PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM

PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM PHÚC TRÌNH THỰC tập PROTEIN và ENZIM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHÚC TRÌNH THỰC TẬP PROTEIN & ENZYME

MỤC LỤC

BÀI 1: TRÍCH LY PROTEIN 1

I.ĐỊNH NGHĨA 1

II.NGUYÊN TẮC 1

III.DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VÀ NGUYÊN VẬT LIỆU 1

1.Dụng cụ thí nghiệm: 1

2.Quy trình trích ly protein: 2

IV.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3

1.Kết quả: 3

2.Thảo luận: 3

BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 4

I.DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 4

1.Dụng cụ 4

2.Hóa chất 4

II.TIẾN HÀNH 4

III.KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 5

1.Kết quả 5

2.Thảo luận 6

2.1Phương pháp trao đổi ion 6

2.2Trạng thái tích điện của protein – enzyme ở điều kiện trích ly, pH 4, pH 6 7

2.3pH của mỗi phân đoạn được rửa giải Ý nghĩa thực tiễn của các trị số pH vừa xác định được trong quá trình tinh sạch 7

2.4Hiện tượng nhiều hơn 1 phân đoạn protein được rửa giải khỏi cột gel trao đổi ion .8 BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD 9

I.GIỚI THIỆU 9

II.NỘI DUNG THỰC HÀNH 10

1.Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 10

2.Tiến hành thí nghiệm 10

2.1Xây dựng đường chuẩn BSA 10

2.2Định lượng protein có trong mẫu 11

III.KẾT QUẢ 11

1.Xây dựng đường chuẩn BSA 11

2.Định lượng protein có trong mẫu 12

IV.ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 13

BÀI 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KUNITZ CẢI TIẾN 15

I.THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 15

II.TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 15

1.Dựng đường chuẩn Tyrosin 15

2.Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz cải tiến 16

3.Tính toán kết quả: 18

III.ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 18

BÀI 5: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE( SDS – PAGE) 19

BÀI 1: TRÍCH LY PROTEIN

Trích ly enzyme là quá trình thu nhận enzyme thô từ các nguồn nguyên liệuđộng vật, thực vật và vi sinh vật để thực hiện các bước tinh sạch và các nghiên cứukhác

Dịch trích enzyme thô từ thịt khóm là nguồn enzyme thô cho các thí nghiệm kếtiếp để tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, khảo sát hàm lượng proteinbằng phương pháp Bradford, khảo sát hoạt tính bằng phương pháp Kunitz cải tiến, và

xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.

Thu nhận các enzyme trong tế bào nhưng vẫn duy trì hoạt động của enzyme ởmức cao nhất, tránh gây biến tính và hạn chế những ảnh hưởng bất lợi tới enzyme

Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học: Cắt, nghiền, ép bằng thủ công và dùng

máy ép nước trái -> Tế bào được bao bọc và bảo vệ bởi màng tế bào nên để ly trích

enzyme trước tiên ta cần phá vỡ màng tế bào Chú ý: Mẫu cần được làm sạch và phảitrữ lạnh nếu chưa tiến hành trích ly enzyme

Thu nhận enzyme bằng phương pháp li tâm: Phương pháp này được sử dụngrộng rãi trong công nghệ enzyme nhằm tách enzyme ngoại bào hay nội bào (sau khiphá vỡ tế bào) ra khỏi dung dịch

2 Quy trình trích ly protein:

Trữ mẫu (dịch enzyme): 22ml/bọc + 1ml/ống eppendoft (6 ống) + 1 bọc trữ phần mẫu dư 60ml

Ghi tên nhãn và đem vào tủ lạnh trữ

¼ trái khóm (m1 gr)

Bỏ Thu phần vỏ(m2 gr)

Ghi nhận tổng thể tích dịch enzyme thu được V2 (ml).

Lưu ý: Toàn bộ quy trình cần thao tác nhanh, trong điều kiện lạnh 4oC (trữtrong các dụng cụ đặt trong khay nước đá khi chờ đợi các nhóm và thực hiện cácbước) để hạn chế sự biến tính của enzyme cũng như hạn chế sự phân giải của cácenzyme proteolytic có trong dịch chiết

1 Kết quả:

Thu được dịch trích enzyme thô từ thịt khóm

Khối lượng ¼ trái khóm (m1): 344,4gr

Tại sao phải xác định các thông số đầu vào của mỗi nguyên liệu?

• Để tính hiệu xuất thu hồi

• Hiểu được công dụng, liều lượng trong từng trường hợp sử dụng

• Đạt hiệu trái cao trong sản xuất, tránh lãng phí nguyên liệu

- Dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 4

- Dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 6

Bước 1 Chuẩn bị gel SP – StreamLine:

Cân bằng 10 gram bằng gel SP – StreamLine bằng dung dịch đệm ammoniumacetate 0,1M, pH 4

Bước 2 Chuẩn bị cột gel SP – StreamLine:

Nhồi gel vào cột thủy tinh, cân bằng cột gel với dung dịch đệm ammoniumacetate 0,1M, pH 4 (3 lần thể tích cột), tốc độ dòng chảy 1 mL/phút

Bước 3 Load mẫu lên cột:

Bơm 40 mL dung dịch nước khóm (bromelain) pha loãng với dung dịchammonium acetate (tỉ lệ 1:1) qua cột với tốc độ 1 mL/phút

Bước 4 Rửa cột gel:

Rửa cột bằng dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH 4 với tốc độ dòngchảy là 1 mL/phút; theo dõi quá trình rửa cột qua sắc ký đồ, cho đến khi phân đoạnprotein không bám trên cột được đẩy ra hết khỏi cột Thu phân đoạn protein khôngbám, đồng nhất mẫu và xác định thể tích (VUB mL)

Bước 5 Rửa giải:

Protein bám trên cột gel được rửa giải bằng dung dịch đệm ammonium acetate0,1M, pH 6 với tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút; thu dung dịch protein được rửa giải;theo dõi sắc ký đồ để xác định các phân đoạn protein khác nhau

Bước 6 Thu phân đoạn và trữ mẫu:

Thu mẫu vào các ống nghiệm thủy tinh trong quá trình sắc ký (trung bìnhkhoảng 5 mL/ống).

Xác định lượng protein trong mỗi ống bằng cách đo quang phổ ở bước sóng 280

+ Phần dịch enzim của mỗi phân đoạn còn dư cho vào 1 bọc khác để trữ lại

Hình 2.1 Biểu đồ sắc ký dựa vào chỉ số OD ở độ hấp thụ 280 nm

Bảng 2.2 Kết quả phân đoạn thu được

2.1 Phương pháp trao đổi ion

 Nguyên lý chung của sắc ký trao đổi ion:

Tách các phân tử dựa trên điện tích: protein mang điện tích bề mặt, tùy vào pHcủa môi trường chúng sẽ tích điện dương hay âm, với pH < pI protein tích điện dương

và pH > pI protein sẽ tích điện âm Vì vậy có thể chọn loại gel thích hợp cho từng loạiprotein dựa vào pI và độ bền pH của protein

 Có hai loại gel trao đổi ion:

- Gel trao đổi ion dương: có các nhóm chức năng mang điện tích âm, tương tácion với các protein mang điện tích dương

- Gel trao đổi ion âm: có các nhóm chức năng mang điện tích dương, tương tácion với các protein mang điện tích âm

Các protein được đẩy tuần tự theo lực tương tác, các protein tương tác ion yếuvới gel sẽ được đẩy ra trước

2.2 Trạng thái tích điện của protein – enzyme ở điều kiện trích ly, pH 4, pH 6

 pH 4: Gel trao đổi ion sử dụng trong thí nghiệm mang điện tích âm pI của

bromelain là 4,6 nên khi rửa cột gel bằng pH 4 bromelain (và một số protein khác) sẽtích điện dương (pH < pI), tương tác với gel nên bám vào cột gel Protein thu đượctrong giai đoạn này là protein không bám (tích điện âm) Dựa vào kết quả đo OD củamẫu thu được khi rủa với dung dịch đệm pH 4, ta thấy lúc đầu hàm lượng protein thuđược cao, sau đó thấp dần Khi giá trị OD của mẫu thu được gần bằng với giá trị ODcủa dung dịch đệm dùng để cân bằng cột ban đầu thì dừng lại, giai đoạn thu proteinkhông bám kết thúc

 pH 6: Khi rửa giải với dung dịch đệm pH 6, bromelain (và một số protein khác)

lúc này sẽ tích điện âm (do pH > pI) Do vậy chúng không thể bám vào cột gel và sẽ bịđẩy ra khỏi cột

2.3 pH của mỗi phân đoạn được rửa giải Ý nghĩa thực tiễn của các trị số

pH vừa xác định được trong quá trình tinh sạch

Bảng 2.4 Giá trị pH của mỗi phân đoạn

- F1: do dung dung dịch đệm pH 6 để rửa giải nên pH của các phân đoạn tăngdần lên, ở pH 4,5 (vẫn nhỏ hơn pIbromelain) nên đây vẫn không phải là protein chúng tacần tinh sạch.

- F2 và F3: pH của dung dịch ở 2 phân đoạn này là 6, lớn hơn pIbromelain,lúc nàybromelain chuyển sang tích điện âm, không bám được vào gel mang điện tích âm nữanên sẽ bị đẩy ra khỏi cột gel Rất có thể đây là protein chúng ta cần tinh sạch

2.4 Hiện tượng nhiều hơn 1 phân đoạn protein được rửa giải khỏi cột gel trao đổi ion

Khi rửa giải bằng dung dịch đệm pH 6, bromelain sẽ tích điện âm ( do pH > pI)trong khi hạt gel vẫn tích điện âm Do điện tích cùng dấu nên bromelain không bámvào hạt gel và bị đẩy ra ngoài Tuy nhiên hỗn hợp protein không bám ngoài bromelaincòn có một số protein tích điện âm khác Vận tốc di chuyển của protein qua cột tùythuộc vào điện tích thực của chúng tại điểm pH tương ứng Đối với sắc ký trao đổi ion

âm, những protein càng âm sẽ tách giải càng sớm Trong các loại protein đó thì protein

có điện tích âm lớn sẽ có ái lực với gel nhỏ nhất nên sẽ bị đẩy ra khỏi gel đầu tiên, kếđến là protein có điện tích âm nhỏ hơn Vì vậy khi rửa giải bằng dung dịch đệm pH 6

sẽ thu được nhiều hơn 1 phân đoạn

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

BRADFORD

Như đã biết, có nhiều phương pháp định lượng protein như: phương pháp quanphổ, phương pháp BCA, phương pháp Lowry, phương pháp Bradford… Nhưng trongquá trình học chúng ta sử dụng phương pháp Bradford

Phương pháp Bradford thực hiện trên phản ứng của protein với thuốc thửBradford được thực hiện trong môi trường acid mạnh

Nguyên tắc phương pháp này:

- Dựa trên sự biến đổi độ hấp thụ ánh sáng (OD) của Coomassie Brilliant Bluetrong tương tác với protein

- Trong môi trường acid mạnh, khi chưa kết hợp với protein thì thuốc nhuộm cóbước sóng hấp thu cực đại 465 nm, khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thụbước sóng cực đại ở 595 nm

- Độ hấp thụ ở bước sóng có liên quan chặc chẽ, liên quan trực tiếp tới nồng độprotein

Phương pháp Bradford có độ nhạy cao (xác định protein trong khoảng 0,02 – 2mg/ml), đơn giản, nhanh và dễ thực hiện Tuy nhiên, do các protein có độ hấp thụ khác

Hình 1: Công thức cấu tạo của Comassie brilliant blue G250

(Nguồn: Bài giảng Protein và enzyme - Nguyễn Đức Độ)

nhau nên cần chú ý chọn loại protein có cấu trúc tương đồng với protein cần xác địnhhàm lượng làm chất chuẩn.

1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

 Thiết bị, dụng cụ.

- Máy đo quang phổ

- Micropipette và đầu cole

- Ống nghiệm thuỷ tinh

- Cuvette phastic

 Hoá chất.

- Dung dịch comassie brilliant blue (CBB) G250

- Bovine serum albumin (BSA) 1mg/ml

- Cồn tuyệt đối

2 Tiến hành thí nghiệm

2.1 Xây dựng đường chuẩn BSA.

 Chuẩn bị đường chuẩn

Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 30, 60, 120, 180, 240

và 300µg / ml.

Bảng 1: Bảng pha nồng độ dung dịch chuẩn

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 [BSA] (µg / ml) 0 30 60 120 180 240 300

V BSA (µl) 0 30 60 120 180 240 300

V Nước cất (µl) 1000 970 940 880 820 760 700

 Quy trình thực hiện

Thí nghiệm lặp lại 3 lần

Bước 1: Chuẩn bị dung dịch BSA và nước cất.

Đánh số thứ tự các ống nghiệm trên khay theo thứ tự từ 2 – 7 (Tương ứng vớinồng độ dãy protein BSA chuẩn)

Bước 2: Lấy đúng thể tích BSA và nước cất theo bảng trên vào các ống nghiệm

vừa đánh số Lắc đều dung dịch vừa pha

Bước 3: Đánh số các ống nghiệm trên khay theo thứ tự từ 1 đến 7 (Tương ứng

với nồng độ dãy protein BSA chuẩn)

Lấy 100µldung dịch từ các ống nghiệm ở bước 2 vào các ống nghiệm vừa

đánh dấu (Hút riêng 1000 µl nước cất cho vào ống nghiệm 1).

Bước 4: Cho 2ml thuốc thử CBB vào ống nghiệm ở bước 3 Lắc đều ống

nghiệm tránh tạo bọt

Bước 5: Sau 10 phút, tiến hành đo OD595nm các ống nghiệm ở và ghi nhận kếtquả

2.2 Định lượng protein có trong mẫu.

 Pha loãng mẫu

Chuẩn bị các mẫu protein: mẫu thô, mẫu trích protein UB, mẫu F1, mẫu F2 vàmẫu F3 Trong đó, chỉ có mẫu thô pha loãng 5 lần, các mẫu còn lại không pha loãng

 Định lượng protein có trong mẫu

Quy trình thực hiện:

Bước 1: Đánh số các ống nghiệm theo thứ tự tương ứng với thứ tự mẫu: UB, F3

, F1 , F2 và mẫu thô

Bước 2: Lấy 100µldung dịch các mẫu lần lượt cho vào các ống nghiệm trên

(Chú ý mẫu thô lấy mẫu đã pha loãng)

Bước 3: Thêm 2ml dung dịch thuốc thử CBB vào mỗi ống nghiệm trên Lắc

đều các ống nghiệm tránh tạo bọt

Bước 4: Sau 10 phút tiến hành đo OD595nm các ống nghiệm và ghi nhận kết quả

1 Xây dựng đường chuẩn BSA.

Bảng 2: Kết quả đo OD 595nm đường chuẩn BSA

[BSA] (µg / ml) 0 (Đ/C) 30 60 120 180 240 300 Giá trị OD 1 0,654 0,730 0,840 1,024 1,196 1,324 1,415

Giá trị OD 2 0,656 0,770 0,862 1,044 1,231 1,350 1,422

Giá trị OD 3 0,646 0,759 0,879 1,066 1,235 1,372 1,435

Giá trị OD TB 0,652 0,753 0,860 1,045 1,221 1,349 1,424

OD TB – OD Đ/C 0,000 0,101 0,208 0,393 0,569 0,697 0,772

Hình 2: Biểu đồ đường chuẩn BSA

Nhận xét:

- Từ biểu đồ đường chuẩn BSA ta nhận được phương trình hồi quy tuyến tính:

y = 0,0027x + 0,0389 với độ tin cậy R2 = 0,9809

Trong đó: y là giá trị ODTB – ODĐ/C

x là nồng độ BSA (µg / ml).

- Hệ số R2 cànglớn, phân bố càng chuẩn, độ tin cậy càng cao Từ biểu đồ trên, tathấy R2 > 95% chứng tỏ phương tình tuyến tính có độ tin cậy cao và có sự phân bố chuẩn Nghĩa là ta có thể xác định được 98,09% hàm lượng protein trong mẫu

2 Định lượng protein có trong mẫu

Bảng 3: Kết quả đo OD 595nm hàm lượng protein trong mẫu

Loại mẫu UB F 3 F 1 F 2 mẫu thô Giá trị OD 1 0,748 0,700 0,690 1,000 1,126

y Hệ số Tổng [protein] Hàm lượng protein Hàm lượng pro

pha loãng thể tích (µg / ml) trong mẫu trong mẫu

- Sinh viên không được tự ý điều chỉnh máy đo quang phổ

- Pha loãng mẫu theo sự hướng dẫn của cán bộ phụ trách

- Đo mẫu có nồng độ từ thấp đến cao

- Quá trình lắc các ống tránh nghiệm tạo bọt

Từ kết quả hàm lượng protein trong các mẫu, ta nhận thấy hàm lượng proteintrong mẫu thô cao nhất, kế đến là phân đoạn F2, đến UB, cuối cùng là phân đoạn F1 và

F3 không chứa protein

Nguyên nhân:

- Mẫu thô là enzyme của dịch trích ly , chưa được tinh sạch bằng phương phápsắc kí trao đổi ion nên chứa các nhiều loại enzyme (protein) khác nhau là các loạiprotein bám lẫn không bám trên cột gel Do đó hàm lượng protein trong mẫu cao nhất

- Hàm lượng protein chứa trong UB là hàm lượng các loại protein không bámtrên gel có trong dịch trích ly

- Phân đoạn F1 và F3 không chứa protein do phân đoạn F1 là phân đoạn đầutrong quá trình rửa giải khi mới thay đổi dung dịch đệm nên có thể protein bám trêncột gel chưa bị rửa trôi khỏi cột, phân đoạn F3 là phân đoạn sau cùng trong quá trìnhrửa giải của nhóm nên có thể trước đó protein bám trên cột đã được rửa và đẩy hếtkhỏi cột Do đó, ở hai phân đoạn này không chứa protein

- Phân đoạn F2 là phân đoạn giữa trong quá tình rửa giải của nhóm, khi đó lượngdung dịch đệm đã đủ để đẩy các protein bám trên cột gel ra ngoài, nên hàm lượngprotein trong phân đoạn này khá cao và cao hơn hẳn các phân đoạn khác Riêngnguyên nhân hàm lượng protein trong phân đoạn F2 cao hơn cả UB là do trong mẫudịch trích ly chứa nhiều protein bám trên cột gel hơn các loại protein không bám

BÀI 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE BẰNG PHƯƠNG

PHÁP KUNITZ CẢI TIẾN

- Máy đo quang phổ, máy lắc ủ, máy ly tâm tốc độ cao ( 14.000 v/p), cân, …

- Micropipet 20, 100, 200, 1000; ống eppendorf loại 1,5 ml …

- Dung dịch đệm Na-phosphate

- Casein 1% (m/v)

- Dung dịch acid Trichloroacetic 15% (w/v)

- Tyrosin 1µmol/ml

1 Dựng đường chuẩn Tyrosin

- Thí nghiệm lặp lại 3 lần

- Dựng đường chuẩn Tyrosin theo bảng sau:

Bảng 1 Nồng độ Tyrosin

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 [Tyrosin] (µmol/ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

V Tyrosin (µl) 0 300 600 900 1200 1500

Pha loãng (µl) 1500 1200 900 600 300 0

Bảng 2 Số liệu có được khi đem đo OD ở bước sóng 280nm:

Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Lần 1 0,088 0,124 0,155 0,194 0,221 0,249

Hình 1: Biểu đồ đường chuẩn Tyrosin

2 Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Kunitz cải tiến

Thí nghiệm được tiến hành trong các ống eppendorf Tương ứng mỗi mẫuenzyme, ta thực hiện một mẫu đối chứng để khi đo độ hấp thụ ta chuyển giá trị mẫuđối chứng về 0 Dựa vào hàm lượng protein chọn độ pha loãng là: 1 và mẫu thô là 5.Các bước đo hoạt tính mẫu đối chứng emzyme Các bước đo hoạt tính mẫu

180 µl đệm phosphate pH 7,5

20 µl enzyme ↓ Ủ 370C, 20 phút

Số liệu có được khi đem đo mẫu với đối chứng ở bươc sóng 280 nm

Bảng 3 Giá trị OD của mẫu ở bước sóng 280nm

Đối chứng 0,310 0,324 0,291 0,286 0,286

Lần 1 0,341 0,848 0,320 0,378 0,309

Lần 2 0,335 0,877 0,309 0,415 0,318