Nghiên cứu thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học hai loài thực vật thuộc chi ráng (drynaria) họ dương xỉ (polypodiaceae)

Chính vì vậy việc nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên định hướng vào hoạt tính sinh học ngày càng được chú ý[15].. Tại Việt Nam các cây thuốc thuộc chi ráng, Drynaria thường được

VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

VIỆN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

PHẠM THỊ NHẬT TRINH

Chuyên ngành : Hoá học các Hợp chất thiên nhiên

Mã số : 62.44.01.17

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

1 GS.TSKH Nguyễn Công Hào

2 TS Phan Thanh Thảo

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ

công trình nào khác

Tác giả luận án

Phạm Thị Nhật Trinh

Hình 1.1: Cây bổ cốt toái 2

Hình 1.2: Cây tắc kè đá 3

Hình 4.1: Tương quan HMBC trong nhóm 3- metyl-2- butenyl 62

Hình 4.2: Sự ghép spin của các proton trong vòng C 63

Hình 4.3: Tương quan HMBC trong nhóm 4- metyl-3- pentenyl 65

Hình 4.4: Tương quan HMBC giữa các nhóm hexyl, vinyl, và nối đôi trans 66

Hình 4.5: Tương quan HMBC trên vòng A 75

Hình 4.6: Tương quan HMBC giữa vòng benzen với nối đôi ngoài vòng của DFC II 77

Hình 4.7: Tương quan HMBC của vòng thơm và nối đôi ngoài vòng của DFC III 79

Hình 4.8 : Tương quan HMBC trên khung anthraquinon của DFA VI 89

Hình 4.9: Tương quan HMBC của DFM V 95

Hình 4.10 : Tương quan HMBC trên khung anthraquinon của DBH I 97

Hình 4.11: Khung căn bản của DBA IV 111

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các hợp chất đã được phân lập từ chi Drynaria 16

Bảng 1.2: Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR của một số khung flavonoid 25

Bảng 1.3: Độ dịch chuyển hóa học 13C NMR của một số khung flavonoid 26

Bảng 3.1: Khối lượng của các loại cao và hiệu suất (so với cao etanol ban đầu) của hai đối tượng khảo sát 34

Bảng 3.2: Kết quả sắc ký cột silica gel cao eter dầu hỏa (50,0 g)-Drynaria fortunei 35

Bảng 3.3: Kết quả sắc ký cột silica gel cao clorofrom (20,4 g)-Drynaria fortunei 35

Bảng 3.4: Kết quả sắc ký cột silica gel cao etyl acetat (20,0 g)-Drynaria fortunei 36

Bảng 3.5: Kết quả sắc ký cột silica gel cao metanol (143,0 g)-Drynaria fortunei 36

Bảng 3.6: Kết quả sắc ký cột silica gel cao hexan (47,0 g)-Drynaria bonii 36

Bảng 3.7: Kết quả sắc ký cột silica gel cao cloroform (18,7 g)-Drynaria bonii 37

Bảng 3.8: Kết quả sắc ký cột silica gel cao etyl acetat (10,2 g)-Drynaria bonii 37

Bảng 3.9: Kết quả sắc ký cột silica gel cao metanol (110,0 g)-Drynaria bonii 38

Bảng 3.10 Khối lượng và hiệu suất các hợp chất phân lập được 41

Bảng 3.11: Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hoá 56

Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm của cao chiết đến sự phát triển tế bào MG63 57

Bảng 3.13 Kết quả thử nghiệm chất tinh khiết đến sự phát triển tế bào MG63 58

Bảng 3.14: Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 60

Bảng 4.1: So sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DFH III với phổ 1H-NMR và 13C-NMR của bakuchiol 66

Bảng 4.4: Bảng so sánh số liệu phổ 1

H-NMR và 13C-NMR của DFH VI với phổ 1NMR và 13C-NMR của myristin 73 Bảng 4.5: Số liệu phổ NMR của DFCII, DFCIII và DFCV 81 Bảng 4.6: Bảng so sánh số liệu phổ 1

H-H-NMR và 13C-NMR của DFA III với phổ 1NMR và 13C-NMR của cycloeucalenol 85Bảng 4.7: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của DFA V với phổ 1H-NMR và 13C-NMR của cycloartanol 87Bảng 4.8: So sánh số liệu phổ NMR của DFM II với các phổ tương ứng của liquiritin 91Bảng 4.9: Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của DFM V 95Bảng 4.10: Bảng so sánh số liệu phổ 1

H-H-NMR và 13C-NMR của DBH III với phổ 1NMR và 13C-NMR của -tocopherol 99Bảng 4.11: Bảng so sánh số liệu phổ 1

H-H-NMR và 13C-NMR của DBH IVB với phổ

1H-NMR và 13C-NMR của 24-metylencycloartan-3β-ol 101Bảng 4.12: So sánh số liệu phổ 13C-NMR của DBH IVC với phổ 13C-NMR của

triphyllol 104Bảng: 4.13: Số liệu phổ 1

H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của DBC I 106Bảng 4.14: Bảng so sánh số liệu phổ 13C-NMR của DBM V với phổ 13C-NMR của

etyl β-D-fructopyranosid 116

Bảng 4.15a: Bảng so sánh số liệu phổ 13

C-NMR của DBM VI với phổ 13C-NMR của 1-O--D-glucopyranosyl-(2S, 3R , 4E, 8Z)-2-[(2-hydroxyoctadecanoyl) amino]-4,8-octadecadien-1,3-diol 119Bảng 4.15b: Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR của DBM VI với phổ 1H-NMR của 1-O--D-glucopyranosyl-(2S, 3R, 4E, 8Z)-2-[(2-hydroxyoctadecanoyl) amino]-4,8-octadecadiene-1,3-diol 120Bảng 4.16: tổng hợp các chất đã phân lập được từ cây bổ cốt toái và tắc kè đá 121

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Qui trình điều chế cao và phân lập các hợp chất từ cây bổ cốt toái 39

Sơ đồ 3.2: Qui trình điều chế cao và phân lập các hợp chất từ cây tắc kè đá 40

1H-NMR Proton Magnetic Resonance

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

CFU Colony Forming Unit Số đơn vị khuẩn lạc

DEPT Distortionless Enhancement by

spectrometry

Phổ khối lượng phun mù điện

tử

GC-MS Gas chromatography- mass

spectrometry

Sắc ký khí ghép khối phổ

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

ODS Octadecylsilyl silica gel Silica gel C-18

Rp 18 Reversed phase C-18 Silica gel pha đảo C-18

SC Scavenging capacity Khả năng bắt gốc tự do

TLC Thin layer chromatography Sắc ký bản mỏng

ddd Doublet of doublet of doublet Mũi đôi đôi đôi

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium Môi trường DMEM

mỗi khi ốm đau họ biết sử dụng những loài thực vật để chữa bệnh, và cũng biết tránh những loài có tác dụng độc Ban đầu là kinh nghiệm vận dụng các qui luật và giá trị của tài nguyên để chữa bệnh Dần dần hình thành các nền y học mà ngày nay các nhà khoa học gọi là y học cổ truyền dân tộc, tri thức về thảm tài nguyên dược liệu gọi là thực vật học dân tộc, còn các hiểu biết về tác dụng của cây cỏ được gọi là dược lý học dân tộc [5,7]

Khoa học ngày càng phát triển, con người càng đi sâu khám phá thế giới tự nhiên Các nhà khoa học nhận thấy rằng “sinh vật là nhà hóa học tuyệt vời” giỏi hơn

cả các nhà hóa học trong việc tổng hợp các chất tự nhiên Qua hàng triệu năm, sinh vật đã tự tổng hợp các chất để đáp ứng nhu cầu đặc biệt cho sự tồn tại của mình như hidrudin của đĩa để chống đông máu Sau này loài người đã sử dụng hợp chất này

để điều trị các bệnh tắc nghẽn mạch máu Tương tự như vậy, loài người đã thành công trong việc tìm kiếm các thuốc vinblastin, vincristin từ cây dừa cạn, colchicin, conchamin từ một loài tỏi, hoặc các dẫn chất taxol từ thông đỏ Các chất chống oxy hóa màng tế bào như -caroten có trong cà rốt, gấc Quinin và artermisinin gần đây

đã rất có ích cho loài người Trong những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21, bệnh cúm gia cầm trở thành vấn đề toàn cầu, một lần nữa các chất có nguồn gốc thiên nhiên lại giúp cho loài người chống lại virus H5N1 Acid shikimic chiết xuất

từ hoa hồi, sau khi bán tổng hợp thành oseltamivir phosphat có khả năng phòng và chống lại căn bệnh này [11,12]

Việt Nam có nguồn tài nguyên động thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo Phạm Hoàng Hộ và Nguyễn Nghĩa Thìn, thực vật bậc cao có mạch đã thống

kê được là 10.500 loài, dự đoán khoảng 12.000 loài [3,7] Số loài cây thuốc đã thống

kê được ở Việt Nam là 3948 loài thuộc 307 họ thực vật, chiếm 37,6% số loài trong

tự nhiên Dân tộc Việt Nam có truyền thống từ lâu sử dụng cây cỏ trong công tác phòng và chữa bệnh Trong quá trình lịch sử khai thác và sử dụng các cây thuốc,

quên

Những năm gần đây, do nhu cầu phát triển kinh tế xã hội, môi trường tự nhiên

ở nhiều khu vực bị hủy hoại nghiêm trọng làm thu hẹp vùng phân bố và khả năng phát triển của không ít loài cây thuốc Bên cạnh đó nhiều loài cây thuốc bị khai thác thường xuyên với khối lượng lớn để thỏa mãn thu nhập kinh tế của người dân và yêu cầu thị trường trong và ngoài nước [11]

Vì vậy, thông qua việc khảo sát các đặc điểm hóa thực vật, dược tính … của cây thuốc, chúng ta có thể từng bước lý giải thích việc trị bệnh của thảo dược, đồng thời tiêu chuẩn hoá các bài thuốc cổ truyền nhằm sử dụng một cách hợp lý, có hiệu quả đồng thời góp phần bảo tồn cây thuốc dân tộc Chính vì vậy việc nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên nhiên định hướng vào hoạt tính sinh học ngày càng được chú ý[15] Tại Việt Nam các cây thuốc thuộc chi ráng, Drynaria thường được dân

gian sử dụng chữa trị các bệnh phong thấp, nhức mỏi, đau gân xương, bong gân, gãy xương[6]

… Tuy nhiên những nghiên cứu về hóa học cũng như hoạt tính sinh học về những loài này ở trong nước và trên thế giới không nhiều Với mục tiêu tìm hiểu thành phần hoá học và thử nghiệm một số hoạt tính sinh học, qua đó góp phần giải thích và làm sáng tỏ cơ chế trị bệnh của cây thuốc cổ truyền, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính sinh học các chất phân

lập được từ một số loài thuộc chi Drynaria tại Việt Nam.

Nội dung chính của luận án:

1 Phân lập các hợp chất tinh khiết từ thân rễ cây bổ cốt toái và tắc kè đá

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được

3 Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, chống oxy hóa và hoạt tính kích thích thích tế bào tạo xương MG63 các hợp chất phân lập được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Vài nét về chi Drynaria

Chi Drynaria có từ 15 đến 19 loài, sống và phân bố ở Châu Phi, Châu Á đến

Tây Bắc Châu Úc, trong đó có phổ biến và nhiều nhất ở Trung Quốc, được T Janssen và H Schneider phân loại thành các loài tiêu biểu sau [47]

+ Drynaria bonii + Drynaria laurentii

+ Drynaria descensa + Drynaria parishii

+ Drynaria involuta + Drynaria propinqua

+ Drynaria spasisora + Drynaria pleuridioides

+ Drynaria quercifolia + Drynaria rigidula

+ Drynaria delavayi + Drynaria volkensii

+ Dryaria mollis + Drynaria willdenowii

+ Drynaria sinica A + Drynaria fortunei

+ Drynaria sinica B

1.2 Mô tả thực vật

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là hai loài chưa được khảo sát về thành phần

hóa học hoặc có ít công trình nghiên cứu thuộc chi Dyrania gồm: Drynaria fortunei (Kunze) J Sm và Drynaria bonii H Christ

1.2.1 Drynaria fortunei (Kunze) J Sm [13]

Bộ: dương xỉ (Polypodiales)

Họ: dương xỉ (Polypodiaceae)

Tên khoa học: Drynaria fortunei (Kunze) J Sm

Tên thông thường: cốt toái bổ, hộc quyết, cây thu mùn, co tạng tó (Thái ở Châu Quỳnh Nhai), co ín tó (Thái ở Điện Biên), Sáng viằng (Dao), đờ rờ (K’ho) Tên gọi khác: hầu khương, hồ tôn khương, thân khương, tổ rồng, tổ diều [11]

Cây bổ cốt toái sống riêng trên các hốc đá, mọc trên những đám rêu, hoặc sống trên các thân cây lớn như cây đa, cây si Cây sống lâu năm có thân rễ dày mẫm, phủ nhiều vảy màu vàng, bóng Có hai loại lá: lá bất thụ không cuống, màu

nâu, hình trứng dài 5 – 8 cm, rộng 3 – 6 cm, phía cuống hình tim, có thùy, gân nổi rõ; lá hữu thụ, màu xanh nhẵn, đơn xẻ thùy lông chim, dài 25 – 40 cm, cuống có dìa, có thùy thuôn tù ở đầu, dài 5 – 6 cm, có mạng, ổ tử nang nhiều, xếp thành một hàng ở mỗi bên gân chính, hình tròn không có áo tử nang [13]

Tên khoa học: Drynaria bonii H Christ

Tên gọi khác: co tạng tó, bổ cốt toái bon, ráng đuôi phụng bon, thu mùn ổ rả Cây tắc kè đá sống trên các hốc đá, trên đám rêu hay trên các cây lớn (cây đa, cây si, ) Cây sống lâu năm, có thân rễ dạng mầm, mọng nước, phủ nhiều vẩy màu vàng bóng Có 2 loại lá: loại lá bất thụ là lá không cuống, màu nâu, hình trứng, dài 5

- 8 cm, rộng 3 - 6 cm, phía cuống hình tim có gân nổi rõ; loại lá hữu thụ màu xanh

nhẵn, đơn, xẻ thùy lông chim, dài 25 - 40 cm, cuống lá có dìa, có thùy thuôn, tù ở đầu Các túi bào tử xếp hai hàng giữa gân phụ mặt dưới lá; bào tử vàng nhạt, hình trái xoan (hình 1.2)

Hình 1.2: cây tắc kè đá

1.3 Vùng phân bố, thu hái và chế biến

1.3.1 Drynaria fortunei (Kunze) J Sm [13]

Drynaria fortunei (Kunze) J Sm (Polypodiaceae) là một loại dương xỉ phân

bố rộng lớn ở các nước Châu Á như Lào, Trung Quốc, Việt Nam, Thái Lan,

Ở Việt Nam, bổ cốt toái mọc ở khắp núi đá, trên cây hay dọc suối vùng rừng núi

Việc thu hái có thể tiến hành quanh năm, vào những lúc ít công việc đồng áng thường vào các tháng 4 đến tháng 8 – 9

Cây bổ cốt toái được hái về, rửa sạch đất cát, trừ bỏ các lá sâu bệnh là dùng được Nếu dùng khô thì sau khi rửa sạch đất cát, hoặc phơi khô ngay, hoặc phơi

ngay sau khi đồ cho chín cho dễ bảo quản Muốn hết lông thường người ta đốt nhẹ cho cháy hết lông nhỏ phủ trên thân rễ

1.3.2 Drynaria bonii H Christ [6]

Trên thế giới cây thường gặp ở Trung Quốc, Lào,…

Ở Việt Nam cây thường mọc ở các vùng rừng Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Ðồng Nai, Lâm Ðồng, An Giang, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Hà Tây, Hòa Bình, Ninh Bình, Hà Tĩnh, Bình Định,…

Thân rễ cây tắc kè đá được thu hái quanh năm, nhưng thường là từ tháng 4 đến tháng 9

Thân rễ sau khi hái về được cạo bỏ sạch lông, thái nhỏ phơi khô, đốt nhẹ cho cháy hết lông nhỏ phủ trên thân rễ, khi dùng ủ thân rễ cho mềm, rồi tẩm mật hoặc rượu sao vàng Có thể cho vào nước đường nấu chín và phơi khô dùng dần

1.4 Thành phần hóa học

Cho đến hiện nay chỉ có vài công trình nghiên cứu về thành phần hóa học loài

Drynaria fortunei (Kunze) J Sm., riêng Drynaria bonii H Christ thì hoàn toàn chưa

có một nghiên cứu nào Cả hai loài Drynaria này đều chưa được nghiên cứu ở Việt

Nam Trong phần này chúng tôi trình bày thành phần hóa học của một vài loài thuộc

chi Drynaria đã được các tác giả ngoài nước nghiên cứu, vì giữa các loài cùng chi,

cùng họ sẽ có những đặc điểm chung về hóa-thực vật

1.4.1 Drynaria propinqua

Năm 1992, Liu Sonqing và cộng sự tại đại học dược Trung Quốc lần đầu tiên

đã phân lập được một hợp chất flavanol glucosid mới là (-)-epiafzelechin

3-O-D-allopyranosid (1) và các hợp chất acid 4-O-D-allopyranosyl caffeic (2); sistosterol 3-O-β-D-glucopyranosid (3) từ toàn cây Drynaria propinqua [73,94]

β-1.4.2 Drynaria quercifolia

Năm 2001, N Ramesh và cộng sự đã phân lập từ rễ khô cây Drynaria

quercifolia được các hợp chất friedelin (4); epifriedelinol (5); amyrin (6); sitosterol (7); β-sitosterol 3-O-β-D-glucopyranosid (3) và naringin (8) [68]

β-Năm 2007, Khan A và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất acetyllupeol (9)

và 3,4-dihydroxybenzoic acid (10) từ cây Drynaria quercifolia [53]

1.4.3 Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm

Năm 2003, Chang E.J và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết MeOH của thân rễ

Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm 8 hợp chất flavonoid: epiafzelechin (11); epiafzelechin 3-O-β-D-allopyranosid (12); (-)-epiafzelechin 3-O-(6”-O-acetyl)-β-D- allopyranosid (13); 4β-carboxymetyl-(-)-epiafzelechin metyl ester (14); 4β- carboxymetyl-(-)-epiafzelechin sodium salt (15); naringin (8); (-)-epiafzelechin (4β8)- 4β-carboxymetylepiafzelechin metyl ester (16) và (-)-epiafzelechin (4β8, 2βO7)-epiafzelechin-(4β8)-epiafzelechin (17) Trong đó có một số flavonoid

(-)-có hoạt tính phytoestrogen được ứng dụng điều trị chứng loãng xương ở phụ nữ mãn kinh [27]

Năm 2005, Wu X A và cộng sự khảo sát dịch chiết EtOH 75% cây Drynaria fortunei (Kunze) J Sm, đã phân lập được 3 hợp chất (-)-epiafzelechin 3-O-β- D-

allopyranosid (12); (-)-epiafzelechin (11) và β-sitosterol (7) [85]

Năm 2006, Li F và cộng sự nhận thấy dịch chiết etanol, etyl axetat và butanol

của thân rễ Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm có hoạt tính tạo xương Từ phân đoạn

cao chiết butanol dựa theo thử nghiệm hoạt tính 2 hợp chất có tính tạo xương đã

được phân lập là naringin (8) và neoeriocitrin (18) [59]

Năm 2008, Xin Luan Wang và các cộng sự đã phân lập được 11 hợp chất

flavonoid từ dịch chiết DFB (dịch chiết của 30% và 50% etanol) của cây bổ cốt toái, Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm, trong đó có 2 hợp chất mới là kaempferol 3-O-β- D-glucopyranosid-7-O-α-L-arabinofuranosid (19) và (2S)-5,7,3’,5’-

tetrahydroxyflavanon 7-O-neohesperidosid (20), cùng 9 hợp chất đã biết trong đó có

3 flavanon là (2R)-naringin (8); narigenin 7-O-β-D-glucosid (21); 5,7,3’,5’-tetrahydroxyflavanon 7-O-β-D-glucopyranosid (22), 1 flavon là luteolin 7- O-β-D-neohesperidosid (23), 1 flavonol là kaempferol 3-O-α-L-rhamnosyl-7-O-β- D-glucosid (24), 2 chromon là 5,7-dihydroxychromon 7-O-β-D-glucopyranosid (25)

(2S)-và (4H-1-benzopyran-4-on,7-2-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl oxy-5-hydroxy) (26), 1 maltol glucosid (27) và (-)-epicatechin (28) [79]

Năm 2010, Yong hong Liang và cộng sự đã phân lập 6 triterpenoid từ cao ete

dầu hỏa: chiranton (29), dryocrassyl acetat (30), fern-9(11)-en (31), hop-22(29)-en (32), isoglaucanon (33),dryocrassol (34), trong đó chiraton là triterpenoid mới[81].

Năm 2010, Xin Luan Wang và cộng sự đã cô lập được 8 hợp chất từ thân rễ

của cây Drynaria fortunei: narigenin (35), kushennol F (36), sphoraflavanon G

(37), kurarinon (38), leachianon A (39), 8-prenylkaempferol (40), kaempferol (41),

xanthogalenol (42) cùng 1 phenylpropanoid (acid 12-O-caffeoyldodecanoic) (43)

và 1 chalcon (3’-lavandulyl-4-methoxyl-2,2’,4’,6’-tetrahydroxylchalcon) (44) mới

caffeoyllaurat glyceryl (51) Trong đó (45) và (52) là hai hợp chất mới trong tự

nhiên [43]

Năm 2011, Wang Xin Luan và cộng sự cũng đã cô lập năm flavonoid:

narigenin (35), kurarinon (38), kushennol F (36), xanthogalenol (42) và sophoraflavanon G (37) [88]

27

29 30

dryocrassyl acetat chiraton

Những hợp chất cô lập từ chi Drynaria được trình bày tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Các hợp chất đã được phân lập từ chi Drynaria

4-O-β-D-allopyranosyl caffeic C15H18O9 Drynaria propinqua 73,94

8 naringin C27H32O14 Drynaria quercifolia

Drynaria fortunei

27,59, 68,79

3,4-dihydroxybenzoic C7H6O4

Drynaria quercifolia Drynaria fortunei 43,53

11 (-)-epiafzelechin C15H14O5 Drynaria fortunei 27, 85

28 (-)-epicatechin C15H14O6 Drynaria fortunei 79

37 sphoraflavanon G C24H26O6 Drynaria fortunei 78,88

40 8-prenylkaempferol C20H20O6 Drynaria fortunei 78

42 xanthogalenol C21H22O5 Drynaria fortunei 78,88

3-imino-di-benzoic C14H11NO6 Drynaria fortunei 43

47 acid p-hydroxybenzoic C7H6O3 Drynaria fortunei 43

48 acid (E)-caffeic C9H8O4 Drynaria fortunei 43

49 etyl trans-3, 4-dihydroxy

cinnamat C9H10O4 Drynaria fortunei 43

50 acid caffeic

4-O-β-D-glucopyranosid C15H18O9 Drynaria fortunei 43

51 p-coumaric acid

4-O-β-D-glucopyranosid C15H18O8 Drynaria fortunei 43

52

23(S)-12-O-caffeoyl-12-hydroxyl laurat glyceryl C24H36O8 Drynaria fortunei 43

CÁC HỢP CHẤT TERPENOID

4 friedelin C30H50O Drynaria quercifolia 68

5 epifriedelinol C30H52O Drynaria quercifolia 68

6 β-amyrin C30H50O Drynaria quercifolia 68

9 acetyllupeol C32H52O2 Drynaria quercifolia 53

30 dryocrassyl acetat C32H54O2 Drynaria fortunei 60

CÁC HỢP CHẤT STEROID

3 sistosterol

3-O-β-D-glucopyranosid C33H56O6

Drynaria propinqua Drynaria quercifolia

68,73 ,94

7 β-sitosterol C29H50O Drynaria quercifolia

Drynaria fortunei 68, 85

CÁC HỢP CHẤT KHÁC

27 maltol glucosid C12H16O8 Drynaria fortunei 79

1.5 Những nghiên cứu về dược tính

1.5.1 Drynaria fortunei (Kunze) J Sm

Bổ cốt toái là thành phần chính trong nhiều bài thuốc được dùng chữa gãy xương và làm mạnh xương khớp trong kinh nghiệm dân gian của Việt Nam, Trung Quốc, Triều Tiên Thân rễ bổ cốt toái có tác dụng bổ thận, mạnh gân xương, hành huyết, phá huyết ứ, cầm máu, thu phong thấp, sát trùng, giảm đau, dùng để dự phòng và điều trị loãng xương, đau xương, đau lưng, mỏi gối, khớp sưng đau, ngã chấn thương, bong gân, tụ máu, sai khớp, gãy xương, thận hư (suy giảm chức năng nội tiết), chảy máu chân răng Ngày dùng 6 – 12 g thân rễ khô dưới dạng thuốc sắc hoặc ngâm rượu uống Dùng ngoài, lấy thân rễ tươi giã đắp lên vết thương, chỗ sưng đau hoặc dược liệu khô sao cháy, tán bột rắc Bộ phận dùng: thân rễ thu hoạch quanh năm Cắt bỏ rễ con, phần lá còn sót lại và cạo sạch lông, rửa sạch, cắt thành từng miếng theo kích thước quy định, phơi hay sấy khô [3]

 Các bài thuốc có bổ cốt toái [9]

+ Bài thuốc bổ khí huyết, bổ gân xương, phòng và chữa trị bệnh loãng xương, dùng cho người cao tuổi, người suy nhược cơ thể, gãy xương: bổ cốt toái 12 g; đảng

sâm, hoài sơn, ba kích, mỗi vị 16 g; hoàng kỳ, bạch truật, đương quy, cẩu tích, tục đoạn, mẫu lệ, mỗi vị 12 g; thiên niên kiện 10 g Sắc uống ngày một thang hoặc nấu cao lỏng uống

+ Bài thuốc bổ gân xương, phòng và điều trị loãng xương: bột bổ cốt toái, bột sừng hươu nai, bột mẫu lệ, mỗi vị 12 g Làm thành viên uống, hay uống dạng bột trong một ngày Uống liên tục trong thời gian dài Chữa đau lưng mỏi gối do thận

hư yếu: bổ cốt toái 16 g; cẩu tích, củ mài, mỗi vị 20 g; tùy giải, đỗ trọng, mỗi vị 16 g; rễ gối hạc, rễ cỏ xước, dây đau xương, thỏ tuy tử, mỗi vị 12 g Sắc uống ngày một thang

+ Bài thuốc chữa đau lưng, răng đau, ù tai do thận hư: bổ cốt toái tán nhỏ 4 –

6 g, cho vào bầu dục lợn, nướng chín ăn

+ Bài thuốc chữa phong thấp, đau nhức, thuộc huyết:

a) Phương thuốc ngâm rượu: bổ cốt toái 40 g; rễ gắm 120 g; vỏ chân chim

100 g; rễ rung rúc 80 g; rễ bươm bướm (bạch hoa xà), rễ chiên chiến, mỗi vị 60 g; xích đồng nam, bạch đồng nữ, tiền hồ, ô dược, cỏ xước, rễ bưởi bung, mỗi vị 40 g Nấu thành cao đặc rồi cho thêm rượu 400

thành 2 lít, ngâm trong 3 giờ Lọc lấy dịch trong, mỗi lần uống 30 ml, ngày 2 lần

b) Phương thuốc viên: bổ cốt toái 160 g (nấu với mật, phơi khô), cẩu tích 240

g (tẩm rượu, nấu với nước muối, phơi khô), thạch hộc 160 g (rửa với rượu, chưng

kỹ, phơi khô), hy thiêm 160 g (chưng với rượu và mật , phơi khô), rễ cỏ xước160 g (dùng tươi, rửa với rượu), vỏ chân chim 160 g (sao), rễ gắm 160 g (sao), quán chúng 100 g (phơi chỗ râm), lá ké đầu ngựa 40 g (phơi chỗ râm) Các vị tán thành bột, vò thành viên, uống mỗi lần 8 – 12 g uống với rượu hay nước gừng

+ Bài thuốc chữa thấp khớp mạn tính (thể nhiệt): bổ cốt toái, thạch cao, kê huyết đằng, đan sâm, sinh địa, rau má, uy linh tiên, hy thiêm, khương hoạt, độc hoạt, thiên hoa phấn, thổ phục linh, mỗi vị 12 g, cam thảo 4 g Sắc uống mỗi ngày một thang

+ Bài thuốc chữa bong gân, tụ máu: bổ cốt toái tươi, bóc bỏ hết lông tơ và lá khô, rửa sạch, giã nhỏ, rấp nước, gói vào lá chuối nướng cho mềm, đắp vào chỗ đau, bó lại Thay thuốc bó nhiều lần trong ngày

Phạm Xuân Sinh, Nguyễn Trần Giáng Hương - Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu thử nghiệm tác dụng chống viêm cấp và chống viêm mãn tính của cao lỏng bổ cốt toái (tỉ lệ 1:1, 1 mL = 1 g dược liệu, dung môi dùng làm chứng là nước muối sinh lý 0,9%) trên chuột trắng Kết quả cho thấy cao lỏng bổ cốt toái có tác dụng chống viêm cấp ở liều dùng trung bình 4 g/kg tương đương với các thuốc nam khác (hòe hoa tán, trinh nữ, phân tằm…) đã nghiên cứu, làm giảm số lượng bạch cầu trong dịch rỉ viêm (49,79% so với chứng), tác dụng này tương đương với thuốc làm đối chứng aspirin (67,99% với liều dùng là 0,05 g/kg) Đối với tác dụng chống viêm mãn tính, kết quả cho thấy cao lỏng bổ cốt toái với liều dùng 4 g/kg có tác dụng ức chế sự phát triển của u hạt, làm giảm 55,65% trọng lượng của u hạt so với chứng [16]

Ricky W.K Wong và A Bakr M Rabie đã nghiên cứu tác động của dịch chiết

thô từ thân rễ cây Drynaria fortunei (Kunze) J Sm đến sự phát triển tế bào xương ở chuột và nhận thấy dưới tác dụng của dịch chiết cây Drynaria fortunei (Kunze) J

Sm, tỷ lệ thể tích xương/thể tích mô tăng 6,45% sau 5 tuần [84]

Mian Long và cộng sự đã nghiên cứu vai trò của flavonoid chiết xuất từ thân

rễ cây Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm trong việc chữa bệnh và ngăn ngừa chứng thận hư trên chuột nhắt trắng giống Swiss nhận thấy flavonoid của thân rễ Drynaria fortunei (Kunze) J Sm có tác dụng giảm khả năng suy thận và tái tạo được các tế

bào hình ống của thận [63]

Guo-Chung Dong và cộng sự đã chế tạo vật liệu cấy ghép xương từ dịch chiết

của thân rễ Drynaria fortunei (Kunze) J Sm Vật liệu này là hỗn hợp của genipin liên kết với gelatin, tricalcium phosphat và dịch chiết Drynaria fortunei (GGT- GSB) Qua thử nghiệm in vitro và in vivo trên chuột các tác giả nhận thấy rằng nồng

độ tối ưu, có hiệu quả của dịch chiết Drynaria fortunei đối với sự tăng trưởng các tế

bào tạo xương, tăng hoạt tính alkaline phosphat (ALP) trong mô xương chuột mà

không ảnh hưởng đến hoạt động của các tế bào hủy xương là 100 µg/ml Trong nghiên cứu này các tác giả cũng so sánh giữa vật liệu cấy ghép xương gồm hỗn hợp genipin, gelatin, tricalcium phosphat (GGT) với vật liệu cấy ghép xương GGT-GSB trên sự hình thành tế bào tạo xương ở chuột thì nhận thấy vật liệu cấy ghép xương GGT-GSB có khả năng kích thích tế bào tạo xương tốt hơn vật liệu GGT [33]

Năm 2001, Liu H C và cộng sự khi nghiên cứu độc tính tế bào và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết nước của cây bổ cốt toái nhận thấy ở nồng độ 10 µg/ml, dịch chiết không có độc tính tế bào nhưng có hoạt tính chống oxi hóa [62]

G.I Anuja, P.G Latha và cộng sự (2011) nhận thấy Drynaria quercifolia có

tác dụng giảm đau thông qua việc ức chế sự tổng hợp prostaglandin hoặc ức chế enzym cyclooxygenase và lipoxygenase [22]

1.5.3 Drynaria bonii H Christ [13]

Thân rễ của cây có vị hơi đắng, tính ấm

Được sử dụng nhiều trong y học cổ truyền, làm thuốc chữa chữa phong thấp đau lưng, thận hư, thần kinh suy nhược, đau mình mẩy, tụ máu, bong gân, ù tai,…

1.6 Đại cương về hoạt tính chống oxi hóa, loãng xương và kháng vi sinh vật 1.6.1 Hoạt tính chống oxi hóa [4,7,18]

Oxi hóa là quá trình không thể thiếu đối với sinh vật hiếu khí Các nghiên cứu khoa học chứng tỏ rằng oxi vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa học Đồng thời với các quá trình đó, oxi tạo ra các chất trung gian là các gốc tự do, có hoạt tính cao, kém bền vững và được gọi chung là dạng oxi hoạt động Sự sản sinh ra nhiều dạng oxi hoạt động được loại bỏ bằng các chất chống oxi hóa tự nhiên Trong cơ thể luôn tồn tại sự cân bằng giữa các dạng oxi họat động và các dạng chống oxi hóa Stress oxi hóa là hiện tượng mất cân bằng giữa việc sinh ra gốc tự do và hoạt tính bắt gốc tự do trong cơ thể sinh vật do ảnh hưởng của các yếu tố bên ngoài hay bên

trong cơ thể Nguyên nhân gây ra ung thư đã được làm sáng tỏ là một quá trình nhiều bước, trong đó giai đoạn xúc tiến có liên hệ chặt chẽ đến sự hư hại mô bị viêm

và mô bị oxi hóa Bằng thực nghiệm đã chứng minh được các gốc tự do có liên quan đến sự xúc tiến khối u trong da chuột và các mô khác Khi các chất hoạt hóa khối u được áp dụng cục bộ vào da chuột đã sinh ra H2O2 trong biểu bì, điều này tương quan với khả năng xúc tiến khối u của các chất này Do đó các chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh có khả năng ngăn chặn sự gây ung thư, đặc biệt ở giai đoạn xúc tiến Dựa trên nguyên tắc hoạt động, chất chống oxi hóa được chia làm hai loại: chất chống oxi hóa bậc 1 (có tác dụng bao vây hoặc trung hòa các gốc tự do) và chất chống oxi hóa bậc 2 (ức chế hình thành gốc tự do)

Ngoài ra, stress oxi hóa được xem là nguyên nhân dẫn đến nhiều căn bệnh hiểm nghèo khác như tim mạch, alzheimer, lão hóa sớm, suy yếu hệ thống miễn dịch…

Do vậy, xu hướng nghiên cứu gốc tự do và các chất chống oxi hóa ngày càng được chú trọng trong lĩnh vực Y-dược nhằm phát hiện những chất chống oxi hóa mang lại những tác dụng tốt có lợi cho sức khỏe con người, trong đó chất chống oxi hóa có nguồn gốc thiên nhiên được nhiều quốc gia, nhiều nhà khoa học quan tâm do đặc tính ít độc, dễ hấp phụ đối với cơ thể và ít gây ra các phản ứng phụ

1.6.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật [2,5]

Kháng sinh là những chất có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn, Vi khuẩn ngày càng có xu hướng kháng lại các thuốc kháng sinh ngay cả những loại kháng sinh thế hệ mới Các công trình nghiên cứu ở nhiều cơ sở bệnh viện khác nhau tại Việt Nam cho thấy có rất nhiều loại vi khuẩn không những chỉ kháng lại một hay hai loại thuốc kháng sinh mà còn kháng lại nhiều thuốc kháng sinh do tình hình lạm dụng kháng sinh hiện nay Cần phải có các kháng sinh mới có tác dụng hiệu quả lên các vi khuẩn kháng thuốc, trong số đó kháng sinh từ nguồn thực vật rất được chú ý

Kháng sinh thực vật tuy không mạnh bằng tân dược nhưng cũng đủ để chữa khỏi nhiều bệnh nhiễm khuẩn Không những thế, chúng còn có nhiều ưu điểm là

chưa thấy hiện tượng kháng thuốc Ngoài ra, kháng sinh thực vật là rất ít độc, do đó không gây ra những tai biến nguy hiểm, nhiều khi chết người như thuốc kháng sinh tân dược

1.6.3 Loãng xương [8,10,17,19,65]

Loãng xương là một vấn đề mang tính toàn cầu, đang được thế giới quan tâm

vì quy mô lớn và hệ quả nghiêm trọng trong cộng đồng Ở Việt Nam bệnh loãng xương ảnh hưởng đến 1/3 phụ nữ và 1/8 đàn ông trên 50 tuổi, tương đương 1,5 triệu người cao tuổi có nguy cơ loãng xương với nhiều biến chứng nguy hiểm

Loãng xương là hệ quả của việc mất cân bằng chu trình chu chuyển xương, làm sức mạnh của xương bị suy giảm đưa đến tăng nguy cơ gãy xương Chu trình này do hai loại tế bào osteoblast (tạo xương) và osteoclast (hủy xương) điều khiển Thuốc điều trị loãng xương hiện nay gồm hai loại: chống hủy xương (estrogen, calcitonin, bisphosphonates, raloxifene) và tăng tạo xương (fluoride, parathyroid hormone PTH, strontium ranelate), đều có những tác dụng phụ không mong muốn

và chi phí cao Ngoài ra, nhiều bệnh nhân bị loãng xương đã mất đi một số lượng đáng kể của xương, do đó rất cần một phương pháp để tăng khối lượng xương bằng cách kích thích hình thành xương mới, quá trình này do tế bào tạo xương điều khiển Do đó, việc quan tâm tìm kiếm cây thuốc có tác dụng điều trị loãng xương hiệu quả, ít tác dụng phụ với chi phí hợp lý thông qua kích thích tế bào tạo xương

có ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.7 Sử dụng phổ NMR xác định cấu trúc flavonoid [20]

Kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân là công cụ quan trọng để xác định cấu trúc các flavonoid, lượng mẫu chỉ cần vài miligam Cấu trúc hoá học của flavonoid được xác định dựa vào việc phân tích độ dịch chuyển hoá học () và hằng số ghép spin (J) trên phổ 1H NMR và 13C NMR, kết hợp với những tương quan trên phổ NMR 2 chiều Do đồng vị 13C NMR có hàm lượng thấp (1,108%) so với đồng vị 1H (100%) và hằng số từ trên đồng vị 13C bằng một phần tư đồng vị 1H nên lượng mẫu

đo phổ 13C thường phải gấp 10 lần so với phổ 1H

1.7.1 Dung môi

Dung môi được sử dụng nhiều nhất cho phân tích flavonoid là

hexadeuterodimetylsulfoxid (DMSO-d 6) và tetradeuterometanol (CD3OD) Hợp chất anthocyanin thường phải thêm 1 lượng nhỏ acid để đảm bảo flavonoid ở dạng flavylium Với những flavonoid có độ phân cực trung bình, dung môi sử dụng là

hexadeuteroaceton (aceton-d 6), deuterocloroform (CDCl3) Lựa chọn dung môi phụ thuộc vào độ tan của mẫu, nhiệt độ đo, độ nhớt của dung môi và phải dễ dàng thu hồi mẫu sau khi phân tích

Với những flavonoid có độ phân cực mạnh dung môi thường là DMSO-d 6 Tín hiệu dung môi là 39,6 ppm trên phổ 13C và 2,49 ppm trên phổ 1H DMSO-d 6 là lựa chọn tốt cho ghi phổ NOE, nhưng không thể thực hiện phép đo ở nhiệt độ thấp (m.p

18 0C) Ngược lại với dung môi CD3OD, ta dễ dàng thực hiện phép đo ở nhiệt độ thấp nhưng lại khó thực hiện ở nhiệt độ cao

Độ tan của nhiều flavonoid trong CD3OD kém hơn so với DMSO-d 6 Dung môi CD3OD đã acid hoá (2-20% CF3COOH) là lựa chọn tốt nhất cho anthocyanin Tuy vậy cũng có thể xảy ra sự trao đổi proton H-6, H-8 của anthocyanin với deuterium, điều này làm những tương quan trong phổ 2 chiều khó ghi nhận được khi đo; đôi khi có thể xảy ra quá trình thuỷ phân flavonoid glycosid

1.7.2 Phổ 1 H NMR

Phổ 1H NMR cung cấp thông tin độ dịch chuyển hoá học, hằng số ghép spin

và giá trị tích phân tín hiệu cộng hưởng, qua đó cho thông tin tương đối về số hydro Với flavonoid, thông tin trên giúp xác định khung aglycon, nhóm acyl, số phân tử đường đơn và cấu hình của chúng Các tín hiệu proton xuất hiện trong khoảng 0-11 ppm, độ dịch chuyển hoá học xác định bản chất của hydro trong khi hằng số ghép spin xác định proton orto, meta hoặc vicinal

Proton orto và meta lần lượt có hằng số J từ 6,5 – 9,0 Hz và 1,5-2,5 Hz, thông

qua giá trị J sẽ xác định kiểu thế trên vòng thơm Dưới đây là độ dịch chuyển hoá học trên phổ 1

H NMR của một số kiểu flavonoid được trình bày trong bảng 1.2

Bảng 1.2: Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR của một số khung flavonoid

Heq-4 khung flavan-3-ol; isoflavan

Hax-4 khung flavan-3ol; isoflavan

Heq-3 flavanon

Hax-3 flavanon

Heq-3 neoflavanon

Hax-3 neoflavanon H-3 isoflavan; homoisoflavanon H-4 flavan

H-3 homoflavon, neoflavon H-4 flavan-4-ol

1.7.3 Phổ 13 C NMR

Mặc dù các phổ IR, UV, MS và 1H NMR chứa đựng nhiều thông tin quan trọng cho việc xác định cấu trúc flavonoid, phổ 13C NMR cũng rất quan trọng trong việc xác định cấu trúc flavonoid, đặc biệt trong trường hợp những đồng phân của flavonoid mang oxygen tại C-6 và C-8 Độ nhạy của hạt nhân 13C kém hơn 5700 lần so với hạt nhân 1

H NMR, tuy vậy ảnh hưởng của dung môi trên độ dịch chuyển hóa học của phổ 13C ít hơn trên phổ 1

H NMR Trong phổ 13C NMR các tín hiệu cộng hưởng xuất hiện từ 0 – 220 ppm so với TMS Nhóm carbonyl của flavonoid có

độ dịch chuyển trong khoảng 170-205 ppm Với flavonoid hoặc isoflavonoid mang nối đôi tại C2=C3, mười lăm tín hiệu carbon cộng hưởng trong vùng 90-200 ppm Trong trường hợp nếu C2-C3 bão hòa, vùng 90-200 ppm chỉ xuất hiện 13 tín hiệu và thêm hai tín hiệu carbon tại trường cao Độ dịch chuyển hóa học của một số khung flavonoid được trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Độ dịch chuyển hóa học 13

C NMR của một số khung flavonoid

Độ dịch chuyển

7-22 Aromatic C-CH3; Đường rhamnose

19-26 Acetoxy – CH3;Flavan – C-4; Chalcanon C-

Homoisoflavanon (C-3); -Chalcanon (C-) 55-63 Ph-OCH3

-Chalcanol (C-) 90-110 C anomer (C-1); 5,7-dihydroxyflavonoid (C-6 và C-8); 5,7-

dihydroxyisoflavonoid (C-6 và C-8) 100-104 Metylendioxy

90-135

Carbon sp2 không mang oxy; Flavon (C-3); Homoflavon (C-3); Isoflavon (C-3); Chalcon (C-); -Chalcanol (C-); 4-Hydroxy-3-phenylcoumarin (C-3); 3-Phenylcoumarin (C-3);

Chalcen (C-, C-); Auron (C-2); Isoprenyl (-CH=C<); Neoflavon (C-3)

130-150 Carbon sp2 mang oxy (có nhóm thế oxygen tại vị trí orto và para) 135-144 Flavonol (C-3); 3-Phenylcoumarin (C-4); 3-Metoxyflavon (C-3);

Anthocyanidin (C-4) 136-158

Flavonol (C-2); Chalcon (C-); 3-Metoxyflavon (C-2); Anthocyanidin (C-3); Isoflavon (C-2); Homoisoflavon (C-2); Auron (C-2)

155-168

Carbon sp2 mang oxy (không có nhóm thế oxygen tại vị trí orto và para); Flavon (C-2); Homoflavon (C-2); Isoflavon (C-2); -Chalconol (C-); 3-Phenylcoumarin (C-2); 4-Hydroxy-3-phenylcoumarin (C-2 và C-4); Anthocyanidin (C-2); Neoflavon (C-2 và C-4)

166-210 Carbonyl

166-172 Ester (C=O); Neoflavon (C-2)

171-186 Flavon (C-4); Homoflavon (C-4); Flavonol (C-4); 3-metoxyflavon

(C-4); Auron (C=O); Isoflavon (C-4); Homoisoflavon (C-4) 187-200

Flavanon (C-4); Flavanonol (C-4); Isoflavanon (C-4); Chalcone (C=O); -Chalconol (C=O); Homoisoflavanon (C-4)

3,6’-cyclohomoisoflavanon (C-4) 197-207 ’-Chalcanon (C=O); -Chalcanon (C=O)

1.1 Vài nét về chi Drynaria 1

1.2 Mô tả thực vật 11.2.1 Drynaria fortunei (Kunze) J Sm [13] 1Hình 1.1: cây bổ cốt toái 21.2.2 Drynaria bonii H Christ.[6] 2Hình 1.2: cây tắc kè đá 31.3 Vùng phân bố, thu hái và chế biến 31.3.1 Drynaria fortunei (Kunze) J Sm [13] 31.3.2 Drynaria bonii H Christ [6] 41.4 Thành phần hóa học 41.4.1 Drynaria propinqua 41.4.2 Drynaria quercifolia 41.4.3 Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm 5

Bảng 1.1: Các hợp chất đã được phân lập từ chi Drynaria 16

1.5 Những nghiên cứu về dược tính 181.5.1 Drynaria fortunei (Kunze) J Sm 181.5.2 Drynaria quercifolia 211.5.3 Drynaria bonii H Christ [13] 211.7 Sử dụng phổ NMR xác định cấu trúc flavonoid [20]

231.7.1 Dung môi 241.7.2 Phổ 1H NMR 24Bảng 1.2: Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR của một số khung flavonoid 251.7.3 Phổ 13

C NMR 26Bảng 1.3: Độ dịch chuyển hóa học 13C NMR của một số khung flavonoid 26

Hình 1.1: Cây bổ cốt toái 2Hình 1.2: Cây tắc kè đá 3

Bảng 1.1: Các hợp chất đã được phân lập từ chi Drynaria 16

Bảng 1.2: Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR của một số khung flavonoid 25Bảng 1.3: Độ dịch chuyển hóa học 13C NMR của một số khung flavonoid 26

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 MẪU THỰC VẬT

Mẫu nguyên liệu là thân rễ cây bổ cốt toái (ráng đuôi phụng fortune)

Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm được thu hái tại Châu Đốc – An Giang vào tháng 12 năm 2007 và thân rễ cây tắc kè đá (ráng đuôi phụng bon) Drynaria bonii H Christ được thu hái tại huyện Hàm Thuận Nam, Bình Thuận vào tháng 2

năm 2009

Mẫu tươi được rửa sạch, phơi nơi thoáng mát sau đó được sấy khô ở 50 0

C Mẫu khô được xay nhỏ thành bột, đây là nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

Mẫu nguyên liệu của hai loài Drynaria fortunei (Kunze) J.Sm và Drynaria bonii H Christ được giám định tên khoa học bởi DS Phan Văn Đệ, bộ môn tài

nguyên thực vật, Trung tâm Sâm và Dược Liệu TP.HCM

2.2 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC CHẤT

2.2.1 Phương pháp chiết xuất

Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng này vào một pha lỏng khác không hoà lẫn với

nó Mục đích của chiết là chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng

độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu; ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện chiết thích hợp thường dùng trong phân lập các hợp chất thiên nhiên Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Quá trình chiết bằng hệ thống Soxhlet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Trong đó chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật Tuỳ thuộc mục đích cần chiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện qui trình chiết hợp lí

để đạt hiệu quả cao Sự hiểu biết về đặc tính của những hợp chất thứ cấp trong cây khảo sát đưa lại những thông tin quan trọng, từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và thu được tối đa nhóm chất mong muốn

Dung môi thường dùng nhất trong chiết ngâm là metanol, etanol do khả năng hoà tan tốt các hợp chất từ không phân cực đến phân cực trong nguyên liệu Sau khi chiết, dung môi được thu hồi bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ không quá 50 0C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt độ cao hơn

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck) Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong etanol được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu

2.2.3 Sắc ký cột (SKC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Silica gel pha đảo ODS Ngoài ra còn sử dụng chất nhồi cột là nhựa trao đổi ion diaion HP-20 và gel sephadex LH-20

2.2.4 Thiết bị sắc ký lỏng điều chế cao áp (P-HPLC)

Quá trình phân lập một số chất được tiến hành trên thiết bị sắc ký lỏng cao

áp điều chế Agilent 1100 Series DAD, đầu dò UV ở các bước sóng 210, 230, 254

và 280 nm, cột điều chế Zorbax XDB - C18 tại Viện Công nghệ Hoá học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

2.3.1 Phổ khối lượng

Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass spectrometry) được đo trên máy agilent 1100 LC-MSD Trap, phổ khối lượng

phân giải cao ghi trên máy HR-MS của Viện Hoá học, Viện Khoa học và Công

nghệ Việt Nam

2.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chất chuẩn nội là TMS (tetrametyl silan)

2.4 PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC

2.4.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Phương pháp thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo hai bước:

- Bước 1: thử định tính theo phương pháp khuếch tán trên thạch, sử dụng khoanh giấy lọc đã tẩm chất theo nồng độ tiêu chuẩn

- Bước 2: các mẫu có hoạt tính (+) sẽ được tiến hành thử tiếp để tính nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo phương pháp của Vanden Bergher và Vlietinck

2.4.1.1 Chủng vi sinh vật kiểm định

Mẫu thử được chuẩn bị theo một quy trình thống nhất tại Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên đã xây dựng

2.4.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Môi trường duy trì và bảo tồn giống: saboraud dextrose broth cho nấm men

và nấm mốc, vi khuẩn trong môi trường Trypcase soya broth (TBS)

Môi trường thí nghiệm: eugon broth cho vi khuẩn, myco phil cho nấm