Kiểm nghiệm thuốc theo tiêu chuẩn

Kiểm nghiệm thuốc theo tiêu chuẩn

Phương pháp hoá, vật lý tiến hành nhanh, chính xác nhưng chỉ

áp dụng được với các chất thành phần hoá học đã biết Một số dược phẩm có yêu cầu về hiệu lực tác dụng, hoặc những tính chất riêng biệt như độ an toàn của vaccine, độc tính bất thường hay yếu tố gây sốt của một số loại thuốc…Những tiêu chuẩn này không thể xác định được bằng phương pháp lý, hoá mà phải dùng phương pháp

1.1 Nguyên tắc

 •Phương pháp sinh học dựa trên nguyên tắc:

chất thử với chất chuẩn tương ứng trong cùng điều kiện và thời gian thí nghiệm.

nghiệm được áp dụng nhiều nhất là:

động vật

vật.

1.2 Chất chuẩn

chất thử Chất chuẩn được chia làm hai loại:

trong điều kiện khô, tránh ánh sáng.

 1.3 Đánh giá kết quả

dài và phụ thuộc vào nhiều yếu tố như tính chất đáp ứng của sinh vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm, các điều kiện thử nghiệm Các yếu tố này thường không ổn định Vì vậy kết quả thử nghiệm sinh học phải được đánh giá bằng toán

II KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ TRÊN ĐỘNG VẬT

 2.1 Nguyên tắc

 Kiểm nghiệm thuốc bằng các phép thử trên động vật dựa trên sự đáp ứng của động vật thí nghiệm đối với các chế phẩm được đưa vào cơ thể một liều lượng theo qui định của từng thí nghiệm đẻ đánh giá chất lượng của chế phẩm cần thử

2.2 Động vật thí nghiệm

 Yêu cầu: Động vật thí nghiệm phải đồng đều, thuần khiết về nòi giống, khoẻ mạnh không nhiễm bệnh, không có thai và được nuôi dưỡng đầy đủ Chất lượng của động vật quyết định sự chính xác của phép thử

2.4 Liều (Dose)

 Liều là lượng chế phẩm thử đưa vào cơ thể động vật một lần cho từng mục đích thí nghiệm Ví dụ: Liều LD 0 , LD 50 , LD 100 , MLD, liều thử chất hạ áp, liều thử chất gây sốt.

 2.5 Một số thử nghiệm trên động vật áp dụng trong kiểm nghiệm thuốc

 2.5.1 Thử độc tính bất thường

 • Nguyên tắc:

 Độc tính bất thường của mẫu thử được đánh giá bằng số chuột nhắt sống và chết trong thời gian 48 giờ sau khi chuột nhận được một lượng thuốc thử thích hợp bằng đường tiêm hoặc đường uống.

 Thí nghiệm này thường được áp dụng cho các thuốc đông dược

có dược liệu độc như ô đầu, phụ tử hay các chế phẩm đông dược mới.

• Động vật thí nghiệm :

được có thai, cân nặng từ 18g đến 22g.

• Nguyên tắc tiến hành:

tiêm để tạo dung dịch có nồng độ quy định cho từng chuyên luận.

dung dịch chất thử bằng một trong các đường dùng sau:

• Đánh giá kết quả:

chuột nào chết, mẫu thử đạt yêu cầu Nếu có một hay nhiều chuột chết trong thời gian trên phải làm lại thí nghiệm lần thứ hai.

thì mẫu thử đạt yêu cầu Nếu có một hay nhiều chuột chết, mẫu thử không đạt yêu cầu.

2.2.2 Thử chất gây sốt

 • Nguyên tắc:

 Là một phương pháp sinh học để kiểm tra chất lượng mẫu thử, dựa trên sự tăng thân nhiệt của thỏ sau khi được tiêm thuốc thử cần thử vào tĩnh mạch tai

 Các dịch tiêm truyền yêu cầu bắt buộc phải thử chất gây sốt Các thuốc tiêm nếu ghi trên nhãn

“không có chất gây sốt” hoặc có thể tích từ 15ml trở lên cũng phải thử chất gây sốt

 Chỉ dùng thỏ có nhiệt độ từ 38 - 39,80C Trong thời gian lấy nhiệt độ không cho thỏ ăn, nhưng có thể cho uống nước Những con thỏ có sự chênh lệch nhiệt độ giữa các lần đo trong ngày ≥0,60C không được dùng để thí nghiệm.

 Lấy nhiệt độ ban đầu: Trước khi tiêm chất thử, lấy nhiệt

độ thỏ 2 lần, mỗi lần cách nhau 30 phút Hai nhiệt độ này không được chênh nhau quá 0,20C Nhiệt độ ban đầu là trung bình cộng của 2 lần đo

 Tiêm thuốc: Thể tích tiêm từ 0,5 – 10ml/ 1kg thỏ

 Theo dõi nhiệt độ thỏ ở những khoảng thời gian ít nhất

30 phút trong 3 giờ sau khi tiêm

 Nếu 4 thỏ trở lên trong 8 con của hai lần thí nghiệm tăng nhiệt độ ≥ 0,60C, hoặc nếu tổng số tăng nhiệt độ của 8 con > 3,70C thì chế phẩm coi như không đạt yêu cầu thử chất gây sốt.

 Phương pháp thử trên động vật còn được áp dụng để kiểm nghiệm nhiều loại dược phẩm có tính chất đặc biệt: Định lượng các hormon, corticotropin (ACTH), insulin, adrenalin, định lượng heparin, vitamin D, Oxytocin, digitalin và các chế phẩm chứa glucosid trợ tim, kiểm tra độ an toàn và hiệu lực của vacxin…

III KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG CÁC PHÉP THỬ VI SINH VẬT

 3.1 Đại cương về vi sinh vật

 Vi sinh vật là những cơ thể sống có kích thước rất nhỏ

mà mắt thường không nhìn thấy được Trong tự nhiên,

vi sinh vật tồn tại rất phong phú và đa dạng, chúng đóng vai trò tích cực vào vòng tuần hoàn vật chất Nhiều loại vsv được ứng dụng trong các lĩnh vực y tế, công nghiệp, nông nghiệp như các vsv có khả năng lên men rượu, sinh tổng hợp kháng sinh, vitamin, acid amin, vi sinh vật cố định đạm ở thực vật…

 Để phục vụ cho việc kiểm nghiệm thuốc bằng các thử nghiệm vi sinh vật, ta cần tìm hiểu một số đặc điểm chính của hai nhóm vi sinh vật là vi khuẩn và vi nấm

 3.1.1 Vi khuẩn (Bacteria)

 • Đặc điểm:

 Vi khuẩn là những vi sinh vật đơn bào có cấu tạo tế bào tiền nhân (Procaryote), có kích thước rất nhỏ, khoảng 0,2- 2,0 x 2- 8 μm Vi khuẩn có nhiều hình dáng khác m Vi khuẩn có nhiều hình dáng khác nhau: hình cầu, hình que, xoắn, dấu phẩy Vi khuẩn sinh sản vô tính, một số tạo bào tử Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ

có một bào tử Một số vi khuẩn có khả năng di động nhờ lông (flagella)

 • Phân loại:

 Với mục đích phục vụ cho công tác kiểm nghiệm thuốc,

ta cần tìm hiểu vi khuẩn theo các nhóm dựa trên hình thể, tính chất bắt màu thuốc nhuộm Gram và khẳ năng

hô hấp của chúng

Theo hình thể:

 + Cầu khuẩn (Coccus): Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus Diplococcus

 + Trực khuẩn (Bacillus): Bacillus anthracis ,Escherichia coli.

 + Xoắn khuẩn (Spirillum): Vi khuẩn hình lò xo như Treponema pallidum

 + Phẩy khuẩn (Vibrio): Vibrio cholerae (Vk hình lò xo).

 Theo tính chất bắt mầu thuốc nhuộm Gram

• Sinh sản của vi khuẩn:

- Vi khuẩn sinh sản bằng cách phân đôi tế bào

- Tốc độ phát triển của vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy tĩnh thay đổi theo thời gian và tuân theo một quy luật nhất định bao gồm 4 pha: Pha lag, pha logarit, pha ổn định và pha

tử vong

- Sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng có thể quan sát sau khoảng 18- 24 giờ nuôi cấy: làm đục môi trường, tạo váng trên bề mặt hoặc lắng cặn ở đáy ống nghiệm.

- Trong môi trường đặc, vi khuẩn tạo thành các khuẩn lạc có đặc tính riêng về hình dạng, kích thước, màu sắc.

Những tính chất trên giúp cho việc xác định vi khuẩn trong quá trình kiểm nghiệm thuốc.

3.1.2 Vi nấm (Microfungi)

 • Đặc điểm:

 Vi nấm có cấu tạo tế bào nhân thật (Eucaryote), tế bào rất nhỏ Nấm không có chất diệp lục, sống hoại sinh hoặc ký sinh, sinh sản vô tính hoặc hữu tính

 Vi nấm gồm: Nấm men (Yeast) và Nấm mốc (Mold)

3.1.3 Sự ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đối với quá trình phát triển của vi sinh vật

 Sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật liên quan chặt chẽ đến các điều kiện của môi trường bên ngoài

Đa số các yếu tố đều có một đặc tính tác dụng chung biểu hiện ở 3 điểm tác động: Tối thiểu, tối ưu, cực đại

 Các yếu tố bên ngoài có ảnh hưởng đến đời sống của vi sinh vật là vật lý, hoá học và sinh học, trong đó các yếu

tố vật lý là đáng chú ý nhất Yếu tố vật lý bao gồm nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm…

3.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật

nhằm đảm bảo cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển.

theo yêu cầu thí nghiệm, có pH trong khoảng quy định và phải vô trùng.

vào chất lượng môi trường.

3.2.1 Phương pháp pha chế môi trường

 Tiến hành qua 6 bước sau:

 3.2.2 Bảo quản môi trường

 - Môi trường bột khô được giữ ở 10 – 120C trong điều kiện khô, tránh ánh sáng

 - Môi trường đã pha chế được bảo quản ở 4 – 100C trong 1 – 2 tháng tuỳ theo thành phần môi trường

 3.2.3 Các phương pháp khử trùng

 Khử trùng là một quá trình làm cho một vật hoặc sản phẩm không còn vi sinh vật sống được Khử trùng được thực hiện bằng phương pháp vật lý, hoá học

 Chọn phương pháp khử trùng phụ thuộc vào tính chất lý hoá và độ bền vững của môi trường:

• Khử trùng bằng nhiệt khô:

băng, vải, gạc, dụng cụ thuỷ tinh…

đường, sữa, bia, máu, albumin… cần khử trùng ở nhiệt độ thấp bằng các phương pháp sau:

• Phương pháp lọc:

lỏng chảy qua màng lọc có kích thước lỗ lọc ≤ 0,22μm Vi khuẩn có nhiều hình dáng khác m Phần chảy qua phễu được đựng trong các dụng cụ vô trùng

buồng pha chế, tủ cấy vi sinh vật.

phẩm như dịch tiêm truyền, một số loại thuốc tiêm, thuốc tra mắt

và các dụng cụ y tế mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô trùng.

3.3.2 Nguyên tắc:

 Vi sinh vật có trong chế phẩm thử sẽ phát triển trên các môi trường dinh dưỡng thích hợp, chúng làm đục môi trường lỏng, tạo váng trên bề mặt hoặc lắng cặn ở đáy ống nghiệm Trên môi trường đặc vi khuẩn, vi khuẩn nấm mọc thành các khuẩn lạc đặc trưng.

 3.3.3 Môi trường

 Các loại môi trường

 Môi trường Thioglycolat (phát hiện vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí)

 Môi trường canh thang (phát hiện vi khuẩn hiếu khí)

 Môi trường Wilson – Blair (phát hiện vi khuẩn kỵ khí)

 Môi trường Sabuoraud lỏng (phát hiện vi nấm)

• Kiểm tra chất lượng môi trường:

- Độ vô trùng:

 Lấy 1- 2 ống (hoặc bình) môi trường mới làm ủ ở 30- 35 0 C ít nhất trong 4 ngày đối với môi trường phát hiện vi khuẩn, và 25- 28 0 C ít nhất trong 7 ngày với môi trường phát hiện vi nấm Sau thời gian nuôi cấy, các ống môi trường không được có vi sinh vật mọc

- Khả năng dinh dưỡng:

 Cấy vào mỗi ống môi trường thích hợp khoảng 100 tế bào các vi sinh vật sau:

 + Vi khuẩn hiếu khí: Staphylococcus aureus

 Baccillus subtilis

 Pseudomonas aeruginosa

 + Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium sporogenes

 + Vi khuẩn nấm: Candida albicans

3.3.4 Lấy mẫu thử:

 Thông thường, khi một lô có ít hơn 100 đơn vị, lấy 3 đơn vị để kiểm nghiệm Nếu nhiều hơn thì cứ 50 đơn vị lấy thêm 1 đơn vị nhưng không quá 10

 Tuy nhiên, khi lấy mẫu cũng cần dựa vào tiêu chuẩn nghành hoặc tiêu chuẩn cơ sở của từng sản phẩm để lấy mẫu cho thích hợp

3.3.5 Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật của chế phẩm thử

 Một số thuốc trong quá trình sản xuất dược thêm các chất bảo quản những chất này có thể ảnh hưởng đến sự phát hiện vi sinh vật có trong chế phẩm Một chế phẩm chưa biết có tác dụng ức chế đối với vi sinh vật hay không thì cần phải kiểm tra :

 Lấy ít nhất 2 ống của mỗi loại môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, vi nấm cấy vào 1 trong 2 ống chế phẩm cần thử.

 Cấy khoảng 100 tế bào vào 2 ống của môi trường tương ứng Nuôi cấy 30 - 35 0 C/ 7 ngày đối với vi khuẩn, và 25 - 28 0 C/ 7 ngày đối với vi nấm.

 Trong thời gian nuôi cấy, nếu vi sinh vật phát triển giống nhau (mọc nhanh và phong phú) trong các ống chứng và ống kiểm tra, chế phẩm thử được coi là không có tác dụng ức chế

 Nếu các ống có chất thử, vsv phát triển yếu hoặc không phát triển so với các ống không có chất thử, chế phẩm có chất ức chế.

 Tác dụng ức chế của chất thử phải được loại bỏ bằng cách pha

3.3.6 Phương pháp thử

 • Phương pháp dùng màng lọc:

gồm 2 bộ phận có thể tháo rời, ở giữa có lưới đỡ màng lọc Màng lọc nitrat cellulose thường dùng lọc nước, dầu và dung dịch alcol yếu Màng acetat cellulose để lọc các dung dịch alcol mạnh Lỗ màng có nhiều kích thước khác nhau,

nghiệm.

giữ lại trên màng, cấy màng lọc vào các môi trường thích hợp để phát hiện vi khuẩn, vi nấm.

• Phương pháp nuôi cấy trực tiếp:

phát hiện vi sinh vật giảm khi số lượng vi sinh vật ít và phân phối trong một thể tích chất thử lớn và không thực hiện được với các chế phẩm có tác dụng ức chế và các chất kháng sinh.

 • Lượng mẫu thử dùng trong thí nghiệm:

từng loại mẫu (bảng 2).

trường nuôi cấy 1% tween 80 hoặc các chất nhũ hoá khác với nồng độ thích hợp.

pepton 0,1% vô trùng theo tỷ lệ 1/10 trước khi cấy vào môi trường (dung dịch pepton cần tween 80 theo tỷ lệ 1ml/1lit

một đơn vị đóng gói trường nuôi cấy trường Chất lỏng:

2 ml

5 ml

10 ml Thường 10%

Toàn bộ một đơn vị đóng gói 1/ 2 khối lượng của một đơn

vị đong gói 100mg

10 ml

15 ml 20ml

• Kỹ thuật thử:

phẩm thử vào các môi trường phát hiện vi khuẩn, vi nấm Chất rắn là dạng bột có thể cho trực tiếp vào môi trường hoặc làm thành dung dich hay nhũ dịch 1% sau đó cấy vào môi trường.

dạng cho phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100 ml môi trường.

chảy qua để thu được ít nhất 15 ml và cấy vào 100ml môi trường

(Mỗi loại môi trường làm 2- 3 ống thử song song)

• Nhận định kết quả:

không có vi khuẩn, vi nấm phát triển.

lần thứ 2:

không vô trùng.

được làm lại lần 3 với số lượng mẫu gấp đôi:

3.4 Thử giới hạn vi sinh vật

 Các dược phẩm trong quá trình sản xuất thường bị nhiễm vi khuẩn, vi nấm Vì vậy, thử giới hạn vi sinh vật là một thử nghiệm bắt buộc cho các dược phẩm từ nguyên liệu đế thành phẩm không được tiệt trùng trong quá trinh sản xuất.

 3.3.4.1 Mục đích

hạn tối đa của số lượng vi khuẩn hiếu khí, vi nấm có trong 1g (hoặc 1ml) chế phẩm thử Đồng thời phát hiện các vi khuẩn chỉ điểm vệ sinh quy định không được có trong

thuốc là: Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia coli, các loài Salmonella, vi khuẩn

kỵ khí Clostridia.

3.3.4.2 Nguyên tắc

 • Phép thử được dựa trên nguyên tắc

 Đếm số vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc, nấm men có trong dược phẩm được thể hiện bằng các khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa thạch dinh dưỡng thích hợp Căn cứ vào các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hoá của từng loại vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh Trên cơ sở kết quả thí nghiệm đánh giá chất lượng của thuốc theo tiêu chuẩn dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở.

 3.3.4.3 Phương pháp thử

 • Môi trường:

 - Môi trường thạch casein - đậu tương (thử vi khuẩn hiếu khí).

 - Môi trường thạch thường (thử vi khuẩn hiếu khí)

 - Môi trường Sabouraud - kháng sinh ( thử vi nấm )

 Thêm 100mg benzylpenicillin và 1000mg tetracylin vào 1 lít môi trường đã tiệt trùng, hoặc 50 mg cloramphenicol cho 1 lít môi trường trước khi tiệt trùng

10-3,…tuỳ theo yêu cầu thí nghiệm.

 Mẫu thử là chất lỏng không hoà lẫn vào nước như dạng dầu, kem hoặc thuốc mỡ cần thêm một lượng chất nhũ hoá vô trùng thích hợp như tween 20, tween 80 làm nóng nhẹ để tạo một hỗn dịch đồng nhất

• Kiểm tra chất ức chế

 Kết quả thí nghiệm sẽ không có giá trị nếu trong mẫu thử có chất bảo quản hoặc các thành phần có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật Vì vậy, cần kiểm tra chất ức chế trước khi đếm số lượng vi sinh vật.

 Vi sinh vật chỉ thị:

 Staphylococcus aureus (đại diện vi khuẩn Gram +)

 Escherichia coli (đại diện vi khuẩn Gram -)

 Candida albicans (đại diện vi nấm)

 Các chủng trên được nuôi cấy trong các môi trường dinh dưỡng thích hợp sau 18 – 24 giờ (đối với vi khuẩn) và 24 giờ đến 48 giờ đối với vi nấm, được làm thành nhũ dịch có khoảng 100 tế bào/ml.