Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh bà rịa - vũng tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP

Tài liệu tham khảo chuyên ngành công nghệ sinh học Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh bà rịa - vũng tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, cây điều (Anacardium occidental L.) đã và đang trở

thành một cây công nghiệp mạnh, có giá trị kinh tế – xã hội cao của nước ta Hằng năm, doanh thu từ cây điều đem về cho nước ta hàng trăm triệu USD, trở thành nước xuất khẩu nhân điều đứng thứ 2 thế giới, vượt qua Ấn Độ, chỉ đứng sau Brazil [4] Bên cạnh đó, việc canh tác cây điều còn giúp nước ta giải quyết được những vấn đề xã hội khác như: phủ xanh đất trống đồi trọc, giải quyết việc làm, đem lại thu nhập ổn định cho người nông dân ở những vùng đất khô cằn, bạc màu,…Nước ta nằm trong vùng có khí hậu thuận lợi và có diện tích lớn đất phù hợp cho sự phát triển của cây điều, vì vậy chúng ta có tiềm năng lớn để phát triển mạnh cây điều

Tuy nhiên tình hình canh tác cây điều của nước ta nói chung và của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu nói riêng không đạt tương xứng như tiềm năng, do đó năng suất bình quân còn thấp, không đồng đều và không ổn định cả về chất lượng và sản lượng, bắt nguồn từ việc phát triển cây điều một cách tự phát, không được đầu tư nghiên cứu nghiêm túc, đặc biệt là những nghiên cứu về các giống điều và kỹ thuật canh tác Để có thể đề ra một chiến lược toàn diện phát triển cây điều, điều qua trọng là cần phải đầu tư cho công tác lai tạo, bảo tồn và phổ biến những giống điều có chất lượng vượt trội so với những giống hiện có Muốn vậy trước hết phải đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây điều hiện có Xuất phát từ yêu cầu đó, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học–Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, dưới sự hướng

dẫn của thầy TS Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện đề tài: “Bước đầu đánh giá mức

độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà

Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu

 Thông qua kỹ thuật RAPD đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu

 Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật AFLP trên cây điều, làm cơ sở cho việc áp dụng kỹ thuật AFLP vào những nghiên cứu sâu rộng hơn về tính đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử trên cây điều cũng như trên những đối tượng nghiên cứu khác sau này

1.2.2 Yêu cầu

 Thu thập được mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và điển hình dựa trên kiểu hình như: khả năng chịu hạn tốt hay không tốt, năng suất và chất lượng hạt cao hay thấp, có tính đề kháng với sâu bệnh cao hay thấp, ra hoa sớm

hay muộn,…

 Ly trích DNA có chất lượng tốt từ các mẫu lá thu được (được bảo quản

lạnh) làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD và AFLP

 Thực hiện thành công kỹ thuật RAPD từ đó đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, đồng thời nhận diện một số đoạn DNA có thể được sử dụng như những chỉ thị phân tử liên quan đến những tính trạng

 Không có đủ điều kiện để thu thập lượng mẫu lớn

 Không có đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR – RAPD với nhiều primer và tìm ra quy trình PCR – RAPD tối ưu

 Không có điều kiện để tiến hành kỹ thuật AFLP trên nhiều mẫu và với nhiều tổ hợp primer do chi phí thực hiện quá cao

Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về cây điều 2.1.1 Nguồn gốc cây điều

Cây điều có tên khoa học là Anacardium occidentale L

Cây điều có nguồn gốc ở Brazil Người Bồ Đào Nha là những người đầu tiên mang cây điều từ Brazil sang trồng ở châu Á và châu Phi trong công cuộc mở rộng thuộc địa của họ Điều kiện tự nhiên ở châu Á phù hợp cho sự phát triển của cây điều

Ngày nay cây điều trải rộng trong ranh giới vĩ tuyến 25o Bắc và 25o Nam Trước kia, cây điều được trồng chủ yếu để che phủ đất, chống xói mòn,…Mãi đến tận đầu thế kỷ 20 nhân điều mới thực sự trở thành nông sản có giá trị trên toàn thế giới [2][3]

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây điều

Cây điều là loài cây thân mộc vùng nhiệt đới, sống lâu năm (đến khoảng 30 – 40 năm hay cao hơn), chịu hạn tốt, có thể sinh trưởng và phát triển ở những vùng đất khô cằn, bạc màu mà những cây lương thực khác khó có thể sống nổi

2.1.2.1 Thân và cành cây

Thân thường cao khoảng 6 – 8 m, những nơi đất tốt có thể đến 10 – 12 m, đường kính vòng thân có thể đạt 40 – 50 cm Chiều cao thân cây có liên hệ mật thiết với mật độ trồng Nếu trồng với mật độ dày, thân cây tăng trưởng chiều cao mạnh nhưng cành nhánh nhỏ và ngắn, lá thưa thớt, không thể cho nhiều hoa và trái Thông thường khoảng cách trồng phổ biến khoảng 8 – 10 m

Tán cây điều rộng, trung bình khoảng 10 m, có khi đạt 20 m [2]

2.1.2.2 Hệ rễ

Cây điều có rễ cọc và rễ ngang Ở những vùng đất khô, mạch nước ngầm thấp, rễ cọc đâm xuống sâu để hút nước, do đó cây điều có khả năng chịu hạn cao và vững

chắc Rễ cọc cây điều trên 5 tuổi có thể sâu khoảng 5 m Hệ thống rễ ngang mọc cách

mặt đất khoảng 12 cm 2.1.2.3 Lá

Lá cây điều thuộc loại lá đơn, nguyên Lá thường có dạng thuôn hay hình trứng, đuôi lá thường hơi tròn Lá non có màu xanh hay đỏ tía tùy giống, khi già có màu xanh thẫm Theo Rao và Hassan (1957), thời gian trung bình từ khi ra lá non đến lá trưởng thành khoảng 20 ngày [3]

2.1.2.4 Hoa và quả điều

Hoa điều nhỏ, đài hợp, có năm cánh rời Khi mới nở cánh hoa có màu trắng hay vàng có sọc đỏ, sau đó chuyển thành màu hồng sẫm Hoa điều có hai loại: hoa đực và hoa lưỡng tính Hoa đực gồm toàn nhị đực, hoa lưỡng tính có khoảng 8 – 12 nhị đực và có một nhụy cái ở chính giữa Nhụy cái gồm một bầu noãn nằm dưới một vòi dài (dài và mập hơn nhị đực) Theo Copeland (1961), trong bầu noãn chứa một noãn duy nhất, nếu được thụ tinh sẽ phát triển thành hạt điều [2]

Hoa điều mọc thành từng chùm có từ vài chục đến 1 – 2 trăm hoa, gồm cả hoa đực và hoa lưỡng tính, trong đó hoa đực chiếm tỉ lệ cao, còn hoa lưỡng tính dao động từ 0 – 30 % tổng số hoa trong chùm Số hoa lưỡng tính đậu quả tới chín cho thu hoạch khoảng 10 % Những chùm hoa của đầu và cuối vụ thường nhiều hoa đực, những chùm hoa chính vụ có tỉ lệ hoa lưỡng tính cao Tỉ lệ hoa lưỡng tính còn tùy thuộc vào từng cây khác nhau trong vườn Bình quân tỉ lệ hoa lưỡng tính trong chùm khoảng 12 – 15 % [3]

Mùa hoa điều nở là mùa khô Hoa điều thường nở từ tháng 11 kéo dài đến tận tháng 3 năm sau, tuy nhiên hoa nở rộ ở tháng 1 – tháng 2 Sự nở hoa có liên hệ mật thiết với nhiệt độ môi trường Có sự chênh lệch về thời điểm nở hoa, ngay cả với những hoa cùng chùm Hoa điều nở từ sáng sớm tới trưa, sau đó bắt đầu héo Sau khi thụ phấn xong, quá trình thụ tinh bắt đầu: hạt phấn nảy nầm trên đầu núm nhụy cái đưa các tinh tử xuyên qua vòi nhụy vào bầu noãn để thụ tinh cho tế bào trứng Thụ tinh xong bắt đầu quá trình hình thành và phát triển của hạt điều Quả điều thật là phần mà ta hay gọi là hạt, phần gọi là quả thực ra do phần cuống phình to ra, gọi là quả giả Hạt điều bao giờ cũng phát triển trước và nhanh hơn quả giả ở gần cuống Khi hạt điều

tăng trưởng đến kích thước tối đa, có sự hình thành đầy đủ các bộ phận, bước vào giai đoạn chín lúc bấy giờ quả giả mới tăng trưởng mạnh [2]

Hạt điều có hình dạng giống quả thận, khi non có màu xanh, khi chín khô chuyển qua màu nâu xám hoặc xám hồng Hạt điều ở nước ta thường dài 2,6 – 3,1 cm, dày 1,2 – 1,7 cm, nặng khoảng 3 – 7 g Cấu tạo hạt điều gồm 3 phần rõ rệt:

 Phần vỏ cứng: chiếm khoảng 60 % – 70 % trọng lượng hạt điều, trong đó phần dầu vỏ hạt chiếm 20 % – 22 % trọng lượng hạt

 Phần giữa: là lớp vỏ lụa, lúc còn non đóng vai trò cung cấp chất dinh dưỡng nuôi hạt, khi chín teo lại, chiếm khoảng 5 % trọng lượng hạt

 Phần trong cùng: là nhân hạt điều, chính là phôi hạt có đầy đủ chồi mầm, thân mầm và rễ mầm Bộ phận có kích thước lớn của phôi là hai lá mầm có chứa nhiều chất dinh dưỡng để nuôi cây mầm khi mới mọc [3]

 Sau khi thụ tinh xong không phải bất cứ hoa điều lưỡng tính nào cũng đều phát triển thành quả giả và hạt cho đến khi chín Có nhiều khi hạt và quả giả chưa kịp chín đã rụng, gọi là hiện tượng rụng trái non Tỉ lệ rụng trái non phụ thuộc vào từng cây, từng vụ, do nhiều nguyên nhân khác nhau như: di truyền, thời tiết bất thường, sâu bệnh, đất quá khô hoặc úng lầy, thiếu hụt chất dinh dưỡng nghiêm trọng

Sau khi trồng khoảng 2 – 3 năm, cây điều bắt đầu ra hoa kết trái Năng suất giữa các cây trong cùng một vườn, giữa các năm, giữa các vườn điều với nhau thường khác nhau, phụ thuộc chủ yếu vào giống, kỹ thuật trồng và thời tiết Năng suất hạt điều trung bình của nước ta khoảng 1,1 tấn/ha [4]

2.1.3 Đặc điểm sinh thái của cây điều 2.1.3.1 Khí hậu

Các yếu tố thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây điều :

 Chế đô mưa: Theo Ohler (1979), lượng mưa thích hợp giới hạn từ 1.000 – 2.000 mm/năm, có một mùa mưa tập trung, không đến sớm, sau đó là một mùa khô kéo dài 4 – 6 tháng [2]

 Chế độ nhiệt: Thích hợp từ 20o

C – 37oC, cực thuận ở 27o

C [9] Một điều ảnh hưởng rõ rệt đến năng suất hạt điều là do sương muối Khi có nhiều sương muối trùng với thời kỳ kết hạt non của cây, nhiều hạt non sẽ bị thối đen, năng suất giảm Cây điều nước ta thường bị ảnh hưởng nhiều bởi sương muối

 Chế độ ánh sáng: Cây điều là cây ưa sáng hoàn toàn, thích hợp ở những vùng mà độ dài ngày và đêm bằng nhau và bầu trời quang đãng Số giờ nắng khoảng 2000 h/năm [3]

 Độ ẩm tương đối: Độ ẩm không khí thích hợp từ 65 % – 80 %

2.1.3.2 Đất đai

Cây điều có thể mọc trên nhiều loại đất khác nhau (đất đỏ, đất cát, đất xám phù sa cổ, đất sỏi đá,…), tuy nhiên muốn đạt năng suất cao đòi hỏi phải có tầng đất mặt sâu, thành phần cơ giới nhẹ, thoát nước tốt, pH đất từ 4,5 – 6,5 Vườn trồng phải được nhổ cỏ thường xuyên để cây phát triển tốt

2.1.3.3 Mật độ trồng

Thông thường mật độ trồng thích hợp là 10 m x 10 m, ở mật độ này cây điều phát triển tốt chiều cao và tán [3]

2.1.4 Giống điều và các phương pháp nhân giống

Giống như các loại cây trồng từ hạt khác, cây điều có khả năng xảy ra thụ phấn chéo cao và phát tán rộng, vì vậy quần thể cây điều có tính đa dạng di truyền cao

Trong thực tế, ở Việt Nam có những giống điều chủ yếu như: PN1, MH4/5, MH5/4, BO1 (là giống điều ghép cao sản) Bên cạnh đó còn những giống điều khác chưa phân loại được [3] Theo như kinh nghiệm của các nông dân, có 2 giống điều chủ yếu là: điều Ấn Độ có tán rộng, đọt non màu đỏ và cho năng suất rất cao song hay bị sâu hại trong khi điều Việt Nam có tán hẹp và đọt non màu xanh, năng suất không cao bằng điều Ấn Độ song khả năng chống chịu sâu hại cao

2.1.4.1 Đặc điểm thực vật học của các giống điều

 Về hình dạng cây: Có cây thân cao và cây thân lùn Giữa 2 dạng chính này còn có nhiều dạng trung gian phong phú

 Về màu sắc lá: Có giống có lá non màu nõn chuối và lá già màu xanh nhạt, có giống có lá non từ màu hồng đến đỏ tía và lá già màu xanh đậm

 Về hoa: Có giống hoa nở muộn, nở sớm chênh nhau 10 – 15 ngày, số lượng hoa trong mỗi chùm cũng khác nhau (có giống mỗi chùm chỉ có vài chục hoa, có giống lại có vài trăm hoa trên một chùm), tỉ lệ hoa đực/hoa lưỡng tính bình quân trong một chùm cũng thay đổi tùy giống (có giống có tỉ lệ hoa lưỡng tính thấp chỉ khoảng 5 % hay cũng có giống cao đến khoảng 30 %) Tỉ lệ hoa lưỡng tính sau khi nở và đậu thành trái cũng khác nhau, có khi nhiều khoảng 6 – 10 trái, ít chỉ 1 – 3 trái

 Về quả giả: Khác biệt ở màu sắc, hình dạng, kích cỡ, mùi vị quả giữa các giống Có giống quả màu đỏ, màu hồng, màu vàng, đỏ sọc xanh Có giống quả tròn, quả dài, quả to hay nhỏ Có giống quả ngọt khi chín, có giống quả nhạt, khi ăn khé cổ do có nhiều tananh trong nước quả

 Về hạt và năng suất hạt: Khác biệt về hạt ở các đặc điểm như hình dạng, kích thước, trọng lượng, tỉ lệ nhân Có giống hạt tròn mẩy, có giống hạt lép Có giống hạt to và nặng, khi chín trọng lượng khô đạt đến 8 g/hạt (khoảng 127 – 132 hạt/kg), có giống hạt nhỏ, chỉ đạt 3,5 g/hạt (gần 300 hạt/kg) Có giống tỉ lệ nhân đạt 20 % trọng lượng hạt, cũng có giống đạt 30 % trọng lượng hạt

2.1.4.2 Phương pháp nhân giống cây điều

Các phương pháp nhân giống điều chủ yếu là chiết, ghép, gieo hạt, tuy nhiên trong thực tế nông dân thường dùng phương pháp chọn cây điều mẹ tốt để lấy hạt làm giống Ngoài ra, hiện nay nông dân thường mua cây giống cao sản từ những công ty giống

2.1.5 Sản xuất điều trên thế giới

Từ một cây mọc hoang dại ở vùng Đông Bắc Brazil, ngày nay cây điều được trồng ở nhiều nơi trên thế giới, chủ yếu ở những nước có nền nông nghiệp khá phát triển hay những nước đang phát triển Hiện nay có khoảng 50 nước trồng điều trên toàn thế giới Những nước sản xuất điều chủ yếu: Ấn Độ, Brazil, Việt Nam, Guinea-Bissau, Ivory Coast, Benin, Nigeria, Mozambique, Tanzania,…

Bảng2.1 Sản xuất nhân hạt điều của thế giới niên vụ 1997 và 2000 – 2001

ĐVT: tấn

Ấn Độ Brazil

Việt Nam Tanzania

2.1.6 Sản xuất điều ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có khí hậu thuận lợi cho cây điều phát triển Cây điều có thể đã được đưa vào nước ta từ thế kỷ 18 hay sớm hơn (Johnson, 1973) [2], nhưng mãi đến đầu những năm 1975, cây điều mới được trồng phổ biến để phủ xanh đất trống đồi trọc do bom đạn chiến tranh Cho đến cuối thập kỷ 80 của thế kỷ 20 chúng ta mới bắt đầu xuất khẩu nhân điều [3] Kể từ mốc thời gian đó đến nay, phát triển cây điều không phải lúc nào cũng thuận lợi, có những lúc người nông dân trồng điều đã phải chặt bỏ hết cả vườn điều để trồng tiêu, cà phê,… do giá điều quá thấp và mất mùa liên tục Tuy nhiên hiện nay ngành trồng điều đã và đang phát triển mạnh, đạt được những thành tựu đáng ghi nhận Năm 2004, cả nước có hơn 400.000 ha diện tích trồng điều, là năm cho sản lượng cao nhất của ngành điều từ trước đến nay, đã xuất khẩu được 107.000 tấn nhân điều, tăng 25 % so với năm 2003, giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 425 triệu USD, tăng 40 % so với năm 2003, trong đó thị trường Mỹ chiếm 41 %, Trung Quốc 20 %, Úc 10 %, còn lại là các thị trường khác Năm 2004, Việt Nam chính thức trở thành nước xuất khẩu hạt điều đứng hàng thứ 2 thế giới, vượt qua Ấn Độ, chỉ đứng sau Brazil Năm 2005, chỉ tiêu của ngành điều là sản xuất chế biến khoảng 450.000 tấn điều thô, xuất khẩu 110.000 tấn nhân điều, giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt từ 430 – 450 triệu USD, phấn đấu hoàn thành kế hoạch trồng mới 50.000 ha điều cao sản và đến năm 2010, toàn bộ diện tích điều trên cả nước sẽ được thay bằng giống cao sản [4]

Bảng2.2 Tình hình sản xuất, xuất nhập khẩu nhân điều của Việt Nam

Năm

Hạt điều thô (tấn) Xuất khẩu (tấn) Giá trị kim ngạch (triệu USD)

Sản xuất

trong nước Nhập khẩu

Hạt điều thô

Nhân điều 1986

1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002

1530 1449 468 12.000 28.000 31.000 47.000 60.000 90.000 100.000 110.000 140.000 100.000 70.000 135.000 140.000

-

10.000 20.000 25.000 40.000

-

- - 300 11.000 27.000 30.000 40.000 30.000 50.000

- - 33,6

261 286 360 1.400 6.000 9.526 18.257 23.791 33.000 26.000 16.000 30.000 38.000 63.000

14 23 29 49 75 90 110 133 117 100 150 135 214

Bảng2.3 Thị phần xuất khẩu nhân điều của Việt Nam 3 năm 2000, 2001 và 2002

STT Quốc gia và khu vực 2000 (%) 2001 (%) 2002 (%)

Nhật

Canada Hồng Kông

Đức

New Zealand Đài Loan

Bảng2.4 Tình hình phát triển sản xuất điều tại Việt Nam dự kiến đến năm 2010

61.000

4.000 3.000 15.000

8.000 7.000 3.000 21.000

100.000

10.000 10.000 15.000 15.000 15.000 10.000 25.000

180.000

25.000 25.000 25.000 20.000 25.000 20.000 40.000

Tây Nguyên

Kon tum Gia Lai Đắc Lắc Lâm Đồng

27.000

500 10.500 10.000 6.000

60.000

16.000 17.000 15.000 12.000

120.000

25.000 35.000 30.000 30.000

Đông Nam Bộ

Đồng Nai

Bà Rịa – Vũng Tàu Bình Dương

Bình Phước Tây Ninh

Tp Hồ Chí Minh

149.000

35.000 20.000 32.000 50.000 10.000 2.000

170.000

40.000 25.000 28.000 65.000 10.000 2.000

190.000

40.000 30.000 28.000 65.000 25.000 2.000

Nguồn: [4]

Năm Vùng/Tỉnh

2.1.7 Tình hình canh tác cây điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu

Bà Rịa – Vũng Tàu là tỉnh mới thành lập năm 1991, thế mạnh là công nghiệp dầu khí và du lịch, ngoài ra còn phát triển mạnh cây công nghiệp như cao su, cà phê, tiêu, điều, đem lại nguồn thu nhập khá cao, chủ yếu là cho các huyện của tỉnh Cũng như các địa phương khác, cây điều được trồng ở tỉnh chủ yếu là trồng từ hạt, có độ tuổi trung bình cao Trong những năm gần đây đang phát triển mạnh cây điều cao sản cho năng suất cao và ổn định hơn so với các giống điều địa phương Đất nông nghiệp của tỉnh khá màu mỡ, có diện tích đất đỏ bazan lớn, cùng với điều kiện khí hậu khá ổn định, nhiệt độ trung bình trong năm là 24o

C – 28oC, có mùa khô và mùa mưa phân biệt, hệ thống thủy lợi phát triển và rộng khắp,…là những điều kiện thuận lợi cho phát triển cây điều

Bảng2.5 Sản lượng điều tại tỉnh BR – VT phân theo đơn vị hành chính ĐVT: tấn

Tổng số

TP Vũng Tàu TX Bà Rịa H Tân Thành H Châu Đức H Xuyên Mộc H Long Đất H Côn Đảo

6.257

153 109 1.630 1.387 2.589 384

6

5.102

48 73 413 742 3.575

250 1

6.010

48 71 812 1.272 3.575 231

1

7.316

24 72 1.462 1.447 4.009 301

1

10.417

28 143 1.462 2.206 6.138 440

1

(Nguồn: Sở Nông Nghiệp – Phát Triển Nông Thôn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu;

Cục Thống kê tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.)

Nói chung, giá trị đóng góp của các loại nông sản vào tổng thu nhập của toàn tỉnh không nhiều, song có một vai trò quan trọng trong sự phát triển chung của tỉnh, góp

phần đem lại thu nhập tương đối cho một bộ phận khá đông những người nông dân, giúp ngăn chặn tình trạng phân hóa giàu nghèo giữa thành thị và nông thôn Với những vùng đất khô cằn, bạc màu thì cây điều là giải pháp thích hợp nhất để giúp bà con có được thu nhập cao Tỉnh chủ trương đến năm 2010 thay thế dần các giống điều địa phương, trồng lâu năm, cho năng suất không cao, không ổn định bằng các giống điều cao sản cho năng suất cao, ổn định, kháng sâu bệnh và chất lượng đồng đều, phấn đấu đến năm 2010 đạt 16.000 tấn/năm (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh BR – VT) Chính vì vậy, việc đánh giá từng vùng quần thể và nhận diện các giống có giá trị cao là rất cần thiết

2.2 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 2.2.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử

Tế bào là đơn vị của sự sống, được phân ra làm 2 loại: Tế bào tiền nhân (Prokaryote) và tế bào nhân thật (Eukaryote) Bộ máy di truyền của 2 loại tế bào trên

được hình thành từ 2 loại nucleic acid: DNA (Deoxyribonucleic acid) và RNA (Ribonucleic acid) Ở sinh vật có tế bào nhân thật (Eukaryote), thông tin di truyền là

phân tử DNA – là chuỗi xoắn kép mạch đôi gồm 2 chuỗi polynucleotide song song, có trình tự các nucleotide bắt cặp bổ sung với nhau Các nucleotide được cấu tạo từ 3 thành phần: nhóm photphat, đường ribose và một trong 4 loại bazơ hữu cơ (adenine, cytoxine, thymine và guanine) Có 4 loại nucleotide khác nhau: A (nucleotide có chứa base adenine), T (nucleotide có chứa base thymine), C (nucleotide có chứa base cytoxine) và G (nucleotide có chứa base guanine) Các nucleotide trong cùng một mạch đơn được nối với nhau bằng liên kết photphat và 2 mạch đơn sắp xếp đối song với nhau theo nguyên tắc bổ sung A – T, G – C [1] [5] [8]

Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống Sự khác biệt về di truyền như vậy được gọi là tính đa dạng di truyền [1]

Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra được sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị [1]

Có 3 loại chỉ thị thường được sử dụng: - Chỉ thị hình thái - Chỉ thị allozyme.- Chỉ thị phân tử.

2.2.1.1 Chỉ thị hình thái

Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể phát hiện được Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lượng chỉ thị ít do không phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện được, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp

2.2.1.2 Chỉ thị allozyme

Là những chỉ thị protein Mỗi protein là sản phẩm biểu hiện của một hay một vài gene, do vậy người ta dựa vào điều này để tìm ra những chỉ thị Dựa vào hàng loạt những enzyme giống nhau được mã hóa bởi những allen khác nhau nằm cùng trên một locus Do sự khác nhau về điện tích của aminoacid, allozyme có thể được phân tách bằng điện di Nhiều enzyme bất biến trong quần thể và hầu hết sự đa hình của những enzyme này chỉ do một vài biến đổi nhỏ Kết quả mà chỉ thị allozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do có số lượng chỉ thị có thể phát hiện được nhiều hơn, tuy nhiên số lượng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng

2.2.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA

Là những chỉ thị phân tử DNA được tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử Có thể nói rằng kể từ khi con người biết đến sự hiện diện của gene và khi Watson và Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinh học phân tử được phát minh ngày càng nhiều và càng ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho

công tác nghiên cứu khoa học do số lượng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với 2 loại chỉ thị trên (Tansley và ctv, 1980), độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều Càng ngày người ta càng tìm ra được nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị, tuy nhiên có thể được chia ra làm 2 nhóm:

 Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…

 Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP [1] [8]

2.2.2 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lượng và kích thước của những đoạn DNA được tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống được nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA được cắt ra này được lai với những probe được đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả được quan sát qua màu huỳnh quang phát ra Sử dụng đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tượng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [1]

2.2.3 Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism)

Kỹ thuật này dựa trên giả thuyết: sự khác biệt giữa các DNA do sự thay đổi cấu trúc của dây đơn DNA có cấu trúc hình học khác nhau, làm cho DNA dịch chuyển trên gel với tốc độ và khoảng cách di chuyển khác nhau Sau khi thực hiện phản ứng PCR, làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di và nhuộm bạc Kỹ thuật SSCP có quy trình thực hiện khó nhưng kết quả có độ tin cậy không cao [1]

2.2.4 Kỹ thuật STS (Sequence – Tagged Sites)

Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, dựa trên nguyên lý: Trình tự một đoạn DNA chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu lần và phát hiện qua điện di [6] Kỹ thuật này có nhược điểm là phải biết trình tự gene của đối tượng nghiên cứu

2.2.5 Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat)

Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: Giữa những giống khác nhau có một đoạn DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides được lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng các primer chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên Điều quan trọng là phải biết được những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng giống Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu được dùng để định danh những giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền [6]

2.2.6 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiếu dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội [1] [6]

Nguyên lý của kỹ thuật RAPD được minh họa trong hình 2.1

Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật RAPD 2.2.6.1 Các bước tiến hành kỹ thuật RAPD

 Bước 1: Tách chiết DNA

DNA được tách chiết có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy nhiều)

5` 5`

5*

3`

3` 3`

Primer ngẫu nhiên

Thực hiện PCR với những primer ngẫu nhiên

Sau phản ứng PCR, kết quả đem điện di phát hiện band

Sử dụng phương pháp của Doyle và Doyle (1988) [1] [13] Phương pháp này sử dụng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) – một chất tẩy cation hình thành phức hợp với những polysaccharide, protein, polyphenol,… Phức hợp này sau đó được tách ra khỏi dung dịch tách chiết bằng hỗn hợp chloroform – isoamyl alcohol, bằng cách hình thành 2 pha: pha thứ nhất là dung dịch sạch ở phía trên có chứa DNA, pha thứ hai đặc hơn ở dưới chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…) Sau khi ly tâm, thu được DNA

Thông thường quy trình ly trích DNA ở thực vật gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân Tế bào lá được nghiền với dịch trích EB (extraction buffer) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng các thành phần có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích

Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác (polysaccharides, polyphenols, lipids,…)

Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100 %, thường tủa bằng isopropanol lạnh trước, sau đó tiếp tục tủa bằng ethanol 100 % kết hợp với muối

Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: DNA bị phân hủy hoặc bị gãy

Có RNA trong mẫu DNA

Có polysaccharide trong mẫu DNA Có polyphenol trong mẫu DNA

Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA được trình bày trong bảng 2.6

Bảng 2.6 Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA

những enzyme phân hủy (như enzyme DNase hoạt động ở pH=7)

phân hủy DNA

kết tủa và rửa sạch DNA -Bảo vệ DNA

hexadecyltrime-bromide

thylammonium-Chất tẩy cation -Hòa tan màng tế bào -Biến tính protein

-Thành lập phức hợp với những protein, polysaccha-ride

ß-mercaptoetha-Tác nhân phá hủy màng nhân và kháng lại sự oxi hóa

-Ức chế quá trình oxi hóa -Phá vỡ màng nhân

-Bảo vệ DNA khỏi những quinone, disulfite, peroxi-dase, polyphenoloxydase

-Rửa sạch DNA Có thể gây hại cho DNA do vậy phải kết hợp với muối

gây hại cho DNA do ở nồng độ thấp

 Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác

 Bước 3: Điện di phát hiện: Kết quả PCR – RAPD được điện di trên gel agarose

2.2.6.2 Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD

 Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao Thời gian thực hiện nhanh Khả năng nhân bản cao

 Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [6]

2.2.6.3 Những hạn chế của kỹ thuật RAPD

 Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp)

 Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao [1] [6]

2.2.6.4 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:

 Đánh giá đa dạng di truyền: Đã được áp dụng trên các đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,…

 Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gene RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1999) [1] [6]

 Xây dựng bản đồ gene: Sử dụng phương pháp BSA kết hợp kỹ thuật RFLP và RAPD lập bản đồ gene tms – 1 của dòng lúa TGMS (5460S) (Wang và ctv, 1995) [1] [6]

2.2.7 Kỹ thuật AFLP

2.2.7.1 Nguyên lý kỹ thuật AFLP

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa hình chiều dài những đoạn DNA được nhân bản) là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1993) phát minh ra, sau đó được Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt được thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR được thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA được cắt giới hạn từ bộ gene của đối tượng nghiên cứu Những đoạn DNA được nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 basepairs Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao [1] [6] [17] [18] Nguyên

lý kỹ thuật AFLP được trình bày trong hình 2.2

Hình 2.2 Nguyên lý kỹ thuật AFLP

2.2.7.2 Các bước của kỹ thuật AFLP [17]

Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bước cơ bản:

 Bước 1: Tách chiết DNA Tương tự như ở kỹ thuật RAPD, tuy nhiên chất lượng DNA sử dụng cho kỹ thuật AFLP phải tốt hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD

 Bước 2: Cắt giới hạn và gắn adapter Bước này gồm có hai giai đoạn:

Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn bằng 2 enzyme cắt

Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ xung với những đoạn DNA vừa được cắt Mục đích để tạo ra những khuôn DNA có trình tự 2 đầu đã biết, để trong 2 phản ứng PCR sau này người ta sử dụng những primer có trình tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn

Để không cho các đoạn DNA vừa được cắt ra không bắt cặp lại với nhau, giai đoạn cắt và gắn adapter được thực hiện đồng thời và được coi như một bước

 Bước 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification)

Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn adapter từ bước 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bước 2 và cộng thêm 1 nucleotide ở đầu 3’

Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter MseI + 1 nucleotide (thường là C)

Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter EcoRI + 1 nucleotide (thường là A)

Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp những đoạn DNA được cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lượng của những đoạn có thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn lọc) Với việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt được nhiều đoạn có gắn với adapter

Bước này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %  Bước 4: Nhân bản chọn lọc (Selective amplification)

Thực hiện phản ứng PCR thứ hai sử dụng các primer nhân bản chọn lọc có trình tự tương tự như primer nhân bản tiền chọn lọc, cộng thêm 2 hay 3 nucleotide ở đầu 3’ Mục đích chính của bước này nhằm chọn lọc tối đa các đoạn DNA đã được cắt giới hạn và gắn adapter đã được nhân bản ở bước 3, chỉ nhân bản những đoạn DNA có trình tự 2 đầu hoàn toàn bổ xung với trình tự của các primer nhân bản chọn lọc, qua đó làm giảm nhiều độ phức tạp của kết quả

Primer nhân bản chọn lọc MseІ = trình tự bổ xung với trình tự của adapter MseI + 2 hay 3 nucleotide

Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ xung với trình tự của adapter EcoRI + 3 nucleotide + chất phát màu huỳnh quang (giúp phát hiện sản

phẩm khi điện di)

Bảng 2.7 Những primer EcoRІ nhân bản chọn lọc

Những primer EcoRІ nhân bản chọn

lọc dùng cho bộ gene có kích thước lớn

Những primer EcoRІ nhân bản chọn

lọc dùng cho bộ gene có kích thước nhỏ

EcoRІ-ACT FAM EcoRІ -ACA FAM EcoRІ -AAC NED EcoRІ -ACC NED EcoRІ -AGC NED EcoRІ -AAG JOE EcoRІ -AGG JOE EcoRІ -ACG JOE

EcoRІ-TG FAM EcoRІ-TC FAM EcoRІ-AC FAM EcoRІ-TT NED EcoRІ-AT NED EcoRІ-TA JOE EcoRІ-AG JOE EcoRІ-AA JOE

Bảng 2.8 Những primer MseI nhân bản chọn lọc

Những primer MseІ nhân bản chọn lọc

MseІ-CAA MseІ-CAC MseІ-CAG MseІ-CAT MseІ-CTA MseІ-CTC MseІ-CTG MseІ-CTT

 Bước 5: Điện di và phân tích kết quả

Kết quả AFLP có thể được điện di trên máy giải trình tự gene hay điện di trên gel polyacrylamide

Nguyên lý hoạt động của máy giải trình tự: Khi sử dụng máy giải trình tự để điện di, các sản phẩm của phản ứng nhân bản chọn lọc sẽ được hút qua những ống mao quản có đường kính rất nhỏ, bên trong có polymer Trong phản ứng nhân bản

chọn lọc, các primer EcoRI có gắn chất phát huỳnh quang trước đó, vì vậy khi các sản

phẩm nhân bản chọn lọc đi qua một camera laser, chúng sẽ phát màu, khi đó một đầu dò cực nhạy sẽ thu nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra này và truyền tín hiệu về máy tính sử lý Độ dài của các đoạn được nhân bản chọn lọc sẽ được tính toán dựa vào vị trí tương đối của chúng với những band chuẩn có kích thước đã biết Kết quả điện di trên máy giải trình tự cho độ chính xác rất cao, có thể phân biệt các band chỉ chênh lệch nhau đến vài nucleotide [17]

2.2.7.3 Những ƣu điểm của kỹ thuật AFLP

 Kỹ thuật AFLP phù hợp cho tất cả các đối tượng nghiên cứu là thực vật, động vật và vi sinh vật mà không cần biết trước trình tự bộ gene

 Không giống như kỹ thuật RAPD sử dụng những primer ngắn và nhân bản một cách ngẫu nhiên, cho kết quả có độ tin cậy không cao, kỹ thuật AFLP sử dụng 2 primer dài, cho kết quả đáng tin cậy và ổn định (kết quả giống nhau khi được lập lại nhiều lần) do điều kiện thực hiện 2 phản ứng PCR nghiêm ngặt

 Kết quả AFLP có thể được điện di trên máy giải trình tự gene có độ phân tách các band cao giúp phát hiện hầu hết những đoạn được nhân bản chọn lọc có độ dài gần bằng nhau mà khi điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide khó phát hiện được

 Khả năng xuất hiện đa hình lớn, nhận diện được chỉ thị trội với độ tin cậy cao Đánh giá đa dạng di truyền với độ tin cậy cao

 Sử dụng một lượng ít DNA so với RFLP [17]

2.2.7.4 Những hạn chế của kỹ thuật AFLP

 AFLP là kỹ thuật mới nên chưa được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu Chi phí tiến hành cao và thiết bị phức tạp nên chưa thể thay thế hoàn toàn các kỹ thuật khác, đặc biệt là với các đối tượng nghiên cứu hoàn toàn mới

 Thao tác thực hiện khó, cần có đội ngũ chuyên viên được đào tạo lành nghề

2.2.7.5 Ứng dụng của kỹ thuật AFLP

Kỹ thuật AFLP được sử dụng cho những công việc:  Đánh giá đa dạng di truyền

 Nhận diện chỉ thị phân tử  Xây dựng bản đồ gene

2.2.8 So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử

Việc chọn lựa một kỹ thuật sinh học phân tử để sử dụng phải căn cứ vào nhiều yếu tố, cụ thể như những ưu và khuyết điểm của kỹ thuật đó hay tùy thuộc vào tình hình nghiên cứu thực tế, tuy nhiên các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử có thể được so sánh một cách tương đối theo những tiêu chí như bảng 2.9

Bảng 2.9 So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử

Số lượng thông tin Khả năng đáng tin cậy Độ phân giải

Cách tiến hành Thời gian tiến hành

Cao Cao Cao Vừa phải

Ngắn

Cao Biến đổi Vừa phải

Dễ Ngắn

Cao Cao Cao Khó (*)

Dài (*)

Thấp Cao Cao Khó Dài

Thấp Cao Vừa phải

Dễ Ngắn

(*): Khi chưa phát hiện được trình tự primer Nếu đã có trình tự primer thì thời gian tiến hành ngắn và cách thức tiến hành dễ (Theo Hillis và ctv, Karp và Edwards, 1998) [17]

2.2.9 Kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản nhanh chóng một chuỗi DNA khuôn thành hàng triệu bản giống hệt nhau và giống hệt chuỗi DNA khuôn qua vài chục chu kỳ nhiệt độ luân chuyển liên tục, sử dụng các primer bắt cặp bổ sung với chuỗi DNA khuôn, enzyme polymerase gắn các dNTPs vào với nhau theo một trình tự bổ xung với trình tự của chuỗi DNA khuôn, bắt đầu từ đầu 3’ của các primer [1] [5] [6] [8] [10] [11] [12] [14]

2.2.9.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR

Được miêu tả qua 3 giai đoạn:

 Giai đoạn 1 – Biến tính (denature): Biến tính DNA mạch đôi ở nhiệt độ cao (khoảng 92oC – 96oC) tạo những khuôn DNA mạch đơn có độ dài bằng nhau và bằng DNA mạch đôi tạo ra nó

 Giai đoạn 2 – Bắt cặp (annealing): Gắn các primer vào các khuôn DNA mạch đơn (tạo ra ở giai đoạn 1), dựa trên nguyên tắc bổ sung Primer là các oligonucleotide có khoảng 10 – 25 nucleotide, có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn nào đó trên DNA khuôn Giai đoạn này thường được tiến hành ở nhiệt độ 50o

C – 56oC

 Giai đoạn 3 – Kéo dài (extension): kéo dài mạch đơn DNA bắt đầu từ nucleotide cuối cùng của primer ở đầu 3’ do tác dụng của enzyme polymerase gắn các nucleotide vào với nhau, theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (A – T, G – C) với những nucleotide của mạch khuôn (DNA template) Kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu sẽ cho 2 phân tử DNA hoàn toàn giống nhau và giống với phân tử DNA ban đầu về chiều dài và trình tự các nucleotide Giai đoạn này thường được tiến hành ở 70oC – 72oC

Phản ứng PCR được tiến hành với sự hiện diện của: đoạn DNA khuôn (DNA template), các dNTPs, enzyme polymerase, các primer, MgCl2, dung dịch đệm (buffer) và máy thermocycler – máy điều khiển chu kỳ nhiệt độ, thực hiện duy trì và luân chuyển nhiệt độ của từng giai đoạn một cách chính xác và ổn định trong một khoảng thời gian chính xác trong 30 – 45 chu kỳ

Nguyên lý kỹ thuật PCR được trình bày trong hình 2.3 và hình 2.4

Hình 2.3 Nguyên lý kỹ thuật PCR

2.2.9.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR

Tiến hành qua 25 – 35 chu kì, trong điều kiện nhiệt độ và nồng độ các chất:  Nồng độ các chất trong hỗn hợp PCR:

Nồng độ enzyme: thường sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/25 μl dung

dịch phản ứng Nếu như nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp

thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme

Các dNTPs: Hàm lượng các dNTPs trong khoảng 20 – 200 μM cho kết quả ổn định và đặc hiệu Bốn loại dNTPs (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tương đương nhau

Hàm lượng MgCl2: Nồng độ tối ưu của MgCl2 cho kết quả PCR tốt Ion Mg+ có thể ảnh hưởng đến:

- Nhiệt độ để biến tính mạch đôi thành mạch đơn

Nguyên lý kỹ thuật PCR

Từ 30 – 45 chu kỳ

Bước 1: Biến tính

Bước 2: Bắt cặp

Bước 3: Nối dài

- Quá trình bắt cặp của primer: MgCl2 làm tăng khả năng bắt cặp chính xác của primer với DNA template

- Sự đặc hiệu của sản phẩm PCR: bao gồm cả sự bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn và sự nối dài chính xác

- Hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả Thông thường hàm lượng ion Mg+

cần thiết từ 0,5 – 2.5 mM  Chu trình nhiệt:

Ban đầu thiết lập một giai đoạn nhiệt độ khoảng 94oC trong 5 phút để hầu như tất cả các đoạn DNA khuôn mạch đôi bị biến tính tách ra thành 2 DNA khuôn mạch đơn phân biệt và không tự bắt cặp lại với nhau

Nhiệt độ biến tính: 94oC – 96oC trong 15 giây hay lâu hơn, các sản phẩm của chu kỳ PCR trước tiếp tục bị làm biến tính để thành DNA khuôn mạch đơn cho chu kỳ PCR tiếp theo

Nhiệt độ bắt cặp: 55oC (50oC – 56oC) trong 30 giây Nhiệt độ bắt cặp là quan trọng nhất, bảo đảm rằng không quá thấp (do dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu) và cũng không quá cao (dẫn đến khó bắt cặp hoàn toàn hay không bắt cặp)

Nhiệt độ nối dài: 72oC trong 90 giây Thời gian kéo dài phải đủ để có thể kéo dài hoàn toàn một trình tự và hầu hết các đoạn DNA khuôn mạch đơn, nếu không sẽ dẫn đến những kết quả sai lầm do không đủ thời gian để nối dài

Ba bước này lặp lại khoảng 30 – 45 chu kỳ

Chu kì cuối cùng kết thúc bằng một khoảng thời gian nối dài ở 72oC trong 5 phút Sản phẩm PCR sau đó sẽ được bảo quản ở 4oC hay –20oC

2.2.9.3 Tối ƣu hoá phản ứng PCR

Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trưng riêng Các biện pháp tối ưu đó liên quan đến những vấn đề:

 Trình tự của primer: Theo nguyên tắc, primer càng dài sự bắt cặp càng chuyên biệt và ngược lại Mục đích của việc thiết kế primer là có được sự cân bằng giữa sự chuyên tính (bắt cặp hoàn toàn bổ xung giữa những nucleotide của primer với những nucleotide của DNA template) và hiệu quả của PCR (tạo ra càng nhiều sản phẩm gần với lý thuyết tính toán càng tốt) Trình tự của primer xác định kích thước, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ước lượng được nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thường chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs)

 Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thường khoảng 200 μM

 Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR Không nên sử dụng enzyme ở nồng độ cao hơn 2,5 nM (1,25 U/25 μl)

 Chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thường là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA

 Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dư thừa

 Tỉ lệ primer/DNA template: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng dimer – primer sẽ xuất hiện do lượng DNA template thấp và lượng primer quá cao Ngược lại sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản

3.1.1.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Thực hiện việc thu thập mẫu lá cây điều trên địa bàn tỉnh Bà

Rịa – Vũng Tàu Giai đoạn thu thập mẫu được thực hiện từ 20/02/2005 – 11/03/2005

 Giai đoạn 2: Thực hiện tách chiết DNA, kỹ thuật RAPD và kỹ thuật AFLP tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực Vật và Vi Sinh Vật, Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh, Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM Giai đoạn thực hiện

trong phòng thí nghiệm được thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005 3.1.2 Hóa chất cần thiết

3.1.2.1 Hóa chất dùng cho tách chiết và kiểm tra DNA lá điều

 Dung dịch chloroform – isoamyl alcohol (CIA) có tỉ lệ chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1

 RNase (10 mg/ml) – enzyme phân huỷ RNA  Dung dịch isopropanol lạnh

 Sodiumacetate 3 M

 Ethanol 96 % và ethanol 70 %  Agarose

 TAE (Tris – Acetate – EDTA)

 Dịch tách chiết EB (Extraction buffer), pha 100 ml (bảng 3.1)

Bảng 3.1 Thành phần và cách pha EB

Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 100 ml)

CTAB

(hexade-cyltrimethylammoniumbromide) EDTA 0,5 M

Mercaptroethanol NaCl 5 M

Tris – HCl 0,5 M Nước

2 g

4 ml 1 ml 28 ml 20 ml

1 ml 0,2 ml

 Loading dye  Ethidiumbromide

 Nước cất siêu sạch khử ion

3.1.2.2 Hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR – RAPD

 Bộ Taq polymerase (Biorad) và Taq polymerase (ABgene) gồm: Taq

polymerase, MgCl2 và Taq buffer

 Nước cất siêu sạch khử ion, chiếu tia UV

3.1.2.3 Hóa chất dùng cho kỹ thuật AFLP (Applied Biosystem)

 2 enzyme cắt: EcoRI và MseI

 Dung dịch đệm 5 X (50 mM Tris – HCl pH 7,0; 50 mM MgAc; 250 mM KAc)

 2 adapter: EcoRI adapter và MseI adapter

 ATP 10 mM  T4 DNA ligase

 Core mix Pre – selective amplification

 2 primer nhân bản tiền chọn lọc: EcoRI và MseI

 Core mix Selective amplification

 Primer EcoRI nhân bản chọn lọc  Primer MseI nhân bản chọn lọc

 Nước cất siêu sạch, khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV  Hidi

 Polyacrylamide

 Thang chuẩn Gene Scan

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

3.1.3.1.Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho tách chiết và kiểm tra DNA

 Chày cối nghiền mẫu (Đức)  Cân điện tử (Ohaus, Mỹ)  Ống eppendorf 1,5 ml (Pháp)

 Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl, 10 μl – 100 μl và 100 μl – 1000 μl (Nichiryo, Nhật)

 Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl, 10 μl – 100 μl và 100 μl – 1000 μl (Đức)  Bao tay (Malaysia)

 Máy vi ly tâm 14.000 vòng/phút (Hettich, Đức)  Tủ sấy (Anh)

 Tủ ủ mẫu (Anh)

 Tủ – 20oC (Sanyo, Nhật)  Nồi hấp autoclave (Nhật)

 Máy điện di (Biorad, Thụy Điển và Cosmo Bio Co, Nhật)  Máy vortex (Đức)

 Tủ hút, tủ cấy vô trùng (Việt Nam / Anh)

 Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad, Thụy Điển)  Giếng đổ gel

3.1.3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật PCR – RAPD

 Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl  Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl  Bao tay

 Tủ hút (Việt Nam / Anh)

 Tủ lạnh các loại (Nhật)  Ống eppendorf 200 μl

 Máy PCR PTC Thermocycle 100  Giếng đổ gel

 Máy điện di (Biorad)

 Máy chụp hình DNA Geldoc

3.1.3.3 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật AFLP

 Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl  Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl  Đá gel, bao tay

 Tủ hút

 Tủ lạnh các loại  Ống eppendorf 200 μl  Giếng đổ gel

 Máy điện di

 Máy chụp hình DNA Geldoc

 Máy PCR Biorad (Biorad, Thụy Điển)

 Bộ máy sequencing AB 3100 (Applied Biosystems, Mỹ)

3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phần thu thập mẫu

Thực hiện thu thập mẫu lá điều của những cây điều đặc biệt và điển hình

3.2.1.1 Phương pháp chọn mẫu

Tiến hành thu thập mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và điển hình trong vườn của những nông hộ được khảo sát theo mẫu in sẵn (xem phụ lục)

Lựa chọn nông hộ để khảo sát một cách ngẫu nhiên Những đặc điểm nổi bật được chọn chủ yếu gồm:

 Năng suất: cao hay thấp

 Ra hoa: nhiều hay ít, sớm hay muộn, một đợt hay nhiều đợt, nở đồng loạt hay phân tán

 Chùm: nhiều hay ít, một chùm có nhiều hay ít hạt  Hạt: to hay nhỏ, màu sắc hạt

 Thân và cành cây: sum suê hay thưa thớt  Hiện tượng rụng trái non: nhiều hay ít  Quả: to hay nhỏ, màu sắc, ngon hay dở  Khả năng chống chịu sâu hại: cao hay thấp  Khả năng chống chịu bệnh: cao hay thấp

3.2.1.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

Sau khi chọn được cây điều có những đặc điểm nổi bật đáng quan tâm, chúng tôi tiến hành lấy mẫu lá Lấy khoảng 4 – 5 lá còn non hay lá đã trưởng thành, không lấy lá đã già, chọn những lá tốt, không bị rách hay bị sâu hại, lau sạch rồi cho vào bọc nilon đã ghi đầy đủ thông tin về mẫu và được giữ mát trong thùng đá Sau đó mẫu được giữ trong ngăn đá tủ lạnh và sau vài ngày chúng tôi đem mẫu giữ ở tủ –20o

C tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM

3.2.2 Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm

Trong phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành những công việc:

 Thực hiện tách chiết và kiểm tra DNA của các mẫu lá điều thu thập được  Thực hiện kỹ thuật RAPD

 Thực hiện kỹ thuật AFLP

3.2.2.1 Phương pháp tách chiết và kiểm tra DNA lá điều

 Phương pháp tách chiết: Tách chiết DNA dựa trên phương pháp của Doyle và Doyle (1988) Phương pháp này dựa vào tính chất của CTAB như đã trình bày Quy trình tách chiết gồm 12 bước:

Bước 1: Cân 0,2.g lá đã rửa sạch cho vào cối nghiền mẫu, cho vào 1,2.ml dịch trích EB để nghiền lá với dung dịch này Vortex kỹ Ủ ở 65oC trong 45 phút

Bước 2: Thêm 500 μl chloroform:isoamylalcohol (24:1), vortex 10 phút, li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 10o

C

Bước 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bước 2

Bước 4: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 μl RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ

Bước 5: Thêm vào 250 μl dung dịch isopropanol lạnh Để tủa ở –200C trong khoảng 1 giờ (nên để qua đêm)

Bước 6: Ly tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 10oC Đổ bỏ dịch trong Bước 7: Cho vào 300 μl TE 1X, ủ 37oC trong 1 giờ

Bước 8: Thêm 20 μl muối sodium acetate 3 M và 640 μl ethanol 96 % (hay 100 %), trộn đều và để –20oC trong 30 phút

 Phương pháp kiểm tra DNA: Có 2 phương pháp kiểm tra DNA:

Phương pháp đo mật độ quang phổ: Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối chính xác lượng DNA cũng như chất lượng DNA có trong mẫu kết

quả thu được Kết quả nếu giá trị tỉ số OD260 nm/OD280 nm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì mẫu DNA tương đối sạch, có thể sử dụng được cho phản ứng PCR Định lượng DNA theo công thức:

Lượng DNA (ng/μl) = ( 62,9 x OD260 nm –36 x OD280 nm) x n với “n” là hệ số pha loãng

Phương pháp điện di: Phương pháp này cho phép ta đánh giá chất lượng DNA (có bị gãy nhiều hay không, có bẩn không,…) tuy nhiên không cho biết nồng độ của DNA thu được hay độ sạch của dung dịch DNA một cách chính xác Điện di bằng gel agarose 1,0 % Kết quả được đọc trên máy UV

3.2.2.2 Kỹ thuật RAPD

Tiến hành kỹ thuật PCR – RAPD với các primer (bảng 3.3)

Bảng 3.3 Các primer sử dụng cho kỹ thuật PCR – RAPD

Primer 1 5’TGCCGAGCTTG 3’ ; Tm = 40,7oC; MW = 3.044 Primer 2 5’AGTCAGCCAC 3’ ; Tm = 34,3oC; MW = 2.997 Primer 9 5’GGTACTCCCC 3’ ; Tm = 33,9oC; MW = 2.964 Primer 11 5’GAGACGCACA 3’; Tm = 35,3oC; MW = 3.046

Trong quá trình thực hiện chúng tôi bố trí một số thí nghiệm nhằm tìm ra quy

trình thực hiện kỹ thuật PCR – RAPD phù hợp cho cây đìều:

 Thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình do Samal và ctv (2003) đưa ra, thành phần hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt độ của thí nghiệm 1 được trình bày trong bảng 3.4 Thực hiện với 4 primer: 1; 2; 9 và 11