng hợp Q10 trình bày Bảng Bảng 8: Ảnh hưởng tiền tố tự nhiên lên tổng hợp Q10 Lô TN Tiền tố bổ sung SA SA + Cà chua 25% SA + Cà chua 50% SA + Cà chua 75% SA + Cà rốt 25% SA + Cà rốt 50% SA + Cà rốt 75% Chủng PN16 355 350 373 365 355 392 395 Kết thí nghiệm phù hợp với cơng bố Bule Singhal (2009) tiền tố tự nhiên có cà rốt cà chua làm tăng 56-87% hàm lượng CoQ10 Pseudomonas diminuta so với môi trường tối ưu không bổ sung tiền tố(2) 220 Hàm lượng Q-10 (µ µg/g SKT) Chủng PN21 380 379 400 385 382 435 435,7 Chủng PN31 335 336 351 342 340 350,5 352,1 So sánh việc bổ sung tiền tố vào môi trường bổ sung vitamin E, nhận thấy việc bổ sung vitamin E vào môi trường nuôi cấy cho kết gần kết nuôi cấy dịch ép cà rốt, Chuyên Đề Dược Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 chọn Vitamin E chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy để thu nhận CoQ10 Nghiên cứu Y học tử ngoại Hàm lượng Q-10 chủng vi khuẩn khảo sát xác định phương pháp đo quang phổ tử ngoại Chủng PN16 có 348,8 µg/g sinh khối tươi, chủng PN21 có 385,3 µg /g sinh khối tươi chủng PN31 có 399,8 µg/g sinh khối tươi TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình 3: Ảnh hưởng tiền tố tự nhiên lên trình tổng hợp Q-10 chủng R Palustris KẾT LUẬN Khảo sát yếu tố dinh dưỡng ảnh hưởng lên tăng trưởng chủng vi khuẩn Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 PN31từ đề nghị cơng thức bổ sung vào môi trường SA sau: Hỗn hợp natri acetate mannitol nguồn carbon (2 g) Nguồn nitơ thích hợp ammonium có bổ sung thêm pepton 0,5g/lit Nồng độ cao nấm men 0,75 g/lit Vitamin E (5 µg/ml) dịch chiết cà rốt 50% yếu tố kích thích tăng trưởng tế bào sinh tổng hợp Q-10 chủng PN16, PN21 PN31 Chiết xuất thành công Q-10 từ ba chủng vi khuẩn quang dưỡng tía khơng lưu huỳnh Rhodopseudomonas palustris PN16, PN21 PN31 Hợp chất Q-10 kiểm nghiệm phương pháp sắc ký lớp mỏng phổ hấp thu Chuyên Đề Dược Học Lê Thị Thúy Ái (2002), “Phân lập, định danh khảo sát khả biến dưỡng hợp chất dị vòng chứa nitơ vi khuẩn quang dưỡng tía khơng lưu huỳnh” Luận văn thạc sĩ Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Blue MV, Singhal RS (2009), “Use of carrot juice and tomato juiceas natural preccursors for enhanced production of ubiquinon-10 by P.diminuta NICM 2865, Food chem 116: 302305 Collins MD, Jones D (1981) “Distribution of isoprenoid quinonestructural types in bacteria and their taxonomic implication”, Microbiol rev 45: 316-354 Yoshida H, Kotani Y, Ochaiai K, and Araki K, (1998) “Production of ubiquinone 10 using bacteria”, J Gen Appl Microbiol, Vol 44: 19-26 Lê Quang Huấn, Đỗ Thị Tố Uyên, Trần Văn Nhị, (1999) “Phương pháp thu nhận carotenoid ubiquinon từ số vi khuẩn quang hợp thuộc chi Rhodobacter phân lập Việt Nam”, Hội nghị khoa học tồn quốc “Hội nghị Cơng nghệ Sinh học toàn quốc” – Hà Nội, 526-530 Kalen A, Norling B, Appelkvist EL, Dallner G (1987), “Uboquinone biosynthesis by the microsomal fraction of the rat liver”, Biochim Biophys Acta 926:70-79 Wu Z, Du G, Chen J, (2003) “Effects of dissolved oxygen concentration and DO-stat feeding strategy on COQ10 production with Rhizobium radiobacter.World J Microbiol Biotechnol 19: 925-928 Ngày nhận báo: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét báo: 24.12.2012 Ngày báo đăng: 10.03.2014 221 ... tác dụng sinh học, đặc biệt ubiquinon Q-10 Chính thế, tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy phù hợp cho vi c sản xuất Q-10 từ chủng Rhodopseudomonas palustris phân lập Vi t Nam ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG... Na2S2O3.5H2O, Dung dịch vi lượng, thêm nước cất vửa đủ Khảo sát thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn Khảo sát số thành phần môi trường ảnh hưởng đến tăng trưởng vi khuẩn nguồn carbon... trường bổ sung vitamin E thu sinh khối cao nhất, tiếp đến môi trường bổ sung vitamin C, môi trường SA môi trường bổ sung vitamin A cho sinh khối thấp Chiết xuất phân tích hợp chất Q10 Chiết xuất