Lên men thu nhận GABA (gamaamino Butyric axit) từ bột hạt bụp giấm bởi Lactobacillus acidophillus. Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện của quá trình lên men thu nhận GABA: pH, Nhiệt độ, tỉ lệ giống cấy...
MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, số hoạt chất có hoạt tính sinh học nhiều quan tâm nhà khoa học tính chất quan trọng sức khỏe đời sống người Trong đó, gamma amino butyric acid (GABA) thành phần nghiên cứu nhiều thời gian gần GABA amino acid có vai trò thiết yếu để đảm bảo trì hoạt động bình thường não đặc biệt neuron thần kinh GABA đóng vai trò việc giảm bớt hoạt động neuron thần kinh ức chế lan truyền tế bào dẫn truyền Vì thế, GABA giúp cho thể thư giãn, an thần GABA tìm thấy nhiều loại ngũ cốc đặc biệt ngũ cốc nảy mầm Ngoài ra, hàm lượng GABA tăng lên đáng kể tác động vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn lactic Do đó, trình sản xuất GABA lên men vi sinh vật đào sâu nghiên cứu sản xuất số nơi Cho đến nay, GABA khai thác nghiên cứu loại nguyên liệu hạt ngũ cốc, gạo có giá trị thương phẩm cao Trong đó, hạt bụp giấm nước ta từ trước đến xem loại phế liệu có giá trị sử dụng thường bị thải bỏ Nhưng hạt bụp giấm chứa hàm lượng protein cao (26 – 27%) với tỷ lệ aicd glutamic cao tổng số amino acid (22%) Do đó, xem hạt bụp giấm nguồn nguyên liệu tiềm cho việc sản xuất GABA Đề tài “Khảo sát điều kiện lên men chuyển hóa acid glutamic thành GABA từ hạt bụp giấm Lactobacillus acidophilus” góp phần khai thác nguồn nguyên liệu bụp giấm chưa sử dụng hiệu quả, nâng cao giá trị kinh tế cho bụp giấm Hiện bụp giấm mở rộng diện tích xem xóa đói giảm nghèo cho số tỉnh thành Đồng thời nghiên cứu mở đầu cho nghiên cứu sản xuất GABA với giá thành thấp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan GABA 1.1.1 GABA GABA amino acid phi protein có carbon, tìm thấy loài vi khuẩn đơn giản đến trồng động vật có vú GABA phát từ nửa kỷ trước Tuy nhiên vai trò giới thực vật chưa nghiên cứu cách đầy đủ, giới động vật nhà khoa học tìm vai trò GABA: chất dẫn truyền xung thần kinh quan trọng, có nhiều hoạt tính sinh học giảm stress, chống oxy hóa, giảm thiểu nguy mắc bệnh tim mạch thần kinh Ở vi khuẩn thực vật GABA đóng vai trò trao đổi chất chu trình Krebs, động vật có xương sống đóng vai trò máy phát tín hiệu thần kinh mạnh (Diana cộng sự, 2014) Hình 1.1 Công thức cấu tạo GABA GABA chủ yếu hình thành phản ứng α–decarboxylation không nghịch đảo acid L–glutamic muối nó, xúc tác enzyme decarboxylase acid glutamic Enzyme tìm thấy vi khuẩn Lactobacillus (Bertoldi cộng sự, 1999), Escherichia (Rice cộng sự, 1993), Streptococcus, Aspergillus (Kato cộng sự, 2002) Neurospora (Kubicek cộng sự, 1979); thực vật trà (Zhao cộng sự, 2011), cà chua (Yoshimura cộng sự, 2010), đậu nành (Serraj cộng sự, 1998), gạo lứt nảy mầm (Daixin cộng sự, 2008); não động vật có vú (Nathan cộng sự, 1994) Tuy nhiên vi khuẩn Lactobacillus nấm men hai loại phổ biến để sản xuất GABA Ngoài ra, GABA tìm thấy côn trùng gián, châu chấu, sâu bướm ong mật (Anthony cộng sự, 1993) 1.1.2 Chức sinh lý GABA Ngày GABA nghiên cứu nhiều có hoạt tính sinh học mạnh, có nhiều chức sinh lý nhiều tác động tích cực có lợi cho sức khỏe người Như nói GABA chất dẫn truyền xung thần kinh quan trọng, có nhiều hoạt tính sinh học, giảm thiểu nguy mắc bệnh tim mạch thần kinh bệnh Huntington, bệnh Parkinson, bệnh Alzheimer (Wong cộng sự, 2003) Ngoài GABA có chức sinh lý khác thư giãn (Wong cộng sự, 2003), ngủ trầm cảm (Okada cộng sự, 2000), bệnh điều trị GABA Hơn nữa, amino acid góp phần làm tăng nồng độ hormone tăng trưởng huyết tương tỷ lệ tổng hợp protein não (Tujioka cộng sự, 2009) Mới nghiên cứu secretor mạnh insulin, giúp ngăn ngừa bệnh tiểu đường (Adeghate cộng sự, 2002) GABA làm chậm ngăn chặn xâm nhập di loại tế bào ung thư khác chẳng hạn tuyến vú, đại tràng tế bào ung thư gan (Kleinrok cộng sự, 1998; Minuk, 2000; Opolski cộng sự, 2000) Ngoài ra, GABA có tế bào chống viêm nguyên bào sợi hoạt động phổ biến, thúc đẩy việc chữa lành da vết thương (Han cộng sự, 2007) Các chức sinh lý GABA tổng hợp bảng 1.1 Bảng 1.1 Các chức sinh lý GABA (Diana cộng sự, 2014) Chức sinh lý Dẫn truyền thần kinh Điều chỉnh huyết áp Bệnh não Bệnh tâm thần Các quan quan trọng Hệ thống miễn dịch Bảo vệ phòng chống ung thư Điều chỉnh tế bào Tim mạch Hệ hô hấp Điều chỉnh nội tiết tố Chức cụ thể Ức chế dẫn truyền thần kinh Giảm huyết áp Làm giảm rối loạn thần kinh Tăng cường trí nhớ Làm giảm rối loạn tâm trạng Tác dụng thư giãn Làm giảm triệu chứng ngủ Giảm phiền muộn Phòng ngừa điều trị chứng nghiện rượu Bảo vệ chống lại bệnh thận mãn tính Kích hoạt chức gan Cải thiện chức thị giác Tăng tốc độ tổng hợp protein não Tăng khả miễn dịch Làm chậm ức chế tế bào ung thư tăng sinh Kích thích tế bào ung thư tự hủy diệt Ức chế khối u Chống viêm tăng sinh tế bào nguyên bào sợi Tổng hợp acid hyaluronic Nâng cao hiệu suất nguyên bào sợi da Làm suy giảm phản ứng trao đổi chất làm thiếu máu cục Kiểm soát bệnh suyễn Kiểm soát đường hô hấp Tăng hormone tăng trưởng Kiểm soát tiết hormone Kiểm soát progesterone Kiểm soát hormone tuyến giáp Ngăn ngừa béo phì 1.1.3 Cơ chế hình thành GABA Trong động vật, GABA hình thành qua enzyme: enzyme glutamate decarboxylase (GAD), enzyme GABA transaminase (GABA–T) enzyme succinic seminaldehyde dehydrogenase (SSADH) Chu trình thủy phân nitrogen enzyme glutamine–synthetase hay glutamate– synthase (GS hay GOGAT) đường để đồng hóa nitrogen thành glutamate amino acid thực vật Glutamate decacrboxylase (GAD) enzyme dịch tế bào chịu ảnh hưởng phức hợp Ca 2+–calmondulin (CaM), làm xúc tác cho tình decarboxyl glutamate biến đổi thành GABA Sau đó, GABA chuyển vào ty thể bị biến đổi thành succinic seminaldehyde enzyme GABA transaminases sử dụng α–ketoglutarate (thành enzyme GABA–TK) pyruvate (thành enzyme GABA–TP) nơi tiếp nhận amino acid Tiếp theo, succinic seminaldehyde biến đổi thành succinate enzyme succinic semialdehtde dehydrogenase (SSADH), sau tham gia vào chu trình TCA Cả ATP NADH trở thành chất ức chế hoạt động enzyme SSADH Các enzyme succinyl–CoA ligase α–ketoglutarate dehydrogenase (α–KGDH) enzyme chu trình TCA có liên quan đến chu trình biến đổi GABA enzyme nhạy cảm với stress oxy hóa Succinic semialdehyde bị biến đổi thành γ– hydroxybutyric (GHB) bên dịch bào động vật thực vật Ở động vật có vú, GHB biết đến chất dẫn truyền xung thần kinh, đó, thực vật chưa biết rõ chức GHB Vai trò enzyme GABA–TK nghiên cứu, đó, vai trò enzyme GABA–TP nghiên cứu rõ ràng thuốc hoa Arabidopsis GABA–TP enzymee chức cho trình biến đổi GABA GABA–TP có vài chức đặc biệt loài hoa: đóng góp vào cân C:N, điều chỉnh lại độ pH, chống lại oxy hóa, bảo vệ khỏi côn trùng, GABA chất điều hòa thẩm thấu màng tế bào (Palanivelu cộng sự, 2003) Như chất trình tạo thành GABA glutamate, sau GABA sinh chuyển hóa tiếp tạo thành succinic semialdehyde cuối tạo thành sản phẩm GHB (ở dịch tế bào) succinate (ty lạp thể) Ngoài ta thu glutamate từ đường dị hóa lysine (Bouche' cộng sự, 2004) Có nhiều nghiên cứu để làm tăng hàm lượng GABA tác động lên gen enzyme glutamate dehydroxylase, biến tế bào thành nhà máy sinh tổng hợp thừa GABA Bên cạnh đó, nhà khoa học sử dụng phương pháp lên men vi sinh vật Lactobacillus brevis, Lactobacillus paracasei, ; Escherichia coli; Monascus, … nhiều nguồn nguyên liệu khác để sản xuất GABA Và nhiều phương pháp khác (Bouche' cộng sự, 2004) Hình 1.2 Chu trình chuyển hóa GABA 1.2 Tổng quan bụp giấm Cây bụp giấm có tên khoa học Hibiscus sabdariffa Linn Có hai loại Hibiscus sabdariffa Hibiscus sabdariffa var altissima Hibiscus sabdariffa var sabdariffa Altissima cành phát triển đến chiều cao từ – m Hoa loài có màu vàng, đài hoa có màu đỏ xanh với hàm lượng chất xơ cao chưa sử dụng loại thực phẩm, có tính thương mại cao, trồng Ấn Độ, Nigeria khu vực Nam Mỹ để thu hoạch loại sợi đay Một loại khác, sabdariffa mọc dạng bụi với nhiều cành Hoa loại mọc từ chồi nách, cánh hoa có màu trắng, phần trung tâm có màu đỏ Đài hoa loại to trưởng thành Sabdariffa chủ yếu khai thác phần đài hoa phần chất xơ (Abu, 1997; Morton, 1987) Về mặt sinh thái học, bụp giấm loại trồng quanh năm, thân thảo, thân thẳng, hình trụ, màu đỏ bề mặt trơn láng, thường mọc thành bụi rậm Thân phát triển đến chiều cao 0.5 – m, đài hoa có màu vàng tái đến đỏ ăn (Morton, 1987; Brouk, 1975; Purseglove, 1986) Cây khoảng ba đến bốn tháng chăm sóc để thu hoạch Bên cạnh đó, người ta cho tháng việc trồng bụp giấm, cần chiếu sáng đủ 13 ngày để tránh tình trạng hoa sớm Bụp giấm thích hợp với khí hậu nhiệt đới, lượng mưa thích hợp vào khoảng 1500 – 2000 mm/ năm, địa hình khoảng 600 m so với mực nước biển Cây chịu đựng thời tiết ẩm không 21 °C, đặc biệt bụp giấm nhạy cảm bị chết điều kiện nhiều sương mù băng giá Cây cần trồng vùng đất tơi xốp, thoáng khí, thích hợp hỗn hợp cát đất sét có bổ sung phân bón Nó chống chịu lũ gió mạnh, cần nhổ cỏ dại nơi trồng chúng (Robert, 2005) Như nêu trên, bụp giấm loài chống chịu tốt với vùng đất có điều kiện khắc nghiệt nên tìm thấy nhiều nơi giới Ấn Độ, Ảrập Sauđi, Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Philippines, Việt Nam, Sudan, Ai Cập hay Mexico,… (Quezon, 2005; Rao, 1996) Không có nguồn tài liệu chắn nguồn gốc bụp giấm, Mat (1985) cho chúng xuất xứ từ Ấn Độ, Abu (1997) cho chúng có nguồn gốc từ Ảrập Sauđi Bụp giấm biết đến với nhiều tên xứ khác Roselle tiếng Anh, Sorrel tiếng Anh khu vực châu Phi, Mesta tiếng Ấn, hay Karkade khu vực Trung Đông Tại Việt Nam, trồng nhiều miền Trung, không kén đất, ưa đất đồi núi, khí hậu nóng ẩm Đông Nam Ở miền Bắc, trồng thí điểm khu vực tỉnh Hà Tây, Bắc Kạn Thái Nguyên Từ đầu thập niên 90 đến nay, bụp giấm với giống lấy từ Đức trồng nhiều Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương Bình Phước (với diện tích khoảng 400 ha) để xuất Tại châu Phi, phần hạt ép lấy dầu (Gabb, 1997) Thịt hạt phơi khô nghiền thành loại bột có vị đắng, dùng để bổ sung vào loại súp nước chấm bữa ăn gia đình (Morton, 1987) Tại phía bắc Nigeria, hạt bụp giấm lên men tạo thành loại gia vị có tên mungza ntusa Tại Sudan, hạt bụp giấm ép lấy dầu, phụ phẩm trình dùng làm thức ăn cho gia súc Ở số quốc gia, hạt bụp giấm sử dụng loại cà phê sử dụng làm thức ăn cho gà (Morton, 1987) Tại Trung Quốc, hạt bụp giấm ép lấy dầu để sử dụng Tại Malaysia, hạt bụp giấm dùng để sản xuất chất tẩy rửa Tại Myanmar, hạt bụp giấm dùng để chữa chứng suy nhược thể (Perry, 1980) Tại Đài Loan, người ta tìm thấy tác dụng lợi tiểu, nhuận tràng khả tăng lực loại hạt (Duke, 1983) Nhưng nói chung, ứng dụng nhỏ lẻ hạt bụp giấm thường xem phế phẩm bị thải bỏ trình sản xuất 1.2.1 Thành phần hóa học hạt bụp giấm Hình 1.3 Hình dạng hạt bụp giấm Hạt bụp giấm có cấu trúc hình cầu dẹp, với kích thước trung bình a, b,c hình 5.58, 5.21 2.81 mm (Omobuwajo cộng sự, 2000) Hạt bụp giấm Ai Cập chứa 7.6% ẩm, 34.0% protein, 22.3% béo, 15,3% chất xơ, 7.0% tro 0.3% canxi (Samy, 1980) Một nghiên cứu Ấn Độ đưa số liệu hạt bụp giấm chứa – 8% ẩm, 18 – 22% protein thô, 19 – 22% béo, 5.4% tro, 39 – 42% chất xơ tiêu hóa, 119 – 128 mg Ca, 596 – 672 mg P, 4.0 mg Zn, 3.1 mg Cu, 393 – 396 mg Mg, 0.08 – 0.18 mg Cr, 0.36 – 0.51 mg riboflavin 0.9 mg nicotinic acid (Rao, 1996) Nghiên cứu gần vào năm 2008 Hainida cộng thực hạt bụp giấm trồng Malaysia cho bảng 1.2 Bảng 1.2 Thành phần hóa học hạt bụp giấm (Hainida cộng sự, 2008) Thành phần Độ ẩm (%) Protein (g) Hàm lượng 9.9 33.5 10 Nguyên tắc: Dùng dung môi kỵ nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu nghiền nhỏ Một số thành phần hòa tan chất béo trích ly theo bao gồm sắc tố, vitamin tan chất béo, chất mùi,… Tuy nhiên hàm lượng chúng thấp Do có lẫn tạp chất, phần trích ly gọi lipid tổng Hàm lượng lipid tổng tính cách cân trực tiếp lượng dầu sau chưng cất loại dung môi tính gián tiếp từ khối lượng bã lại Hóa chất, dụng cụ, thiết bị: - Hóa chất: Dung môi trích ly diethyl ether - Dụng cụ, thiết bị: Bộ soxhlet (bình cầu, trụ chiết, ống sinh hàn), tủ sấy, cân phân tích, bình hút ẩm, bếp điện Tiến hành: - Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi, cân xác g mẫu nghiền nhỏ, cho vào bao giấy sấy khô biết khối lượng Chú ý gói phải có bề rộng nhỏ đường kính ống trụ, chiều dài ngắn chiều cao ống chảy tràn Đặt bao giấy vào trụ chiết, lắp trụ chiết vào bình cầu gắn ống sinh hàn Qua đầu ống sinh hàn dùng phễu cho dung môi vào trụ chiết cho lượng dung môi chảy xuống bình cầu lượng trụ chiết đủ ngập mẫu Dùng làm nút đầu ống sinh hàn Mở nước lạnh vào ống sinh hàn Mở bếp điện bắt đầu trích ly lipid Thực – 12 trích ly hoàn toàn hết chất béo - Thử cách lấy vài giọt ether cuối ống xiphong nhỏ lên giấy lọc, dung môi bay không để lại vết dầu loang kết thúc 63 - Cho ether chảy xuống hết bình cầu Lấy bao giấy đặt tủ hút cho bay nhiệt độ thường cho vào tủ sấy, sấy 100 – 105 °C 1.5 giờ, để nguội bình hút ẩm, cân xác định khối lượng Tính kết quả: Hàm lượng chất béo tính phần trăm theo công thức: X = m1 − m2 × 100 m Trong đó: m1: khối lượng bao giấy mẫu ban đầu (g) m2: khối lượng bao giấy mẫu sau trích ly lipid sấy khô (g) m: khối lượng mẫu ban đầu (g) Kết cuối trung bình cộng kết thử song song, tính xác đến 0.1% Chênh lệch kết lần thử không lớn 0.3% A5 Xác định hàm lượng đường khử Phương pháp: Chuẩn độ oxy hóa khử với ferrycyanure Nguyên tắc: Khi cho ferrycyanure K 3Fe(CN)6 phản ứng với đường khử, sản phẩm thu ferrocyanure Dựa vào phản ứng ta suy lượng đường khử có mặt dung dịch cần xác định Việc chuẩn độ tiến hành môi trường kiềm NaOH, đun nóng với thị methylene blue Hóa chất, dụng cụ, thiết bị: 64 - Hóa chất: K3Fe(CN)6 1%, Glucose 0,5% (w/v), NaOH 5%; NaOH 2.5 N, HCl 5%, CCl3COOH 10%, methylen red 1%, methylen blue 0.04% - Dụng cụ, thiết bị: Bếp điện, kẹp, lưới amiang, nồi cách thủy, phễu, ống đong, bình định mức, becher, erlen, burette, pipette Tiến hành: Bước 1: Xử lý nguyên liệu - Cân – 10g mẫu Kết tủa protein tạp chất dung dịch CCl3COOH 10%, sau trung hòa dung dịch NaOH 5% với thị methylen red (màu đỏ chuyển sang vàng) Thêm nước cất tới vạch định mức, lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô, nước qua lọc dung dịch mang định lượng Bước 2: Định lượng đường khử - Dung dịch mẫu sau thu cho vào burete chuẩn độ với 10 ml K3Fe(CN)6 2.5 ml dung dịch NaOH 2.5N Đun sôi chuẩn độ bếp Dung dịch ban đầu có màu vàng chanh ferrycyanure, điểm dừng chuẩn độ xác định màu vàng chanh biến mất, dung dịch suốt không màu 30 giây chuyển sang màu vàng rơm nhạt ferrocyanure Trong trường hợp khó nhận biết điểm chuyển màu kiểm tra điểm kết thúc cách nhỏ giọt thị methylen blue giọt đường thừa làm màu xanh Bước 3: Định lượng glucose chuẩn 0.5% 65 - Tiến hành thí nghiệm tương tự với dung dịch đường chuẩn dung dịch glucose 0.5% Thay lượng đường khử burette dung dịch glucose chuẩn 0.5% chuẩn độ tương tự định lượng đường khử Tính kết quả: Hàm lượng đường khử tính phần trăm theo công thức: Xk = 0.5 × V g × V × 100 100 × Vk × m Trong đó: Xk: hàm lượng đường khử (%) Vg: thể tích dung dịch glucose 0.5% dùng chuẩn độ (ml) Vk: thể tích dung dịch đường khử dùng chuẩn độ (ml) V: thể tích bình định mức (ml) m: lượng mẫu thí nghiệm (g) A6 Xác định hàm lượng đường tổng Phương pháp nguyên tắc: Tương tự phương pháp xác định hàm lượng đường khử Tiến hành: Bước 1: Xử lý nguyên liệu - Cân xác – 10 g nguyên liệu Nghiền nhuyễn nguyên liệu cối sứ với nước cất Nhỏ giọt thị methyl red cho từ từ NaOH 5% 66 vào xuất màu hồng nhạt Sau cho hỗn hợp vào bình định mức 100 ml để trích ly, lắc 10 phút, định mức tới vạch đem lọc lấy xác 50 ml dung dịch mẫu cho vào bình tam giác 250 ml Thêm 20 ml dung dịch HCl 5% đem đun cách thủy hỗn hợp 30 – 45 phút Sau làm nguội nhanh trung hòa hỗn hợp dung dịch NaOH 2.5N với thị methyl red (dung dịch từ màu đỏ chuyển sang vàng) Sau cho vào bình định mức 250 ml định mức tới vạch Bước 2: Tiến hành chuẩn độ tương tự phương pháp xác định hàm lượng đường khử Hàm lượng đường tổng tính phần trăm theo công thức: Xk = 0.5 × V g × V1 × V2 × 100 100 × Vt × 50 × m Trong đó: Xt: hàm lượng đường tổng (%) Vg: thể tích dung dịch glucose 0.5% dùng chuẩn độ (ml) Vt: thể tích dung dịch đường dùng chuẩn độ (ml) V1: thể tích bình định mức dung dịch xác định đường khử (ml) V2: thể tích bình định mức dung dịch xác định đường tổng (ml) m: lượng mẫu thí nghiệm (g) A7 Xác định hàm lượng tinh bột 67 Phương pháp: Tương tự phương pháp xác định hàm lượng đường khử đường tổng Nguyên tắc: Dùng enzyme amylase thủy phân hoàn toàn tinh bột thành glucose Chuẩn độ định lượng tinh bột dựa vào hàm lượng glucose trước sau thủy phân Hóa chất, dụng cụ, thiết bị: - Hóa chất: Enzyme amylase, thị Lugol hóa chất định lượng đường khử - Dụng cụ: Tương tự dụng cụ để xác định hàm lượng đường khử Tiến hành: - Cân – g mẫu (m) xay nghiền, cho vào becher thêm vào 30 ml nước cất khuấy đun sôi để hồ hóa tinh bột, làm nguôi tới 40 °C thêm vào ml dung dịch amylase để thủy phân hoàn toàn tinh bột 30 – 45 phút Kiểm tra thủy phân hoàn toàn giọt thuốc thử Lugol Sau tiến hành giống mẫu xác định đường khử phương pháp ferrycyanure Tính kết quả: Hàm lượng tinh bột tính phần trăm theo công thức: TB = ( X TB − X k ) × 0.9 Trong đó: TB: hàm lượng tinh bột XTB: hàm lượng đường khử sau thủy phân 68 Xk: hàm lượng đường khử trước thủy phân 0.9: hệ số chuyển đổi từ glucose sang tinh bột A8 Phương pháp pha loãng xác định tổng số vi sinh vật Nguyên tắc: Dựa hình thành khuẩn lạc tế bào ban đầu môi trường thạch Tiến hành: - Hấp tiệt trùng đĩa petri môi trường thạch MRS Đổ 10 – 15 ml môi trường thạch MRS làm nguội 50 °C vào hộp petri tiệt trùng Xếp hộp mặt phẳng nằm ngang thạch nguội Bao gói hộp petri giấy bảo quản tủ ấm 38 °C ngày Kiểm tra độ vô trùng đĩa petri - Pha loãng mẫu nước muối sinh lý tiệt trùng với độ pha loãng khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6,… hình sau: Hình A1 Sơ đồ pha loãng 69 - Lắc mẫu pha loãng, dùng micropipet vô trùng lấy 0.1 ml độ pha loãng cần xác định mật độ tế bào cho vào bề mặt hộp petri chứa thạch MRS Dùng que trang vô trùng gạt mẫu bề mặt môi trường thạch MRS Bao gói hộp petri đặt vào tủ ấm 38°C ngày Sau đếm số khuẩn lạc đĩa petri - Chọn hộp petri có số khuẩn lạc từ 25 đến 250 để tính kết Số N khuẩn lạc có ml mẫu ban đầu tính theo công thức: N = C×d Trong đó: N: số khuẩn lạc có ml mẫu ban đầu C: số khuẩn lạc có đĩa petri độ pha loãng chọn D: hệ số pha loãng mẫu A9 Phương pháp xác định nồng độ GABA Chuẩn bị mẫu có chứa GABA: Các mẫu có chứa GABA lọc qua giấy lọc để tách bã sinh khối vi sinh vật Xác định GABA: 0.2 ml mẫu chứa GABA thêm vào ml dung dịch 0.5 M NaHCO3 0.4 ml dung dịch ethanol có chứa 5% FDNB Hỗn hợp ủ 37 °C, sau FDNB dư trích bỏ với ethyl acetate lớp dung môi phía không vàng Sau đó, dung dịch có chứa phức GABA FDNB chỉnh pH 2.0 với 0.4 ml HCl 6M Sau dẫn xuất trích với ethyl acetate Sau trích, phần dung dịch bốc đến khô 37 °C Các phức màu vàng lại bao gồm DNP – GABA hòa tan ml NaOH 70 0.1 M pha loãng 40 lần với 0.01 M tris - HCl đệm (pH 6.0) Sau pha loãng, dung dịch đem đo OD với bước sóng hấp thu 400 nm Hình A2 Đường chuẩn GABA Phụ lục B: Kết số liệu B1 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu nước Bảng B1 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu nước Tỷ lệ nước Yếu tố Hàm lượng GABA Vi sinh vật pH 1:5 1:10 1:15 1:20 1:25 0.77 ± 0.0002c 7.04±0.003b 5.6 ± 0.02a 1.16 ± 0.0001e 7.16±0.001c 5.8 ± 0.01b 0.88 ± 0.0001d 7.11±0.001c 5.9 ± 0.01b 0.44 ± 0.0015b 6.73±0.002a 5.8 ± 0.01b 0.04 ± 0.0003a 6.86±0.002a ± 0.01b B2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH Bảng B2 Kết khảo sát ảnh hưởng pH pH Yếu tố Hàm lượng GABA Vi sinh vật pH 0.59 ± 0.76 ± b 0.0002 0.0001c 7.25±0.04b 7.39±0.03c 3.4 ± 0.02a 3.7 ± 0.13b 6.4 0.85 ± 1.05 ± 0.86 ± 0.38 ± cd e d 0.0006 0.0003 0.003 0.001a 7.38±0.04c 7.49±0.02d 7.31±0.06b 7.11±0.06a 4.3 ± 0.20c 4.5 ± 0.07d 5.2 ± 0.01e 6.8 ± 0.12f 71 B3 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ Bảng B3 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ Yếu tố Hàm lượng GABA Vi sinh vật pH 33 °C 38 °C 43 °C 48 °C 0.74 ± 0.001b 0.92 ± 0.001c 0.48 ± 0.001a 0.44 ± 0.001a 7.20 ± 0.01c 5.1 ± 0.02a 7.26 ± 0.01c 5.1 ± 0.01a 5.81 ± 0.01b 5.8 ± 0.01b 4.70 ± 0.03a ± 0.01c B4 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy Bảng B4 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy Tỷ lệ giống 5% 10% 15% 20% cấy Yếu tố Hàm lượng GABA 1.03 ± 0.001a 1.11 ± 0.002b 1.28 ± 0.001c 1.02 ± 0.001a Vi sinh vật 7.03 ± 0.002a 7.25 ± 0.001d 7.18 ± 0.001c 7.13 ± 0.003b pH 5.4 ± 0.01b 5.2 ± 0.01a 5.2 ± 0.01a 5.1 ± 0.01a B5 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường bổ sung Bảng B5 Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường bổ sung Hàm lượng 0% đường bổ sung Yếu tố Hàm lượng GABA Vi sinh vật 10% 1.00 ± 0.003c 7.31 ± 15% 1.01 ± 0.001bc 7.30 ± 20% 1.29 ± 0.002d 7.43 ± 72 25% 0.92 ± 0.001b 7.36 ± 0.78 ± 0.008a 7.38 ± 0.001a 5.7 ± 0.01a pH 0.001a 5.4 ± 0.00b 0.001d 5.3 ± 0.00b 0.002b 5.3 ± 0.00b 0.002c 5.3 ± 0.01b B6 Kết khảo sát biến thiên hàm lượng GABA theo thời gian Bảng B6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian Thời gian 12 24 36 48 0.83 ± 0.02b 1.27 ± 0.01d 1.12 ± 0.01c 0.83 ± 0.01b 6.89 ± 0.01b 5.8 ± 0.02c 7.52 ± 0.02d 4.7 ± 0.02b 7.41 ± 0.12d 3.9 ± 0.08a 7.18 ± 0.04c 3.7 ± 0.14a Yếu tố Hàm lượng 0.48 ± 0.02a GABA Vi sinh vật 6.51 ± 0.01a pH 6.7 ± 0.01d Phụ lục C: Kết phân tích ANOVA C1 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu nước ANOVA Table for GABA by Ty le nuoc Source of Variation Between Groups Within Groups Total SS 2.23E+08 2810000 2.26E+08 df 10 14 MS 55746000 281000 F 198.3843 P-value F crit 1.77E-09 3.47805 Mutiple Range Tests for GABA by Ty le nuoc Method: 95.0 percent LSD Ty le nuoc 25 Count Mean 375 Homogeneous Groups x 73 20 15 10 3 3 4375 7675 8775 11575 x x x x C2 Khảo sát ảnh hưởng pH đầu ANOVA Table for GABA by pH Source of Variation Between Groups Within Groups Total SS df MS F 82886250 4555000 87441250 12 17 16577250 379583.3 P-value 43.6722 2.73595E-07 F crit 3.10588 Mutiple Range Tests for GABA by pH Method: 95.0 percent LSD pH Mẫu (6.4) Count 3 3 3 Mean 3825 5875 7625 8525 8625 10525 Homogeneous Groups x x x xx x x C3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên men ANOVA Table for GABA by Nhiet Source of Variation Between Groups SS df MS F 47000625 15666875 39.475 74 P-value F crit 3.8443E-05 4.06618 Within Groups Total 3175000 50175625 11 396875 Mutiple Range Tests for GABA by Nhiet Method: 95.0 percent LSD Nhiet 48 43 33 38 Count 3 3 Mean 4375 4775 7375 9225 Homogeneous Groups x x x x C4 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ giống cấy ANOVA Table for GABA by Ty le giong cay Source of Variation Between Groups Within Groups Total SS df MS F P-value F crit 12787500 1045000 13832500 11 4262500 130625 32.6316 7.76992E-05 4.06618 Mutiple Range Tests for GABA by Ty le going cay Method: 95.0 percent LSD Ty le giong cay 0.5 1.5 Count 3 3 Mean 10175 10325 11125 12775 Homogeneous Groups x x x x C5 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng đường saccharose bổ sung 75 ANOVA Table for GABA by Ham luong duong bo sung Source of Variation Between Groups Within Groups Total SS df MS F P-value F crit 41700000 10425000 27.4703 2.25E-05 3.47805 3795000 45495000 10 14 379500 Mutiple Range Tests for GABA by Ham luong duong bo sung Method: 95.0 percent LSD Ham luong duong bo sung 25 20 10 15 Count 3 3 Mean 7825 9225 10025 10125 12925 Homogeneous Groups x x x xx x C6 Khảo sát thời gian ANOVA Table for GABA by Thoi gian Source of Variation Between Groups Within Groups Total SS 1.165227 0.013067 1.178293 df 10 14 MS 0.291307 0.001307 Mutiple Range Tests for GABA by Thoi gian Method: 95.0 percent LSD 76 F P-value F crit 222.9388 9.97E-10 3.47805 Thoi gian Count 12 48 36 12 Mean 0.46 0.82333 1.26333 1.13666 0.86333 77 Homogeneous Groups x x x x x [...]... tinh bột 2.3.2 Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu 2.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của vỏ Mẫu nguyên liệu: Bột hạt bụp giấm Xử lý nguyên liệu: - Đối với mẫu hạt bụp giấm không loại bỏ vỏ, bột hạt bụp giấm được nghiền ướt với tỷ lệ nguyên liệu và nước là 1:10, sau đó toàn bộ dịch sẽ được xử lý qua các công đoạn tiếp theo để chuẩn bị cho quá trình lên men - Đối với mẫu hạt bụp giấm có loại bỏ vỏ, bột hạt bụp. .. lượng GABA (Phản ứng FDNB) Thời gian Hàm lượng GABA (Phản ứng FDNB) 20 Hàm lượng GABA (Phản ứng FDNB) Hàm lượng GABA (Phản ứng FDNB) 2.3.1 Khảo sát thành phần hóa học của hạt bụp giấm Mẫu nguyên liệu: Hạt bụp giấm Xử lý nguyên liệu: Hạt bụp giấm được xay nghiền thành dạng bột mịn lọt qua rây có kích thước khoảng 400 μm Sau khi được nghiền, bột hạt bụp giấm được mang đi khảo sát các thành phần sau:... nguyên liệu, dịch bụp giấm thu được sẽ được tiến hành lên men theo sơ đồ sau: Dịch bụp giấm Chỉnh pH Lactobacillus acidophilus Xác định hàm Lọc lượng GABA 23 Tiệt trùng (121 °C, 20 phút) Đếm số Lênt men bào VSV Đo pH Hình 2.1 Quy trình lên men 2.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH Mẫu nguyên liệu: Dịch bụp giấm đã tách béo và loại bỏ vỏ với tỷ lệ nguyên liệu và nước là 1:10 Chỉnh pH: Dịch bụp giấm sau khi được... hưởng của nhiệt độ lên men Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men (°C) đến hàm lượng GABA (g/100 ml), tổng số vi sinh vật (log CFU/ml) và giá trị pH sau 24 giờ lên men được trình bày trong hình 3.6 và hình 3.7 Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng GABA và tổng số vi sinh vật sau 24 giờ lên men Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến giá trị pH sau 24 giờ lên men Kết quả thí... Điều này chứng tỏ không có dấu hiệu của quá trình lên men hoặc quá trình lên men xảy ra rất yếu - Mẫu dịch bụp giấm đã loại bỏ vỏ: pH giảm khoảng 1 đơn vị và số tế bào vi sinh vật tăng từ 106 lên 107 CFU/ml Đồng thời nồng độ GABA cũng tăng từ 0.42 lên 0.72 g/100 ml Điều này khẳng định vi khuẩn Lactobacillus acidophilus có thể sinh trưởng trong dịch bụp giấm đã loại bỏ vỏ 29 Nguyên nhân được kiến nghị... Mẫu nguyên liệu: Bột hạt bụp giấm đã tách béo Xử lý nguyên liệu: Nguyên liệu được xử lý như ở mục 2.3.2.2 với tỷ lệ nguyên liệu : nước (w/v): 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 Dịch bụp giấm sau khi được xử lý sẽ được lên men với các điều kiện sau: - pH: 6.4 - Nhiệt độ: 38 °C - Tỷ lệ giống cấy: 10% (v/v) - Thời gian lên men: 24 giờ - Hàm lượng đường bổ sung: 0% 2.3.3 Khảo sát điều kiện lên men Sau khi xử lý... tốt nhất Do đó, môi trường lên men cần được khảo sát điều chỉnh để tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển cũng như tạo điều kiện cho quá trình tổng hợp GABA được diễn ra tốt nhất 3.2 Khảo sát điều kiện xử lý nguyên liệu 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của vỏ Quá trình lên men đối với mẫu dịch bụp giấm có vỏ và đã loại vỏ được ghi nhận sau 24 giờ lên men như sau: - Mẫu dịch bụp giấm chưa loại bỏ vỏ: Sự phát... thí nghiệm cho thấy, sau 24 giờ lên men ở nhiệt độ 38 °C, hàm lượng GABA sinh ra là cao nhất: 0.92 g/100 ml 35 Ở các mẫu được lên men ở nhiệt độ 43 °C và 48 °C, hàm lượng GABA sinh ra là thấp đáng kể so với mẫu được lên men ở nhiệt độ 38 °C Hàm lượng vi sinh vật của mẫu lên men ở nhiệt độ 38 °C sau 24 giờ là cao nhất: 7.26 log CFU/ml Hàm lượng vi sinh vật của các mẫu lên men ở nhiệt độ 43 °C và 48 °C... liệu và điều kiện lên men lên hiệu suất sinh tổng hợp GABA từ hạt bụp giấm - Tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất sinh tổng hợp GABA 2.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung nghiên cứu được trình bày tóm tắt ở bảng 2.1 Bảng 2.1 Nội dung nghiên cứu ST T Nội dung nghiên cứu 1 Khảo sát thành phần hóa học của nguyên liệu 2 Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu 3 Khảo sát điều kiện lên men 4 Tối ưu hóa 5... có ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp GABA Hình 3.5 cho thấy, sau 24 giờ lên men, pH của tất cả các mẫu đều giảm từ 0.6 đến 1.8 đơn vị Điều này có thể được giải thích rằng Lactobacillus acidophilus là vi khuẩn lên men lactic đồng hình, nên lượng acid lactic sinh ra trong quá trình lên men đã làm pH thay đổi đáng kể Như vậy, giá trị pH ban đầu của dịch lên men là 6.4 được chọn làm điều kiện để khảo ... loại hạt (Duke, 1983) Nhưng nói chung, ứng dụng nhỏ lẻ hạt bụp giấm thường xem phế phẩm bị thải bỏ trình sản xuất 1.2.1 Thành phần hóa học hạt bụp giấm Hình 1.3 Hình dạng hạt bụp giấm Hạt bụp giấm. .. GABA (Phản ứng FDNB) 20 Hàm lượng GABA (Phản ứng FDNB) Hàm lượng GABA (Phản ứng FDNB) 2.3.1 Khảo sát thành phần hóa học hạt bụp giấm Mẫu nguyên liệu: Hạt bụp giấm Xử lý nguyên liệu: Hạt bụp giấm. .. tinh bột 2.3.2 Khảo sát trình xử lý nguyên liệu 2.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng vỏ Mẫu nguyên liệu: Bột hạt bụp giấm Xử lý nguyên liệu: - Đối với mẫu hạt bụp giấm không loại bỏ vỏ, bột hạt bụp giấm