Nghiên cứu Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme phytase từ dòng nấm nội sinh Penicillium oxalicum HNC12-76 của cây Ngải bún (Auttum crosscus) được thực hiện nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất enzyme phytase từ nấm P. oxalicum như nguồn cơ chất, pH môi trường, nguồn carbon bổ sung và nguồn nitrogen bổ sung. Hoạt lực enzyme phytase được xác định bằng cách đo lường phosphate vô cơ. Mời các bạn cùng tham khảo!
KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME PHYTASE TỪ DÒNG NẤM NỘI SINH Penicillium oxalicum HNC12-76 CỦA CÂY NGẢI BÚN (Auttum crosscus) Nguyễn Phạm Tuấn, Nguyễn Cơng Kha, Nguyễn Hồi Vững, Huỳnh Cảm Thủy Trang1, Nguyễn Ngọc Giàu, Ngô Văn Chúng, Nguyễn Phạm Tú, Khƣu Minh Hiện Trung tâm Công nghệ Sinh học tỉnh An Giang, tỉnh An Giang * Email: ngphamtuan1983@gmail.com TÓM TẮT Nghiên cứu ―Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến q trình sản xuất enzyme phytase từ dịng nấm nội sinh Penicillium oxalicum HNC12-76 Ngải bún (Auttum crosscus)‖ thực nhằm xác định yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất enzyme phytase từ nấm P oxalicum nguồn chất, pH môi trường, nguồn carbon bổ sung nguồn nitrogen bổ sung Hoạt lực enzyme phytase xác định cách đo lường phosphate vơ Kết nghiên cứu cho thấy, dịng nấm P oxalicum sinh enzyme phytase cao điều kiện chất (cám bắp), pH (pH = 7), nguồn carbon (glucose 20 g/L) nguồn nitrogen (peptone g/L) sau ngày lên men, với hoạt lực enzyme phytase 7,98 U/g Kết nghiên cứu góp phần tạo nguồn ban đầu cho trình tổng hợp enzyme theo phương pháp sinh học ứng dụng lĩnh vực nuôi trồng thủy sản chăn nuôi Từ khóa: Cơ chất, carbon, nitrogen, phytase, Penicillium oxalicum GIỚI THIỆU Phytase enzyme làm giảm hiệu lực tính kháng dưỡng thức ăn có hàm lượng phytate cao Phytase diện tự nhiên, từ vi sinh vật, thực vật số mô động vật Chẳng hạn phytase phân lập từ thực vật, vi khuẩn nấm (Pasamontes et al., 1997) [1] Phytase làm tăng hấp thụ Phosphate thể vật nuôi thêm 60% dùng chất bổ sung bắt buộc cho thức ăn chăn nuôi châu Âu, Đông Nam Á, Hàn Quốc, để giảm tác hại đến môi trường Phosphate từ phân vật nuôi thải Theo Furuya et al (2001) [2], việc sử dụng phytase phần thức ăn nhằm tăng calcium phosphor hữu dụng, cải thiện tốc độ tăng trưởng tăng hiệu sử dụng thức ăn Enzyme phytase từ vi sinh vật với hàm lượng bổ sung hoạt độ 1000 UI kg thức ăn mang lại kết việc tăng trưởng sử dụng chất khoáng tương tự với việc sử dụng phần thức ăn từ thực vật bổ sung phosphor vô (Liebert Portz, 2005) [3] Những năm trở lại đây, nguồn nấm vi khuẩn nội sinh quan tâm ý nghiên cứu, đặc biệt dòng nội sinh từ dược liệu Nấm Penicillium oxalicum nguồn tiềm sản xuất enzyme phytase Quá trình sản xuất enzyme phytase từ nấm chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố khác Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu ―Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sản xuất enzyme phytase từ dòng nấm nội sinh Penicillium oxalicum HNC12-76 Ngải bún (Auttum crosscus)‖ thực nhằm xác định thơng số thích hợp cho q trình sản xuất enzyme phytase từ dòng nấm nội sinh phương pháp lên men bán rắn góp phần tạo nguồn nguyên liệu cho trình sản xuất sản phẩm có khả ứng dụng chăn ni thủy sản 681 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Dòng nấm P oxalicum HNC12-76 lưu giữ phịng thí nghiệm Trung tâm Cơng nghệ Sinh học tỉnh An Giang Hóa chất thiết bị: acid trichloroacetic cân phân tích, máy đo quang phổ,… 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Dòng nấm nội sinh nhân sinh khối môi trường Awad et al (2014) [4], với thành phần (g/100 mL) KCl 0,05g; MgSO4 0,5 g; NH4NO3 0,05 g; MnSO4 0,01 g; CaCl2 0,5 g; FeSO4 0,001 g; Yeast extract 0,1 g Soya bean meal 10 g (g/100 mL) điều chỉnh pH = Ủ điều kiện nhiệt độ phòng lắc với tốc độ 200 vòng/phút thời gian từ ngày 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng chất đến q trình sinh enzyme phytase Chuẩn bị mơi trường lên men bán rắn môi trường gồm sucrose 20 g/L; MgSO4 0,5 g/L; KH2PO4 g/L yeast extract g/L, điều chỉnh pH = Chuẩn bị 20 g chất lên men khác (rơm, trấu, gạo, cám bắp, gạo cám bắp) bổ sung 25 mL môi trường lên men (ẩm chất 60%), hấp trùng để nguội Tiến hành chủng 10 mL dung dịch nhân sinh khối nấm vào keo thí nghiệm Các keo nấm ủ điều kiện nhiệt độ phòng thời gian ngày Hoạt lực enzyme phytase xác định theo phương pháp Awad et al (2014) [4]: mẫu lên men bán rắn ly trích với dung dịch đệm (làm lạnh điều kiện 4°C) (20 mL nước/g chất nền), máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút nhiệt độ phòng Sau đó, tiến hành ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/20 phút điều kiện nhiệt độ 4°C, thu phần dịch, phần dịch sử dụng cho phân tích hoạt lực enzyme Hoạt lực enzyme phytase xác định cách đo lường phosphate vô Hỗn hợp phản ứng bao gồm 0,9 mL dung dịch đệm acetate (0,2 M, pH = 5,5) chứa mM phytate 0,1 mL dung dịch enzyme thô Sau ủ 30 phút điều kiện nhiệt độ 370C, phản ứng dừng lại cách thêm mL trichloroacetic acid 10% Một đơn vị phytase định nghĩa lượng enzyme giải phóng µmol phospho vơ cơ/mL/phút theo điều kiện thí nghiệm Hoạt lực enzyme phytase xác định với đơn vị U/g chất 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến trình sinh enzyme phytase Chuẩn bị môi trường lên men bao gồm chất 20 g (cám bắp) 25 mL môi trường gồm sucrose 20 g/L; MgSO4 0,5 g/L; KH2PO4 g/L yeast extract g/L, điều chỉnh pH khác (5-9), hấp trùng để nguội Tiến hành chủng 10 mL dung dịch nhân sinh khối nấm vào keo thí nghiệm Các keo nấm ủ điều kiện nhiệt độ phòng thời gian ngày 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon đến q trình sinh enzyme phytase Chuẩn bị mơi trường lên men bao gồm chất 20 g (cám bắp) 25 mL môi trường gồm MgSO4 0,5 g/L; KH2PO4 g/L yeast extract g/L, điều chỉnh pH = 7, bổ sung nguồn carbon khác (glucose, sucrose, D-mantose, dextrose đối chứng) (20 g/L), hấp trùng để nguội Tiến hành chủng 10 mL dung dịch nhân sinh khối nấm vào keo thí nghiệm Các keo nấm ủ nhiệt độ phòng thời gian ngày 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen đến q trình sinh enzyme phytase Chuẩn bị mơi trường lên men bao gồm chất 20 g (cám bắp) 25 mL môi trường gồm glucose 20 g/L; MgSO4 0,5 g/L; KH2PO4 g/L nguồn nitrogen khác (malt, yeast, beef, peptone, NH4NO3 đối 682 chứng), điều chỉnh pH = 7, hấp trùng để nguội Tiến hành chủng 10 mL dung dịch nhân sinh khối nấm vào keo thí nghiệm Các keo nấm ủ điều kiện nhiệt độ phòng thời gian ngày 2.3 Phƣơng pháp thống kê Các số liệu thí nghiệm xử lý phần mềm Excel Thống kê phần mềm Statgraphics 16.0 Kiểm tra khác biệt giá trị trung bình theo phép thử Duncan LSD KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng chất đến trình sinh enzyme phytase Trong trình lên men bán rắn, việc lựa chọn chất phù hợp đóng vai trị quan trọng (Pandey, 1992) [5] Sự hình thành sản phẩm trực tiếp phụ thuộc vào tăng trưởng sinh vật, chất cung cấp số chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển bên cạnh nhu cầu nguồn carbon, nitrogen, muối khoáng, Chủng Penicillium oxalicum phát triển chất khác có khả sinh hoạt lực enzyme phytase khác khác biệt có ý nghĩa mức độ 5% (Hình 1) Hoạt lực enzyme phytase thể cao nguồn chất cám bắp đạt hoạt lực enzyme phytase 2,14 U/g; nguồn chất gạo hỗn hợp gạo cám bắp, hoạt lực enzyme phytase đạt 0,82 0,74 U/g; thấp rơm với hoạt lực enzyme phytase 0,15 U/g Kết nghiên cứu tương tự Kumari et al (2016) [6] Awad et al (2014) [4] cho rằng, nguồn chất thích hợp cho q trình lên men sản xuất enzyme phytase đạt cao từ nấm mốc Sporotrichum thermophile nấm Penicillium purpurogenum GE1 cám bắp với hoạt lực enzyme phytase 1890 U/g (bioreactor) 40/U/g Hoạt tính enzyme phytase (U/g) 2.5 2.14a 1.5 0.82b 0.74b 0.46bc 0.5 0.15c Rơm Trấu Gạo Cám bắp Gạo cám bắp Cơ chất Hình Ảnh hưởng chất lên men đến trình sản xuất enzyme phytase 3.2 Ảnh hƣởng pH đến trình sinh enzyme phytase Vohra Satyanarayana (2003) [8] cho rằng, yếu tố vật lý pH, nhiệt độ, oxygen hịa tan áp suất thơng số vật lý quan trọng ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng sinh vật sinh tổng hợp chất chuyển hóa Phytase từ nấm Penicillium oxalicum hoạt động mạnh môi trường khoảng pH = 6,0-8,0 đạt giá trị tối ưu pH = (Hình 2) Hoạt lực enzyme phytase thể cao pH = đạt hoạt lực enzyme phytase 3,88 U/g; pH = pH = 8, hoạt lực enzyme phytase đạt 2,83 2,69 U/g; thấp pH = với hoạt lực enzyme phytase 0,93 U/g 683 Hàm lƣợng enzyme phytase (U/g) 3.88a 2.83b 2.69b 1.91c 0.93d pH Hình Ảnh hưởng pH lên men đến trình sản xuất enzyme phytase Kết pH tối ưu tương tự với nghiên cứu Ramandeep et al (2017) [9], cho giá trị pH = thích hợp cho sản xuất enzyme phytase nấm Penicillium oxalicum EUFR-3 với hoạt độ đạt 12,8 U/g Mặc khác, kết khác với hầu hết nghiên cứu tham khảo, phytase loài nấm khác A niger có giá trị tối ưu khoảng pH từ pH = 2-2,5 pH = 5,0-5,5 Sự khác biệt loại nấm sản xuất môi trường dinh dưỡng Đồng thời, khoảng pH thích hợp cho hoạt động enzyme phytase khoảng acid phù hợp với điều kiện tiêu hóa dày (pH= 2,0-4,0) ruột non (pH = 4,0-6,0) động vật nên giúp tăng hiệu bổ sung thức ăn gia súc (Casey Walsh, 2002) [10] Howson Davis (1983) [11], khoảng pH bền phytase từ 1,8-8,0 Nhưng kết thấp so với kết Kim et al (1998) [12] phytase từ B subtilis có khoảng pH bền từ 4,0-8,0 3.3 Ảnh hƣởng nguồn carbon đến trình sinh enzyme phytase Nguồn carbon có ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ vi sinh vật Hoạt lực enzyme phytase từ nấm Penicillium oxalicum chịu ảnh hưởng nguồn carbon khác malt, yeast extract, peptone, beef extract, NH4NO3 (Hình 3) (Hình 3) Hoạt lực enzyme phytase thể cao nguồn carbon glucose đạt hoạt lực enzyme phytase 5,59 U/g; nguồn carbon sucrose lactose, hoạt lực enzyme phytase đạt 4,5 4,68 U/g; thấp không bổ sung nguồn carbon với hoạt lực enzyme phytase 2,42 U/g Nguyên nhân hàm lượng carbon cao trở nên dư thừa ức chế trình sinh phytase Kết tương tự nghiên cứu củaVats Banerjee (2002) [7] cho răng, nấm Aspergillus niger sinh enzyme phytase cao sử dụng nguồn carbon glucose Hoạt tính enzyme phytase (U/g) 5.59a 4.68b 4.5b 2.54c 2.42c đối chứng glucose sucrose D-Mantose Nguồn carbon lactose Hình Ảnh hưởng nguồn carbon khác đến trình sản xuất enzyme phytase 684 3.4 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen đến trình trình sinh enzyme phytase Hoạt tính enzyme phytase (U/g) 10 7.98a 5.4b 4.83c 4.96c 3.51d 3.3d Malt Yeast Beef NH₄NO₃ Nguồn nitrogen Peptone đối chứng Hình Ảnh hưởng nguồn nitrogen khác đến trình sản xuất enzyme phytase Nguồn nitơ có ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ nấm P.oxalicum khác biệt có ý nghĩa so với nguồn nitơ khác (Hình 4) Hoạt lực enzyme phytase thể cao nguồn nitrogen peptone đạt hoạt lực enzyme phytase 7,98 U/g; nguồn nitrogen NH4 beef, hoạt lực enzyme phytase đạt 5,4 4,96 U/g; thấp không bổ sung nguồn nitrogen với hoạt lực enzyme phytase 0,93 U/g Kết nguồn nitrogen tối ưu tương tự với Ramandeep et al (2017) [9], cho giá trị nguồn nitrogen peptone thích hợp cho sản xuất enzyme phytase nấm Penicillium oxalicum EUFR-3 với hoạt độ đạt 12,8 U/g Kết thí nghiệm khác so với nghiên cứu Vats Banerjee (2002) [7], nguồn nitơ vô có tác động giúp vi sinh vật tăng sinh khối cho hoạt lực cao nguồn nitơ hữu Điều chủng Penicillium oxalicum nguồn nitơ hữu có tác dụng tăng sinh khối nguồn nitơ vơ ảnh hưởng nhiều đến trình sinh tổng hợp phytase KẾT LUẬN Nghiên cứu xác định thông số cho q trình sản xuất enzyme phytase từ dịng nấm nội sinh Penicillium oxalicum HNC12-76 Dòng nấm Penicillium oxalicum sinh enzyme phytase cao điều kiện chất (cám bắp), pH (pH = 7), nguồn carbon (glucose) nguồn nitrogen (peptone) sau ngày lên men Kết nghiên cứu rằng, nguồn nấm nội sinh ngải bún nguồn cung cấp enzyme phong phú tiềm cho việc sản xuất sản phẩm enzyme ứng dụng thực tế LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn thành viên Trung tâm Công nghệ sinh học tỉnh An Giang Sở Khoa học Công nghệ An Giang tạo điều kiện hỗ trợ để thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Pasamontes, L., Haiker, M., Wyss, M., Loon, P (1997) Gene cloning, purification and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigates Appl Environ Micorbiol 63: 1696-1700 [2] Furuya W M., Goncalves G S., Rossetto V., Furuya B., Hayashi C (2001) Phytase as feeding for Nile tilapia (Oreochromis niloticus): performance and digestibility Rev Brazil Zootech 30 (3):924929 685 [3] Liebert, F and Portz, L (2005) Nutrient utilization and Nile tilapia Oreochromis niloticus fed plant based low phosphorus diets supplemented with graded levels of different sources of microbial phytase Aquaculture, 248, 111-119 [4] Awad GE, Helal MM, Danial EN, Esawy MA (2014) Optimization of phytase production by Penicillium purpurogenum GE1 under solid state fermentation by using Box–Behnken design Saudi J Biol Sci 21(1):81-88 [5] Pandey A (1992) Recent developments in solid state fermentation Process Biochem, 27: 109-116 [6] Kumari A, Satyanarayana T, Singh B (2016) Mixed Substrate Fermentation for Enhanced Phytase Production by Thermophilic Mould Sporotrichum thermophile and Its Application in Beneficiation of Poultry Feed Appl Biochem Biotechnol 178 (1):197-210 [7] Vats P, Banerjee UC (2002) Studies on the production of phytase by a newly isolated strain of Aspergillus niger var teigham obtained from rotten wood-logs Process Biochem 38: 211-217 [8] Vohra, A and Satyanarayana, T (2003) Phytases: Microbial Sources, Production, Purification, and Potential Biotechnological Applications Critical Reviews in Biotechnology, 23: 29-60 [9] Ramandeep Kaur, Abhishake Saxena, Punesh sangwan, Ajar nath yadav, Vinod kumar, Harcharan Singh Dhaliwal (2014) Production and characterization of a neutral phytase of Penicillium oxalicum EUFR-3 isolated from Himalayan region Nusantara Bioscience (1): 68-76 [10] Casey A, and Walsh G (2002) Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus nigerATCC 9142 Bioresour Technol 2002, 86:183-188 [11] Howson, S.J and Davis, R.P (1983) Production of phytate-hydrolyzing enzyme by some fungi Enzyme and Microbial Technology, 5: 377-382 [12] Kim YO, Kim HK, Bae KS, Yu JH, Oh TK (1998) Purification and properties of a thermostable phytase from Bacillus sp DS11 Enzyme Microb Technol 22:2-7 686 ... Nghiên cứu xác định thơng số cho q trình sản xuất enzyme phytase từ dòng nấm nội sinh Penicillium oxalicum HNC12-76 Dòng nấm Penicillium oxalicum sinh enzyme phytase cao điều kiện chất (cám bắp),... nitrogen Peptone đối chứng Hình Ảnh hưởng nguồn nitrogen khác đến trình sản xuất enzyme phytase Nguồn nitơ có ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp enzyme phytase từ nấm P .oxalicum khác biệt có ý nghĩa... cám bắp Cơ chất Hình Ảnh hưởng chất lên men đến trình sản xuất enzyme phytase 3.2 Ảnh hƣởng pH đến trình sinh enzyme phytase Vohra Satyanarayana (2003) [8] cho rằng, yếu tố vật lý pH, nhiệt độ,