PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN PHÚC TRÌNH THỰC tập CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÚC TRÌNH THỰC TẬP CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN MÃ HỌC PHẦN: CS307 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TS NGUYỄN THỊ PHA Trần Thúy An B1303 Nguyễn Thị Kiều Nga B1303685 Lê Thị Mỹ Phượng B1303709 Nguyễn Thị Tâm B1303 Lê Trần Quốc Thịnh B1303 Cần Thơ, 11/2015 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ Bài 1: PHÂN LẬP VÙNG GEN 16S rDNA VI KHUẨN A NỘI DUNG I Giới thiệu a Kĩ thuật PCR PCR (Polymerase Chain Reaction), phương pháp cho phép khuếch đại đoạn DNA dễ thực hiện, môi trường có diện Taq polymerase, mồi, loại nu tự do, DNA khuôn ( trích từ sinh vật có đoạn DNA cần khuếch đại) Một phản ứng PCR bao gồm giai đoạn: - Giai đoạn tách: tăng nhiệt độ từ 94-95 0C, nhằm tách chuỗi DNA từ dạng xoắn kép sang dạng sợi đơn - Giai đoạn gắn mồi: hạ nhiệt độ xuống nhiệt độ để gắn kết chuỗi mồi, khoảng từ 40-70oC, cho phép chuỗi mồi đặc hiệu gắn lại đoạn DNA vị trí có mã tương đồng - Giai đoạn tổng hợp DNA: tác dụng enzyme taq polymerase thực 72oC (nhiệt độ tối ưu cho hoạt động taq) Tiến hành sinh tổng hợp DNA vị trí có đoạn mồi theo chiều 5’-3’ Phản ứng PCR thường tiến hành 35 đến 40 chu kì b Kĩ thuật RELP RFLP hay gọi kỹ thuật đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn, kỹ thuật sử dụng endonuclease giới hạn cắt DNA hệ gen trình tự nhận biết đặc trưng tạo hàng loạt đoạn DNA có độ dài xác định, số lượng đoạn phụ thuộc vào số điểm nhận biết hệ gen Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định tính trạng trạng thái đồng hợp dị hợp thể Vì vậy, RFLP thị tin cậy phân tích liên kết chọn giống Tuy nhiên, kỹ thuật có nhược điểm tốn thời gian, sử dụng phóng xạ, đòi hỏi phải có lượng DNA lớn (50 – 200 ng từ cá thể) Enzyme cắt giới hạn (RE) nhân tố kỹ thuật RFLP RE enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu RE diện tế bào vi khuẩn hệ thống bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại xâm nhập virus Hiện RE chia thành nhóm tùy theo tính chất cắt sợi DNA chúng Trong nhóm I nhóm III không cắt vị trí nhận biết Nhóm II nhóm RE cắt vị trí nhận biết, thường vị trí nhận biết nhóm từ – 12 cặp nucleotide Đây Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ nhóm RE ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử Hiện có khoảng hon 3400 RE phân lập có 540 RE thương mại hóa c Kỹ thuật PCR – RFLP úng dụng kỹ thuật vùng gen 16S rRNA PCR – RFLP kỹ thuật kết hợp phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) truyền thống đa dạng hệ thống RE Phương pháp khắc phục tính phức tạp RFLP, tốn an toàn thời gian thực nhanh, không sử dụng phóng xạ Ở vi khuẩn có loại rRNA có hệ số lắng 23S, 16S 5S, với số lượng nucleotide tương ứng 2904, 1542 120 Vùng gen 16S rDNA vùng có số lượng nucleotide lý tưởng cho việc nghiên cứu đa dạng vi khuẩn không nhiều vùng 23S không vùng 5S Gen mã hóa rRNA ribosome xác định đoạn gene bảo thủ tất tế bào Trình tự đoạn gen vi sinh vật có khoảng cách di truyền xa tìm thấy có giống Điều cho thấy, vùng gen mã hóa rRNA từ sinh vật xa di truyền dùng để xác định mối liên hệ cách xác, làm cho khác biệt thật dễ dàng xác định (nghĩa khác biệt giả xảy ra) Vì lí này, gen mã hóa rRNA sử dụng rộng rãi để xác định phân loài, phát sinh loài (mối quan hệ tiến hóa), để ước tính mức độ đa dạng loài vi khuẩn Vì vậy, so sánh trình tự 16S rARN biểu diễn mối liên hệ tiến hóa vi sinh vật Đi tiên phong nghiên cứu vậy, Carl Woese đề xuất hệ thống phân loại ba nhóm Archaea, vi khuẩn, sinh vật nhân thật (Eucarya) – dựa thông tin trình tự vùng gen rARN Do có đặc điểm riêng hình thành suốt trình tiến hóa nên gen mã acid ARN ribosome (rARN) vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt gen 16S rRNA, sử dụng công cụ việc phân loại xác định mối quan hệ di truyền chủng vi khuẩn (Woese, 1987) Theo Ludwing Schleifer (1999) có tới 16.000 gen 16S – rRNA từ chủng vi khuẩn xác định trình tự nucleotide Theo tạp chí y học, nói PCR 16S chuẩn vàng “gold standard” việc phân biệt vi khuẩn giới vi sinh vật Sự kết hợp kỹ thuật PCR – RFLP vùng gen 16S rRNA phân tích đa dạng vi sinh vật ngày quan tâm tính hiệu tiện lợi Trong kết hợp vùng gen 16S rRNA khuếch đại cặp mồi chuyên biệt cho Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ loài vi khuẩn cặp mồi phổ thông cho hầu hết chi vi khuẩn Sau sản phẩm PCR cắt với RE để tìm khác biệt trình tự vùng gen Kỹ thuật giúp việc xác định đa dạng di truyền dòng vi khuẩn trở nên đơn giản nhanh chóng Tuy nhiên sử dụng PCR nên phương pháp mang nhược điểm PCR dễ nhiễm thao tác mẫu DNA nhiễm, chuyên biệt mồi, xác thành phần phản ứng PCR Một số nghiên cứu đa dạng di truyền vi sinh vật dựa vào vùng gen 16S rARN kỹ thuật PCR – RFLP báo cáo: Gyaneshwar cộng năm 2001 phân lập sáu dòng vi khuẩn cố định đạm từ bề mặt rễ thân tiệt trùng giống lúa khác xác định chúng thuộc loài Serratia marcescens Kết thực cách sử dụng kỹ thuật PCR nhân đoạn gen cắt chúng enzyme exonuclease I shrimp alkaline phosphate sau giải mã trình tự so sánh với sở liệu ngân hàng gen Alfonso et al năm 2000 sử dụng kỹ thuật PCR – RFLP vùng gen 16S rRNA vùng ITS (16S – 23S rDNA intergenic spacer) 22 dòng vi khuẩn lên men lactic (acetic acid bacteria) với RE TaqI, CfoI, HaeIII, AluI, HinfI, MboI, MspI RsaI Kết RE thể đa hình Nghiên cứu Jianping et al 2008 khảo sát đa dạng di truyền tập đoàn vi khuẩn dựa vào vùng 16S đất trồng lúa Ningxia, Trung Quốc, cặp mồi sử dụng nghiên cứu 27F 1492R enzyme cắt giới hạn MspI Jamal cộng năm 2009 sử dụng kỹ thuật PCR – RFLP vùng 16S 16 dòng vi khuẩn Frankia – chủng vi khuẩn cố định đạm cộng sinh tạo nốt không thuộc họ đậu Các chủng phân lập từ nốt rễ phi lao (Casuarina) Nghiên cứu sử dụng cặp mồi F-968, R-1346 R-1401 Kết phản ứng cắt với RE CfoI cho thấy 16 dòng có vị trí cắt RE có dòng có vị trí cắt khác biệt với dòng lại Gisele cộng năm 1996 ứng dụng kỹ thuật PCR – RFLP phân tích 43 dòng vi khuẩn Rhizobium leguminosarum dựa vào vùng gen mã hóa cho 16S 23S rDNA Trong nước báo cáo việc sử dụng phương pháp PCR – RFLP vùng gen 16S vi sinh vật chưa nhiều Một số báo cáo kỹ thuật công bố: Lê Nhật Minh cộng 2006 áp dụng kỹ thuật PCR – RFLP vùng gen 16S để xác định số nguyên vi khuẩn gây viêm màng não trẻ em vi khuẩn gây nên Trong nghiên cứu 10 dòng vi khuẩn gây bệnh phân lập PCR với mồi chuyên Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ biệt dựa vào vùng gen 16S RE HaeIII Nghiên cứu Nguyễn Hoài Giang cộng 2005 đăng tạp chí nghiên cứu Y học Phát đột biến Hemophilia gây máu khó đông người ứng dụng kỹ thuât d Kĩ thuật điện di Nguyên lý Đây phương pháp sử dụng phổ biến ưu điểm nhanh tương đối đơn giản Nguyên lý phương pháp điện di dựa vào tích điện âm phân tử DNA, điện trường tích điện âm phân tử DNA di chuyển từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) Các phân tử DNA di chuyển điện trường với tốc độ khác chúng khác kích thước, điện tích, mức độ cuộn xoắn dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) Sự khác biệt giúp phân tử DNA tách trường điện di giúp người nghiên cứu tách gen cần tìm hay khảo sát số lượng vị trí DNA nghiên cứu Trong trường điện di phân tử có kích thước nhỏ di chuyển nhanh, phân tử kích thước di chuyển tốc độ Khi trình điện di kết thúc phân tử DNA quan sát thấy nhờ sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang Hiện nay, thuốc nhuộm sử dụng phố biến safe view, chất khuyến cáo không độc, không gây hại cho môi trường sinh vật, hiệu tương đương thuốc nhuộm ethidium bromide (rất độc) dùng trước Mỗi vệt sáng (băng-band) xuất gel thể tập hợp phân tử DNA có kích thước Để ước lượng kích thước phân tử DNA, phân tích thang chuẩn thường sử dụng Thang chuẩn hay gọi “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” (Moclecular weigth maker-MWM), tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước biết trước, dựa vào kích thước biết trước người nghiên cứu biết kích thước đoạn DNA cần nghiên cứu Có hai loại gel thường sử dụng kỹ thuật điện di agarose polyacrylamide Agarose: loại gel thông dụng thường sử dụng sinh học phân tử thao tác đơn giản, phân tách đoạn phân tử DNA có kích thước khoảng từ 0.5-20kb Gel đổ giá thể nằm ngang điện di thực theo phương nằm ngang Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ Các loại dung dịch đệm thường sử dụng điện di Một số đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường dùng Trisacetate-EDTA (TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) Tris-phosphate-EDTA (TPE) nồng độ khoảng 50 mM pH 7,5-7,8 Các đoạn DNA dịch chuyển với tốc độ khác chút loại đệm có khác cường lực ion đệm Đệm thiết lập giá trị pH, mà cung cấp ion để hỗ trợ cho độ dẫn (conductivity) Nếu dùng nước thay đệm trình điện di, dịch chuyển cần thiết DNA gel Ngược lại, sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dung dịch stock ×10), nhiệt độ gel tăng cao làm gel nóng chảy II Mục đích Phân lập vùng gen 16S rDNA đặc trưng vi khuẩn để điều tra khảo sát đa dạng dòng vi khuẩn với đặc tính riêng vi khuẩn III Vật liệu Dụng cụ thiết bị thí nghiệm - Máy li tâm Eppendorf - Máy PCR Perkin Elmer 9700 - Máy chụp gen đọc hình BioRad UV 2000 - Bộ Micropipette - Bộ điện di chiều - Ống type eppendorf - Máy ủ Hóa chất - Dung dịch TE 1X, pH=8 - Dịch vi khuẩn IV Tiến hành thí nghiệm Phân lập vùng gen 16S phương pháp li trích sốc nhiệt (Santos et al 2001), gồm bước sau: Bước 1: Hút vào ống eppendorf (2,2 ml) 2ml dung dịch vi khuẩn chuẩn bị sẵn Bước 2: Ly tâm phút với tốc độ 13.000 rpm máy li tâm Bước có tác dụng phá vỡ vỏ tế bào phóng thích DNA bên Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ Bước 3: Thu cặn Đổ bỏ phần dung dịch phía để loại bỏ phần tạp chất thu lại gennome Bước 4: Cho thêm 500 µl TE pH 8, trộn pipet phút Dung dịch TE pH8 giúp hòa tan kết tủa giúp DNA không bị biến tính Bước 5: Ly tâm thu cặn để thu DNA có độ tinh cao Bước 6: Cho thêm 500 µl TE pH 8, trộn mẫu phút pipet Bước giúp làm gennome vi khuẩn lần loại bỏ phần DNA Bước 7: Ly tâm thu cặn để thu DNA có độ tinh cao Bước 8: Thu cặn thêm 1000 µl TE 1X giúp DNA ổn định không bị biến tính Bước 9: Ủ 950C vòng 10 phút Nhằm làm biến tính DNA Bước 10: Ly tâm 13000 vòng/phút Bước 11: Hút phần (có chứa DNA) bỏ phần tủa Trữ mẫu - 200C Tiến hành thực phản ứng khuếch đại vùng gen 16S rDNA Ta sử dụng loại mồi 27F 1492R Primer 27F 1492R Trình tự Primer 5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ Tiến hành pha chế thành phần phản ứng cho mẫu phản ứng với thể tích mẫu 15 µl Thành phần Thể tích (µl ) Bi H2O PCR buffer Primer(27F 1495R) Taq DNA 9,65*5= 48,25 3*5= 15 0,6*5+ 0,6*5= 0,15*5= 0,75 1*5= Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ Sau bổ sung thành phần theo thứ tự trên, ta tiến hành chạy phản ứng PCR thời gian đến tiếng với: Tháo xoắn: 94oC phút 94oC phút Gắn mồi: 53oC phút Kéo dài: 30 chu kỳ 72oC phút 30 giây Ổn định: 72oC 10 phút V Kết thảo luận Kết phân tích kĩ thuật điện di gel agarose hình dưới: Hình 1: Vùng 16S số dòng vi khuẩn Nhận xét: Mẫu đến mẫu nhìn chung tốt so với yêu cầu thí nghiệm Vùng khuếch đại mẫu có độ lớn tương đối xác với vùng 16S vi khuẩn xấp xỉ band 1492 nu Nhưng bên cạnh thấy vệt sáng kéo dài từ giếng đến band chứng tỏ DNA có lẫn tạp chất có sản phẩm không đặc hiệu trình khuếch đại vùng gen mục tiêu hay gen đứt gãy thao tác Các mẫu 5, 8, 9, 13 xuất band chứng tỏ phản ứng PCR chưa xảy ra, nguyên nhân trình thao tác dẫn đến thành phần phản ứng không đủ thể tích trình ly trích DNA vi khuẩn, chúng bị hết bị gãy nát làm cho gen mục tiêu để mồi gắn vào gen để khuếch đại Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ Các mẫu 6, 7, 14, 15 có xuất band điện di có khối lượng tương đương với sản phẩm cần tìm vệt sáng mờ chứng tỏ mẫu DNA ban đầu sản phẩm sau PCR có số không cao Nguyên nhân trình load mẫu, DNA bị rơi khỏi giếng trình trộn mẫu với thuốc nhuộm không tốt làm cho DNA nhuộm màu không hoàn toàn dẫn đến chụp hình không thấy Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ Bài KHẢO SÁT SỰ KHÁC BIỆT VÙNG 16S rDNA BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN I Mục đích Khảo sát đa dạng tiến hóa mẫu vi khuẩn việc sử dụng enzymes chuyên biệt II Vật liệu Dụng cụ thiết bị thí nghiệm - Ống eppendorf - Máy lắc ủ - Máy PCR - Máy điện di Vật liệu Enzyme cắt giới hạn, sản phẩm PCR trước, gel agarose 2%, loading buffer III Tiến hành thí nghiệm Để đánh giá đa dạng vùng gen 16S vi khuẩn, ta sử dụng loại enzyme cắt giới hạn là: - Nhóm nhóm sử dụng EcoRI có vùng cắt 5’-GAATTC- 3’ cho đoạn DNA đầu tà, ủ 370C với dung dịch đệm tango - Nhóm nhóm sử dụng SmaI có vùng cắt 5’-CCCGGG-3’ cho đoạn DNA đầu bằng, ủ 300C với dung dịch đệm tango Sau rã đông mẫu ta tiến hành thí nghiệm Tiến hành pha chế thành phần phản ứng cho mẫu phản ứng với thể tích mẫu 15 µl Thành phần Thể tích (µl) Bi H2O 10X Buffer RE Sản phẩm PCR 16S 4,5*5= 22,5 1,5*5= 7,5 1*5= 8*5= 40 Sau cho thành phần phản ứng, ta trộn chúng ống eppendorf chuyển qua máy ủ 370C vòng tiếng Sau ủ xong ta tiến hành load mẫu để điện di đánh giá kết Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 ... ngang điện di thực theo phương nằm ngang Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ Các loại dung dịch đệm thường sử dụng điện di Một số đệm điện di thích... NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm chiều thứ loài vi khuẩn cặp mồi phổ thông cho hầu hết chi vi khuẩn Sau sản phẩm PCR cắt với RE để tìm khác biệt trình tự vùng... đủ thể tích trình ly trích DNA vi khuẩn, chúng bị hết bị gãy nát làm cho gen mục tiêu để mồi gắn vào gen để khuếch đại Viện NC & PT CNSH Công nghệ sinh học K39 Thực tập Công nghệ di truyền Nhóm