Phúc trình thực tập Protein và Enzyme

Header Page of 133 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÚC TRÌNH THỰC TẬP PROTEIN & ENZYME MÃ HỌC PHẦN: NHÓM: 12B SINH VIÊN THỰC HIỆN: TRẦN QUỐC KHÁNH MSSV: B1303671 CẦN THƠ, 11.2015 Footer Page of 133 Header Page of 133 MỤC LỤC BÀI 1: TRÍCH LY PROTEIN I ĐỊNH NGHĨA II NGUYÊN TẮC III DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VÀ NGUYÊN VẬT LIỆU 1 Dụng cụ thí nghiệm: Quy trình trích ly protein: IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả: Thảo luận: BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ I DỤNG CỤ, HÓA CHẤT Dụng cụ Hóa chất II TIẾN HÀNH III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Kết Thảo luận 2.1 Phương pháp trao đổi ion 2.2 Trạng thái tích điện protein – enzyme điều kiện trích ly, pH 4, pH 2.3 pH phân đoạn rửa giải Ý nghĩa thực tiễn trị số pH vừa xác định trình tinh 2.4 Hiện tượng nhiều phân đoạn protein rửa giải khỏi cột gel trao đổi ion ………………………………………………………………………………… BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD I GIỚI THIỆU II NỘI DUNG THỰC HÀNH 10 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 10 Tiến hành thí nghiệm 10 2.1 Xây dựng đường chuẩn BSA 10 2.2 Định lượng protein có mẫu 11 III KẾT QUẢ 11 Xây dựng đường chuẩn BSA 11 Định lượng protein có mẫu 12 IV ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 13 BÀI 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KUNITZ CẢI TIẾN 15 I THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 15 II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 15 Dựng đường chuẩn Tyrosin 15 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp Kunitz cải tiến 16 Tính toán kết quả: 18 III ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 18 BÀI 5: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE( SDS – PAGE) 19 I GIỚI THIỆU CHUNG 19 II NỘI DUNG THỰC HÀNH 19 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 19 Tiến hành thí nghiệm 20 III KẾT QUẢ 21 Footer Page of 133 Header Page of 133 IV ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ 23 Footer Page of 133 Header Page of 133 BÀI 1: TRÍCH LY PROTEIN I ĐỊNH NGHĨA Trích ly enzyme trình thu nhận enzyme thô từ nguồn nguyên liệu động vật, thực vật vi sinh vật để thực bước tinh nghiên cứu khác Dịch trích enzyme thô từ thịt khóm nguồn enzyme thô cho thí nghiệm để tinh phương pháp sắc ký trao đổi ion, khảo sát hàm lượng protein phương pháp Bradford, khảo sát hoạt tính phương pháp Kunitz cải tiến, xác định trọng lượng phân tử phương pháp điện di SDS-PAGE II NGUYÊN TẮC Thu nhận enzyme tế bào trì hoạt động enzyme mức cao nhất, tránh gây biến tính hạn chế ảnh hưởng bất lợi tới enzyme Phá vỡ tế bào phương pháp học: Cắt, nghiền, ép thủ công dùng máy ép nước trái -> Tế bào bao bọc bảo vệ màng tế bào nên để ly trích enzyme trước tiên ta cần phá vỡ màng tế bào Chú ý: Mẫu cần làm phải trữ lạnh chưa tiến hành trích ly enzyme Thu nhận enzyme phương pháp li tâm: Phương pháp sử dụng rộng rãi công nghệ enzyme nhằm tách enzyme ngoại bào hay nội bào (sau phá vỡ tế bào) khỏi dung dịch III DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM VÀ NGUYÊN VẬT LIỆU Dụng cụ thí nghiệm: - Cân điện tử 1500gr - Micropipette - Đĩa petri - Máy ly tâm lạnh - Đầu cole loại - Dao, thớt, vải lọc - Máy ép nước trái - Ống eppendorf - Tủ lạnh Nguyên liệu: 1/4 trái khóm (lấy phần vỏ) Footer Page of 133 Header Page of 133 Quy trình trích ly protein: ¼ trái khóm (m1 gr) Thu phần vỏ(m2 gr) Ép Bả khóm Vắt (Bằng vải the) Tổng dịch (V ml) Cặn Bỏ Ly tâm lạnh (7000 vòng/phút 20 phút) Dịch (V0 ml) Cặn Bỏ Trữ mẫu (dịch enzyme): 22ml/bọc + 1ml/ống eppendoft (6 ống) + bọc trữ phần mẫu dư 60ml Ghi tên nhãn đem vào tủ lạnh trữ - 20oC Footer Page of 133 Header Page of 133 Ghi nhận tổng thể tích dịch enzyme thu V2 (ml) Lưu ý: Toàn quy trình cần thao tác nhanh, điều kiện lạnh 4oC (trữ dụng cụ đặt khay nước đá chờ đợi nhóm thực bước) để hạn chế biến tính enzyme hạn chế phân giải enzyme proteolytic có dịch chiết IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả: Thu dịch trích enzyme thô từ thịt khóm Khối lượng ¼ trái khóm (m1): 344,4gr Khối lượng vỏ (m2): 139,9gr Dịch V0: 88ml Thảo luận: Phần trăm vỏ khóm thu so với nguyên liệu ban đầu là: Phần trăm vỏ khóm = (m1/m2)*100 = (139,9/344,4)*100 = 40,6% Tại phải xác định thông số đầu vào nguyên liệu?  Để tính hiệu xuất thu hồi  Hiểu công dụng, liều lượng trường hợp sử dụng  Đạt hiệu trái cao sản xuất, tránh lãng phí nguyên liệu Footer Page of 133 Header Page of 133 BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ I DỤNG CỤ, HÓA CHẤT Dụng cụ - Hệ thống sắc ký lỏng bơm nhu động - Máy phân đoạn sắc ký (fraction collector) - Cốc thủy tinh, - Ống eppendorf,… Hóa chất - Gel SP – StreamLine - Dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH - Dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH II TIẾN HÀNH Bước Chuẩn bị gel SP – StreamLine: Cân 10 gram gel SP – StreamLine dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH Bước Chuẩn bị cột gel SP – StreamLine: Nhồi gel vào cột thủy tinh, cân cột gel với dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH (3 lần thể tích cột), tốc độ dòng chảy mL/phút Bước Load mẫu lên cột: Bơm 40 mL dung dịch nước khóm (bromelain) pha loãng với dung dịch ammonium acetate (tỉ lệ 1:1) qua cột với tốc độ mL/phút Bước Rửa cột gel: Rửa cột dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH với tốc độ dòng chảy mL/phút; theo dõi trình rửa cột qua sắc ký đồ, phân đoạn protein không bám cột đẩy hết khỏi cột Thu phân đoạn protein không bám, đồng mẫu xác định thể tích (VUB mL) Bước Rửa giải: Protein bám cột gel rửa giải dung dịch đệm ammonium acetate 0,1M, pH với tốc độ dòng chảy mL/phút; thu dung dịch protein rửa giải; theo dõi sắc ký đồ để xác định phân đoạn protein khác Bước Thu phân đoạn trữ mẫu: Footer Page of 133 Header Page of 133 Thu mẫu vào ống nghiệm thủy tinh trình sắc ký (trung bình khoảng mL/ống) Xác định lượng protein ống cách đo quang phổ bước sóng 280 nm (OD280) Thu, tách riêng phân đoạn protein dựa theo sắc ký đồ vẽ từ số liệu OD280 Đồng phân đoạn riêng biệt xác định tổng thể tích phân đoạn (VUB, VF1, VF2,…) Trữ enzim - 200C: + ống eppendorf, ống chứa mL dịch enzim (để xác định hàm lượng protein, hoạt tính enzim điện di SDS – PAGE sau) + Phần dịch enzim phân đoạn dư cho vào bọc khác để trữ lại III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Kết Bảng Kết đo OD bước sóng 280 nm Ống nghiệm Chỉ số OD Ống nghiệm Chỉ số OD 0,117 41 0,212 0,121 42 0,243 0,106 43 0,331 0,098 44 0,245 0,096 45 0,287 0,101 46 0,528 0,350 47 0,564 3,000 48 0,667 3,000 49 0,775 10 3,000 50 0,799 11 3,000 51 0,697 12 3,000 52 0,615 13 3,000 53 0,511 14 3,000 54 0,400 15 3,000 55 0,321 16 3,000 56 0,266 17 1,931 57 0,229 18 1,305 58 0,207 19 0,936 59 0,190 Footer Page of 133 Header Page of 133 20 0,697 60 0,185 21 0,548 61 0,183 22 0,417 62 0,178 23 0,317 63 0,181 24 0,278 64 0,189 25 0,262 65 0,192 26 0,248 66 0.193 27 0,237 67 0,199 28 0,222 68 0,201 29 0,206 69 0,204 30 0,199 70 0,205 31 0,195 71 0,208 32 0,193 72 0,208 33 0,190 73 0,207 34 0,183 74 0,214 35 0,179 75 0,198 36 0,176 76 0,189 37 0,176 77 0,177 38 0,175 78 0,172 39 0,188 79 0,165 40 0,233 3.5 Biểu đồ sắc ký dựa vào số OD độ hấp thụ 280 nm Chỉ số đo OD 2.5 1.5 0.5 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 Thứ tự ống nghiệm Hình 2.1 Biểu đồ sắc ký dựa vào số OD độ hấp thụ 280 nm Footer Page of 133 Header Page 10 of 133 Bảng 2.2 Kết phân đoạn thu Phân đoạn UB F1 F2 F3 Số ống thu - 39 41 - 44 45 - 55 67 - 76 Đỉnh Không xác định 43 50 71 - 72 Bảng 2.3 Tổng thể tích thể tích trữ lại phân đoạn Phân đoạn UB F1 F2 F3 Tổng thể tích (ml) 175 20 55 50 Thể tích trữ lại (ml) 6 6 Thảo luận 2.1 Phương pháp trao đổi ion  Nguyên lý chung sắc ký trao đổi ion: Tách phân tử dựa điện tích: protein mang điện tích bề mặt, tùy vào pH môi trường chúng tích điện dương hay âm, với pH < pI protein tích điện dương pH > pI protein tích điện âm Vì chọn loại gel thích hợp cho loại protein dựa vào pI độ bền pH protein  Có hai loại gel trao đổi ion: - Gel trao đổi ion dương: có nhóm chức mang điện tích âm, tương tác ion với protein mang điện tích dương - Gel trao đổi ion âm: có nhóm chức mang điện tích dương, tương tác ion với protein mang điện tích âm Các protein đẩy theo lực tương tác, protein tương tác ion yếu với gel đẩy trước 2.2 Trạng thái tích điện protein – enzyme điều kiện trích ly, pH 4, pH  pH 4: Gel trao đổi ion sử dụng thí nghiệm mang điện tích âm pI bromelain 4,6 nên rửa cột gel pH bromelain (và số protein khác) tích điện dương (pH < pI), tương tác với gel nên bám vào cột gel Protein thu giai đoạn protein không bám (tích điện âm) Dựa vào kết đo OD mẫu thu rủa với dung dịch đệm pH 4, ta thấy lúc đầu hàm lượng protein thu cao, sau thấp dần Khi giá trị OD mẫu thu gần với giá trị OD dung dịch đệm dùng để cân cột ban đầu dừng lại, giai đoạn thu protein không bám kết thúc Footer Page 10 of 133 Header Page 12 of 133 BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD I GIỚI THIỆU Như biết, có nhiều phương pháp định lượng protein như: phương pháp quan phổ, phương pháp BCA, phương pháp Lowry, phương pháp Bradford… Nhưng trình học sử dụng phương pháp Bradford Phương pháp Bradford thực phản ứng protein với thuốc thử Bradford thực môi trường acid mạnh Nguyên tắc phương pháp này: - Dựa biến đổi độ hấp thụ ánh sáng (OD) Coomassie Brilliant Blue tương tác với protein - Trong môi trường acid mạnh, chưa kết hợp với protein thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại 465 nm, kết hợp với protein thuốc nhuộm hấp thụ bước sóng cực đại 595 nm Hình 1: Công thức cấu tạo Comassie brilliant blue G250 (Nguồn: Bài giảng Protein enzyme - Nguyễn Đức Độ) - Độ hấp thụ bước sóng có liên quan chặc chẽ, liên quan trực tiếp tới nồng độ protein Phương pháp Bradford có độ nhạy cao (xác định protein khoảng 0,02 – mg/ml), đơn giản, nhanh dễ thực Tuy nhiên, protein có độ hấp thụ khác Footer Page 12 of 133 Header Page 13 of 133 nên cần ý chọn loại protein có cấu trúc tương đồng với protein cần xác định hàm lượng làm chất chuẩn II NỘI DUNG THỰC HÀNH Thiết bị, dụng cụ, hóa chất  Thiết bị, dụng cụ - Máy đo quang phổ - Micropipette đầu cole - Ống nghiệm thuỷ tinh - Cuvette phastic  Hoá chất - Dung dịch comassie brilliant blue (CBB) G250 - Bovine serum albumin (BSA) 1mg/ml - Cồn tuyệt đối Tiến hành thí nghiệm 2.1 Xây dựng đường chuẩn BSA  Chuẩn bị đường chuẩn Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 30, 60, 120, 180, 240 300 g / ml Bảng 1: Bảng pha nồng độ dung dịch chuẩn Ống nghiệm [BSA] ( g / ml ) 30 60 120 180 240 300 VBSA ( l ) 30 60 120 180 240 300 1000 970 940 880 820 760 700 VNước cất ( l )  Quy trình thực Thí nghiệm lặp lại lần Bước 1: Chuẩn bị dung dịch BSA nước cất Đánh số thứ tự ống nghiệm khay theo thứ tự từ – (Tương ứng với nồng độ dãy protein BSA chuẩn) Bước 2: Lấy thể tích BSA nước cất theo bảng vào ống nghiệm vừa đánh số Lắc dung dịch vừa pha 10 Footer Page 13 of 133 Header Page 14 of 133 Bước 3: Đánh số ống nghiệm khay theo thứ tự từ đến (Tương ứng với nồng độ dãy protein BSA chuẩn) Lấy 100 l dung dịch từ ống nghiệm bước vào ống nghiệm vừa đánh dấu (Hút riêng 1000 l nước cất cho vào ống nghiệm 1) Bước 4: Cho 2ml thuốc thử CBB vào ống nghiệm bước Lắc ống nghiệm tránh tạo bọt Bước 5: Sau 10 phút, tiến hành đo OD595nm ống nghiệm ghi nhận kết 2.2 Định lượng protein có mẫu  Pha loãng mẫu Chuẩn bị mẫu protein: mẫu thô, mẫu trích protein UB, mẫu F1, mẫu F2 mẫu F3 Trong đó, có mẫu thô pha loãng lần, mẫu lại không pha loãng  Định lượng protein có mẫu Quy trình thực hiện: Bước 1: Đánh số ống nghiệm theo thứ tự tương ứng với thứ tự mẫu: UB, F3 , F1 , F2 mẫu thô Bước 2: Lấy 100 l dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm (Chú ý mẫu thô lấy mẫu pha loãng) Bước 3: Thêm 2ml dung dịch thuốc thử CBB vào ống nghiệm Lắc ống nghiệm tránh tạo bọt Bước 4: Sau 10 phút tiến hành đo OD595nm ống nghiệm ghi nhận kết III KẾT QUẢ Xây dựng đường chuẩn BSA Bảng 2: Kết đo OD595nm đường chuẩn BSA [BSA] ( g / ml ) (Đ/C) Giá trị OD1 0,654 Giá trị OD2 30 60 120 180 240 300 0,730 0,840 1,024 1,196 1,324 1,415 0,656 0,770 0,862 1,044 1,231 1,350 1,422 Giá trị OD3 0,646 0,759 0,879 1,066 1,235 1,372 1,435 Giá trị ODTB 0,652 0,753 0,860 1,045 1,221 1,349 1,424 ODTB – ODĐ/C 0,000 0,101 0,208 0,393 0,569 0,697 0,772 11 Footer Page 14 of 133 Header Page 15 of 133 Hình 2: Biểu đồ đường chuẩn BSA Nhận xét: - Từ biểu đồ đường chuẩn BSA ta nhận phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0,0027x + 0,0389 với độ tin cậy R2 = 0,9809 Trong đó: y giá trị ODTB – ODĐ/C x nồng độ BSA ( g / ml ) - Hệ số R2 lớn, phân bố chuẩn, độ tin cậy cao Từ biểu đồ trên, ta thấy R2 > 95% chứng tỏ phương tình tuyến tính có độ tin cậy cao có phân bố chuẩn Nghĩa ta xác định 98,09% hàm lượng protein mẫu Định lượng protein có mẫu Bảng 3: Kết đo OD595nm hàm lượng protein mẫu Loại mẫu UB F3 F1 F2 mẫu thô Giá trị OD1 0,748 0,700 0,690 1,000 1,126 Giá trị OD2 0,720 0,653 0,656 0,982 1,149 Giá trị OD3 0,703 0,659 0,669 0,996 1,111 Giá trị ODTB 0,724 0,671 0,672 0,993 1,129 ODTB - ODĐ/C 0,072 0,019 0,020 0,341 0,477 Công thức tính hàm lượng protein mẫu: Nồng độ protein = y  0,0389 0,0027 Hàm lượng protein mẫu ( mg / ml ) = Nồng độ protein * Hệ số pha loãng * 10-3 12 Footer Page 15 of 133 Header Page 16 of 133 Bảng 4: Hàm lượng protein mẫu (mg/ml) Hệ số Tổng [protein] pha loãng thể tích ( g / ml ) y (ml) Hàm lượng protein Hàm lượng pro mẫu mẫu ( mg / ml ) (mg/tổng ml) UB 0,072 175 12,2593 0,0123 2,1525 F3 0,019 50 0,0000 0,0000 0,0000 F1 0,02 20 0,0000 0,0000 0,0000 F2 0,341 55 111,8889 0,1119 6,1545 mẫu thô 0,477 88 162,2593 0,8113 71,3944  Chú ý: - Sinh viên không tự ý điều chỉnh máy đo quang phổ - Pha loãng mẫu theo hướng dẫn cán phụ trách - Đo mẫu có nồng độ từ thấp đến cao - Quá trình lắc ống tránh nghiệm tạo bọt ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Từ kết hàm lượng protein mẫu, ta nhận thấy hàm lượng protein mẫu thô cao nhất, phân đoạn F2, đến UB, cuối phân đoạn F1 IV F3 không chứa protein Nguyên nhân: - Mẫu thô enzyme dịch trích ly , chưa tinh phương pháp sắc kí trao đổi ion nên chứa nhiều loại enzyme (protein) khác loại protein bám lẫn không bám cột gel Do hàm lượng protein mẫu cao - Hàm lượng protein chứa UB hàm lượng loại protein không bám gel có dịch trích ly - Phân đoạn F1 F3 không chứa protein phân đoạn F1 phân đoạn đầu trình rửa giải thay đổi dung dịch đệm nên protein bám cột gel chưa bị rửa trôi khỏi cột, phân đoạn F3 phân đoạn sau trình rửa giải nhóm nên trước protein bám cột rửa đẩy hết khỏi cột Do đó, hai phân đoạn không chứa protein - Phân đoạn F2 phân đoạn tình rửa giải nhóm, lượng dung dịch đệm đủ để đẩy protein bám cột gel ngoài, nên hàm lượng protein phân đoạn cao cao hẳn phân đoạn khác Riêng 13 Footer Page 16 of 133 Header Page 17 of 133 nguyên nhân hàm lượng protein phân đoạn F2 cao UB mẫu dịch trích ly chứa nhiều protein bám cột gel loại protein không bám 14 Footer Page 17 of 133 Header Page 18 of 133 BÀI 4: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH PROTEASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP KUNITZ CẢI TIẾN I - THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT Máy đo quang phổ, máy lắc ủ, máy ly tâm tốc độ cao ( 14.000 v/p), cân, … - Micropipet 20, 100, 200, 1000; ống eppendorf loại 1,5 ml … - Dung dịch đệm Na-phosphate - Casein 1% (m/v) - Dung dịch acid Trichloroacetic 15% (w/v) - Tyrosin 1µmol/ml II TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM Dựng đường chuẩn Tyrosin - Thí nghiệm lặp lại lần - Dựng đường chuẩn Tyrosin theo bảng sau: Bảng Nồng độ Tyrosin Ống nghiệm [Tyrosin] (µmol/ml) VTyrosin (µl) Pha loãng (µl) 0 1500 0,2 300 1200 0,4 600 900 0,6 900 600 0,8 1200 300 1,0 1500 Bảng Số liệu có đem đo OD bước sóng 280nm: Ống nghiệm Lần 0,088 0,124 0,155 0,194 0,221 0,249 Lần 0,087 0,123 0,153 0,190 0,217 0,250 Lần 0,088 0,122 0,156 0,183 0,215 0,253 Trung bình 0,087667 0,123 0,154667 0,189 0,217667 0,250667 Trung bình hiệu chỉnh 0,035333 0,067 0,101333 0,13 0,163 15 Footer Page 18 of 133 Header Page 19 of 133 Hình 1: Biểu đồ đường chuẩn Tyrosin Xác định hoạt tính enzyme phương pháp Kunitz cải tiến Thí nghiệm tiến hành ống eppendorf Tương ứng mẫu enzyme, ta thực mẫu đối chứng để đo độ hấp thụ ta chuyển giá trị mẫu đối chứng Dựa vào hàm lượng protein chọn độ pha loãng là: mẫu thô Các bước đo hoạt tính mẫu đối chứng emzyme 16 Footer Page 19 of 133 Các bước đo hoạt tính mẫu Header Page 20 of 133 180 µl đệm phosphate pH 7,5 20 µl enzyme ↓ Ủ 370C, 20 phút Bổ sung 600 µl Casein 1% ↓ Lắc ủ 10 phút, 370C Bổ sung 600 µl TCA 15% ↓ Ổn định 40C, 10 phút Ly tâm 10.000 v/p, 10 phút, 40C ↓ Đo độ hấp thụ 280 nm 180µl dung dich đệm 20µl enzyme ↓ Ủ 370C, 20 phút Bổ sung 600 µl TCA 15% ↓ Lắc ủ 10 phút, 370C Bổ sung 600 µl Casein 1% ↓ Ổn định 40C, 10 phút Ly tâm 10.000 v/p, 10 phút 40C ↓ Đo độ hấp thụ 280 nm Số liệu có đem đo mẫu với đối chứng bươc sóng 280 nm Bảng Giá trị OD mẫu bước sóng 280nm OD Đối chứng UB 0,310 Thô 0,324 F1 0,291 F2 0,286 F3 0,286 Lần 0,341 0,848 0,320 0,378 0,309 Lần 0,335 0,877 0,309 0,415 0,318 17 Footer Page 20 of 133 Header Page 21 of 133 Lần 0,348 0,817 0,320 0,384 0,319 Trung bình 0,341 0,847 0,316 0,392 0,315 Trung bình hiệu chỉnh 0,031 0,523 0,025 0,106 0,029 Từ phương trình đường chuẩn ta suy hàm lượng tyrosin dịch thủy phân Bảng Hàm lượng Tyrosin dịch thủy phân Khối lượng Tyrosin (µM/ml) UB Thô F1 F2 F3 1,9 17,086 1,716 4,216 1,839 Tính toán kết quả: Đơn vị hoạt tính enzyme 1ml enzyme tính theo công thức: U = [(a x Vt)/(T x VE)] x k* Trong đó: U: Hoạt tính 1ml dung dịch enzyme a: Nống độ Tyrosin dung dịch thủy phân (µM/ml) Vt: Thể tích tổng dung dịch phản ứng (1400µl) T: Thời gian phản ứng (10 phút) VE: Thể tích enzyme (20µl) k*: hệ số pha loãng Theo tính toán ta có đơn vị hoạt tính Bảng Giá trị đơn vị hoạt tính Đơn vị hoạt tính UB Thô F1 F2 F3 13,3 598,01 12,012 29,512 12,873 Đơn vị hoạt tính riêng: U-mg = U/[Protein tổng] Bảng Giá trị hoạt tính riêng Đơn vị họạt tính riêng UB Thô F1 F2 F3 6,179 8,25 4,795 Độ tinh có đượclà 0.58 III ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 18 Footer Page 21 of 133 Header Page 22 of 133 BÀI 5: PHÂN TÍCH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI TRÊN GEL POLYACRYLAMIDE( SDS – PAGE) I GIỚI THIỆU CHUNG Sau tinh enzyme phương pháp sắc ký ta thu enzyme mục tiêu, liệu enzyme vừa qua sắc ký khiết hay chưa? Để trả lời cho câu hỏi này, kĩ thuật điện di Điện di phương pháp kiểm định độ tinh enzyme dựa khác trọng lượng phân tử điểm đẳng điện pI chúng Có hai kĩ thuật điện di là: Điện di chiều( SDS – PAGE) điện di hai chiều( IEF) - Điện di chiều( SDS – PAGE): Là phương pháp phân tách protein dựa trọng lượng phân tử Trong kĩ thuật này, protein xử lí tác nhân gây biến tính – mercaptoethanol, sau với có mặt SDS làm cho tất protein tích điện âm, protein có kích thước lớn tích điện nhiều Tiếp theo, tác động điện trường protein di chuyển gel polyacrylamide với vận tốc tuỳ thuộc vào kích thước phân tử, phân tử có kích thước lớn di chuyển chậm protein có kích thước nhỏ qua lỗ gel có kích thước định - Điện di hai chiều( IEF): Là phương pháp điện di phân tách protein dựa kích thước phân tử điểm đẳng điện pI chúng Trong kĩ thuật có hai chiều điện di: chiều thứ protein tách dựa điểm đẳng điện pI chúng, pH mà protein không tích điện không di chuyển điện trường chiều thứ hai tác dụng điện trường protein mang điện tích âm sau cân trạng thái nên protein di chuyển từ cực âm sang cực dương, protein di chuyển qua gel polyacrylamide, cọ sát hạt acrylamide với phân tử protein tạo lực kháng làm ngăn cản di chuyển protein, protein có trọng lượng phân tử lớn lực cản mạnh Ở khảo sát phương pháp điện di chiều phân đoạn giai đoạn sắc kí dịch nước khóm II NỘI DUNG THỰC HÀNH Thiết bị, dụng cụ, hóa chất  Thiết bị, dụng cụ - Máy khuấy từ, cân phân tích, cân điện tử, vortex, hệ thống điện di mini protein III (Bio – Rad), máy lắc bàn, máy đo pH, tủ hút, 19 Footer Page 22 of 133 Header Page 23 of 133 - Dụng cụ: micropipette( 20, 100, 200, 1000, 5000 µl), giá để ống eppendorf, ống eppendorf, đầu cole vàng, đầu cole xanh, găng tay, cá từ, chai bia, cốc thuỷ tinh, cốc nhựa,  Hoá chất - Dung dịch acrylamide - Dung dịch đệm Tris – HCl 1,5M pH 8,8 - Dung dịch đệm Tris – HCl 0,6M pH 6,8 - Amonium persulphat( APS) - Sodium dodecyl sulphat( SDS) - Tetramethylethylenediamine( TEMEDE) - Sample buffer - β-mercaptoethanol - Dung dịch điện di - Dung dịch nhuộm gel dung dịch rửa gel Tiến hành thí nghiệm Bước Chuẩn bị hộp điện di: Khuôn, lược cài, hộp điện di phải rửa lau khô cồn Sau ráp thành khuôn chuẩn bị đổ gel Bước Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide 10%: Pha hỗn hợp 3,3 ml nước cất, ml acrylamide, 2,5 ml Tris – HCl pH 8,8, 100µl SDS 10%, 100µl APS10%, 4µl TEMED khuấy máy khuấy từ, nhanh chóng chuyển hỗn hợp dung dịch gel vào khung kiếng đổ gel( sử dụng micropipette 1000ml), gel bơm đến vạch cách đáy lược khoảng 0,5cm( tránh tạo bọt khuôn gel), sau bơm tiếp lượng nước cất lên bề mặt gel để tạo cho bề mặt gel phẳng Đợi gel đông khoảng 15 – 20 phút Bước Chuẩn bị gel tập trung 4%: Pha hỗn hợp 2,7 ml nước cất, 0,67 ml acrylamide, 0,5 ml Tris – HCl pH 6,8, 40µl SDS 10%, 40µl APS10%, 4µl TEMED khuấy máy khuấy từ, nhanh chóng chuyển hỗn hợp dung dịch gel vào khung kiếng đổ gel( sử dụng micropipette 1000ml), lược đưa vào cẩn thận để trách tạo bọt khí phía lược Gel tập trung đông lại sau 20 phút Bước Chuẩn bị mẫu protein: Thêm β-mercaptoethanol vào sample buffer trước sử dụng Trộn mẫu protein với sample buffer theo tỉ lệ: - Thô : Sample buffer theo thể tích 20µl : 20 µl - UB : Sample buffer theo thể tích 50µl : µl 20 Footer Page 23 of 133 Header Page 24 of 133 - F1: Sample buffer theo thể tích 50µl : µl - F2: Sample buffer theo thể tích 50µl : 10 µl - F3: Sample buffer theo thể tích 50µl : µl Lắc đun cách thuỷ 100°C 10 phút, sau để nguội Bước Bơm mẫu protein vào giếng: Sau gel tập trung đông, lắp khung đổ gel vào hộp điện di, thêm dung dịch điện di ngập hoàn toàn kiếng giữ gel, cẩn thận lấy lược bơm mẫu vào giếng( 5µl protein chuẩn, 20µl dung dịch protein) *Lưu ý: - Không để mẫu tràn qua giếng bên cạnh - Ghi chép lại vị trí mẫu đưa vào giếng để dễ thảo luận Bước Chạy điện di: sau bơm mẫu xong, đậy nắp hộp điện di lại cho dòng điện qua Dòng điện chạy điện di 25mA 80V, sau khoảng kết thúc trình điện di Bước Nhuộm gel: Lấy gel khỏi hộp gel cẩn thận cho vào dung dịch nhuộm gel khoảng Bước Tẩy màu: Rửa gel vi sóng Cho gel vào nước cất rửa gel vi sóng khoảng -2 phút, lặp lại lần, lần kết thúc vi sóng thay nước cất Rửa gel dung dịch tẩy khoảng 4-5 lặp lại trình rửa tới phát băng protein rõ gel III KẾT QUẢ Bảng Sự tương quan trọng lượng protein giá trị Rf Trọng lượng protein chuẩn(KD) 14,4 18,4 25 35 45 66,2 116 logM 1,16 1,26 1,4 1,54 1,65 1,82 2,06 Giá trị Ri 0,7 1,2 1,8 2.3 3,0 3,8 4,3 Giá trị RB 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 Giá trị Rf 0,84 0,76 0,59 0,45 0,35 0,23 0,14 21 Footer Page 24 of 133 Header Page 25 of 133 Ghi chú: Các giá trị làm tròn chữ số thập phân đến hàng trăm Công thức tính Rf: Rf Hình Thể tương quan trọng lượng protein Rf Nhận xét: Từ biểu đồ ta thu phương trình hồi quy tuyến tính sau: y = -0,8124x + 0,8001 với hệ số tương quan R2= 0,9673 Trong đó: y: giá trị Rf x: giá trị log trọng lượng protein chuẩn (logM), đưa log protein có trọng lượng thấp  logM = x + 1,16 Biểu đồ thể trọng lượng protein lớn Rf nhỏ Hình Mẫu gel điện di SDS-PASGE 22 Footer Page 25 of 133 Header Page 26 of 133 Bảng Các giá trị Rf trọng lượng phân tử protein có mẫu Các giá trị Ri RB Rf logM Thô UB 4,8 3,4 2,8 3,2 5,1 5,1 5,1 5,1 0,941 0,667 0,549 0,627 1,142 1,324 1,469 1,373 M (KD) 13,87 21,08 29,44 23,60 F2 2,7 5,1 0,529 1,493 31,12 Ghi chú: logM tính theo công thức: logM IV + 1,16 ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ Trong mẩu thô có chứa protein, UB chứa protein F2 chứa protein Bromelain nằm mẩu thô F2 với trọng lượng phân tử khoảng 29 - 31 kDa Phân đoạn F1 F3 không cho kết rõ ràng protein trình điện di xảy sai sót bước cho mẫu vào giếng gel 23 Footer Page 26 of 133 ... PROTEIN I ĐỊNH NGHĨA Trích ly enzyme trình thu nhận enzyme thô từ nguồn nguyên liệu động vật, thực vật vi sinh vật để thực bước tinh nghiên cứu khác Dịch trích enzyme thô từ thịt khóm nguồn enzyme. .. rửa cột gel pH bromelain (và số protein khác) tích điện dương (pH < pI), tương tác với gel nên bám vào cột gel Protein thu giai đoạn protein không bám (tích điện âm) Dựa vào kết đo OD mẫu thu rủa... bromelain không bám vào hạt gel bị đẩy Tuy nhiên hỗn hợp protein không bám bromelain có số protein tích điện âm khác Vận tốc di chuyển protein qua cột tùy thuộc vào điện tích thực chúng điểm pH