PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN

PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÚC TRÌNH THỰC TẬP CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN

MÃ HỌC PHẦN: CS307

Nguyễn Thị Kiều Nga B1303685

Lê Thị Mỹ Phượng B1303709

Lê Trần Quốc Thịnh B1303

Cần Thơ, 11/2015

Bài 1: PHÂN LẬP VÙNG GEN 16S rDNA VI KHUẨN

A NỘI DUNG

I Giới thiệu

a Kĩ thuật PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction), là một phương pháp cho phép khuếch đại một đoạn DNA dễ thực hiện, trong môi trường có sự hiện diện của Taq polymerase, mồi, 4 loại nu tự do, DNA khuôn ( được trích từ sinh vật có đoạn DNA cần khuếch đại) Một phản ứng PCR bao gồm các giai đoạn:

- Giai đoạn tách: tăng nhiệt độ từ 94-950C, nhằm tách các chuỗi DNA từ dạng xoắn kép sang dạng sợi đơn

- Giai đoạn gắn mồi: hạ nhiệt độ xuống dưới nhiệt độ để gắn kết các chuỗi mồi, khoảng từ 40-70oC, cho phép các chuỗi mồi đặc hiệu gắn lại trên đoạn DNA cơ bản ở vị trí có mã tương đồng

- Giai đoạn tổng hợp DNA: do tác dụng của enzyme taq polymerase thực hiện ở

72oC (nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của taq) Tiến hành sinh tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có đoạn mồi theo chiều 5’-3’

Phản ứng PCR thường được tiến hành 35 đến 40 chu kì

b Kĩ thuật RELP

RFLP hay còn gọi là kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn, là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA hệ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn DNA có độ dài xác định, số lượng các đoạn phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen Sử dụng kỹ thuật RFLP có thể xác định một tính trạng ở trạng thái đồng hợp hoặc dị hợp trong một các thể Vì vậy, RFLP là một chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là tốn kém và mất thời gian, sử dụng phóng xạ, đòi hỏi phải có một lượng DNA lớn (50 – 200 ng từ mỗi cá thể)

Enzyme cắt giới hạn (RE) là nhân tố chính trong kỹ thuật RFLP RE là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu RE hiện diện trong tế bào vi khuẩn như một hệ thống bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại sự xâm nhập của virus Hiện tại RE được chia thành 3 nhóm tùy theo tính chất cắt sợi DNA của chúng Trong

đó nhóm I và nhóm III không cắt ngay vị trí nhận biết Nhóm II là nhóm RE cắt ngay

vị trí nhận biết, thường vị trí nhận biết của nhóm này là từ 4 – 12 cặp nucleotide Đây

là nhóm RE được ứng dụng trong các kỹ thuật sinh học phân tử Hiện tại có khoảng hon 3400 RE được phân lập trong đó có hơn 540 RE đã được thương mại hóa

c Kỹ thuật PCR – RFLP và úng dụng kỹ thuật này trên vùng gen 16S rRNA

PCR – RFLP kỹ thuật này là sự kết hợp giữa phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) truyền thống và sự đa dạng của hệ thống RE Phương pháp này khắc phục được tính phức tạp của RFLP, cũng như ít tốn kém và an toàn hơn do thời gian thực hiện nhanh, không sử dụng phóng xạ

Ở vi khuẩn có 3 loại rRNA có hệ số lắng là 23S, 16S và 5S, với số lượng nucleotide tương ứng là 2904, 1542 và 120 Vùng gen 16S rDNA là vùng có số lượng nucleotide lý tưởng cho việc nghiên cứu đa dạng trên vi khuẩn không quá nhiều như vùng 23S và không quá ít như vùng 5S

Gen mã hóa rRNA của ribosome được xác định là đoạn gene bảo thủ nhất ở tất cả các tế bào Trình tự các đoạn gen này ở các vi sinh vật có khoảng cách di truyền rất xa nhau vẫn tìm thấy có sự giống nhau Điều này cho thấy, vùng gen mã hóa rRNA từ các sinh vật xa nhau về di truyền có thể được dùng để xác định mối liên hệ một cách chính xác, làm cho những khác biệt thật sự dễ dàng được xác định (nghĩa là sự khác biệt giả không thể xảy ra) Vì lí do này, gen mã hóa rRNA đã được sử dụng rộng rãi để xác định phân loài, phát sinh loài (mối quan hệ tiến hóa), và để ước tính mức độ đa dạng các loài vi khuẩn Vì vậy, sự so sánh các trình tự 16S rARN có thể biểu diễn mối liên

hệ tiến hóa giữa các vi sinh vật Đi tiên phong bằng các nghiên cứu như vậy, Carl Woese đã đề xuất hệ thống phân loại ba nhóm Archaea, vi khuẩn, và sinh vật nhân thật (Eucarya) – dựa trên các thông tin về trình tự vùng gen rARN

Do có những đặc điểm riêng hình thành trong suốt quá trình tiến hóa nên gen sao

mã các acid ARN ribosome (rARN) ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen 16S rRNA, được sử dụng như một công cụ trong việc phân loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi khuẩn (Woese, 1987) Theo Ludwing và Schleifer (1999) đã có tới hơn 16.000 gen 16S – rRNA từ các chủng vi khuẩn đã được xác định trình tự nucleotide Theo tạp chí y học, hiện nay có thể nói PCR 16S là chuẩn vàng “gold standard” trong việc phân biệt vi khuẩn trong thế giới vi sinh vật

Sự kết hợp giữa kỹ thuật PCR – RFLP và vùng gen 16S rRNA trong phân tích đa dạng vi sinh vật ngày càng được quan tâm do tính hiệu quả và tiện lợi Trong sự kết hợp này vùng gen 16S rRNA được khuếch đại bằng những cặp mồi chuyên biệt cho

từng loài vi khuẩn hoặc bằng những cặp mồi phổ thông cho hầu hết các chi vi khuẩn Sau đó sản phẩm PCR sẽ được cắt với RE để tìm ra sự khác biệt về trình tự của vùng gen này Kỹ thuật này giúp việc xác định đa dạng di truyền của các dòng vi khuẩn trở nên đơn giản và nhanh chóng hơn Tuy nhiên do sử dụng PCR nên phương pháp này cũng mang những nhược điểm của PCR như dễ nhiễm nếu thao tác và mẫu DNA nhiễm, sự chuyên biệt của mồi, sự chính xác của các thành phần trong phản ứng PCR Một số nghiên cứu về đa dạng di truyền vi sinh vật dựa vào vùng gen 16S rARN

và kỹ thuật PCR – RFLP đã được báo cáo: Gyaneshwar và cộng sự năm 2001 đã phân lập được sáu dòng vi khuẩn cố định đạm từ bề mặt của rễ và thân tiệt trùng của 4 giống

lúa khác nhau và xác định chúng thuộc loài Serratia marcescens Kết quả này được

thực hiện bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR nhân bản đoạn gen này rồi cắt chúng bằng enzyme exonuclease I và shrimp alkaline phosphate sau đó giải mã trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu của ngân hàng gen Alfonso et al năm 2000 đã sử dụng kỹ thuật PCR – RFLP trên vùng gen 16S rRNA và vùng ITS (16S – 23S rDNA intergenic spacer)

của 22 dòng vi khuẩn lên men lactic (acetic acid bacteria) với 8 RE là TaqI, CfoI,

HaeIII, AluI, HinfI, MboI, MspI và RsaI Kết quả cả 8 RE đều thể hiện sự đa hình.

Nghiên cứu của Jianping et al 2008 khảo sát sự đa dạng di truyền của tập đoàn vi khuẩn dựa vào vùng 16S trên đất trồng lúa bằng ở Ningxia, Trung Quốc, cặp mồi sử

dụng trong nghiên cứu này là 27F và 1492R và enzyme cắt giới hạn là MspI Jamal và

cộng sự năm 2009 sử dụng kỹ thuật PCR – RFLP trên vùng 16S của 16 dòng vi khuẩn Frankia – chủng vi khuẩn cố định đạm cộng sinh tạo nốt ở các cây không thuộc họ

đậu Các chủng này được phân lập từ nốt rễ cây phi lao (Casuarina) Nghiên cứu sử dụng cặp mồi F-968, R-1346 và R-1401 Kết quả phản ứng cắt với RE CfoI cho thấy

cả 16 dòng đều có vị trí cắt của RE này trong đó có 3 dòng có vị trí cắt khác biệt với các dòng còn lại Gisele và cộng sự năm 1996 ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP phân

tích 43 dòng vi khuẩn Rhizobium leguminosarum dựa vào vùng gen mã hóa cho 16S

và 23S rDNA

Trong nước các báo cáo về việc sử dụng phương pháp PCR – RFLP trên vùng gen 16S của vi sinh vật chưa nhiều Một số báo cáo về kỹ thuật này đã công bố: Lê Nhật Minh và cộng sự 2006 áp dụng kỹ thuật PCR – RFLP trên vùng gen 16S để xác định một số căn nguyên vi khuẩn gây viêm màng não ở trẻ em do vi khuẩn gây nên Trong nghiên cứu này 10 dòng vi khuẩn gây bệnh phân lập được PCR với mồi chuyên

biệt dựa vào vùng gen 16S và RE là HaeIII Nghiên cứu của Nguyễn Hoài Giang và

cộng sự 2005 đăng trên tạp chí nghiên cứu Y học về Phát hiện các đột biến Hemophilia gây máu khó đông trên người cũng ứng dụng kỹ thuât này

d Kĩ thuật điện di

Nguyên lý

Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến hơn cả do ưu điểm là nhanh và tương đối đơn giản Nguyên lý của phương pháp điện di dựa vào sự tích điện âm của phân tử DNA, trong điện trường do tích điện âm của phân tử DNA sẽ di chuyển từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) Các phân tử DNA sẽ di chuyển trong điện trường với các tốc độ khác nhau do chúng khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) Sự khác biệt này giúp các phân tử DNA dần dần tách nhau ra trên trường điện di giúp người nghiên cứu có thể tách được gen cần tìm hay khảo sát được số lượng cũng như vị trí của DNA nghiên cứu Trong trường điện di các phân tử có kích thước càng nhỏ sẽ di chuyển càng nhanh, những phân tử cùng kích thước sẽ di chuyển cùng tốc độ Khi quá trình điện di kết thúc các phân tử DNA sẽ được quan sát thấy nhờ sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang Hiện nay, thuốc nhuộm được sử dụng phố biến là safe view, chất này được khuyến cáo là không độc, không gây hại cho môi trường và sinh vật, hiệu quả tương đương thuốc nhuộm ethidium bromide (rất độc) được dùng trước kia Mỗi vệt sáng (băng-band) xuất hiện trên bản gel là sự thể hiện của một tập hợp các phân tử DNA có cùng kích thước Để ước lượng kích thước các phân tử DNA, phân tích thang chuẩn thường được

sử dụng Thang chuẩn hay còn gọi là “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (Moclecular weigth maker-MWM), đây là tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước được biết trước, dựa vào kích thước biết trước này người nghiên cứu có thể biết được kích thước đoạn DNA cần nghiên cứu

Có hai loại gel thường được sử dụng trong kỹ thuật điện di là agarose và polyacrylamide

Agarose: đây là loại gel thông dụng thường được sử dụng trong sinh học phân tử

do thao tác đơn giản, có thể phân tách được những đoạn phân tử DNA có kích thước trong khoảng từ 0.5-20kb Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang

Các loại dung dịch đệm thường được sử dụng trong điện di

Một số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường được dùng là Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ở nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8 Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tốc độ hơi khác nhau một chút trong 3 loại đệm trên có sự khác nhau về cường lực ion của đệm Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn (conductivity) Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện

di, thì sẽ không có sự dịch chuyển cần thiết của DNA trong gel Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dung dịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm gel nóng chảy

II Mục đích

Phân lập được vùng gen 16S rDNA đặc trưng của vi khuẩn để điều tra khảo sát

sự đa dạng của các dòng vi khuẩn với nhau cũng như đặc tính riêng của từng vi khuẩn

III Vật liệu

1 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

- Máy li tâm Eppendorf

- Máy PCR Perkin Elmer 9700

- Máy chụp gen và đọc hình BioRad UV 2000

- Bộ Micropipette

- Bộ điện di một chiều

- Ống type eppendorf

- Máy ủ

2 Hóa chất

- Dung dịch TE 1X, pH=8

- Dịch vi khuẩn

IV Tiến hành thí nghiệm

1 Phân lập vùng gen 16S bằng phương pháp li trích sốc nhiệt (Santos et al 2001), gồm các bước sau:

Bước 1: Hút vào ống eppendorf (2,2 ml) 2ml dung dịch vi khuẩn đã chuẩn bị sẵn Bước 2: Ly tâm trong 3 phút với tốc độ 13.000 rpm bằng máy li tâm Bước này

có tác dụng phá vỡ vỏ tế bào và phóng thích DNA bên trong

Bước 3: Thu cặn Đổ bỏ phần dung dịch trong phía trên để loại bỏ những phần tạp chất và thu lại gennome

Bước 4: Cho thêm 500 µl TE pH 8, trộn đều bằng pipet trong 1 phút Dung dịch

TE pH8 giúp hòa tan kết tủa và giúp DNA không bị biến tính

Bước 5: Ly tâm thu cặn để thu được DNA có độ tinh sạch cao

Bước 6: Cho thêm 500 µl TE pH 8, trộn đều mẫu trong 1 phút bằng pipet Bước này giúp làm sạch gennome vi khuẩn một lần nữa và loại bỏ phần không phải DNA Bước 7: Ly tâm thu cặn để thu được DNA có độ tinh sạch cao

Bước 8: Thu cặn và thêm 1000 µl TE 1X giúp DNA ổn định và không bị biến tính

Bước 9: Ủ ở 950C trong vòng 10 phút Nhằm làm biến tính DNA

Bước 10: Ly tâm ở 13000 vòng/phút

Bước 11: Hút phần trong (có chứa DNA) bỏ phần tủa

Trữ mẫu ở - 200C

2 Tiến hành thực hiện phản ứng khuếch đại vùng gen 16S rDNA

Ta sử dụng 2 loại mồi là 27F và 1492R

Tiến hành pha chế thành phần phản ứng cho 4 mẫu phản ứng với thể tích mỗi mẫu là 15 µl

Primer(27F và 1495R) 0,6*5+ 0,6*5= 3

Sau khi bổ sung các thành phần theo thứ tự trên, ta tiến hành chạy phản ứng PCR trong thời gian 2 đến 3 tiếng với:

Tháo xoắn: 94oC trong 5 phút

94oC trong 1 phút

Gắn mồi: 53oC trong 1 phút 30 chu kỳ

Kéo dài: 72oC trong 1 phút 30 giây

Ổn định: 72oC trong 10 phút

V Kết quả và thảo luận

Kết quả được phân tích bằng kĩ thuật điện di trên gel agarose như hình dưới:

Hình 1: Vùng 16S của một số dòng vi khuẩn.

Nhận xét:

Mẫu 1 đến mẫu 4 nhìn chung khá tốt so với yêu cầu của thí nghiệm Vùng khuếch đại 4 mẫu này có độ lớn tương đối chính xác với vùng 16S của vi khuẩn là xấp xỉ band

1492 nu Nhưng bên cạnh đó cũng thấy được các vệt sáng kéo dài từ giếng đến band chính chứng tỏ rằng DNA có lẫn tạp chất và có các sản phẩm không đặc hiệu trong quá trình khuếch đại vùng gen mục tiêu hay các gen đứt gãy khi thao tác

Các mẫu 5, 8, 9, 13 không có sự xuất hiện của band chứng tỏ rằng phản ứng PCR chưa xảy ra, nguyên nhân có thể là do quá trình thao tác dẫn đến thành phần phản ứng không đủ thể tích hoặc do quá trình ly trích DNA của vi khuẩn, chúng đã bị mất hết hoặc đã bị gãy nát làm cho không có gen mục tiêu để mồi được gắn vào gen để khuếch đại

Các mẫu 6, 7, 14, 15 thì cũng có xuất hiện các band điện di có khối lượng tương đương với sản phẩm cần tìm nhưng vệt sáng hơi mờ chứng tỏ rằng mẫu DNA ban đầu khá ít do đó sản phẩm sau PCR có số bản sao không cao Nguyên nhân có thể do trong quá trình load mẫu, DNA bị rơi ra khỏi giếng hoặc cũng có thể do quá trình trộn mẫu với thuốc nhuộm không tốt làm cho DNA nhuộm màu không hoàn toàn dẫn đến chụp hình không thấy

Bài 2 KHẢO SÁT SỰ KHÁC BIỆT VÙNG 16S rDNA

BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN

I Mục đích

Khảo sát sự đa dạng và tiến hóa của các mẫu vi khuẩn bằng việc sử dụng các enzymes chuyên biệt

II Vật liệu

1 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

- Ống eppendorf

- Máy lắc ủ

- Máy PCR

- Máy điện di

2 Vật liệu

Enzyme cắt giới hạn, sản phẩm PCR bài trước, gel agarose 2%, loading buffer

III Tiến hành thí nghiệm

Để đánh giá sự đa dạng của vùng gen 16S của vi khuẩn, ta sử dụng 2 loại enzyme cắt giới hạn lần lượt là:

- Nhóm 1 và nhóm 2 sử dụng EcoRI có vùng cắt là 5’-GAATTC- 3’ cho ra các

đoạn DNA đầu tà, ủ ở 370C trong 1 giờ với dung dịch đệm tango

- Nhóm 3 và nhóm 4 sử dụng SmaI có vùng cắt là 5’-CCCGGG-3’ cho ra các đoạn

DNA đầu bằng, ủ ở 300C trong 1 giờ với dung dịch đệm tango

Sau khi rã đông mẫu ta tiến hành thí nghiệm Tiến hành pha chế thành phần phản ứng cho 5 mẫu phản ứng với thể tích mỗi mẫu là 15 µl

Sau khi cho các thành phần phản ứng, ta trộn đều chúng trong ống eppendorf rồi chuyển qua máy ủ 370C trong vòng 1 tiếng

Sau khi ủ xong ta tiến hành load mẫu để điện di đánh giá kết quả