NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA PHI LƯU HUỲNH ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN NƯỚC NGỌT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA PHI LƯU HUỲNH ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN NƯỚC NGỌT Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực : NGUYỄN THÚY KIỀU Niên khóa : 2006 - 2010 Tháng 7/2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM VI KHUẨN QUANG DƯỠNG TÍA PHI LƯU HUỲNH ỨNG DỤNG TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN NƯỚC NGỌT Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT NGUYỄN THÚY KIỀU KS BIỆN THỊ LAN THANH Tháng 7/2010 LỜI CẢM ƠN Em xin gởi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy Trường Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh dạy, truyền đạt trang bị cho em kiến thức bổ ích suốt q trình học tập thực đề tài Em xin gởi lời cảm ơn đến Thạc sĩ Nguyễn Như Nhứt cô Biện Thị Lan Thanh tạo điều kiện thuận lợi cho em có hội làm việc, học tập thực tốt đề tài tốt nghiệp Em chân thành cảm ơn kỹ sư Hồ Bang Hoài tận tình hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Anh người thầy, người bạn sẵn sàng giúp đỡ chia sẻ với em khó khăn, bế tắc thực đề tài Xin gởi lời cảm ơn đến: Những người bạn lớp DH06SH san sẻ buồn vui, học tập trao đổi kiến thức suốt thời sinh viên Toàn thể nhân viên Chi nhánh Công Ty TNHH Gia Tường dạy, hỗ trợ cho tơi q trình thực đề tài Cuối cùng, cho gởi lời biết ơn chân thành, sâu sắc đến Bố, Mẹ, gia đình bên cạnh, tin tưởng, ủng hộ chỗ dựa tinh thần vững cho để vững bước đến ngày hơm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2010 Nguyễn Thúy Kiều i TÓM TẮT Đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm vi khuẩn quang dưỡng tía phi lưu huỳnh ứng dụng nuôi trồng thủy sản nước ngọt” thực Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường _ kho C2, lơ D, tổng kho Sóng Thần, khu cơng nghiệp Sóng Thần I, huyện Dĩ An, tỉnh Bình Dương từ tháng 2/2010 đến tháng 7/2010 Ngành nuôi trồng thủy sản phát triển nhằm tạo nhiều sản phẩm thủy sản an toàn chất lượng, đáp ứng nhu cầu thị trường ngày gia tăng Trong giai đoạn nay, giải pháp sinh học giải ô nhiễm môi trường nước giải pháp đang quan tâm để thay giải pháp dùng hóa chất, kháng sinh Vì thế, chúng tơi thực đề tài để khảo sát chọn lọc chủng vi khuẩn quang dưỡng tía phi lưu huỳnh có khả xử lý H2S, NO2-, NH4+ môi trường nhân tạo Sau đó, nghiên cứu tạo chế phẩm PNSB từ chủng chọn lọc thử nghiệm ứng dụng chế phẩm vi khuẩn quang dưỡng tía phi lưu huỳnh mơi trường ni cá tra quy mơ phòng thí nghiệm Các phương pháp sử dụng phương pháp bảo quản chủng thạch nghiêng, tăng sinh chủng ống nghiệm, phương pháp xác định tổng số vi khuẩn đo OD MPN, phương pháp Nessler, Methylene blue, Griess Llosvay, Lowry, phương pháp xác định COD, DO Sau thời gian thực đề tài, xác định nguồn nitrogen nguồn carbon thích hợp để ni cấy chủng vi khuẩn quang dưỡng tía phi lưu huỳnh chọn lọc NH4H2PO4 với nồng độ 1,2g/l, glucose với nồng độ 1g/l 3g/l ethanol với nồng độ 1,5ml/l Các chủng vi khuẩn chọn có khả ổn định pH, phát triển điều kiện ánh sáng yếu (280 lux) Chế phẩm sản xuất từ chủng chọn có khả cải thiện chất lượng nước quy mơ phòng thí nghiệm ii SUMMARY The thesis “Reseaching into producing and applying purple non – sulfur photosynthetic bacteria bioproduct in aquatic environment” was carried out in lab of Gia Tuong limited company, Binh Duong branch _ C2 depot, D plot, Song Than base depot, Song Than I industrial park, Di An district, Binh Duong province from February to June 2010 The aquaculture is developing to made safe, high – quality products and satisfy the market’s demand is on the increase Currently, bio-solutions are used to replace chemical solutions on solving pollution problems, antibiotic Therefore, we carry out this study for selecting purple non–sulfur photosynthetic bacteria (PNSB) strains that have ability to reduce H2S, NO2-, NH4+ in artificial medium, reseaching on production of PNSB bioproduct from selective bacteria, and in vitro applying this bioproduct upon Pangasius hypophthalmus aquatic environment Main methods were used including maintaining, enriching bacteria, MPN method, Nessler, Methylene blue, Griess Llosvay, Lowry method, determining chemical oxygen demand (COD) and dissolved oxygen (DO) The obtained results includes there are eight selected PNSB strains which are able to decompose H2S, NO2-, and NH4+ We also selected appropriate concentration of nitrogen and carbon sources including 1.2g/l NH4H2PO4, or 3g/l glucose, and 1.5ml/l ethannol The selected strains are able to remain pH stable and to grow in low intensity light (280 lux) The bioproduct made from this selected strains has capability to refresh in vitro the polluted aquatic environment Key words: purple non – sulfur photosynthetic bacteria, Pangasius hypophthalmus iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT ii SUMMARY iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC CÁC BẢNG ix DANH MỤC CÁC HÌNH .x Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan vi khuẩn quang dưỡng tía phi lưu huỳnh 2.1.1 Giới thiệu .3 2.1.2 Sự phát sinh loài 2.1.3 Sự phân loại 2.1.3.1 Alpha – Proteobacteria 2.1.3.2 Alpha – Proteobacteria 2.1.3.3 Alpha – Proteobacteria 2.1.3.4 Beta – Proteobacteria 2.1.4 Đặc tính sinh lý 2.1.4.1 Quang hợp 2.1.4.2 Sự hô hấp 2.1.4.3 Quá trình lên men .9 2.1.4.4 Biến dưỡng carbon .9 2.1.4.5 Biến dưỡng sulfur .11 2.1.4.6 Biến dưỡng nitrogen 12 2.1.4.7 Biến dưỡng hydrogen .13 2.1.5 Các ứng dụng .14 2.2 Đặc điểm ngành nuôi cá tra 14 iv 2.2.1 Đặc điểm cá tra 14 2.2.1.1 Phân loại 14 2.2.1.2 Hình thái, sinh lý 15 2.2.2 Ảnh hưởng yếu tố môi trường 15 2.2.2.1 Nhiệt độ 15 2.2.2.2 pH .15 2.2.2.3 Ammonia (NH3) .16 2.2.2.4 Sulfur hydrogen (H2S) 16 2.2.2.5 Nitrite (NO2-) 17 2.2.2.6 Oxy hòa tan (DO) .17 2.2.2.7 Nhu cầu oxy hóa học (Chemical Oxygen Demand – COD) 18 2.2.3 Các điều kiện nuôi cá da trơn 18 2.2.3.1 Nguồn nước 18 2.2.3.2 Thức ăn .18 2.2.3.3 Mật độ thả nuôi 18 2.2.3.4 Màu nước 18 2.2.4.5 Các loại bệnh cách phòng ngừa cá da trơn 19 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 21 3.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.2 Vật liệu 21 3.2.1 Chủng vi khuẩn quang dưỡng tía phi lưu huỳnh .21 3.2.2 Nước nuôi trồng thủy sản dùng để xử lý 21 3.2.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất .21 3.2.3.1 Dụng cụ thiết bị 21 3.2.3.2 Hóa chất 21 3.2.4 Môi trường 22 3.3 Các phương pháp thực đề tài .24 3.4 Phương pháp tiến hành 25 3.4.1 Khảo sát chọn giống PNSB 25 3.4.1.1 Khảo sát khả xử lý NH4+ PNSB 25 3.4.1.2 Khảo sát khả xử lý NO2- PNSB .25 3.4.1.3 Khảo sát khả xử lý H2S PNSB 25 v 3.4.2 Nghiên cứu tạo chế phẩm từ chủng PNSB chọn lọc 25 3.4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ (NH4)H2PO4 lên phát triển PNSB 25 3.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ glucose lên phát triển PNSB 26 3.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ ethanol lên phát triển PNSB 26 3.4.2.1 Khảo sát thời gian thu nhận PNSB 26 3.4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng cường độ sáng đến phát triển PNSB .26 3.4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến phát triển PNSB 27 3.4.3 Khảo sát tỷ lệ sử dụng chế phẩm để xử lý nước nuôi cá tra 27 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Kết 28 4.1.1 Khảo sát chọn giống PNSB 28 4.1.1.1 Khảo sát khả xử lý NH4+ PNSB môi trường nhân tạo 28 4.1.1.2 Khảo sát khả xử lý NO2- PNSB môi trường nhân tạo 29 4.1.1.3 Khảo sát khả xử lý H2S PNSB môi trường nhân tạo 30 4.1.2 Nghiên cứu tạo chế phẩm từ PNSB chọn lọc 31 4.1.2.1 Ảnh hưởng nồng độ (NH4)H2PO4 lên phát triển PNSB .31 4.1.2.2 Ảnh hưởng nồng độ glucose lên phát triển PNSB 32 4.1.2.3 Ảnh hưởng nồng độ ethanol lên phát triển PNSB 33 4.1.2.4 Khảo sát thời gian thu nhận chế phẩm 35 4.1.2.5 Ảnh hưởng cường độ sáng đến phát triển PNSB 35 4.1.2.6 Ảnh hưởng pH đến phát triển PNSB 36 4.1.3 Khảo sát tỷ lệ sử dụng chế phẩm để xử lý nước nuôi cá tra 38 4.1.3.1 Khảo sát nhiệt độ môi trường nước nuôi cá 38 4.1.3.2 Khảo sát tiêu pH .39 4.1.3.3 Khảo sát tiêu oxy hòa tan DO 39 4.1.3.4 Khảo sát tổng số PNSB 39 4.1.3.5 Khảo sát tiêu COD 40 4.1.3.6 Khảo sát tiêu tổng TAN (Total Ammonia Nitrogen) .40 4.1.3.7 Khảo sát tiêu NO2- 41 4.1.3.8 Khảo tiêu H2S 42 4.1.3.9 Khảo sát tiêu protein .43 4.2 Thảo luận .44 vi Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO .48 PHỤ LỤC vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT COD (Chemical Oxygen Demand) Nhu cầu oxy hóa học DO (Dissolved oxygen) Hàm lượng oxy hòa tan ĐC Đối chứng NT Nghiệm thức OD (optical density) Mật độ quang PNSB (Purple nonsulfur bacteria) Vi khuẩn quang dưỡng tía phi lưu huỳnh TAN (Total Ammonia Nitrogen) Tổng đạm ammonia viii - Dung dịch Nessler: hòa tan 15g HgI2 10g KI (hoặc 9g HgCl2 15,5g KI) 500ml nước cất không đạm (cho 20ml H2SO4 đặc vào lít nước cất, lắc đem cất lại lần nữa) sau cho vào 40g NaOH, khuấy cho NaOH hòa tan hồn tồn, để lắng vài ngày gạn lấy phần nước cho vào bình nâu sử dụng A.5.3 Thiết lập mẫu chuẩn để phân tích TAN phương pháp Nessler Ống nghiệm Dung dịch N-NH4+ 0,01Nmg/l Nước cất không đạm (ml) Dung dịch Seignett hay trion B (ml) Dung dịch Nessler (ml) Nồng độ N-NH3 tổng số 0,0 10 0,2 1,0 0,0 0,2 9,8 0,2 1,0 0,2 0,4 9,6 0,2 1,0 0,4 0,6 9,4 0,2 1,0 0,6 0,8 9,2 0,2 1,0 0,8 1,0 9,0 0,2 1,0 1,0 A.5.4 Tiến hành − Đong 10 ml mẫu nước, cho 0,2 ml dung dịch Seignett ml thuốc thử Nessler vào Lắc đều, để yên 15 phút, đo OD bước sóng λ = 425 nm Dựa vào đường chuẩn suy nồng độ TAN mẫu − Tính kết quả: Để xác định hàm lượng N-NH3 N-NH4+ ta phải xác định nhiệt độ pH, dựa vào bảng tra để xác định tỷ lệ NH3 chứa TAN, từ tính kết Hàm lượng N-NH3 (mg/l) = TAN x I/100 (I: tỷ lệ N-NH3 chứa TAN) Hàm lượng N-NH4+ (mg/l) = TAN – N – NH3 Bảng A.1 Tỷ lệ % NH3/TAN theo nhiệt độ pH pH 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8 9,0 9,2 9,4 9,6 9,8 10,0 16 0,30 0,47 0,74 1,17 1,84 2,88 4,49 6,93 10,56 15,76 22,87 31,97 42,68 54,14 65,17 74,78 18 0,34 0,54 0,86 1,35 2,12 3,32 5,16 7,94 12,03 17,82 25,57 35,25 46,32 57,77 68,43 77,46 20 0,40 0,63 0,99 1,56 2,45 3,83 5,94 9,09 13,68 20,08 28,47 38,69 50,00 61,31 71,53 79,92 Nhiệt độ nước (0C) 22 24 26 0,46 0,52 0,60 0,72 0,82 0,95 1,14 1,30 1,50 1,79 2,05 2,35 2,80 3,12 3,68 4,37 4,99 5,71 6,76 7,68 8,75 10,30 11,65 13,20 14,40 17,28 19,42 22,38 24,88 27,64 31,37 34,42 37,71 42,01 45,41 48,96 53,45 56,86 60,33 64,54 67,63 70,67 74,25 76,81 79,25 82,05 84,00 85,82 28 0,70 1,10 1,73 2,72 4,24 6,55 10,00 14,98 21,83 30,68 41,23 52,65 63,79 73,63 81,57 87,52 30 0,81 1,27 2,00 3,13 4,88 7,52 11,41 16,96 24,45 33,90 44,84 56,30 67,12 76,29 83,68 89,05 32 0,95 1,50 2,36 3,69 5,72 8,77 13,22 19,46 27,68 37,76 49,02 60,38 70,72 79,29 85,85 90,58 A.6 Phương pháp xác định H2S (phương pháp Methylene Blue) A.6.1 Nguyên tắc Nguyên tắc phản ứng dựa phản ứng sulfide (S2-), ferric chloride dimethyl-p-phenylenediamine tạo nên methylene blue Ammonium phosphate thêm vào sau màu để khử màu ferric chloride Sau nồng độ S2- xác định máy so màu quang phổ bước sóng 665 nm A.6.2 Thuốc thử - Dung dịch PRE 1: 500ml HCl 37% pha thành 1000ml với nước cất - Dung dịch A: hòa tan 4g C8H14Cl2N2 PRE thành 1000ml - Dung dịch B: hòa tan 16g FeCl3.6H2O PRE thành 1000ml - Dung dịch chuẩn: dung dịch Na2S.9H2O 100mg/l: hòa tan 0,75g Na2S.9H2O 1000ml nước cất khơng oxy (nước cất không oxy: đun nước cất lên sôi khoảng 10 phút đem khỏi bếp bịt kín ngay) - Dung dịch Na2S.9H2O 5mg/l: hòa tan 5ml dung dịch Na2S.9H2O 100mg/l với nước cất thành 100ml A.6.3 Thiết lập mẫu chuẩn STT Nồng độ mẫu chuẩn (mg/l) 0,00 0,02 0,04 0.06 0,08 0,10 Thể tích dung dịch chuẩn Na2S.9H2O 5mg/l (ml) 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 Thể tích nước cất (ml) 100,0 99,6 99,2 98,8 98,4 98,0 A.6.4 Tiến hành - Đong 20ml mẫu nước - Lần lượt cho thuốc thử vào 1ml thuốc thử A, 1ml thuốc thử B - Chờ phút màu xanh xuất đem đo độ hấp thụ quang bước sóng 665nm - Dựa vào đường chuẩn xác định nồng độ H2S có mẫu cần phân tích Để tính hàm lượng H2S thu mẫu nước phải đo pH nhiệt độ Dựa vào bảng tra để xác định tỷ lệ % H2S chứa tổng sulfide, từ tính hàm lượng H2S Bảng A.2 Tỷ lệ % H2S/tổng sulfide theo pH nhiệt độ pH 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 16 99,3 97,7 93,2 81,2 57,7 30,1 12,0 4,1 1,3 18 99,2 97,6 92,8 80,2 56,2 28,9 11,4 3,9 1,3 20 99,2 97,4 92,3 79,2 54,6 27,5 10,7 3,7 1,2 Nhiệt độ nước (0C) 22 24 26 99,1 99,1 99,0 97,3 97,1 96,9 92,0 91,4 90,8 78,1 77,0 75,7 53,0 51,4 49,7 26,3 25,0 23,8 10,1 9,6 9,0 3,4 3,2 3,0 1,1 1,0 1,0 28 98,9 96,7 90,3 74,6 48,2 22,7 8,5 2,9 0,9 30 98,9 96,5 89,7 73,4 46,6 21,6 8,0 2,7 0,9 32 98,9 96,3 89,1 72,1 45,0 20,6 7,5 2,5 0,8 A.7 Phương pháp xác định NO2- (phương pháp Griess Llosvay) A.7.1 Nguyên tắc Xác định có mặt NO2- nước thuốc thử Griss Nếu xuất màu đỏ pháo có NO2- Phản ứng NO2- với thuốc thử Griss sau: H2N – C6H4 – SO3H + HNO2 Ỉ N = N+ – C6H4 – SO3Acid N = N+ – C6H4 – SO3- + C10H7 – NH2 Ỉ H2N – C10H6 – N = N – C6H4 – SO3H (α-naftilamin) (Phức chất màu đỏ pháo) Cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng nitrite có nước Đo mật độ quang máy bước sóng 550 nm Từ mật độ quang thu dựa vào phương trình đường chuẩn, ta tính hàm lượng nitrite mẫu tương ứng A.7.2 Hóa chất - Thuốc thử Griss: hỗn hợp gồm 1g α-naftilamin + 10 g acid sunfanilic + 50g succinic acid (hoặc oxalic acid) Æ nghiền nhỏ trộn với Đây loại thuốc thử khô, bảo quản lọ màu - Dung dịch NaNO2 chuẩn: cân xác g NaNO2 pha lít nước cất A.7.3 Phương pháp thực - Dựng đường chuẩn NaNO2: + Pha loãng chất chuẩn 500 lần: nồng độ chất chuẩn NaNO2 hay NO2- 2µg/ml + Thuốc thử Griss pha lỗng 50 lần: cân g thuốc thử Griss hỗn hợp cho vào bình định mức 50 ml Thiết lập mẫu chuẩn: Dung dịch hóa chất Chất chuẩn NaNO2 2µg/ml (ml) Nước cất (ml) Nồng độ NO2- (µg/ml) Thuốc thử (ml) 0 10 0,0 1 0,2 Ống nghiệm 3 0,4 0,6 1 4 0,8 5 1,0 6 1,2 + Lắc đo OD bước sóng λ = 550 nm + Ống nghiệm ống nghiệm thử không (TK), ống lại ống thử thật (TT) Từ kết thu ta dựng đường chuẩn NaNO2 hay NO2- biểu tương quan nồng độ NO2- (µg/ml) ∆OD = ODTT – ODTK - Mẫu nước có NO2- : 10ml mẫu + 1ml thuốc thử, lắc Để yên 15 phút, đo OD bước sóng λ = 550 nm Dựa vào đường chuẩn suy nồng độ NO2- mẫu A.8 Phương pháp xác định protein A.8.1 Nguyên tắc Hầu hết protein chứa Tyrosine Tryptophan Hàm lượng amino acid tùy thuộc vào loại protein Vì vậy, protein loại với chứa hàm lượng amino acid Khi cho tác dụng protein với thuốc thử Folin tạo thành phức chất có màu Màu tỷ lệ với hàm lượng Tyrosine Tryptophan (hàm lượng protein) Vì thế, ta dùng phương pháp so màu xác định hàm lượng protein A.8.2 Hóa chất - Dung dịch Albumin 0,1%: hòa tan 0,1g Albumin nước thành 100ml - Dung dịch NaOH N/10: hòa tan 0,4g NaOH nước thành 100ml - Dung dịch A: hòa tan 2g Na2CO3 NaOH N/10 thành 100ml - Dung dịch Trisodium citrate 1%: hòa tan 1g Trisodium citrate nước thành 100ml - Dung dịch B: hòa tan 0,5g CuSO4.5H2O dung dịch Trisodium citrate 1% thành 100ml - Dung dịch C: hỗn hợp dung dịch A dung dịch B theo tỷ lệ 49:1 (pha trước dùng 30 phút) - Thuốc thử Folin A.8.3 Tiến hành - Hút 0,4ml dung dịch có chứa protein cho vào ống nghiệm sấy khơ Thêm vào 2ml dung dịch C, lắc để yên 10 phút, sau thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc phút - Thêm nước cất cho đủ 5ml Đem đo mật độ quang với bước sóng 750nm Thiết lập mẫu chuẩn Ống nghiệm Dung dịch Albumin 0,1% (ml) Nước cất (ml) Nồng độ protein (mg/l) 0,0 10 0,5 9,5 50 1,0 9,0 100 1,5 8,5 150 2,0 8,0 200 2,5 7,5 250 Dùng dung dịch protein để dựng đường chuẩn với trục X nồng độ protein trục Y ∆OD (∆OD=ODi – OD0) Dựa vào đường chuẩn xác định nồng độ protein có dung dịch mẫu A.9 Phương pháp xác định nhu cầu oxy hóa học COD A.9.1 Định nghĩa Xác định nhu cầu oxy hóa học (COD: Chemical Oxygen Demand) lượng oxy cần thiết cho q trình oxy hóa tồn chất hữu mẫu nước thành CO2 H2O Lượng oxy tương ứng với hàm lượng chất hữu bị oxy hóa xác định sử dụng tác nhân oxy hóa mạnh môi trường acid A.9.2 Nguyên tắc Để xác định COD sử dụng chất oxy hóa mạnh mơi trường acid Chất oxy hóa dùng Kali bicromat (K2Cr2O7) Ag2SO4 + CO2 + H2O + Cr3+ + 2K+ Chất hữu + K2Cr2O7 + H nhiệt độ Lượng bicromat dư chuẩn độ dung dịch muối Mohr [Fe(NH4)2(SO4)2] với thị dung dịch Ferroin: thị chuyển từ màu xanh lam sang màu đỏ nhạt Có phương pháp xác định COD phương pháp đun kín đun hồn lưu Cr2O7-2 + Fe3+ + H+ Ỉ Cr+3 +Fe+3 + H2O A.9.3 Dụng cụ hóa chất ™ Dụng cụ: ống nghiệm có nắp, tủ sấy 1500C ™ Hóa chất - Dung dịch chuẩn K2Cr2O7 (0,0167M): cân 4,931g K2Cr2O7 (sấy lò sấy 1050C giờ) + 500ml nước cất + 167ml H2SO4 đậm đặc, khuấy tan để nguội, thêm nước cất thành 1000ml - H2SO4 đậm đặc 36N, H2SO4 20% - Chỉ thị màu Ferroin: hòa tan 1,485g 1-10 phenanthroline monohydrate + 0,695g FeSO4.7H2O nước thành 1000ml - Dung dịch FAS (0,1M): cân xác 39,2g Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O hòa tan nước cất + 20ml H2SO4 đậm đặc, làm lạnh thêm nước cất đủ 1000ml A.9.4 Cách thực Phương pháp đun kín (với COD > 50mg O2/l): rửa ống nghiệm có nút vặn với H2SO4 20% trước sử dụng, chọn thể tích mẫu thể tích hóa chất dùng tương ứng theo bảng sau: Ống nghiệm 16x100mm 20x150mm 25x150mm Thể tích mẫu (ml) 2,5 5,0 10,0 Dung dịch K2Cr2O7 (ml) 1,5 3,0 6,0 H2SO4 đậm đặc (ml) 3,5 7,0 14,0 Tổng thể tích (ml) 7,5 15,0 30,0 Cho mẫu vào ống nghiệm thêm dung dịch K2Cr2O7 0,0167M vào, cho H2SO4 đậm đặc vào cách cho acid chảy từ từ vào thành bên ống nghiệm Đậy nút vặn ngay, lau sạch, lắc kỹ nhiều lần thật cẩn thận, đặt vào lò sấy 1500C Lấy ống nghiệm ra, để nguội đến nhiệt độ phòng Đổ hỗn hợp vào erlen 250ml thêm 23 giọt ferrion định phân FAS 0,1M Định phân đến hỗn hợp chuyển từ màu xanh lục sang đỏ nâu Làm mẫu thử khơng với nước cất A.9.5 Cách tính kết Hàm lượng COD mẫu là: (A – B) N 8000 COD (mg/l) = V A: Thể tích dung dịch FAS chuẩn độ mẫu thử không (ml) B: Thể tích dung dịch FAS chuẩn độ mẫu thử thật (ml) N: Nồng độ đương lượng dung dịch FAS 8000: Hệ số chuyển đổi kết sang mg O2/l V: Thể tích mẫu (ml) A.10 Phương pháp xác định oxy hòa tan DO (phương pháp Winkler cải tiến) A.10.1 Nguyên tắc Oxygen (O2) hòa tan nước quan trọng với q trình hơ hấp thủy sinh vật Nguồn O2 nước chủ yếu O2 hòa tan vào nước qua bề mặt tiếp xúc với khí nhờ trình quang hợp tảo, vi sinh vật quang dưỡng… Sự hòa tan chất khí vào nước đến giới hạn xác định Giới hạn độ bão hòa Với O2 độ bão hòa chủ yếu phụ thuộc vào nhiệt độ, áp suất, độ mặn…Vì giá trị oxy hòa tan đo thường giá trị oxy hòa tan mức bão hòa Do vậy, thông số DO thường sử dụng để đánh giá mức độ ô nhiễm nguồn nước chất hữu Ở đây, ta xác định hàm lượng O2 phương pháp Winkler sở phản ứng oxy hóa – khử nối tiếp sau: ™ Nếu khơng có oxy mẫu nước Mn2+ + 2OH- → Mn(OH)2 ↓(trắng) ™ Nếu có oxy mẫu nước Mn2+ + 2OH- + ½ O2 → MnO2 ↓(nâu) + H2O ™ Sau hòa tan kết tủa acid H2SO4 đậm đặc MnO2 + 2I- + 4H+ → Mn2+ +I2 + 2H2O ™ I2 giải phóng cho tác dụng với dung dịch Na2SO3 Chỉ thị tinh bột I2 + 2Na2SO3 Na2S2O6 (không màu) + 2NaI A.10.2 Dụng cụ hóa chất ™ Dụng cụ Bình Winkler tích 300ml, dụng cụ thí nghiệm khác ™ Hóa chất - MnSO4: hòa tan 480g MnSO4.4H2O (hoặc 400g MnSO4.2H2O, 364g MnSO4.H2O) nước cất pha thành 1000ml - Dung dịch Iodur – Azur – kiềm: chuẩn bị cách + Hòa tan 700g KOH 150g KI nước cất thành 1000ml, thêm vào dung dịch 10g NaN3 hòa tan sẵn 40ml nước cất + Hòa tan 400g NaOH 500ml nước cất đun sôi, làm lạnh từ từ thêm 900g NaI Hòa tan 10 NaN3 40ml nước cất, tan hoàn toàn cho vào dung dịch pha loãng thành 1000ml - Acid H2SO4 đậm đặc 36N - Dung dịch Na2SO3 0,025N: hòa tan 6,205g Na2SO3.5H2O nước cất, thêm 0,4g NaOH viên, pha thành 1000ml - Chỉ thị tinh bột 1%: cân 1g tinh bột hòa 5ml nước cất, đun cách thủy cho tan hồn tồn sau định mức lại cho đủ 100ml Pha trước sử dụng 30 phút A.10.3 Cách tiến hành - Cho mẫu nước vào bình Winkler, đậy nút, gạt bỏ phần ra, V=300ml, không để bọt khí bám quanh thành chai - Mở nút, thêm vào 1ml MnSo4 1ml Iodur – Azur – kiềm - Đậy nút đảo ngược chai 20 giây - Để yên đến kết tủa lắng hoàn toàn, lắc chai thêm lần Nếu nước lợ thời gian đảo chai phút - Đợi kết tủa lắng yên, cẩn thận mở nút chai, thêm 2ml H2SO4 đậm đặc vào - Đậy nút, rửa chai vòi nước, đảo chai để hòa tan hồn tồn kết tủa - Rót bỏ 97ml dung dịch chai, định phân lượng lại dung dịch Na2SO3 0,025N với thị hồ tinh bột Hồ tinh bột cho vào màu vàng dung dịch thật nhạt Định phân đến màu xanh chuyển thành màu trắng A.10.4 Cách tính kết 1ml Na2SO3 0,025N dùng = 1mg O2/l A N 300 8000 DO (mg/l) = B (300 – 2) Với: A: thể tích dung dịch Na2SO3 chuẩn độ (ml) B: thể tích dung dịch đem chuẩn độ (ml) N: nồng độ đương lượng dung dịch Na2SO3 8000: hệ số chuyển đổi kết sang mg O2/l PHỤ LỤC B Hình B.1 Cây phát sinh lồi dựa vào trình tự 16S rDNA nhóm Rhodospirillum (α – Proteabacteria) có quan hệ với vi khuẩn tía phi lưu huỳnh khác, với vi khuẩn tía lưu huỳnh với đại diện nhóm hóa dưỡng có quan hệ gần gũi [19] Hình B.2 Cây phát sinh lồi dựa vào trình tự 16S rDNA nhóm Rhodopseudomonas (α – Proteabacteria) có quan hệ với vi khuẩn tía phi lưu huỳnh khác, với vi khuẩn tía lưu huỳnh với đại diện nhóm hóa dưỡng có quan hệ gần gũi [19] Hình B.3 Cây phát sinh lồi dựa vào trình tự 16S rDNA nhóm Rhodobacter (α – Proteabacteria) có quan hệ với vi khuẩn tía phi lưu huỳnh khác, với vi khuẩn tía lưu huỳnh với đại diện nhóm hóa dưỡng có quan hệ gần gũi [19] PHỤ LỤC C Bảng C.1 Giá trị OD660 tương ứng với tổng số vi sinh OD Tổng vi sinh (tế bào/ml) Log (N) 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,9.1010 0,4.1010 15.108 7,5.108 45.107 15.107 1,4.107 7,5.107 9,9542 9,1761 8,8751 8,6532 8,1761 7,1461 7,8751 9,6021 Đồ thị C.1 Đường chuẩn xác định tổng số vi sinh Bảng C.2 Giá trị OD425 tương ứng với nồng độ N-NH3 tổng số Ống nghiệm Nồng độ N-NH3 tổng số OD ∆OD 0,114 0,2 0,146 0,032 0,4 0,180 0,066 0,6 0,214 0,100 0,8 0,250 0,136 0,286 0,172 Đồ thị C.2 Đường chuẩn xác định TAN Bảng C.3 Giá trị OD665 tương ứng với nồng độ sulfide tổng số Ống nghiệm Nồng độ tổng sulfide (mg/l) OD ∆OD 0 0,094 0,02 0,101 0,007 0,04 0,108 0,014 0,06 0,115 0,021 0,08 0,121 0,027 0,1 0,128 0,034 0,414 0,399 1,2 0,487 0,472 Đồ thị C.3 Đường chuẩn xác định NO2Bảng C.4 Giá trị OD550 tương ứng với nồng độ NO2Ống nghiệm Nồng độ NO2- (mg/l) OD ∆OD 0 0,015 0,2 0,100 0,085 0,4 0,183 0,168 0,6 0,261 0,246 0,8 0,338 0,323 Đồ thị C.4 Đường chuẩn xác định NO2- Bảng C.5 Giá trị OD750 tương ứng với nồng độ protein Ống nghiệm Nồng đồ protein (mg/l) OD ∆OD 0 0,010 50 0,047 0,037 100 0,081 0,071 150 0,110 0,100 200 0,142 0,132 250 0,174 0,164 (6) 30,5 31,0 31,5 31,0 31,0 30,5 30,5 31,0 30,5 30,6 31,0 (7) 31,0 31,5 32,0 31,5 31,5 31,0 31,0 31,5 31,0 31,1 31,5 Đồ thị C.5 Đường chuẩn xác định protein NT Bảng C.6 Nhiệt độ nước khảo sát qua tuần Tuần ĐC NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 (1) 31,0 31,2 31,8 32,0 32,0 31,0 31,2 31,3 31,2 31,0 31,0 (2) 31,6 32,0 32,4 32,4 32,4 31,6 32,0 32,0 32,0 31,5 31,7 Nhiệt độ khảo sát qua tuần (0C) (3) (4) (5) 30,4 30,6 31,0 30,4 31,3 31,6 30,8 31,7 32,0 31,0 31,7 32,0 31,0 31,5 32,0 30,0 30,7 31,0 30,0 30,8 31,0 30,5 30,9 31,0 30,4 30,7 31,0 30,5 31,0 31,0 30,5 30,9 31,0 Bảng C.7 Giá trị pH khảo sát qua tuần NT    Tuần ĐC NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 (1) 6,7 6,6 6,7 6,7 6,7 6,8 6,7 6,7 6,8 6,8 6,8 (2) 6,8 6,8 6,7 6,8 6,8 6,9 6,9 6,7 6,9 6,9 6,9 (3) 6,9 6,7 6,8 6,8 6,9 6,9 6,9 6,7 6,9 6,9 6,9 pH (4) 6,9 6,8 6,9 6,9 7,0 7,0 7,0 6,9 7,0 7,1 7,1 (5) 7,0 6,9 7,0 6,9 7,0 7,0 7,0 6,9 7,0 7,0 7,0 (6) 7,0 6,9 7,0 6,9 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,1 (7) 7,0 7,0 7,1 7,0 7,0 7,0 7,0 7,1 6,9 7,0 7,1 Bảng C.8 Hàm lượng oxy hòa tan nghiệm thức khảo sát qua tuần NT    Tuần ĐC NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 NT7 NT8 NT9 NT10 (1) 0,85 0,90 0,90 1,30 1,50 1,45 1,30 1,50 1,55 1,50 1,50 (2) 0,75 0,75 0,80 0,80 0,75 0,75 0,80 0,75 0,85 0,80 0,80 (3) 0,75 0,80 0,85 0,90 0,85 0,90 0,85 0,85 0,90 0,90 0,95 DO (mg/l) (4) 0,75 0,75 0,80 0,75 0,80 0,80 0,90 0,75 0,85 0,80 0,85 (5) 0,75 0,80 0,80 0,80 0,85 0,75 0,90 0,90 0,85 0,75 0,80 (6) 0,80 0,80 0,80 0,80 0,90 0,80 0,90 0,90 0,85 0,85 0,80 (7) 0,75 0,75 0,80 0,80 0,85 0,75 0,90 0,90 0,80 0,75 0,80