Nghiên cứu dạng giá đa dạng di truyền các quần thể tu hài lutraria rhynchaena jonas, 1844 ở quảng ninh, hải phòng và khánh hòa

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các quần thể tu hài Lutraria rhynchaena Jonas, 1844 ở Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa” là

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-*** -ĐINH QUANG THUẤN

NGHIÊN CỨU DẠNG GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC QUẦN

THỂ TU HÀI LUTRARIA RHYNCHAENA JONAS, 1844

Ở QUẢNG NINH, HẢI PHÒNG VÀ KHÁNH HÒA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Khánh Hòa - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-*** -

ĐINH QUANG THUẤN

NGHIÊN CỨU DẠNG GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC QUẦN

THỂ TU HÀI LUTRARIA RHYNCHAENA JONAS, 1844

Ở QUẢNG NINH, HẢI PHÒNG VÀ KHÁNH HÒA

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các quần thể tu hài Lutraria rhynchaena Jonas, 1844 ở Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa” là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân, được thực hiện

dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Thái Thanh Bình

Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là trung thực và chưa được công bố dưới bất cứ hình thức nào

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Tác giả

Đinh Quang Thuấn

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Thái Thanh Bình, người đã định hướng cũng như tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Hiến đã trực tiếp giúp đỡ,

hỗ trợ tôi hoàn thành các thí nghiệm

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ, công nhân viên phòng Khoa học và Hợp tác Quốc tế, phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thủy sản – Trường Cao đẳng Thủy sản đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa sau Đại học- Trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện để tôi có được khóa học này, Trường Cao đẳng Thủy sản đã tạo điều kiện

về thời gian và ủng hộ trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị đồng nghiệp, bạn bè, gia đình

đã cổ vũ và giúp đỡ tôi suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Tác giả

Đinh Quang Thuấn

MỤC LỤC

Lời cam đoan iii

Lời cảm ơn iv

Mục lục v

Danh mục các từ viết tắt vii

Danh mục các bảng viiviii

Danh mục các hình iix

Trích yếu luận văn x

Mở đầu 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Một số đặc điểm sinh học của tu hài 3

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố tu hài 3

1.1.2 Vị trí phân loại tu hài 3

1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng 4

1.1.4 Đặc điểm sinh sản và phát triển 5

1.2 Giá trị kinh tế và tình hình nuôi tu hài ở Việt Nam 6

1.2.1 Giá trị kinh tế và thị trường 6

1.2.2 Tình hình nuôi tu hài tại Việt Nam 6

1.3 Một số nghiên cứu về tu hài ở Việt Nam 9

1.4 Đa dạng sinh học, giá trị của đa dạng sinh học, một số phương pháp đánh giá 10

1.4.1 Đa dạng di truyền 10

1.4.2 Một số phương pháp đánh giá đa dạng sinh học 10

1.5 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu một số loài thủy sản ở nước ngoài và trong nước 13

1.5.1 Những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của một số loài nhuyễn thể 13

1.5.2 Những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài thủy sản và tu hài ở trong nước 16

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài 19

2.2 Vật liệu nghiên cứu 19

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2.2 Thiết bị 19

2.2.3 Hóa chất 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Thu mẫu và bảo quản 20

2.3.2 Tách chiết ADN tổng số 22

2.3.3 Thành phần của một phản ứng PCR 24

2.3.4 Chương trình chạy PCR 24

2.3.5 Kiểm tra sản phẩm PCR 25

2.3.6 Thực hiện cắt ADN bằng enzyme giới hạn 26

2.3.7 Phương pháp định trình tự gen bằng máy giải tự động 27

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng phương pháp RFLP 29

3.1.1 Tách chiết ADN tổng số 29

3.2.1 Kết quả đa dạng di truyền bằng phương pháp RFLP 29

3.2 Kết quả đánh giá đa dạng di truyền của quần thể tu hài nuôi và tự nhiên bằng phương pháp giải trình tự 29

3.2.1 Kết quả tách chiết ADN tổng số 29

3.2.2 Kết quả khuyếch đại đoạn gen 16S mtADN ở các mẫu nghiên cứu 30

3.2.3 Kết quả giải trình tự 30

3.2.4 Hệ số biến dị di truyền 32

3.2.5 Mối quan hệ giữa các quần thể và các cá thể trong mỗi quần thể 34

3.2.6 Xây dựng cây quan hệ di truyền 47

3.2.7 So sánh đa dạng di truyền của quần thể tự nhiên với quần thể nuôi 52

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms

bp: Base pair (cặp bazơ)

Pi: Nucleotide diversity (Đa dạng Nucleotide)

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism

RAPD: RADNom Amplified Polymorphic DNA

CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

EDTA: Ethylene diamine Tetra-acetic acid

TAE: Tris-acetate- EDTA

PCR: Polymerase Chain Reaction

mtADN: Mitochondrial ADN- Hệ gen ty thể

UPGMA: Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Diện tích và sản lượng nuôi tu hài thương phẩm tại tỉnh Khánh Hòa 6

Bảng 2.1 Địa điểm, code mẫu, số lượng mẫu tu hài được giải trình tự ADN 22

Bảng 2.2 Thành phần của một phản ứng PCR 24

Bảng 2.3.Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đoạn 16S 25

Bảng 3.1 Kết quả so sánh trình tự ADN của tu hài Việt Nam với trình tự ADN của tu hài đã công bố trên Genbank 31

Bảng 3.2 Sự đa dạng di truyền của các quần thể và trong mỗi quần thể tu hài Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa 33

Bảng 3.3 Vị trí sai khác Nucleotide giữa các mẫu tu hài ở Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa 34

Bảng 3.4 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa (%) 37

Bảng 3.5 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa (%) 38

Bảng 3.6 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa (%) 39

Bảng 3.7 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa (%) 40

Bảng 3.8 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa (%) 41

Bảng 3.9 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong ba quần thể Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa (%) 42

Bảng 3.10 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong quần thể tu hài Quảng Ninh (%) 44

Bảng 3.11 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong quần thể tu hài Hải Phòng (%) 45

Bảng 3.12 Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trong quần thể tu hài Khánh Hòa (%) 46

Bảng 3.13 Khoảng cách di truyền giữa 3 quần thể tu hài (%) 47

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái cấu tạo của tu hài (Lutraria rhynchaena) 4

Hình 1.2 Tu hài giống được sản xuất tại Yên Hưng- Quảng Ninh năm 2012 5

Hình 1.3 Nuôi tu hài ở Khánh Hòa 8

Hình 1.4 Hệ thống giàn nuôi tu hài ở Vân Đồn- Quảng Ninh 9

Hình 2.1 Sơ đồ các bước phân tích mẫu bằng phương pháp RFLP 20

Hình 2.2 Sơ đồ giải trình tự ADN tu hài 20

Hình 2.3 Địa điểm thu mẫu tu hài 21

Hình 2.4 Sơ đồ trình tự các bước tách chiết ADN bằng bộ kít Qiagen 23

Hình 2.5 Chạy điện di sản phẩm PCR 26

Hình 3.1 Sản phẩm điện di 16S cắt bằng 3 enzyme hạn chế 29

Hình 3.2 Kết quả kiểm tra ADN tổng số của một số mẫu tu hài Vân Đồn 30

Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuyếch đại đoạn gen tu hài 16S mtADN 30

Hình 3.4 Hình thái tu hài Vân Đồn (2 mẫu Trái) và tu hài Cô Tô (2 mẫu phải) 32

Hình 3.5 Cây Neighbor-Joining được xây dựng từ các trình tự ADN của tu hài vùng gen 16S mtADN với giá trị Bootstrap được tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu được trình bày ở Bảng 3.1 48

Hình 3.6 Cây Minimum Evolution được xây dựng từ các trình tự ADN của tu hài vùng gen 16S với giá trị Bootstrap được tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu được trình bày ở Bảng 3.1 49

Hình 3.7 Cây Maximum Parsimony được xây dựng từ các trình tự ADN của tu hài vùng gen 16S với giá trị Bootstrap được tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu được trình bày ở Bảng 3.1 50

Hình 3.8 Cây Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean (UPGMA) được xây dựng từ các trình tự ADN của tu hài vùng gen 16S với giá trị Bootstrap được tính trên 1.000 lần lặp, code mẫu được trình bày ở Bảng 3.1 51

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Chủ đề nghiên cứu:

Tu hài là loài nhuyễn thể có giá trị kinh tế cao và được nuôi phổ biến ở các tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa Để nghề nuôi tu hài phát triển bền vững thì

việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền các quần thể tu hài Lutraria rhynchaena Jonas, 1844 ở Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa” là rất

cần thiết Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những cơ sở dữ liệu khoa học về di truyền cho định hướng chọn giống và bảo tồn các quần thể tu hài ở Việt Nam

Mục tiêu của để tài:

Đánh giá được đa dạng di truyền của tu hài phục vụ cho công tác bảo tồn, phát triển nguồn gen và lựa chọn vật liệu ban đầu phục vụ cho chọn giống

Phương pháp nghiên cứu đã sử dụng:

Cách thu mẫu: Tu hài phân bố tự nhiên và tu hài nuôi được thu mẫu ở các tỉnh

Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa Tổng số mẫu thu và phân tích 58 mẫu

Cách bảo quản mẫu: Mẫu tu hài là một phân cơ của vòi tu hài (10-15g/mẫu)

Mẫu được bảo quản trong ống eppendoft (2 ml) có chứa cồn nồng độ 90%

Tách chiết ADN và giải trình tự ADN: ADN tổng số được tách chiết từ cơ vòi

của tu hài bằng bộ kít Qiagen Phương pháp tách chiết theo hướng dẫn của nhà sản xuất Đoạn gen 16S mtADN được khuếch đại bằng cặp mồi có trình tự như sau: 16Sar: (5’-3’) GGG CTA GTA TGAATG GTT TGA và 16Sbr: (5’-3’) ATG CTG TTA TCC CTATGG TAACT Mỗi phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 25μl (12,5 μl Toptaq Master Mix 2x; 5μl Coral load; 4,5μl nước tinh kiết; 1μl 16sar; 1μl 16sbr; 1μl ADN khuôn) Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR nhân bản vùng gen 16S: 94oC trong 3 phút, tiếp theo 30 chu kỳ (94oC trong 30 giây, nhiệt độ gắn mồi 56oC trong 30 giây và

72oC trong 1 phút), kéo dài đoạn 72oC trong 5 phút Sản phẩm PCR được bảo quản và kiểm tra bằng phương pháp chạy điện di trên bản gel agarose 2%/TAE1X Tiếp theo, trình tự ADN được giải trên máy ABI/3130XL, mỗi mẫu được giải trình tự bằng 2 mồi

xuôi ngược

Kết quả nghiên cứu:

Kết quả tách chiết ADN và khuếch đại vùng gen 16S mtADN

Kết quả đã tách chiết 58 mẫu ADN tổng số của các mẫu tu hài thu tại 3 tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa gồm tu hài tự nhiên và nuôi Mẫu ADN tổng số

được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% Kết quả điện di cho thấy các băng ADN thu được của các mẫu tu hài khá gọn và đồng đều chứng tỏ chất lượng ADN của các mẫu tốt

Kết quả kiểm tra các sản phẩm PCR cho thấy kích thước  500bp gọn, rõ nét,

đủ tiêu chuẩn để thực hiện các nghiên cứu tiếp

Kết quả so sánh trình tự ADN của các mẫu tu hài Việt Nam với các trình tự ADN của tu hài ở Genbank cho thấy trình tự ADN của các mẫu tu hài Việt Nam có sự

tương đồng cao với trình tự ADN của 3 loài tu hài (Lutraria arcuata, Lutraria australis và Lutraria rhynchaena) đã công bố trên Genbank

Hệ số biến dị di truyền

Quần thể tu hài Quảng Ninh có hệ số biến dị di truyền cao nhất (hd=0,671±0,061; Π=0,0267±0,00828), không có sự sai khác của các cá thể tu hài ở Hải Phòng và Khánh Hòa (hd=0; Π=0) Trong 58 mẫu tu hài của 3 quần thể với 4 haplotype có hệ số biến dị di truyền (hd =0,399±0,071; Π=0,0115±0,00445) So với các nghiên cứu về nhuyễn thể thì tu hài Việt Nam có đa dạng di truyền thấp

Mối quan hệ giữa các quần thể và các cá thể trong mỗi quần thể

Kết quả so sánh trình tự nucleotide xác định được ở 3 quần thể tu hài nghiên cứu cho thấy 36 vị trí trên vùng gen 16S mtADN có sự sai khác Sự sai khác tập trung chủ yếu ở tu hài tự nhiên thu mẫu tại Cô Tô

Khoảng cách di truyền cho thấy hệ số sai khác giữa tu hài của 3 tỉnh dao động trong khoảng từ 0-4,3%; Khoảng cách di truyền giữa một số mẫu tu hài ở Cô Tô so với các mẫu tu hài khác lần lượt CTT14, CTT21, CTT8 dao động từ 2,5-2,7% và lớn nhất

là mẫu tu hài CTT2 dao động từ 4,1-4,3% Khoảng cách di truyền thấp nhất ở các mẫu

tu hài của quần thể Khánh Hòa có d=0 Đồng thời qua bảng cho thấy tu hài ở Cô Tô có khoảng các di truyền cao hơn nhiều so với tu hài ở các mẫu khác với khoảng cách di truyền dao động từ 2,5-4,3%

Trong 3 quần thể nghiên cứu, quần thể tu hài Hải Phòng có mối quan hệ di truyền gần gũi nhất với quần thể tu hài Khánh Hòa, khoảng cách di truyền của các mẫu

tu hài Hải Phòng với các mẫu tu hài Khánh Hòa là 0, có nghĩa là sự tương đồng về trình tự nucleotide giữa các mẫu tu hài ở Hải Phòng so với Khánh Hòa là 100%

Giữa 3 quần thể, sự sai khác về trình tự nucleotide giữa tu hài Quảng Ninh so với tu hài ở Hải Phòng và Khánh Hòa là cao nhất, giá trị hệ số khoảng cách di truyền của quần thể tu hài Quảng Ninh so với quần thể tu hài Hải Phòng và Khánh Hòa là 2%

Qua phân tích cây phả hệ cho thấy tu hài Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa

có thể giải thích quá trình di giống tu hài từ Bắc vào Khánh Hòa

Kết luận và đề nghị:

Kết quả nghiên cứu ban đầu về giải trình tự ADN tu hài ở vùng gen 16S

mtADN cho thấy Việt Nam có 2 loài tu hài và có tên khoa học là Lutraria rhynchaena

và Lutraria arcuata Đa dạng di truyền tu hài Việt Nam ở mức trung bình 0,399±0,071

Cần tiến hành những nghiên cứu sâu hơn trên nhiều cá thể tu hài thuộc quần thể Việt Nam và phát triển chỉ thị đánh giá đa dạng di truyền trong nhân tế bào tu hài như IST, H3, Microsatellite, SNP

Từ khóa: Đa dạng di truyền, Lutraria sp, tu hài,16S mtADN

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài

Tu hài (Lutraria sp) là loài nhuyễn thể thuộc lớp 2 mảnh vỏ (Bivalvia) Thịt tu

hài có hàm lượng dinh dưỡng cao: protein chiếm 11,63%, gluicid chiếm 0,42%, khoáng chiếm 1,22% và có tới 8 loại axit amin không thay thế [19] Tu hài là đối tượng hải sản có giá trị kinh tế cao [19] Ở Việt Nam, tu hài phân bố tự nhiên chủ yếu

ở vùng biển tỉnh Hải Phòng, Quảng Ninh và được di giống vào miền trung cách đây hơn 10 năm Tu hài lọc nước để lấy thức ăn, sử dụng vi tảo biển tự nhiên làm thức ăn, hạn chế sự ô nhiễm môi trường, đây là cơ sở để nghề nuôi tu hài phát triển bền vững Vùng biển Hải Phòng - Quảng Ninh là cái nôi của nuôi trồng và phát triển hải sản có giá trị kinh tế cao như cá biển (cá song, cá giò, cá Hồng Mỹ v.v…) và nhuyễn thể (Trai ngọc, Hầu, Ngao, Điệp, tu hài v.v ) Với ưu thế thuận lợi về điều kiện tự nhiên và có nhiều di sản thiên nhiên được thế giới công nhận (Vịnh Hạ Long, Khu dự trữ sinh quyển Cát Bà), trong những năm tới việc phát triển nghề nuôi tu hài trên quy mô lớn

sẽ phù hợp với xu thế phát triển kinh tế biển và đảm bảo an ninh quốc gia của khu vực này

Tu hài là đối tượng nuôi thủy sản có giá trị kinh tế cao cho sản lượng lớn do đó mục tiêu qui hoạch nuôi nhuyễn thể đến năm 2020 (số: 1628/QĐ-BNN-TCTS) của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, sẽ phát triển diện tích nuôi tu hài lên tới 1360 ha với sản lượng trung bình 3.950 tấn/năm

Ở Việt Nam, các nghiên cứu về tu hài còn rất hạn chế Các nhà khoa học chủ yếu tập trung nghiên cứu đánh giá sản lượng, kỹ thuật sản xuất giống và nuôi thương phẩm Báo cáo kết quả điều tra động vật vùng triều của Tổng cục thuỷ sản các năm 1966-1967, hai tác giả Trần Hữu Doanh và Nguyễn Như Tùng đã thống kê 133 loài

động vật thân mềm, trong đó có tên loài tu hài Lutraria rhynchaena Jonas, 1844 [3]

Năm 1979 Nguyễn Xuân Dục, Nguyễn Mạnh Hùng đã có công trình về kết quả điều tra trữ lượng, dẫn liệu sinh thái tự nhiên của tu hài ở vùng biển Cát Bà [4] Năm 1978, trên cơ sở các mẫu vật thu được ở vùng biển Cát Bà, Mai Văn Minh (Sinh học, Đại học Tổng hợp Hà Nội) đã tiến hành nghiên cứu thành phần sinh hoá của thịt tu hài [7]

Mặc dù tu hài đã được nuôi ở Việt Nam từ lâu nhưng những hiểu biết về đa dạng di truyền các quần thể của loài này còn rất hạn chế

Để nghề nuôi tu hài phát triển bền vững thì việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu

đánh giá đa dạng di truyền các quần thể tu hài Lutraria rhynchaena Jonas, 1844 ở

Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa” là rất cần thiết Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những cơ sở dữ liệu khoa học về di truyền cho định hướng chọn giống và bảo tồn các quần thể tu hài ở Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá được đa dạng di truyền của tu hài phục vụ cho công tác bảo tồn, phát triển nguồn gen và lựa chọn vật liệu ban đầu phục vụ cho chọn giống

Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá mức độ đa dạng di truyền trong các quần thể tu hài;

- Xác định các haplotype trong các quần thể tu hài

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

- Là nghiên cứu mới về đa dạng di truyền quần thể, thiết lập được các bộ chỉ thị phân tử đầu tiên cho tu hài ở Việt Nam

- Là cơ sở dữ liệu khoa học quan trọng, góp phần trong định hướng lựa chọn nguồn vật liệu ban đầu phục vụ cho bảo tồn và chọn giống tu hài nhằm phát triển nghề nuôi tu hài theo hướng bền vững

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: các quần đàn tu hài nuôi và quần thể tu hài tự nhiên ở Quảng Ninh, Hải phòng và Khánh Hòa

- Đề tài nghiên cứu thuộc phạm vi nghiên cứu bảo tồn, khai thác và sử dụng tài nguyên di truyền động vật

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một số đặc điểm sinh học của tu hài

1.1.1 Nguồn gốc và sự phân bố tu hài

Trên thế giới, tu hài sống chủ yếu ở vùng bờ biển nước Mỹ, Canada, Tây và Nam Australia Theo thông tin từ khoa sinh thái học trường Puget Sound (Mỹ) cho biết loài tu hài (Geoduck) sống tới 40 năm và nặng tới 9kg Khối lượng trung bình là 7,15 Pound tương đương 3,2kg và vùng Puget Sound là một vùng có trên 109 triệu con tu hài, với mật độ cao nhất ở Hoa Kỳ Cũng theo nguồn thông tin này ở Mỹ người ta gọi loài này là “King Clam” và được coi là đặc sản châu Á Thị trường lớn nhất của tu hài

là Đài Loan, Nhật, Trung Quốc và Hồng Kông [26]

Ở Việt Nam tu hài chỉ phân bố ở khu vực phía Bắc thuộc vùng biển từ đảo Cát

Bà -Hải Phòng đến Vịnh Hạ Long - Quảng Ninh, ở vùng trung triều và hạ triều đến độ sâu 30m [4] Tu hài phân bố chủ yếu ở Vạn Bội, vịnh Lan Hạ, Cát Dứa, Lão Vọng, Cống Kê, Cáp Quan, Vạn Dong, Soi Gianh, Đầu Bê, Cửa Vạn và Lạch Miều Hai khu vực tập trung chủ yếu là từ Đông đảo Cát Bà đến Hòn Đá Mài và từ Đảo Cống Tây đến Cây Khế Đông Riêng khu vực Cát Bà diện tích phân bố tự nhiên khoảng 100 ha, trữ lượng 60- 100 tấn/năm [4, 5] Tu hài phân bố ở những vùng biển tương đối xa bờ, nước có độ mặn cao từ 25 - 30‰, trong sạch Những nơi không có tu hài phân bố gồm: Bãi cát sâu trên 10m hoặc các vùng bãi bùn cửa sông châu thổ và những nơi có độ mặn thấp hơn 25‰ trong mùa mưa Không thấy có tu hài ở vùng Trung bộ, Nam bộ Có thể đây là loài thích hợp với nhiệt độ thấp vì vậy không thấy có ở những vùng biển quanh năm nóng ẩm Khoảng 10 năm trở lại đây tu hài được di giống vào tỉnh Khánh Hòa và Phú Yên do điều kiện môi trường phù hợp với sản xuất giống sớm phục vụ chủ yếu cho các tỉnh phía Bắc

1.1.2 Vị trí phân loại tu hài

Loài: Lutraria rhynchaena Jonas, 1844

Tên tiếng Việt: Tu hài Tên tiếng Anh: Geo-Duck, Snout Otter Clam, Otter Clam

Hình 1.1 Hình thái cấu tạo của tu hài (Lutraria rhynchaena) (Ảnh: Thuấn) 1.1.3 Đặc điểm sinh trưởng

Trong quá trình phát triển của tu hài cũng như các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ khác, hầu hết phải trải qua hai giai đoạn, giai đoạn ấu trùng và giai đoạn trưởng thành Tập tính sống của chúng cũng thay đổi theo mỗi giai đoạn:

+ Giai đoạn ấu trùng (từ Morula- Umbo): ấu trùng bơi lội tự do, giai đoạn này

là giai đoạn sống phù du, cuối giai đoạn ấu trùng umbo (đỉnh vỏ) và bắt đầu giai đoạn Spat (ấu trùng chân bò) chúng chuyển xuống sống đáy, chân chúng bắt đầu phát triển

để đào bới làm nơi định cư

+ Giai đoạn trưởng thành: dùng chân đào bới vùi mình sâu trong nền đáy, thò ống xi phông (xúc tu) lên trên Thông thường ống xi phông vươn dài 5 - 7 cm và liên tục hút nước để lọc thức ăn, khi gặp điều kiện bất lợi hoặc bị va chạm bởi vật lạ chúng thu ống xi phong lại rất nhanh Nếu sống trong điều kiện thuận lợi chỉ 7- 10 tháng tuổi

tu hài bắt đầu thành thục và sinh sản

 Tu hài giống cỡ 1,5 cm; khối lượng trung bình 2,16g

 Sau 3 tháng nuôi đạt kích thước 2,42 cm; khối lượng trung bình 4,20g

 Sau 6 tháng nuôi đạt kích thước 3,82cm; khối lượng trung bình 26,60g

 Sau 12 tháng nuôi đạt kích thước 5,58 cm; khối lượng trung bình 34,00g

 Sau 18 tháng nuôi đạt kích thước 7,13 cm; khối lượng trung bình 60,00g [5]

1.1.4 Đặc điểm sinh sản và phát triển

Tu hài là loài động vật thân mềm (ĐVTM) hai mảnh vỏ, phân biệt đực, cái riêng biệt, chúng đẻ trứng, phóng tinh vào môi trường nước, trứng được thụ tinh tạo thành hợp tử, phát triển thành phôi và nở thành ấu trùng Trải qua vài lần biến thái ấu trùng phát triển thành con non

Tu hài có thể thành thục ở trên một tuổi (1+) Mùa vụ sinh sản của tu hài chịu ảnh hưởng rất lớn bởi các điều kiện môi trường đặc biệt là nhiệt độ và độ mặn Các điều kiện môi trường không chỉ có vai trò trong việc kích thích thành thục sinh dục, sinh sản, đẻ trứng mà còn đảm bảo cho sự tồn tại và phát triển của trứng, phôi và ấu trùng Hầu hết các tháng trong năm đều có tu hài thành thục nhưng tỷ lệ thành thục cao nhất tập trung vào thời gian từ tháng 12 năm trước đến tháng 2 năm sau Mùa vụ sinh sản vào tháng 2-4 [19]

Tu hài có hiện tượng tự điều chỉnh tỉ lệ đực, cái Vào thời kì sinh sản rộ, tỷ lệ đực: cái thường là 1:1 Tuyến sinh dục đực có màu trắng sữa, tuyến sinh dục cái có màu phớt hồng Trứng chín có hình cầu đường kính 60-65μm, tinh trùng hình búp sen, đuôi dài Trứng và tinh trùng được phóng vào môi trường nước và thụ tinh trong nước Tinh trùng vận động mạnh trong nước biển tới 3-4h (ở độ mặn 30‰); nhiệt độ 22-24oC; độ pH = 8, sau đó yếu dần và chết sau 12h

Sức sinh sản của từng cá thể phụ thuộc cỡ cá thể, trung bình mỗi cá thể mang 3 triệu trứng Cỡ cá thể có khối lượng 35,7g có sức sinh sản 1,28 x 106 trứng, cỡ 75,7g

có sức sinh sản 3,14 x 106 trứng; cỡ 130g có sức sinh sản 5,72 x 106 trứng [5]

Hình 1.2 Tu hài giống được sản xuất tại Yên Hưng- Quảng Ninh năm 2012

1.2 Giá trị kinh tế và tình hình nuôi tu hài ở Việt Nam

1.2.1 Giá trị kinh tế và thị trường

Tu hài là loại động vật có giá trị kinh tế cao hơn các loài động vật hai mảnh vỏ khác và hơn nhiều loài cá phân bố ở Việt Nam Thịt tu hài có hương vị thơm ngon, ngọt

Thịt tu hài khá giàu chất dinh dưỡng, trong thịt có chứa 11,63% đạm, 0,42% đường, 1,22% muối khoáng và đặc biệt là 18 loại axit amin, trong đó có một số là những axit amin không thay thế, nên được thị trường ưa chuộng [19]

Tu hài là đối tượng thủy sản có tiềm năng, từ những năm 2013 trở về trước giá

tu hài thương phẩm dao động trong khoảng 150-220 nghìn đồng/kg Từ sau năm 2013

do tình hình dịch bệnh xảy ra trên tu hài, làm nghề nuôi tu hài giảm cả về quy mô lẫn sản lượng [10, 11] Do vậy giá tu hài thương phẩm tăng cao Năm 2015 giá bán tu hài thương phẩm dao động trong khoảng 450-550 nghìn đồng/kg Nhu cầu sản phẩm tu hài rất lớn như tiêu thụ trong nước ở các thành phố lớn như Hà Nội, TP Hồ Chí Minh, … Ngoài ra, tu hài còn được xuất khẩu tới Đài Loan, Nhật, Trung Quốc, Hồng Kông [26]

1.2.2 Tình hình nuôi tu hài tại Việt Nam

Nguồn lợi tu hài vùng biển Hải Phòng phong phú hơn vùng biển Quảng Ninh

Tu hài phân bố đến độ sâu 10m Nơi có mật độ tập trung cao là vùng biển đông Cát

Bà, Bắc và Đông Bắc Cống Tây - Quảng Ninh Trong vòng 27 năm, mật độ sản lượng giảm từ 1,07 tấn/ha (1979) xuống chỉ còn 0,01 tấn/ha (2005) Tính cho toàn bộ vùng biển Hải Phòng- Quảng Ninh những vùng có tu hài phân bố với diện tích là 64.260,6

ha thì trữ lượng ước tính khoảng 511,9 tấn và khả năng khai thác trên dưới 100 tấn (20%) [11]

Tu hài được di giống vào miền trung và thả nuôi ở một số tiểu vùng Khánh Hòa như: Cam Nghĩa, Cam Phúc Bắc (Tp.Cam Ranh); Vạn Thạnh (huyện Vạn Ninh) [10]

Diện tích và sản lượng nuôi tu hài thương phẩm tại Khánh Hòa từ 2010 – 2014 thể hiện ở Bảng 1.1 [10]

Bảng 1.1 Diện tích và sản lượng nuôi tu hài thương phẩm tại tỉnh Khánh Hòa

Những năm gần đây phong trào nuôi hu hài phát triển mạnh, các địa phương có sản lượng lớn là Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa Theo báo cáo của Chi cục nuôi trồng thủy sản Quảng Ninh, sản lượng tu hài năm 2011 đạt khoảng 1.200 tấn giá trị trên 110 tỷ đồng Tuy nhiên chất lượng con giống ngày càng giảm sút, tình hình dịch bệnh gia tăng, chỉ tính 6 tháng đầu năm 2012, Quảng Ninh và Hải Phòng thiệt hại hơn

200 tỷ đồng do tu hài chết và hiện nay dịch bệnh vẫn xẩy ra (Tổng cục thủy sản, 2014) Đề tài nghiên cứu “Xác định nguyên nhân gây chết hàng loạt ở tu hài nuôi tại Việt Nam” của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I thực hiện từ tháng 1 năm 2012 đến nay vẫn chưa xác định rõ nguyên nhân gây bệnh trên tu hài Nên các đơn vị quản

lý nhà nước như Chi cục thủy sản, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn khuyến cáo người dân tạm dừng thả nuôi tu hài để nhằm hạn chế dịch bênh và rủ ro [11]

Trong vài năm gần đây, nuôi tu hài phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh ven biển như Quảng Ninh, Hải Phòng, Phú Yên và Khánh Hoà Nghề nuôi này đem lại nguồn lợi nhuận lớn cho nguời dân địa phương vì giá thị trường tu hài rất cao, chi phí đầu tư nuôi không lớn và kỹ thuật nuôi đã được phổ biến Nuôi tu hài phát triển còn có ý nghĩa về mặt môi trường rất lớn vì tu hài ăn lọc thực vật phù du nên giúp môi trường nuôi ngày càng sạch hơn Tuy nhiên, sự thiếu hụt về con giống là rất lớn

Từ năm 2012 đến nay, do môi trường nuôi ngày càng ô nhiễm, thời tiết diễn biến thất thường nên tu hài mới thả nuôi được vài tháng đã chết hàng loạt, gây thiệt hại nặng cho người nuôi Dấu hiệu bệnh chủ yếu vẫn là sưng vòi, teo cơ,… Năm 2013, các

hộ đã bỏ nghề nuôi tu hài, một số ít hộ duy trì nuôi với quy mô nhỏ, nuôi xen với các đối tượng nuôi khác [10]

Tốc độ phát triển nuôi tu hài ở Quảng Ninh tăng quá nhanh nên nhu cầu con giống hết sức khó khăn Nếu từ đầu năm 2003 mới chỉ có 10 hộ nuôi thì đến năm 2013

đã có trên 20 doanh nghiệp và gần 700 hộ nuôi trồng tu hài với diện tích trên 1.000ha Điều này đồng nghĩa với việc phải đáp ứng khoảng 100 triệu con giống mỗi năm Trong khi đó sản xuất con giống tại địa bàn tỉnh chỉ đáp ứng được 5 - 10% lượng con giống Số còn lại phải nhập từ các tỉnh miền Trung và miền Nam, nhưng cũng chỉ đủ khoảng 70%, nên phải nhập con giống tu hài từ Trung Quốc qua đường tiểu ngạch [11]

Một số cơ sở sản xuất giống tu hài trên địa bàn sử dụng bố mẹ là tu hài thương phẩm tại vùng, chưa đủ tiêu chuẩn (tuổi, khối lượng, thời gian…) dẫn đến chất lượng con giống không đảm bảo,khó thích nghi với môi trường biến đổi và bệnh [11]

Chất lượng con giống mua từ các tỉnh miền Trung, miền Nam và chính nguồn giống được nhập về từ Trung Quốc không kiểm tra chất lượng, kiểm dịch được khiến dịch bệnh phát triển phức tạp [11]

Môi trường nuôi ngày càng ô nhiễm do phát triển quá nhanh nuôi nghề nuôi tu hài, sự xả thải rác sinh hoạt và sản xuất làm cho môi trường vùng nuôi đang bị nghèo muối dinh dưỡng, động vật phù du tự nhiên, nhiều khí độc và vi sinh vật có hại cho tu hài

Người dân chưa ý thức bảo vệ môi trường, nuôi tự phát chưa theo quy hoạch vùng nuôi và kỹ thuật nuôi của cơ quan chuyên môn

Theo thống kê của Viện Kinh tế và Quy hoạch thủy sản, nguồn lợi tu hài ở ngoài tự nhiên ngày càng giảm sút, sản lượng tu hài khai thác tự nhiên dưới 3000 tấn Những năm gần đây phong trào nuôi hu hài phát triển mạnh, các địa phương có sản lượng lớn là Quảng Ninh, Hải Phòng, Khánh Hòa Theo báo cáo của Chi cục nuôi trồng thủy sản Quảng Ninh, sản lượng tu hài năm 2011 đạt khoảng 1.200 tấn giá trị trên 110 tỷ đồng Tuy nhiên chất lượng con giống ngày càng giảm sút, tình hình dịch bệnh gia tăng, chỉ tính 6 tháng đầu năm 2012, Quảng Ninh và Hải Phòng thiệt hại hơn

100 tỷ đồng do tu hài chết [11]

Hình 1.3 Nuôi tu hài ở Khánh Hòa (Nguồn: Chi cục thủy sản Khánh Hòa)

Hình 1.4 Hệ thống giàn nuôi tu hài ở Vân Đồn- Quảng Ninh (Nguồn: Chi cục thủy

sản Quảng Ninh)

1.3 Một số nghiên cứu về tu hài ở Việt Nam

Ở nước ta đối tượng này còn ít được nghiên cứu Trong báo cáo kết quả điều tra động vật vùng triều của Tổng cục thuỷ sản các năm 1966-1967, hai tác giả Trần Hữu Doanh và Nguyễn Như Tùng đã thống kê 133 loài động vật thân mềm, trong đó có tên

loài tu hài Lutraria rhynchaena Jonas

Trong các năm 1977-1979, Nguyễn Xuân Dục đã tiến hành nghiên cứu khá chi tiết về tình hình phân bố, đánh giá trữ lượng cùng các đặc điểm sinh học và sinh thái loài tu hài ở vùng biển Cát Bà: sinh trưởng sinh sản, và quan hệ với các điều kiện môi trường sống như nhiệt độ và độ mặn nước biển, sinh vật phù du và chất đáy [4]

Cũng trong năm 1978, trên cơ sở các mẫu vật thu được ở vùng biển Cát Bà, Mai Văn Minh (Khoa Sinh học, Đại học Tổng hợp Hà Nội) đã tiến hành nghiên cứu thành phần sinh hoá của thịt tu hài [7]

Sau thời gian dài gián đoạn (trên 10 năm) cho tới năm 2001, đối tượng này lại được tiếp tục nghiên cứu Lê Xân và ctv thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản

I, bước đầu đã nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm sinh học, sinh sản và sản xuất giống nhân tạo tu hài ở vùng biển Cát Bà [22] Tiếp đó Hà Đức Thắng, Nguyễn Xuân Dục và cộng

sự cũng tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và sản xuất giống nhân tạo, nuôi đối tượng này ở vùng biển Cát Bà và Quảng Ninh bước đầu có kết quả Hợp phần Hỗ trợ Nuôi trồng Thuỷ sản biển và nước lợ (SUMA) của Bộ Thuỷ sản cũng tiến hành nuôi thử nghiệm tu hài ở vùng biển Quảng Ninh [13]

Năm 2004, với sự giúp đỡ của SUMA, Vũ Văn Toàn và Đặng Khánh Hùng đã xuất bản tài liệu “Kỹ thuật ương giống và nuôi tu hài thương phẩm” Trong tài liệu đã giới thiệu đặc điểm sinh học của tu hài, kỹ thuật ương giống và nuôi tu hài thương phẩm Phần phụ lục có viết sơ bộ tính hiệu quả kinh tế và những khuyến cáo [18]

Năm 2005 trong tuyển tập Quy trình công nghệ sản xuất giống thuỷ sản – Hà Đức Thắng đã công bố quy trình công nghệ sản xuất giống tu hài Trong quy trình tác giả có nêu một số đặc tính sinh học của tu hài (hình dạng cấu tạo, vị trí phân loại, đặc tính sinh thái) Sự phát triển của tu hài (quá trình biến thái, kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo) [13]

Tuy nhiên phương thức và kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo cũng như nuôi; đặc biệt là tổ chức thăm dò khảo sát trên biển còn nhiều vấn đề tồn tại, cần được tiếp tục nghiên cứu

Mặt khác do nhu cầu thị trường ngày một tăng, kỹ thuật khai thác đang được hoàn thiện một cách nhanh chóng, cường độ khai thác cao đã làm môi trường và nguồn lợi ngày càng suy thoái; vấn đề bảo tồn và phát triển bền vững trở nên bức xúc Các ý tưởng nghiên cứu về động vật quý hiếm nói chung và nguồn lợi tu hài nói riêng liên tục được đề xuất và triển khai trong những năm gần đây

1.4 Đa dạng sinh học, giá trị của đa dạng sinh học, một số phương pháp đánh giá

1.4.1 Đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là tất cả các gen di truyền khác nhau của tất cả các cá thể thực vật, động vật, nấm, và vi sinh vật Đa dạng di truyền tồn tại trong một loài và giữa các loài khác nhau

Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể

Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã Xét cho cùng, đa dạng di truyền chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần của axit nucleic, tạo thành mã di truyền [47]

1.4.2 Một số phương pháp đánh giá đa dạng sinh học

Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể (Mitochondrial DNA-mtDNA) chiếm tỉ lệ từ 1 - 5% ADN của tế bào Người ta đã đưa

ra nhiều giả thuyết về nguồn gốc tiến hóa của hệ gen ty thể Giả thuyết được chấp nhận rộng rãi nhất là hệ gen ty thể là dấu vết còn lại của hệ gen vi khuẩn cổ, sống cộng sinh bên trong tế bào sinh vật nhân chuẩn Mỗi ty thể có từ 2 đến 10 bản sao của ADN và bởi vì mỗi tế bào chứa từ hàng trăm đến hàng triệu ty thể nên số lượng ADN ty thể là rất lớn ADN ty thể có các ưu điểm hơn ADN trong nhân như sau:

- Tốc độ đột biến lớn gấp 5 - 10 lần so với hệ gen nhân [27]

- Số lượng bản sao lớn

- Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp [31]

- Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài [31]

Phân tử mtADN có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 - 10 lần so với các gen nhân do

cơ chế sửa chữa tái bản ADN không hiệu quả do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong một loài Bên cạnh đó, các biến dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau mtADN có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtADN thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng mẹ Thêm vào đó mtADN tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào Các đặc điểm trên cùng với việc mtADN bền vững hơn ADN nhân trong khi tách chiết do

có cấu trúc dạng vòng [36], nên sử dụng mtADN như là một công cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có nhiều thuận lợi [27]

1.4.2.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms):

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn

ADN dựa trên điểm cắt các enzyme giới hạn (Restriction Enzyme, RE) Khi ủ ADN với enzyme giới hạn ở dung dịch đệm thích hợp ở pH, nhiệt độ thích hợp sẽ sẽ tạo ra những phân đoạn ADN với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ gen Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến từ thập niên 80 đến nay

Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn (Restriction Enzyme-RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên ADN bộ gen Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau

Ưu và nhược điểm của RFLP

+ Ưu điểm:

- Giá thành thấp nên có thể làm nhiều mẫu, có khả năng lặp lại cao

- Xác định được di truyền đồng trội

- Marker có tính đặc hiệu locus (nên trình tự bảo thủ của các gen của các sinh vật có quan hệ gần gũi có thể xác định được)

- Không yêu cầu thông tin chuỗi

- Dễ ghi điểm do kích thước các băng thường khác nhau đáng kể

+ Nhược điểm:

- Yêu cầu số lượng và chất lượng ADN cao

- Việc xây dựng bộ dò khá phức tạp

- Không thể tự động hóa được

- Mức độ đa hình thấp, chỉ một số ít locus được nghiên cứu trong một lần thử

- Tốn thời gian

1.4.2.2 Phương pháp giải trình tự axit nucleic (Sequencing)

 Phương pháp hóa học của Maxam-Gilbert

Vào năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học Nguyên tắc của phương pháp là dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các ADN không tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau [8, 9]

 Phương pháp enzyme sử dụng các dideoxynucleotide

Phương pháp này được F Sanger và cộng sự phát minh vào năm 1977 Nguyên tắc của phương pháp dideoxy là dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ hoạt động của enzyme ADN-polymerase Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide (ddNTP) với các deoxynucleotide (dNTP) thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn ADN có kích thước khác nhau [8, 9]

 Phương pháp xác định trình tự nucleotide bằng máy tự động

Trong kĩ thuật này, người ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất (các fluochrome) Mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một fluochrome

có màu khác nhau Như vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu Sau khi điện di trên gel polyacriamid (mao quản), kết quả

sẽ được xử lí qua một hệ thống vi tính [8, 9]

Ưu, nhược điểm của phương pháp giải trình tự

+ Ưu điểm:

- Xác định được cả đoạn gen dài dễ dàng, thuận lợi hơn phương pháp RFLP

- Độ chính xác cao

- So sánh được đoạn ADN bất kỳ với dữ liệu trong ngân hàng gen (số hóa)

- Biết được trình tự sắp xếp của các nucleotide

- Xác định đột biến, sự sai khác trong trình tự sắp xếp các nucleotide

et al (2001) so với việc sử dụng các RAPDs và AFLPs trong cá hồi vân và kết luận rằng AFLP là phương pháp được lựa chọn để phân tích đa dạng di truyền Bagley et al (2001) cũng tăng khả năng tái sinh của các chỉ thị AFLP tới gần 100% bằng cách loại trừ 10% trong những đoạn lớn nhất và nhỏ nhất, cũng như đoạn gồm ít hơn 1% của tổng cường độ trong phân tích AFLP [25] Chỉ thị phân tử microsatellite đã được lựa chọn để nghiên cứu sự đa dạng di truyền quần ở hầu hết các loài trong nuôi trồng thủy sản (Xu, 2001) [45]

1.5.1 Những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của một số loài nhuyễn thể

Nghiên cứu về động vật thân mềm đang đi theo chiều hướng chuyên sâu kể cả

về lý thuyết cơ bản và nghiên cứu ứng dụng Việc đi sâu nghiên cứu các cơ quan và tổ chức cấu tạo cơ thể từng nhóm loài bằng các kỹ thuật hiện đại đang được thực hiện phổ biến ở các nước phát triển Bằng các đặc trưng cơ bản các nhà khoa học đang chuẩn hoá việc phân loại bằng việc xây dựng các phần mềm để sử dụng trong phân loại Công việc này đòi hỏi rất nhiều kỹ năng, trong đó việc kết hợp giữa kiến thức phân loại truyền thống và kỹ thuật sử dụng máy tính, lập trình v.v… được xem là không thể thiếu Việc sử dụng kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu cấu trúc quần thể

được xem là phù hợp nhất cho cả nghiên cứu lý thuyết (cơ sở tiến hoá) và thực hành (quản lý và bảo vệ nguồn lợi tự nhiên) Từ thập niên 80 các tác giả Crawford, 1984; Daly, 1981; Richardson, 1983 đã sử dụng phương pháp này để xác định quần thể phụ (subpopulation) hoặc quần thể có liên quan (neighbour hood) với quần thể chính để đánh giá trữ lượng quần thể hoặc nghiên cứu tạo quần thể Nghiên cứu quần thể sẽ giúp cho việc nghiên cứu về sinh học và quản lý nguồn lợi một cách có hiệu quả hơn

So với phương pháp nghiên cứu quần thể truyền thống (đánh dấu cá thể, thả ra tự nhiên và đánh bắt lại), phương pháp này có thể nghiên cứu được ở cả những quần thể

có số lượng cá thể rất nhỏ (động vật quý hiếm) hoặc quần thể có mật độ cao (khả năng bắt lại các cá thể đánh dấu thấp), chi phí nghiên cứu thấp, thời gian nghiên cứu ngắn,

độ chính xác cao hơn

Hầu Thái Bình Dương (Crassostrea giga) là đối tượng được nhiều nhà khoa

học được quan tâm phát triển các chỉ thị phân tử và đánh giá đa dạng di truyền Hubert

và ctv (2004) đã xây dựng bản đồ liên kết phân tử đầu tiên ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ, trong số 115 chỉ thị microsatellite kiểm tra, có 102 chỉ thị đa hình được sử dụng cho phân tích bản đồ liên kết ở hầu Thái Bình Dương [31] Li và ctv (2003), đã phát triển được 79 microsatellite cho hầu Thái Bình Dương (TBD) [33] Wang và ctv (2008),

Yu và ctv (2008) phát triển các chỉ thị EST-SSR [46] Sauvage và ctv (2009) phát triển

18 chỉ thị microsatellite cho hầu TBD [40], Li và ctv (2004) nghiên cứu bản đồ liên kết

di truyền của hầu Thái Bình Dương bằng chỉ thị AFLP [34]

Cấu trúc di truyền của 21 quần thể ốc phân bố ở các vùng địa lý khác nhau (n = 369) đã được phân tích bởi Arnaud (2001) [23] Trai (Pallas) là loài nhuyễn thể hai mảnh có nguồn gốc ở vùng biển Đen đã xâm lấn vào cùng biển Ireland thập kỷ trước

5 chỉ thị microsatellite đã được sử dụng để phân tích đa dạng và cấu trúc di truyền của

10 quần thể ở các vùng địa lý khác nhau (Astainei et al., 2005) Kết quả đã đã góp phần khẳng định hơn nguồn gốc của loài trai Ireland [24]

Qi Li và ctv, (2003) đã tiến hành nghiên cứu di truyền ở bào ngư Thái Bình

Dương Haliotis discus hannai Dấu hiệu di truyền của 7 locus microsatellites của 4

loài bào ngư được lai thuận nghịch 2 đực x 2 cái Tất cả các locus phân ly theo kiểu đồng trội, tuy nhiên chỉ có 3 gen (Hdh1321, Hdh78 và Hdd108C) là tuân theo quy luật phân ly Menden và có thể được dùng trong nghiên cứu về sự di truyền quần thể Khi 2 gen không khuyếch đại bởi PCR (Hdh1761 và Hdh1457) tuân theo định luật Menden ở

tất cả các họ, trong khi đó còn lại 2 locus (Hdd114B và Hdd229) cho ra độ lệch so với

sự phân ly theo Menden ở một loài nhỏ nhất ngay cả khi null allenes được chú ý đến Kết quả đó cho thấy cần tiến hành kiểm tra thông tin di truyền của các chỉ thị Microsatellites khuôn mẫu trước khi dùng chúng trong di truyền quần thể hay phân tích di truyền bố mẹ [38] Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Xin Zhan (Từ đại học Xiamen, Trung Quốc) đã phân lập được 11 chỉ thị microsatellite mới từ bào ngư

Halotis diversicolor Những gen này đã được kiểm tra trên 22 cá thể được thu từ 2

quần thể địa lý khác nhau Nhóm tác giả đã nhận ra được tổng số 162 alen từ 11 vị trí microsatellite Tất cả các vị trí gen đó đều có tính đa hình cao Tính đa hình đo được trong khoảng 0,7738-0,9163 Dị hợp tử quan sát được có giá trị trong khoảng 0,2727-1,0 và tương ứng với lý thuyết là 0,7738-0,9429 3 vị trí gen không tuân theo trạng thái cân bằng của định luật Hardy-Weinberg Chỉ thị đa hình đó sẽ được sử dụng trong phân tích cấu trúc quần thể, nghiên cứu đa dạng di truyền và lập bản đồ liên kết di truyền [44]

Năm 2005, Luly và ctv, đã tiến hành phân lập chỉ thị microsatellite ở vẹm xanh Tổng số 21 DNA microsatellites đã được phân lập nhờ sử dụng kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp có đầu 5’anchored Cặp mồi được thiết kế cho 7 vị trí microsatellites, phản ứng khuyếch đại PCR của 7 vị trí microsatellites này cho thấy sự đa hình của 5 vị trí với số alen trên locus là 2-4 [36]

Năm 2009 Wang và ctv đã nghiên cứu thành công 16 chỉ thị microsatellite cho

trai môi vàng (Pinctada maxima) Năm 2011, Wang và ctv công bố phát triển được 60

micosatellite marker cho bào ngư (Wang, ctv, 2011) [43] Li và ctv (2011) phát triển

16 microsatellite loci cho hầu Crassostrea hongkongensis [32]

Năm 2013, Mohamed và ctv đã nghiên cứu đa dạng di truyền của dòng vi

khuẩn Rhizobium leguminosarum bằng phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rARN

Kết quả cho thấy khoảng cách di truyền trung bình trong số các chủng nghiên cứu là thấp (0,193) với di truyền thấp nhất [37]

Năm 2014, Chiesa et al đã nghiên cứu đa dạng di truyền trên quần thể ngao bằng đoạn gen 16S rADN Stefania và ctv đã thu mẫu tại 12 địa điểm ở Ý, Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha từ Địa Trung Hải đến Đại Tây Dương Kết quả phân tích cho thấy mtADN xuất hiện 11 haplotype, trong đó có 1 haplotype thương gặp và 10 haplotype hiếm [28]

Mặc dù nhiều nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của các loài nhuyễn thể được tiến hành nhưng cho đến nay các nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền quần thể

tu hài được công bố rất hạn chế

1.5.2 Những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số loài thủy sản và tu hài

ở trong nước

Trong những năm gần đây, công nghệ di truyền học phân tử đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong chọn giống động thực vật nói chung và trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản nói riêng

Quyền Đình Thi và ctv, (2003) sử dụng chỉ thị microsatellite, mtRFLP và RAPD để phân tích đa hình tôm sú (Peneaus monodon) kết quả phân tích trên 20 mẫu

tôm sú cho 20 kiểu gen khác nhau và giá trị thông tin đa hình (PIC) luôn luôn > 0,5, cho thấy tính đa hình microsatellite cao Phân tích RFLP của hai phân đoạn 16S rRNA

và 12S rDNA cho thấy tính đa hình thấp Phân tích tính đa hình 20 mẫu tôm sú bằng 4 mồi ngẫu nhiên, ở mỗi mồi ngẫu nhiên đều cho các chỉ thị đặc trưng, cây di truyền

được chia thành 5 nhóm [15] Cũng trên đối tượng tôm sú (Peneaus monodon) Nguyễn

Thị Thảo và ctv (2004) sử dụng chỉ thị microsatellite đánh giá tính đa hình 3 quần đàn tôm sú nuôi ở Việt Nam, kết quả phân tích trên 3 quần đàn, quần đàn I có nguồn gốc ở Singapore tác giả đã chỉ ra với 6 locus CSCUPmo1, CSCUPmo2, CSCUPmo3, CSCUPmo4,CSCUPmo6 và CSCUPmo7; tính đa hình bên trong mỗi quần đàn rất cao với giá trị thông tin đa hình (PIC) > 0,829, tính đa hình giữa các quần đàn tôm sú cũng cao (PIC) >0,913 và khoảng cách di truyền giữa các quần đàn lớn 0,4693-0,7268, quần đàn I và II có đồ thị phân bố tần số allen tương tự nhau hơn so với quần đàn III [12]

Đào thị Tuyết và ctv (2003) sử dụng phương pháp RAPD đánh giá đa hình di truyền quần đàn cá tra nuôi (Pangasius hypophthamus) ở Việt Nam có 4 quần đàn

được ký hiệu R, D, T và TN (quần đàn tự nhiên ) Kết quả phân tích RAPD mồi A7 phân biệt quần đàn R với D, T, TN ở dấu chỉ thị phân tử 2400 base; R và T với D và

TN ở dấu chỉ thị phân tử 2200 base, mồi A8 phân biệt được quần đàn D với các quần đàn còn lại ở dấu chỉ thị phân tử > 500 base; D và R với T và TN ở dấu chỉ thị phân tử 1800-1900 base, mồi 101 phân biệt quần đàn còn lại ở dấu chỉ thị phân tử 1800-2200 base, mồi 456 phân biệt quần đàn D với T, TN, R ở dấu chỉ thị 1800-2000 base; T, TN với D, R ở dấu chỉ thị 3.000-3.500 base, mồi 459 phân biệt quần đàn R với các quần

đàn còn lại ở chỉ thị phân tử 1.800-2.000 base; R, T với D, TN ở dấu chỉ thị phân tử 3.500 base [20]

Quyền Đình Thi và Phạm Anh Tuấn (2004) dùng chỉ thị RAPD và DNA ty thể

phân tích tính đa hình quần đàn cá tra (Pangasius hypophthamus) nuôi ở Việt Nam

Kết quả phân tích RAPD của 4 quần đàn nuôi ở 9 mồi ngẫu nhiên A7, A8, 101, 456,

459, A10, A13, CRL32 và Y13 tìm thấy một số chỉ thị đặc trưng cho từng quần đàn, phân tích mtADN cho thấy các quần đàn có tần suất cắt của enzyme cắt hạn chế khác nhau tức kiểu gen đơn bội thể ở ty thể là khác nhau Qua kết quả nghiên cứu cho thấy

có thể kết hợp nghiên cứu các tính trạng của từng quần đàn cá tra để tìm ra mối quan

hệ giữa chỉ thị phân tử đặc trưng và tính trạng nhằm mục đích chọn giống, ở nghiên cứu này tác giả cũng cho thấy một số chỉ thị phân tử đặc trưng cho cá tra mỡ vàng và

có trọng lượng 2 cực cho thấy 8 băng AFLP có tần số khác biệt trên 50% Tuy nhiên chỉ có 2 băng À 7-4 của tổ hợp mồi E-ACC/M-CA và À 6-1 của tổ hợp mồi E-AGG/M-CTT có tính ổn định và vẫn giữ nguyên tỷ lệ này khi kiểm tra trên số lượng mẫu lớn hơn [17]

Bùi Thị Liên Hà và ctv (2011) sử dụng 6 chỉ thị microsatellite để đánh giá mức

độ đa dạng di truyền của 4 dòng cá rô phi đỏ có nguồn gốc từ Đài Loan, Thái Lan, Malyasia và Ecuador Kết quả nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt di truyền có

ý nghĩa 4 dòng cá và tác giả khuyến cáo nên tiến hành lai chéo 4 dòng cá này hoặc lai với các dòng cá khác có biến di di truyền tương đương hoặc cao hơn nhằm làm tăng biến di di truyền phục vụ cho công tác chọn giống có hiệu quả hơn [6]

Mặc dù nhuyễn thể đóng góp giá trị thủy sản đứng thứ 3 sau cá tra và tôm biển nhưng những nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền và chọn giống còn rất hạn chế

Mai Duy Minh và ctv, (2004) đã sử dụng kỹ thuật allozyme (điện di protein) đánh giá di truyền quần thể của ốc hương ở Thanh Hóa, Bình Thuận và Vũng Tàu Nhóm tác giả nhận định khoảng cách di truyền giữa các quần thể rất nhỏ [7]

Thái Thanh Bình và ctv (2011) đã đánh giá đa dạng di truyền 6 quần thể ngao

(Meretrix lyrata) ở Việt Nam sử dụng 4 chỉ thị microsatellite MME02, GQ141833;

MME12, GQ141843; MME31, GQ141860; MME15, GQ141846 Kết quả bước đầu cho thấy chỉ thị microsatellite rất hữu hiệu trong việc đánh giá đa dạng di truyền của ngao ở Việt Nam Tổng số phát hiện được 75 alleles trên tổng số 4 loci Số alleles trung bình phát hiện trên locus trên quần thể dao động từ 6,1-12 Hệ số dị hợp tử phát hiện và mong đợi trên trên 4 loci lần lượt từ 0,51-0,8 và từ 0,68-8,57 Phân tích UPGMA cho thấy quần thể ngao ở Nam Định, Thái Bình, Quảng Ninh có mối quan hệ gần gũi và có khoảng cách di truyền lớn so với quần thể ngao ở Cà Mau và Bến Tre, Tiền Giang [2]

Nguyễn Thị Trang (2012) đánh giá đa dạng di truyền một số quần thể tu hài ở Quảng Ninh, Hải Phòng va Phú Yên bằng giải trình tự ADN ở ty thể ở vùng gen COI kết quả cho thấy tu hài Quảng Ninh có độ đang dạng cao nhất và cây phát sinh chủng loại của 3 quần thể tu hài chia thành 2 nhánh Trong đó tu hài Quảng Ninh thuộc về cả

2 nhánh và tu hài Hải Phong và Phú Yên thuộc về một nhánh [21]

Năm 2014, Đặng Thúy Bình, Nguyễn Thị Bảo Châu, Bùi Kim Lý đã nghiên

cứu cấu trúc quần thể loài cá trích Sardinella gibbosa Bleeker, 1849 (clupeiformes:

clupeidae) tại vùng biển Việt Nam Kết quả cho thấy vùng gen điều khiển (1122 bp) của 80 cá thể trong tổng số 80 haplotype được phát hiện với đa dạng haplotype là h=0,916±0,00041 Đối với gen 16S (550 bp) của 81 cá thể có tổng số 31 haplotype được phát hiện và đa dạng haplotype là h=0,804±0,0017 [1]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian thực hiện: Đề tài được thực hiện từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 4 năm 2015

Địa điểm tiến hành thí nghiệm: đề tài tiến hành thu mẫu tại Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa và phân tích mẫu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thủy sản - Trường Cao đẳng Thủy sản - Bắc Ninh

Trình tự ADN của tu hài được đọc tại trường đại học tổng hợp Monash Malaysia, Sunway Malaysia

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tu hài tự nhiên và tu hài nuôi ở 3 tỉnh Quảng Ninh, Hải Phòng và Khánh Hòa

2.2.2 Thiết bị

- Đèn cồn, Tủ lạnh, tủ âm, micropipette, đầu côn, ống eppendorf 1,5µl; , cối chày, pank, dao, kéo để cắt mẫu

- Ống eppendorf để chạy PCR; micropipette các loại: 2μl, 20μl, 200μl, 1000μl

- Máy ly tâm, bể ổn nhiệt, máy vontex, máy điện di, máy PCR,máy chiếu tia UV; máy giải trình tự ADN tự động v.v

- Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: 4 loại deoxynucleotit triophosphat (dNTPs) của Sigma , Taq-ADN Polymerase của Fementas

 Hóa chất tách chiết ADN:

- Tách chiết ADN tu hài bằng bộ kít Qiagen của Đức sản xuất

 Bộ kit phản ứng PCR gồm: Nước cất; Toptaq Master Mix 2x; Coral load; Cặp mồi 16S

 Bộ kit Qiagen tinh sạch PCR gồm: Buffer PB; cột QIA quick; PE; Buffer EB 2.3 Phương phỏp nghiờn cứu

Cỏc bước đỏnh giỏ đa dạng cỏc quần thể tu hài được trỡnh bày túm tắt ở Hỡnh 2.1 và Hỡnh 2.2

Hỡnh 2.1 Sơ đồ cỏc bước phõn tớch mẫu bằng phương phỏp RFLP

MẪU TU

HÀI

ADN

Tách chiết ADN

sạch sản phẩm

PC R

PC R

đọc tr ình tự ADN

Giải tr ình tự ADN

Hỡnh 2.2 Sơ đồ giải trỡnh tự ADN tu hài

2.3.1 Thu mẫu và bảo quản

Cỏch thu mẫu: Tu hài phõn bố tự nhiờn và tu hài nuụi được thu mẫu ở cỏc tỉnh Quảng Ninh, Hải Phũng và Khỏnh Hũa Tu hài tự nhiờn được thu bằng phương phỏp

Hầu cửa

sụng

ADN

Tách chiết ADN

Đọc kết quả

Tu hài

lặn và bắt bằng tay Tu hài nuôi được thu ở bè nuôi và các trại sản xuất giống Địa chỉ thu mẫu, số lượng mẫu phân tích được trình bày ở Bảng 3.1 và Hình 3.3

Cách bảo quản mẫu: Mẫu tu hài là một phân cơ của vòi tu hài (10-15g/mẫu) Mẫu được bảo quản trong ống eppendoft (2 ml) có chứa cồn nồng độ 90%

Hình 2.3 Địa điểm thu mẫu tu hài

Địa điểm thu mẫu tu hài nuôi Địa điểm thu mẫu

tu hài tự nhiên

Bảng 2.1 Địa điểm, code mẫu, số lượng mẫu tu hài được giải trình tự ADN

mẫu

Số mẫu được giải trình tự ADN (mẫu)

Ghi chú

3 Hòn Đông Nam, Cô Tô, Quảng Ninh CTT 4 Tự nhiên

5 Việt Hải, Cát Hải, Hải Phòng CBN 10 Nuôi ở bè

7 Cam Lập, Cam Ranh, Khánh Hòa NTN 10 Trại giống

2.3.2 Tách chiết ADN tổng số

Quy trình tách chiết ADN bằng bộ kít Qiagen được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Hình 2.4)

Hình 2.4 Sơ đồ trình tự các bước tách chiết ADN bằng bộ kít Qiagen

Li tâm 8000 vòng/ phút, bỏ phin lọc

Li tâm 8000 vòng/ phút,

bỏ ống dưới

 Kiểm tra chất lượng của ADN tổng số

Chuẩn bị gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE1X

Cho mỗi giếng gồm 5 µl DNA đã tách ở trên trộn đều với 3 µl Loading dye Chỉnh hiệu điện thế 110 V Phương pháp tiến hành trong khoảng 45 phút Khi nào thấy vạch chạy 2/3 bản gel thì dừng lại, quan sát bản gel dưới đèn UV

Kết quả điện di cho các vạch gọn, phân tách rõ ràng nghĩa là ADN trong mẫu đã tinh sạch cho nghiên cứu tiếp

2.3.3 Thành phần của một phản ứng PCR

Mỗi phản ứng PCR bao gồm các thành phần được trình bày ở Bảng 2.2:

Bảng 2.2 Thành phần của một phản ứng PCR

Phản ứng PCR được tiến hành trong ống eppendort 0,2 ml và thực hiện trên máy PCR MyGenic 96 Thermal Block theo chu trình nhiệt sau (Bảng 2.3)

Bảng 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đoạn 16S

Bước 1: Chuẩn bị gel agarose

 Cân 2 mg agarose cho vào ống

 Bổ sung 100 ml TAE 1X vào ống và khuấy đều để hòa tan agarose

 Đun trên lò vi sóng khoảng 2 phút đến khi dung dịch agarose trong suốt

 Để dung dịch agarose nguội ở nhiệt độ 60-64ºC

 Đổ dung dịch agarose đã đun vào khuôn gel đã kẹp máng chắc chắn, có cài lược để tạo các giếng trên bản gel (10 hoặc 15 giếng tùy lượng mẫu) Khi

đổ phải làm từ từ và liên tục để gen không lẫn bọt khí Độ dày của gen khoảng từ 3-5mm Để nguội cho đông lại

 Rút lược ra, khi rút phải dứt khoát và theo phương thẳng đứng để giếng không bị vỡ

 Đặt gel vào buồng điện di có chứa dung dịch TAE 1X, dung dịch này phải phủ đầy mặt gel nhưng không quá ngưỡng max trong buồng điện di

Bước 2: Cho mẫu vào giếng:

 Dùng micropipette lấy 1 µl loading dye để trên giấy nến chống thấm

 Lấy 3µl sản phẩm PCR cho vào 1 µl loading dye, đảo đều dung dịch mẫu bằng pipet

 Dùng pipet hút mẫu nạp vào các giếng không làm tràn ra ngoài và sang các giếng bên cạnh

 Giếng cuối cùng nạp marker

Bước 3: Chạy điện di

Chỉnh hiệu điện thế 110V, cường độ dòng điện là 50-80mA Chạy máy trong khoảng 25-30 phút Khi nào thấy vạch chạy 3/4 bản gel thì dừng lại, quan sát bản gel dưới đèn UV

Hình 2.5 Chạy điện di sản phẩm PCR

2.3.6 Trộn sản phẩm PCR với enzyme giới hạn

Sản phẩm PCR sẽ được cắt bằng 4 enzyme hạn chế: AluI, BanH I, Hae III, Taq

I ở 37oC trong 2 giờ (trừ Taq I ở 62oC trong 2 giờ)

Các thang chuẩn cho từng loại emzyme là hỗn hợp ủ lamba với từng loại enzyme tương ứng đó với thời gian là 2 giờ ở 37oC với AluI, BanH I, Hae III, Taq I ,

và 62oC với TaqI

Kiểm tra sản phẩm trên gel agarose

Chuẩn bị gel agarose 2% trong dung dịch đệm TAE1X

Cho mỗi giếng gồm 5µl DNA được ủ với enzyme giới hạn ở trên trộn đều với 3µl Loading dye

Các thang chuẩn cho từng loại emzyme là hỗn hợp ủ lamba với từng loại enzyme tương ứng đó

Chỉnh hiệu điện thế 110V Phương pháp tiến hành trong khoảng 45 phút Khi nào thấy vạch chạy 2/3 bản gel thì dừng lại, quan sát bản gel dưới đèn UV

Kích thước của các đoạn đa hình sẽ được tạo ra bởi các enzyme hạn chế và được ước lượng bằng băng DNA chuẩn (hỗn hợp ủ lamba với từng loại enzyme tương ứng)

Tuy nhiên, trong quá trình thực hiện đề tài thử các loại 4 loại enzyme cắt hạn chế chỉ có 1 loại enzyme AluI xuất hiện đa hình đối với đoạn gen 16S nhưng không phát hiện đa dạng Do vậy, đề tài chuyển sang phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S

2.3.7 Phương pháp định trình tự gen bằng máy giải tự động

 Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ kit QIAGEN QIAquick PCR Các bước làm sạch sản phẩm PCR bao gồm:

Bước 1: Thêm 100µl Buffer vào sản phẩm PCR với tỉ lệ (5 : 1) PB : PCR =

100 : 20 sau đó tiến hành voltex

Bước 2: Tiến hành hút tất cả dung dịch vào ống đầu lọc đã được chuẩn bị sẵn Bước 3: Li tâm 1 phút với tốc độ 1300 vòng/ 1 phút,loại bỏ ống dưới và lấy ống cọt lọc

Bước 4: Thêm 750µl Buffer BE vào cột lọc và tiến hành li tâm 13000 vòng/1 phút trong thời gian 1 phút

Bước 5: Loại bỏ nước ở phía dưới, lắp cột lọc vào ống Eppendorf 1,5 và đánh dấu theo tỉ lệ như ống cũ

Bước 6: Thêm 30µl Buffer EB vào chính giữa màng cột lọc ( tránh không để chạm vào màng lọc) để ở nhiệt độ phòng 1 phút sau đó mang li tâm 13000 vòng/1 phút trong thời gian 1 phút

Bước 7: Kiểm tra sản phẩm trên agarose

 Phương pháp giải trình tự ADN

Phản ứng PCR: tổng thể tích hóa chất là 20µl bao gồm: 3µl BDT + 4µl ADN khuôn mẫu + 13µl H2O

- Chu kỳ luân nhiệt PCR:

95oC 1 phút

50oC 30 giây 30 chu kỳ

72oC 1 phút

- Trình tự ADN ty thể (mtADN) của tu hài được giải mã trên máy ABI/3130XL, mỗi mẫu được giải trình tự bằng 2 mồi xuôi ngược

2.4 Phương pháp xử lý số liệu

Các giải trình tự ADN của tu hài được dóng và sắp xếp bằng ClustalW trong phần mền BioEdit [30]

Đa dạng di truyền của các quần thể tu hài được tính bằng tổng số haplotype (k),

số lượng vị trí đa hình – polymorphic sites (s), đa dạng haplotype (hd) và đa dạng nucleotide (Π) Các số liệu được xử lý bằng phần mềm DNAsp5 [35]

Đa dạng haplotype: xác xuất hai lựa chọn ngẫu nhiên các haplotype trong một

mẫu là khác nhau (tương đương các dị hợp tử được mong đợi)

P n

n hd

1

21

1

Trong đó: h là đa dạng haplotype; k là số lượng các haplotype trong một mẫu; p

là tần số của từng haplotype trong mẫu

Đa dạng nucleotide: là số lượng trung bình của các vị trí nuleotide khác nhau

giữa hai chuỗi nucleotide được rút ra ngẫu nhiên từ một mẫu

n n  x i x jij



 / 1

Trong đó: xi, xj là tần số của alen i và j; πij là tần số sai khác giữa alen i và j; n

là chiều dài chuỗi nucleotie

Phân tích đa dạng di truyền của tu hài được tiến hành dựa trên các thuật toán Neighbor joining (NJ), Minimum Evolution (ME), Maximum parsimony (MP) và Unweighted Pain Group Method using Arithmetic mean (UPGMA), các phương pháp được phân tích bằng các phần mềm MEGA6.0 Giá trị bootstrap (BT) được tính toán

để xác định tính chính xác của thuật toán MP, ML và NJ với độ lặp lại 1.000 [42]