Khảo sát môi trường nuôi cấy bacillus sinh carotenoid từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền

Đề tài này được thực hiện với mục tiêu khảo sát môi trường thay thế từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền với mục đích thay thế môi trường thương mại đắt tiền tryptic soy broth (TSB) đối với 4 chủng bacillus sinh carotenoid.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY BACILLUS SINH CAROTENOID TỪ CÁC NGUỒN NGUYÊN LIỆU RẺ TIỀN Lê Minh Trí*, Trần Hữu Tâm**, Trần Thị Thanh Thảo*, Trần Cát Đông* TÓM TẮT Mở đầu: Bacillus chi vi khuẩn phân bố rộng rãi tự nhiên Gần đây, số chủng Bacillus chứng minh có khả sinh carotenoid, chất chống oxi hóa tự nhiên có khả ngăn ngừa số bệnh ung thư Mục tiêu: Khảo sát môi trường thay từ nguồn ngun liệu rẻ tiền với mục đích thay mơi trường thương mại đắt tiền Tryptic Soy Broth (TSB) chủng Bacillus sinh carotenoid Phương pháp: Tiến hành khảo sát yếu tố nuôi cấy nhiệt độ, pH, %NaCl thích hợp chủng Bacillus sinh carotenoid gồm AT22 (Bacillus licheniformis), AT14 (Bacillus infantis), HC28 (Bacillus vietnamensis), DD1.1 (Bacillus marisflavi) Sau khảo sát mơi trường thay từ dịch chiết gạo, khoai tây, đậu nành, bắp phối hợp dịch chiết tỷ lệ 1:1 Thí nghiệm tiến hành điều kiện nuôi cấy khảo sát Cuối cùng, xác định ảnh hưởng khoáng chất phosphat kali lên phát triển vi khuẩn cách bổ sung K2HPO4 (2,5 g/l) vào môi trường thay chủng Bacillus Tổng số tế bào (cfu/ml) nuôi cấy môi trường thử nghiệm xác định so sánh với môi trường TSB Kết quả: Tất chủng Baillus phát triển tốt 30-35oC Chủng AT22, DD1.1, AT14 phát triển tốt pH 8, HC28 pH Cả chủng DD1.1 AT14 phát triển tốt với % NaCl chủng AT22 HC28 phát triển tốt không bổ sung NaCl Chọn bốn môi trường thay thế: dịch chiết đậu nành 20% + K2HPO4 DD1.1 HC28, dịch chiết đậu nành-khoai tây (20%) + K2HPO4 cho chủng AT22 dịch chiết đậu nành-khoai tây (20%) cho chủng AT14 Kết luận: Đã tìm mơi trường thay rẻ tiền cho chủng Bacillus sinh carotenoid tổng số tế bào vi khuẩn nuôi cấy môi trường thay cao gấp lần trở lên so với môi trường thương mại TSB Từ khóa: Bacillus; mơi trường; carotenoid; thực phẩm chức ABSTRACT ALTERNATIVE MEDIA FOR CAROTENOGENIC BACILLUS FROM CHEAP MATERIALS Le Minh Tri , Tran Huu Tam , Tran Thi Thanh Thao , Tran Cat Dong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 189 - 194 Background: The Bacillus bacteria were widely distributed in nature Recently, some Bacillus species were demonstrated to have carotenoids, a natural antioxidant which is thought to be able to prevent some kinds of cancer Objectives: To investigate alternative media derived from low cost materials for four carotenogenic Bacillus to replace Tryptic Soy Broth (TSB) Methods: Culture condition like pH, temperature and NaCl concentration for growing carotenogenic Bacillus strains including AT22 (Bacillus licheniformis), AT14 (Bacillus infantis), HC28 (Bacillus *Phòng thí nghiệm Vi sinh Cơng nghệ Dược, khoa Dược, ĐH Y Dược TPHCM **Trung tâm Kiểm chuẩn xét nghiệm Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Cát Đông ĐT: 08 38295641 – 127 Email: trancdong@gmail.com Chuyên Đề Dược Khoa 189 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 vietnamensis), DD1.1 (Bacillus marisflavi) were investigated Then, the alternative media from extracts of rice (R), potato (P), soybean (S), corn (C) and combination of these extracts at ratio 1:1 were investigated Determine the influence of phosphate and potassium on the bacterial growth by adding K2HPO4 (2,5g/l) to the alternative media The growth of these strains on alternative media was determined and compared with TSB by viable count method on Tryptic Soy Agar (TSA) Results: All four Bacillus strains grew optimally at 30-35 oC The optimal pH value for AT22, DD1.1, and AT14 is and for HC28 is Suitable NaCl for growing DD1.1 and AT14 is % Strains AT22 and HC28 can grow optimally without adding NaCl The alternative media were soy bean extract (20%) + K2HPO4 for DD1.1 and HC28; soy bean+potato extract (20%)+K2HPO4 for AT22 and soy bean + potato extract (20%) for AT14 Conclusions: Alternative media from low cost materials have been defined and cell number on alternative media was at least two times higher than Tryptic Soy Broth medium Keywords: Bacillus; medium; carotenoid; functional food carbon, protein Đồng thời, khảo sát ảnh ĐẶT VẤN ĐỀ hưởng khống lên chủng Bacillus Bacillus chi vi khuẩn phân bố rộng nguồn khống đóng vai trò quan trọng đối rãi tự nhiên có nhiều nghiên cứu với chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ mơi liên quan đến chủng đa dạng trường biển(7) loài lợi ích kinh tế Một VẬTLIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ứng dụng quan trọng Bacillus dùng làm chế phẩm probiotic, ví dụ Bacillus Chủng vi khuẩn (4) subtilis , để bổ sung thực phẩm số Các chủng Bacillus sử dụng nghiên nước Châu Âu Bên cạnh đó, vài chủng cứu: AT22 (Bacillus licheniformis), AT14 Bacillus chứng minh có khả sinh (Bacillus infantis), HC28 (Bacillus vietnamensis), carotenoid, chất chống oxi hóa tự nhiên có DD1.1 (Bacillus marisflavi) phân lập khả ngăn chặn số bệnh ung thư thông vùng biển ao tơm Việt Nam, phòng thí qua việc bảo vệ tế bào tránh tổn thương nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược Đại học Y tia UV tác nhân oxi hóa khác(5) Các chủng Dược phân lập Bacillus sinh carotenoid liên quan đến việc sản Điều kiện phát triển xuất sắc tố đỏ, cam, vàng(5) Trong số Nhiệt độ phát triển thích hợp bốn chủng lồi có khả sinh carotenoid dạng tế bào Bacillus khảo sát mốc 20oC, 25oC, sinh dưỡng bào tử(1) 30oC, 35oC, 40oC , 45oC môi trường Tryptic Những nghiên cứu trước Bacillus Soy Broth (TSB) pH tăng trưởng thích hợp sử dụng mơi trường thương mại đắt tiền khảo sát mức 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 Nồng độ NaCl Tryptic Soy Broth (TSB) Vì vậy, hướng đến phù hợp phát triển chủng vi việc sản xuất thực phẩm chức chứa khuẩn khảo sát mức 0%, 1%, 3%, 5%, carotenoid, cần phải tìm kiếm mơi trường 7%, 9%, 11% Sau 24 h nuôi cấy, xác định phát nuôi cấy rẻ tiền để thay cho TSB điều triển chủng vi khuẩn cách đo quang kiện tăng trưởng tốt bước sóng 600 nm Trong báo cáo này, nghiên cứu Môi trường thay môi trường thay bốn chủng Bacillus Môi trường thay điều chế từ gồm: Bacillus marisflavi, Bacillus licheniformis, dịch chiết đậu nành (Đ), gạo (G), bắp (B) Bacillus infantis Bacillus vietnamensis dựa khoai tây (K), nguyên liệu phổ biến nguồn nguyên liệu gạo, khoai tây, đậu nành có giá thành tương đối thấp Việt Nam Các bắp với thành phần dinh dưỡng đa dạng 190 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 nguyên liệu có thành phần đa dạng dùng nguồn cung cấp carbon, nitơ, vitamin khống chất(8) Các mơi trường khảo sát chuẩn bị theo phương pháp Ekwealor(2) biến đổi để phù hợp với nghiên cứu Chuẩn bị môi trường Nguyên liệu cân 10 g, ngâm 100 ml nước nấu 15 phút Riêng đậu nành ngâm nước nóng khoảng 30 phút để làm mềm hạt đậu xay nhuyễn với 100 ml nước Lọc thu dịch chiết, bổ sung nước vừa đủ 100ml Như vậy, dịch chiết có nồng độ 10% Tiến hành tương tự với dịch chiết có nồng độ 15 % 20 % Sau đó, phối trộn bốn loại dịch chiết tỉ lệ 1:1 Mười mơi trường thí nghiệm khảo sát cho chủng Bacillus trình bày Bảng Hấp tiệt trùng môi trường 121 oC/ 15 phút Bảng Các mơi trường thí nghiệm Dịch chiết (%) 10 G B Đ 15 G B Đ 20 G B Đ Môi trường thử nghiệm K GB GĐ K GB GĐ K GB GĐ GK GK GK BĐ BĐ BĐ G: Dịch chiết gạo Đ: Dịch chiết đậu nành B: Dịch chiết bắp K: Dịch chiết khoai tây BK BK BK ĐK ĐK ĐK Các chủng Bacillus nuôi 10 mơi trường điều kiện ni cấy thích hợp nhiệt độ, pH nồng độ muối Chủng vi khuẩn nhân giống 10 ml TSB, ủ qua đêm 37oC Sau đó, dịch vi khuẩn điều chỉnh mật độ 108 CFU/ml cấy vào môi trường thử nghiệm với tỷ lệ 1% Môi trường thử nghiệm ủ 37oC/ 24 giờ, lắc 200 vòng/phút Số tế bào (CFU/ml) mơi trường thử nghiệm xác định phương pháp đếm sống TSA so sánh với môi trường TSB Khảo sát ảnh hưởng muối khoáng Một số muối khoáng quan trọng vi khuẩn phân lập từ biển KCl, K2HPO4, NaCl, CaCl2, MgSO4 (3,10) Nhằm mục đích so sánh với mơi trường thương mại TSB để tìm Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học môi trường thay với giá thành thấp hơn, sử dụng K2HPO4 với nồng độ tương tự thành phần TSB 2,5 g/l để bổ sung vào môi trường thay Xác định ảnh hưởng K2HPO4 lên phát triển vi khuẩn cách so sánh với môi trường thay không bổ sung K2HPO4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Điều kiện nuôi cấy Chúng nhận thấy điều kiện nuôi cấy nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đáng kể đến phát triển vi khuẩn Kết cho thấy, chủng Bacillus phát triển khoảng nhiệt độ từ 3040oC không phát triển nhiệt độ 25oC 40oC Tất chủng phát triển tốt 35oC Cả bốn chủng Bacillus khảo sát phát triển khoảng pH 7-9, không sống pH Chủng AT22, DD1.1, AT14 phát triển tốt pH HC28 pH Tất chủng không phát triển nồng độ NaCl % Cả chủng DD1.1 AT14 phát triển tốt với % NaCl chủng AT22 HC28 phát triển tốt không bổ sung NaCl Đối với kết trên, nhận thấy vài đặc điểm chủng vi khuẩn khác với kết công bố nghiên cứu trước chủng Bacillus marisflavi(13) phát triển tốt khoảng 2-5 % NaCl, Bacillus vietnamensis % NaCl(9) Sự khác biệt chủng Bacillus phân lập vùng biển nhiệt đới Việt Nam với khác biệt địa lý khí hậu Mơi trường thay Sau thử nghiệm 10 môi trường từ dịch chiết đậu nành, khoai tây, bắp gạo với tỉ lệ phối trộn 1:1, nhận thấy bốn chủng vi khuẩn sử dụng nguồn nguyên liệu với hiệu khác Đồ thị Hình cho thấy phát triển chủng Bacillus 10 môi trường thử nghiệm Chẳng hạn chủng DD1.1 phát triển loại môi trường 191 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học chiết khoai tây, phát triển tốt môi trường dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1) nồng độ 20% (961,62 x 106 CFU/ml) cao gấp lần so với TSB (466,25 x 106 CFU/ml) Đối với chủng AT14 phát triển 10 môi trường thử nghiệm môi trường tốt dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1) nồng độ 20% (781,2 x 106 CFU/ml) cao 4,5 lần so với TSB (139 x 106 CFU/ml) dịch chiết khoai tây, dịch chiết đậu nành, dịch chiết gạo-khoai (1:1), dịch chiết đậu-bắp (1:1) dịch chiết đậu-khoai (1:1) Trong số môi trường trên, DD1.1 sử dụng dịch chiết đậu nành nồng độ 20% tốt (1200 x 106 CFU/ml) cao gấp 171 lần so với môi trường TSB (7 x 106 CFU/ml) sau 24 h nuôi cấy Chủng AT22 phát triển tất môi trường thử nghiệm ngoại trừ dịch chiết bắp dịch 1200 1200 DD1.1 1000 800 600 321.5 400 200 0 G B 21.47 K Đ GB 25.94 GK 8.13 0 GĐ BK 2.15 1.45 0.017 BĐ 0 KĐ G TSB B K Đ GB GK GĐ BK 0.005 BĐ 900 1200 AT22 1000 961.62 800 600 400 200 0.32 14.6 3.88 0.24 39.5 51 B K Đ GB GK GĐ TSB 40 700 600 500 400 300 200 100 16.32 105 35.4 G KĐ BK BĐ KĐ TSB 781.2 AT14 800 Số tế bào x 10 CFU/m l Số tế bào x 10 CFU/m l Môi trường thử nghiệm Môi trường thử nghiệm HC28 Số tế bào x 10 CFU/m l Số tế bào x 10 CFU/m l 1400 G 156.3 72.1 4.21 0.1 B K Môi trường thử nghiệm Đ GB 56.1 GK 2.63 GĐ BK 5.12 BĐ KĐ TSB Môi trường thử nghiệm Nổng độ 10 % Nồng độ 20 % Nồng độ 15 % TSB Hình Số tế bào (CFU/ml) Bacillus 10 môi trường thử nghiệm TSB Dịch chiết 10 môi trường thử nghiệm khảo sát nồng độ 10%, 15%, 20% chứa đậu nành với hàm lượng nitơ cao Cuối cùng, chủng HC28 phát triển khoáng chất cần thiết thích hợp cho phát hầu hết môi trường thử nghiệm, ngoại trừ triển vi khuẩn(6,13) Bên cạnh đó, dịch chiết đậu nành nồng độ 20 % môi chủng AT22 AT14, dịch chiết khoai tây phù trường thay tốt chủng HC28 hợp cho phát triển chúng nguồn (8,13 x 10 CFU/ml) cao lần so với TSB nguyên liệu đầy đủ cung cấp carbon, nitơ, (1,35 x 106 CFU/ml) Các chủng Bacillus sử dụng vitamin khống(12) Trên mơi trường thay thế, nguồn nguyên liệu với hiệu khác chủng Bacillus tạo sinh khối cao so với tùy thuộc vào đặc điểm loài Trong đó, mơi trường TSB Như nguồn ngun mơi trường thay tốt cho DD1.1 HC28 liệu rẻ tiền thật có tiềm ứng dụng dịch chiết đậu nành, chủng AT14 AT22 việc sản xuất carotenoid quy mô lớn, phát triển tốt môi trường dịch chiết mang lại hiệu kinh tế cao đậu nành-khoai tây (1:1) Những môi trường 192 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Theo số tác giả(7), đặc điểm quan trọng chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường biển nhu cầu khống như: Na+, K+, Mg2+, Ca2+ Vì cần nghiên cứu ảnh hưởng ion phát triển chủng Bacillus phân lập từ mơi trường biển Nhưng với mục đích so sánh với môi trường TSB, sử dụng K2HPO4 nghiên cứu K2HPO4 1800 1480 sử dụng nhiều số nghiên cứu thành phần quan trọng phát triển vi khuẩn(11) Ngồi ra, K2HPO4 đóng vai trò chất đệm để ổn định pH q trình ni cấy vi khuẩn Hình cho thấy phát triển chủng Bacillus thí nghiệm mơi trường thay có bổ sung không bổ sung 0,25 % K2HPO4 Môi trường thay 1530 Môi trường thay thế+K2HPO4 1400 1112 1200 Số tế bào x 10 CFU/ml 1600 Nghiên cứu Y học 1000 800 531 600 405 400 282.75 200 270.2 30.5 DD 1.1 AT 22 AT 14 HC 28 Chủng Bacillus Hình Sự phát triển chủng Bacillus môi trường thay (20 %) có khơng có bổ sung muối khống K2HPO4 DD1.1 : Môi trường dịch chiết đậu nành AT22 : Môi trường dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1) AT14 : Môi trường dịch chiết đậu nành-khoai tây (1:1) Chúng nhận thấy bổ sung thêm K2HPO4 AT22 phát triển tốt với mật độ 405 x 106 CFU/ml cao 13,5 lần so với môi trường không bổ sung K2HPO4 Mật độ tế bào DD1.1 mơi trường có K2HPO4 (1530 x 106 CFU/ml) cao không đáng kể so với môi trường không bổ sung K2HPO4 HC28 phát triển tốt bổ sung K2HPO4 (1112 x 106 CFU/ml) cao lần so với môi trường không bổ sung (270,2 x 106 CFU/ml) Việc bổ sung phosphat đóng vai trò đệm giúp ổn định pH mơi trường phát triển tế bào(7) Cả chủng AT22, HC28, DD1.1 phát triển tốt với 0,125 % K2HPO4 môi trường thay Ngoại trừ chủng AT14 phát triển lần so với mơi trường thay khơng bổ sung muối khống Môi trường thay chủng Bacillus thể Bảng Chuyên Đề Dược Khoa HC28 : Môi trường dịch chiết đậu nành Bảng Môi trường thay bốn chủng Bacillus Chủng Bacillus DD1.1 AT22 AT14 HC28 Môi trường thay Dịch chiết nguyên liệu K2HPO4 (0,25 %) Đậu nành (20%) + Đậu nành + Khoai tây (20%) + Đậu nành + Khoai tây (20%) – Đậu nành (20%) + KẾT LUẬN Bốn chủng Bacillus sinh carotenoid phát triển tốt môi trường thay từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền Trên môi trường thay thế, chủng Bacillus đạt sinh khối cao gấp lần trở lên so với môi trường TSB Cảm ơn: Nghiên cứu sử dụng kinh phí từ dự án Colorspore (KBBE-2007-207948) cấp cho Trần Cát Đông 193 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 TÀI LIỆU THAM KHẢO 194 Duc L H., Fraser P D., et al (2006) Carotenoids present in halotolerant Bacillus spore formers FEMS Microbiol Lett 255: 215-224 Ekwealor L A., Ebele O A (2003) Preliminary study of Llysine production by Bacillus species using various agricultural by-products Food / Nahrung 47(4): 226-227 Hidaka T (1965) The specificity of mineral requirements of marine bacteria Mem Fac Fish 14: 127-180 Hong H A., Huang J M., et al (2008) The safety of Bacillus subtilis and Bacillus indicus as food probiotics Journal of Applied Microbiology 105: 510-520 Khaneja R., Perez-Fons L., et al (2010) Carotenoids found in Bacillus Journal of Applied Microbiology 108(6): 1889-1902 Ko K S., Oh W S., et al (2006) Bacillus infantis sp nov and Bacillus idriensis sp nov., isolated from a patient with neonatal sepsis International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 56: 2541-2544 MacLeod R A (1968) On the role of inorganic ions in the physiology of marine bacteria Adv Microbiol Sea 1: 95-126 10 11 12 13 Noah K., Bruhn D., et al (2005) Surfactin Production from Potato Process Effluent by Bacillus subtilis in a Chemostat Applied biochemistry and biotechnology 122(1-3): 465-474 Noguchi H., Uchino M., et al (2004) Bacillus vietnamensis sp nov., a moderately halotolerant, aerobic, endospore-forming bacterium isolated from Vietnamese fish sauce International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 54: 2117-2120 Ruger H.J., Hentzschel G (1980) Mineral Salt Requirements of Bacillus globisporus subsp marinus Strains Arch Microbiol (126): 83-86 Sangkharak K., Prasertsan P (2008) Nutrient optimization for production of polyhydroxybutyrate from halotolerant photosynthetic bacteria cultivated under aerobic-dark condition Electronic Journal of Biotechnology 11(3): 1-12 Thompson DN F S., Bala GA (2000) Biosurfactants from potato process effluents Appl Biochem Biotechnol 84-86: 917930 Yoon J.H., Kim I.G., et al (2003) Bacillus marisflavi sp nov and Bacillus aquimaris sp nov., isolated from sea water of a tidal flat of the Yellow Sea in Korea International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 53: 1297–1303 Chuyên Đề Dược Khoa ... môi trường thay từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền Trên môi trường thay thế, chủng Bacillus đạt sinh khối cao gấp lần trở lên so với môi trường TSB Cảm ơn: Nghiên cứu sử dụng kinh phí từ dự án Colorspore... cứu Môi trường thay môi trường thay bốn chủng Bacillus Môi trường thay điều chế từ gồm: Bacillus marisflavi, Bacillus licheniformis, dịch chiết đậu nành (Đ), gạo (G), bắp (B) Bacillus infantis Bacillus. .. Mười mơi trường thí nghiệm khảo sát cho chủng Bacillus trình bày Bảng Hấp tiệt trùng môi trường 121 oC/ 15 phút Bảng Các mơi trường thí nghiệm Dịch chiết (%) 10 G B Đ 15 G B Đ 20 G B Đ Môi trường