Đề tài này được thực hiện với mục tiêu khảo sát môi trường thay thế từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền với mục đích thay thế môi trường thương mại đắt tiền tryptic soy broth (TSB) đối với 4 chủng bacillus sinh carotenoid.
Trang 1KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY BACILLUS SINH CAROTENOID
TỪ CÁC NGUỒN NGUYÊN LIỆU RẺ TIỀN
Lê Minh Trí*, Trần Hữu Tâm**, Trần Thị Thanh Thảo*, Trần Cát Đông*
TÓM TẮT
Mở đầu: Bacillus là một chi vi khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên Gần đây, một số chủng Bacillus đã
được chứng minh có khả năng sinh carotenoid, một chất chống oxi hóa tự nhiên có khả năng ngăn ngừa một số bệnh ung thư
Mục tiêu: Khảo sát môi trường thay thế từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền với mục đích thay thế môi trường
thương mại đắt tiền Tryptic Soy Broth (TSB) đối với 4 chủng Bacillus sinh carotenoid
Phương pháp: Tiến hành khảo sát các yếu tố nuôi cấy như nhiệt độ, pH, %NaCl thích hợp đối với 4 chủng
Bacillus sinh carotenoid gồm AT22 (Bacillus licheniformis), AT14 (Bacillus infantis), HC28 (Bacillus vietnamensis), DD1.1 (Bacillus marisflavi) Sau đó khảo sát các môi trường thay thế từ các dịch chiết gạo, khoai tây, đậu nành, bắp và các phối hợp của các dịch chiết này ở tỷ lệ 1:1 Thí nghiệm được tiến hành dưới các điều kiện nuôi cấy đã khảo sát Cuối cùng, xác định sự ảnh hưởng của khoáng chất như phosphat và kali lên sự phát triển của vi khuẩn bằng cách bổ sung K 2 HPO 4 (2,5 g/l) vào môi trường thay thế đối với từng chủng Bacillus Tổng số tế bào (cfu/ml) nuôi cấy trên các môi trường thử nghiệm được xác định và so sánh với môi trường TSB
Kết quả: Tất cả các chủng Baillus phát triển tốt nhất ở 30-35 o C Chủng AT22, DD1.1, và AT14 phát triển tốt nhất ở pH 8, và HC28 ở pH 7 Cả 2 chủng DD1.1 và AT14 phát triển tốt nhất với 1 % NaCl và 2 chủng AT22 và HC28 phát triển tốt khi không bổ sung NaCl Chọn được bốn môi trường thay thế: dịch chiết đậu nành 20% + K 2 HPO 4 đối với DD1.1 và HC28, dịch chiết đậu nành-khoai tây (20%) + K 2 HPO 4 cho chủng AT22 và dịch chiết đậu nành-khoai tây (20%) cho chủng AT14
Kết luận: Đã tìm được môi trường thay thế rẻ tiền cho 4 chủng Bacillus sinh carotenoid và tổng số tế bào vi
khuẩn nuôi cấy trên môi trường thay thế cao gấp 2 lần trở lên so với môi trường thương mại TSB
Từ khóa: Bacillus; môi trường; carotenoid; thực phẩm chức năng
ABSTRACT
ALTERNATIVE MEDIA FOR CAROTENOGENIC BACILLUS FROM CHEAP MATERIALS
Le Minh Tri, Tran Huu Tam, Tran Thi Thanh Thao, Tran Cat Dong
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 1 - 2011: 189 - 194
Background: The Bacillus bacteria were widely distributed in nature Recently, some Bacillus species were
demonstrated to have carotenoids, a natural antioxidant which is thought to be able to prevent some kinds of cancer
Objectives: To investigate alternative media derived from low cost materials for four carotenogenic Bacillus
to replace Tryptic Soy Broth (TSB)
Methods: Culture condition like pH, temperature and NaCl concentration for growing carotenogenic
Bacillus strains including AT22 (Bacillus licheniformis), AT14 (Bacillus infantis), HC28 (Bacillus
*Phòng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược, khoa Dược, ĐH Y Dược TPHCM
**Trung tâm Kiểm chuẩn xét nghiệm
Trang 2vietnamensis), DD1.1 (Bacillus marisflavi) were investigated Then, the alternative media from extracts of rice (R), potato (P), soybean (S), corn (C) and combination of these extracts at ratio 1:1 were investigated Determine the influence of phosphate and potassium on the bacterial growth by adding K 2 HPO 4 (2,5g/l) to the alternative media The growth of these strains on alternative media was determined and compared with TSB by viable count method on Tryptic Soy Agar (TSA)
Results: All four Bacillus strains grew optimally at 30-35 o C The optimal pH value for AT22, DD1.1, and AT14 is 8 and for HC28 is 7 Suitable NaCl for growing DD1.1 and AT14 is 1 % Strains AT22 and HC28 can grow optimally without adding NaCl The alternative media were soy bean extract (20%) + K 2 HPO 4 for DD1.1 and HC28; soy bean+potato extract (20%)+K 2 HPO 4 for AT22 and soy bean + potato extract (20%) for AT14
Conclusions: Alternative media from low cost materials have been defined and cell number on alternative media was at least two times higher than Tryptic Soy Broth medium
Keywords: Bacillus; medium; carotenoid; functional food
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bacillus là chi vi khuẩn được phân bố rộng
rãi trong tự nhiên và có rất nhiều nghiên cứu
liên quan đến các chủng này do sự đa dạng về
loài cũng như các lợi ích kinh tế Một trong
những ứng dụng quan trọng của Bacillus là dùng
làm chế phẩm probiotic, ví dụ như Bacillus
subtilis(4), để bổ sung trong thực phẩm ở một số
nước Châu Âu Bên cạnh đó, một vài chủng
Bacillus đã được chứng minh có khả năng sinh
carotenoid, một chất chống oxi hóa tự nhiên có
khả năng ngăn chặn một số bệnh ung thư thông
qua việc bảo vệ tế bào tránh các tổn thương do
tia UV và các tác nhân oxi hóa khác(5) Các chủng
Bacillus sinh carotenoid liên quan đến việc sản
xuất các sắc tố đỏ, cam, vàng(5) Trong đó một số
loài có khả năng sinh carotenoid ở cả dạng tế bào
sinh dưỡng và bào tử(1)
Những nghiên cứu trước đây trên Bacillus
đều sử dụng môi trường thương mại đắt tiền
như Tryptic Soy Broth (TSB) Vì vậy, hướng đến
việc sản xuất thực phẩm chức năng chứa
carotenoid, cần phải tìm kiếm các môi trường
nuôi cấy rẻ tiền để thay thế cho TSB và các điều
kiện tăng trưởng tốt nhất
Trong báo cáo này, chúng tôi nghiên cứu
môi trường thay thế đối với bốn chủng Bacillus
gồm: Bacillus marisflavi, Bacillus licheniformis,
Bacillus infantis và Bacillus vietnamensis dựa trên
các nguồn nguyên liệu gạo, khoai tây, đậu nành
và bắp với các thành phần dinh dưỡng đa dạng
như carbon, protein Đồng thời, khảo sát ảnh
hưởng của khoáng lên các chủng Bacillus này vì
nguồn khoáng đóng một vai trò quan trọng đối với các chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ môi trường biển(7)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi khuẩn
Các chủng Bacillus sử dụng trong nghiên cứu: AT22 (Bacillus licheniformis), AT14 (Bacillus infantis), HC28 (Bacillus vietnamensis), DD1.1 (Bacillus marisflavi) phân lập tại các
vùng biển và ao tôm ở Việt Nam, do phòng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược ở Đại học Y Dược phân lập
Điều kiện phát triển
Nhiệt độ phát triển thích hợp của bốn chủng
Bacillus được khảo sát ở các mốc 20oC, 25oC,
30oC, 35oC, 40oC , 45oC trên môi trường Tryptic Soy Broth (TSB) pH tăng trưởng thích hợp được khảo sát ở mức 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Nồng độ NaCl phù hợp đối với sự phát triển của các chủng vi khuẩn được khảo sát ở các mức 0%, 1%, 3%, 5%, 7%, 9%, 11% Sau 24 h nuôi cấy, xác định sự phát triển của chủng vi khuẩn bằng cách đo quang ở bước sóng 600 nm
Môi trường thay thế
Môi trường thay thế được điều chế từ các dịch chiết đậu nành (Đ), gạo (G), bắp (B) và khoai tây (K), đây là các nguyên liệu phổ biến và
có giá thành tương đối thấp ở Việt Nam Các
Trang 3nguyên liệu này có thành phần đa dạng do đó có
thể dùng như nguồn cung cấp carbon, nitơ,
vitamin và các khoáng chất(8) Các môi trường
khảo sát được chuẩn bị theo phương pháp của
Ekwealor(2) và được biến đổi để phù hợp với
nghiên cứu
Chuẩn bị môi trường
Nguyên liệu được cân 10 g, ngâm trong 100
ml nước và nấu trong 15 phút Riêng đậu nành
được ngâm trong nước nóng khoảng 30 phút để
làm mềm hạt đậu và xay nhuyễn với 100 ml
nước Lọc thu dịch chiết, bổ sung nước vừa đủ
100ml Như vậy, các dịch chiết sẽ có nồng độ là
10% Tiến hành tương tự với dịch chiết có nồng
độ 15 % và 20 % Sau đó, phối trộn bốn loại dịch
chiết ở tỉ lệ 1:1 Mười môi trường thí nghiệm
được khảo sát cho mỗi chủng Bacillus được trình
bày trong Bảng 1 Hấp tiệt trùng môi trường ở
121 oC/ 15 phút
Bảng 1 Các môi trường thí nghiệm
Dịch chiết
(%) Môi trường thử nghiệm
B: Dịch chiết bắp K: Dịch chiết khoai tây
Các chủng Bacillus được nuôi trong 10 môi
trường tại các điều kiện nuôi cấy thích hợp về
nhiệt độ, pH và nồng độ muối
Chủng vi khuẩn được nhân giống trong 10
ml TSB, ủ qua đêm ở 37oC Sau đó, dịch vi khuẩn
được điều chỉnh về mật độ 108 CFU/ml và cấy
vào các môi trường thử nghiệm với tỷ lệ 1% Môi
trường thử nghiệm ủ ở 37oC/ 24 giờ, lắc ở 200
vòng/phút Số tế bào (CFU/ml) trên các môi
trường thử nghiệm được xác định bằng phương
pháp đếm sống trên TSA và so sánh với môi
trường TSB
Khảo sát ảnh hưởng của muối khoáng
Một số muối khoáng quan trọng đối với các
vi khuẩn phân lập từ biển như KCl, K2HPO4,
NaCl, CaCl2, MgSO4 (3,10) Nhằm mục đích so
sánh với môi trường thương mại TSB để tìm ra
môi trường thay thế với giá thành thấp hơn, chúng tôi sử dụng K2HPO4 với nồng độ tương tự trong thành phần TSB là 2,5 g/l để bổ sung vào môi trường thay thế Xác định sự ảnh hưởng của
K2HPO4 lên sự phát triển của vi khuẩn bằng cách
so sánh với môi trường thay thế không bổ sung
K2HPO4
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Điều kiện nuôi cấy
Chúng tôi nhận thấy các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl và môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đáng kể đến sự phát triển của vi khuẩn Kết quả cho thấy, các chủng
Bacillus phát triển trong khoảng nhiệt độ từ
30-40oC và không phát triển ở nhiệt độ dưới 25oC hoặc trên 40oC Tất cả các chủng phát triển tốt nhất ở 35oC Cả bốn chủng Bacillus khảo sát đều
phát triển trong khoảng pH 7-9, không sống được dưới pH 6 Chủng AT22, DD1.1, và AT14 phát triển tốt nhất ở pH 8 và HC28 ở pH 7 Tất
cả các chủng đều không phát triển ở nồng độ NaCl trên 2 % Cả 2 chủng DD1.1 và AT14 đều phát triển tốt nhất với 1 % NaCl và 2 chủng AT22 và HC28 phát triển tốt nhất khi không bổ sung NaCl Đối với các kết quả trên, chúng tôi nhận thấy một vài đặc điểm của các chủng vi khuẩn này khác với những kết quả đã được công bố ở các nghiên cứu trước như chủng
Bacillus marisflavi (13) phát triển tốt nhất trong
khoảng 2-5 % NaCl, và Bacillus vietnamensis ở 1
% NaCl(9) Sự khác biệt này có thể do các chủng
Bacillus được phân lập tại các vùng biển nhiệt
đới ở Việt Nam với sự khác biệt về địa lý cũng như về khí hậu
Môi trường thay thế
Sau khi thử nghiệm 10 môi trường từ các dịch chiết đậu nành, khoai tây, bắp và gạo với
tỉ lệ phối trộn 1:1, chúng tôi nhận thấy cả bốn chủng vi khuẩn sử dụng các nguồn nguyên liệu với hiệu quả khác nhau Đồ thị ở Hình 1
cho thấy sự phát triển của 4 chủng Bacillus trên
10 môi trường thử nghiệm Chẳng hạn chủng DD1.1 phát triển trên 5 loại môi trường như
Trang 4dịch chiết khoai tây, dịch chiết đậu nành, dịch
chiết gạo-khoai (1:1), dịch chiết đậu-bắp (1:1)
và dịch chiết đậu-khoai (1:1) Trong số 5 môi
trường trên, DD1.1 sử dụng dịch chiết đậu
nành ở nồng độ 20% tốt nhất (1200 x 106
CFU/ml) cao gấp 171 lần so với trên môi
trường TSB (7 x 106 CFU/ml) sau 24 h nuôi cấy
Chủng AT22 phát triển trên tất cả môi trường
thử nghiệm ngoại trừ dịch chiết bắp và dịch
chiết khoai tây, và phát triển tốt nhất trên môi trường dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1) ở nồng độ 20% (961,62 x 106 CFU/ml) cao hơn gấp 2 lần so với TSB (466,25 x 106 CFU/ml) Đối với chủng AT14 phát triển trên cả 10 môi trường thử nghiệm nhưng môi trường tốt nhất
là dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1) ở nồng
độ 20% (781,2 x 106 CFU/ml) cao hơn 4,5 lần so với TSB (139 x 106 CFU/ml)
DD1.1
0 0 21.47
1200
0 25.94 0 0 0.017
321.5
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
G B K Đ GB GK GĐ BK BĐ KĐ TSB
Môi trường thử nghiệm
6 CF
HC28
8.13
0 0
2.15
0 0.005
1.45
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
G B K Đ GB GK GĐ BK BĐ KĐ TSB
Môi trường thử nghiệm
6 CF
AT22
0 0.32 14.6 3.88 0.24 39.5 51 40 16.32
961.62
0
200
400
600
800
1000
1200
G B K Đ GB GK GĐ BK BĐ KĐ TSB
Môi trường thử nghiệm
6 CF
AT14
35.4 0.1
105 72.1
4.21 56.1
156.3
2.63 5.12
781.2
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
G B K Đ GB GK GĐ BK BĐ KĐ TSB
Môi trường thử nghiệm
6 CF
Nổng độ 10 % Nồng độ 15 %
Nồng độ 20 % TSB
Hình 1 Số tế bào (CFU/ml) của Bacillus trên 10 môi trường thử nghiệm và TSB Dịch chiết của 10 môi trường
thử nghiệm được khảo sát tại các nồng độ 10%, 15%, 20%
Cuối cùng, chủng HC28 phát triển kém trên
hầu hết các môi trường thử nghiệm, ngoại trừ
dịch chiết đậu nành ở nồng độ 20 % là môi
trường thay thế tốt nhất đối với chủng HC28
(8,13 x 106 CFU/ml) cao hơn 6 lần so với TSB
(1,35 x 106 CFU/ml) Các chủng Bacillus sử dụng
các nguồn nguyên liệu với hiệu quả khác nhau
tùy thuộc vào đặc điểm của từng loài Trong đó,
môi trường thay thế tốt nhất cho DD1.1 và HC28
là dịch chiết đậu nành, cả 2 chủng AT14 và AT22
đều phát triển tốt trong môi trường dịch chiết
đậu nành-khoai tây (1:1) Những môi trường này
đều chứa đậu nành với hàm lượng nitơ cao và các khoáng chất cần thiết thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn(6,13) Bên cạnh đó, đối với 2 chủng AT22 và AT14, dịch chiết khoai tây phù hợp cho sự phát triển của chúng vì nguồn nguyên liệu này đầy đủ cung cấp carbon, nitơ, vitamin và khoáng(12) Trên môi trường thay thế,
các chủng Bacillus tạo sinh khối cao hơn so với
môi trường TSB Như vậy những nguồn nguyên liệu rẻ tiền này thật sự có tiềm năng ứng dụng trong việc sản xuất carotenoid ở quy mô lớn, mang lại hiệu quả kinh tế cao
Trang 5Theo một số tác giả(7), một đặc điểm quan
trọng của các chủng vi khuẩn phân lập từ môi
trường biển là nhu cầu về khoáng như: Na+,
K+, Mg2+, và Ca2+ Vì vậy cần nghiên cứu sự
ảnh hưởng của các ion này trong sự phát triển
của 4 chủng Bacillus được phân lập từ môi
trường biển Nhưng với mục đích so sánh với
môi trường TSB, chúng tôi chỉ sử dụng
K2HPO4 trong nghiên cứu này K2HPO4 cũng
được sử dụng nhiều trong một số nghiên cứu như thành phần quan trọng đối với sự phát triển của vi khuẩn(11) Ngoài ra, K2HPO4 cũng đóng vai trò chất đệm để ổn định pH trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn Hình 2 cho thấy
sự phát triển của 4 chủng Bacillus thí nghiệm
trong môi trường thay thế có bổ sung và không bổ sung 0,25 % K2HPO4
1480
30.5
531
270.2
1530
405
282.75
1112
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
Chủng Bacillus
6 CF
Môi trường thay thế
Môi trường thay thế+K2HPO4
Hình 2 Sự phát triển của 4 chủng Bacillus trên môi trường thay thế (20 %) có và không có bổ sung muối
khoáng K 2 HPO 4 DD1.1 : Môi trường dịch chiết đậu nành AT22 : Môi trường dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1)
Chúng tôi nhận thấy khi bổ sung thêm
K2HPO4 AT22 phát triển tốt với mật độ 405 x 106
CFU/ml cao hơn 13,5 lần so với môi trường
không bổ sung K2HPO4 Mật độ tế bào của
DD1.1 trên môi trường có K2HPO4 (1530 x 106
CFU/ml) cao hơn không đáng kể so với môi
trường không bổ sung K2HPO4 HC28 phát triển
tốt khi bổ sung K2HPO4 (1112 x 106 CFU/ml) cao
hơn 4 lần so với môi trường không bổ sung
(270,2 x 106 CFU/ml) Việc bổ sung phosphat còn
đóng vai trò như đệm giúp ổn định pH môi
trường đối với sự phát triển của tế bào(7) Cả 3
chủng AT22, HC28, và DD1.1 đều phát triển tốt
nhất với 0,125 % K2HPO4 trong môi trường thay
thế Ngoại trừ chủng AT14 phát triển kém hơn 2
lần so với môi trường thay thế không bổ sung
muối khoáng Môi trường thay thế của 4 chủng
Bacillus được thể hiện trong Bảng 2
Bảng 2 Môi trường thay thế của bốn chủng Bacillus
Môi trường thay thế Chủng
Bacillus Dịch chiết nguyên liệu K2HPO4 (0,25 %)
AT22 Đậu nành + Khoai tây (20%) + AT14 Đậu nành + Khoai tây (20%) –
KẾT LUẬN
Bốn chủng Bacillus sinh carotenoid đều phát
triển tốt nhất trên môi trường thay thế từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền Trên môi trường thay
thế, các chủng Bacillus này đạt sinh khối cao gấp
2 lần trở lên so với môi trường TSB
Cảm ơn: Nghiên cứu này sử dụng kinh phí từ dự án Colorspore
(KBBE-2007-207948) cấp cho Trần Cát Đông
Trang 6TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Duc L H., Fraser P D., et al (2006) Carotenoids present in
halotolerant Bacillus spore formers FEMS Microbiol Lett 255:
215-224
2 Ekwealor L A., Ebele O A (2003) Preliminary study of
L-lysine production by Bacillus species using various
agricultural by-products Food / Nahrung 47(4): 226-227
3 Hidaka T (1965) The specificity of mineral requirements of
marine bacteria Mem Fac Fish 14: 127-180
4 Hong H A., Huang J M., et al (2008) The safety of Bacillus
subtilis and Bacillus indicus as food probiotics Journal of
Applied Microbiology 105: 510-520
5 Khaneja R., Perez-Fons L., et al (2010) Carotenoids found in
Bacillus Journal of Applied Microbiology 108(6): 1889-1902
6 Ko K S., Oh W S., et al (2006) Bacillus infantis sp nov and
Bacillus idriensis sp nov., isolated from a patient with
neonatal sepsis International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology 56: 2541-2544
7 MacLeod R A (1968) On the role of inorganic ions in the
physiology of marine bacteria Adv Microbiol Sea 1: 95-126
8 Noah K., Bruhn D., et al (2005) Surfactin Production from Potato Process Effluent by Bacillus subtilis in a Chemostat Applied biochemistry and biotechnology 122(1-3): 465-474
9 Noguchi H., Uchino M., et al (2004) Bacillus vietnamensis sp nov., a moderately halotolerant, aerobic, endospore-forming bacterium isolated from Vietnamese fish sauce International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54: 2117-2120
10 Ruger H.J., Hentzschel G (1980) Mineral Salt Requirements
of Bacillus globisporus subsp marinus Strains Arch Microbiol
(126): 83-86
11 Sangkharak K., Prasertsan P (2008) Nutrient optimization for production of polyhydroxybutyrate from halotolerant photosynthetic bacteria cultivated under aerobic-dark condition Electronic Journal of Biotechnology 11(3): 1-12
12 Thompson DN F S., Bala GA (2000) Biosurfactants from potato process effluents Appl Biochem Biotechnol 84-86:
917-930
13 Yoon J.H., Kim I.G., et al (2003) Bacillus marisflavi sp nov and Bacillus aquimaris sp nov., isolated from sea water of a tidal flat of the Yellow Sea in Korea International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 53: 1297–1303