QUÁ TRÌNH THỰC tập tại VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIÊP VIỆT NAM

BÁO CÁO THỰC TẬP NGHỀ Giáo viên hướng dẫn: Lưu Thúy Hòa Vũ Thị Lan Phương Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thuỳ Trang Lớp: Công nghệ Sinh học K14 QUÁ TRÌNH THỰC TẬP TẠI VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIÊP VIỆT NAM Người hướng dẫn: Anh Trần Duy Cường Địa điểm: Từ Liêm, Hà Nội Thời gian: Ngày 8/6/2015 - 12/6/2015 A: Tách chiết DNA từ genome mô thực vật I Hóa chất dụng cụ a) Hóa chất - Nước cất lạnh - Nito lỏng - Dung dịch chiết suất - 10%(wt/vol) N-Lauryl sarkosyl - Isopropanal - 3M Sodium acetate - Dung dịch TE - Cesium Chloride - 10mg/ml Ethidium Bromide - Cscl2-Saturated íopropanal - Ethanol b) Dụng cụ - Ống nghiệm 5ml, chày cối khử trùng cồn 900 II: Các trình trình tách chiết DNA Có nhiều phương pháp tách chiết , tinh DNA khác thành công nhiều đối tượng thực vật Tuy nhiên phương pháp trải qua qiai đoạn bản: a) Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào phương pháp vật lí hay hóa học Tuỳ loại tế bào, có cấu tạo thành màng tế bào khác mà chọn phương pháp thích hợp Đối với tế bào thực vật ta thường nghiền tế bào nito lỏng để phá vỡ tách tế bào.Nito lỏng có tác dụng làm cho vách xenllulose bị cứng gion, dễ bị vỡ nghiền nito giữ cho mẫu trạng thái lạnh, trạng thái mà enryme phá hủy axit nucleic không hoạt chúng bị ức chế hóa chất Một số trình sử dụng vật liệu khô dễ phá vỡ màng hơn, mặt khác sử dụng vật liệu đông khô không cần giữ mẫu trạng thái lạnh, môi trường khô tuyệt đối làm ức chế enzyme phá hủy axit nucleic CTAB (Cetryl Ammonium Bromide):Là loại hóa chất dung chiết suất axit nucleic có hiệu cao sử dụng rộng rãi CTAB chất tẩy cation, hòa tan màng tế bào làm cho DNA dễ hòa tan hơn, biến tính protein vâ hình thành phức hợp với polysaccharide, protein, polyphenol,… CTAB Là loại ion dương có hoạt tính bề mặt, có khả liên kết thuận nghịch với DNA polysaccharide, cụ thể nồng độ muối cao(trên 1,4 M Nacl có đệm chiết) CTAB kết hợp với DNA polysaccharide phức hợp CTAB-DNA tồn trạng thái hòa tan, phức CTAB-Polysaccharide lại kết tủa- phức hợp sau tách khỏi dung dịch tách chiết hỗn hợp chloroform-isoamyl alcohol Nacl thêm vào dể điều khiển nồng độ muối dung dịch Và vậy, mercaptoethanol PVP thường thêm vào dung dịch ly trích để bảo vệ DNA.Đẻ tăng hiệu hoạt động CTAB, mẫu sử lý với nhiệt khoảng từ 550C-650C Ở nhiệt độ , có tác dụng làm rách thêm màng tế bào màng nhân để giải phóng tối đa lượng axit nucleic dung dịch làm biến tính số protein, đặc biệt enzyme phân hủy axit nucleic SDS(Sodium đoecyl sulfate): loại chất tẩy , có nhiệm vụ loại bỏ phân tủ lipit màng, làm đứt gãy màng tế bào màng nhân thành mảng nhỏ cho phép DNA phóng thích bên EDTA(Ethylenediamine tetra acetate): Trong phòng thí nghiệm, EDTA sử dụng rộng rãi giữ ion kim loại làm dừng hoat động enzyme để ngăn chặn thiệt hại cho DNA EDTA thêm vào số dung dịch đệm Khi màng tế bào bị phá vỡ, loạt chất giải phóng dung dịch, số chúng có loại enzyme thủy phân axit nucleic thành vụn nhỏ, ức chế hoạt động enzyme EDTA Các ion hóa trị như: Mg 2+ Ca2+…rất cần thiết cho hoạt động enzyme thủy phân axit nucleic Nếu dung dịch có EDTA, chất lien kết với ion hóa trị nói trên, liên kết dẫn tới ức chế hoạt động eyme thủy phân axit nucleic, mà axit nucleic không bị thủy phân Tris: Axit nuceic bị ảnh hưởng lớn axit kiềm dung dịch tách chiết, axit làm cho axit nucleic bị gãy, chẳng hạn axit HCL làm cho DNA bị đứt vị trí purin, nồng độ kiềm cao DNA bị tách thành sợi đơn DNA ổn định tính axit dung dịch Ph 8,0 Do mẫu có nhiều axit hữu không bào khe hở tế bào, axit làm thay đổi pH dung dịch gây tổn hại đến phân tử DNA Để loại trừ ảnh hưởng axit kiềm người ta sử dụng Tris để điều chỉnh ph dung dịch; trường hợp ph dung dịch ổn định khó bị thay đổi bị nhiễm axit kiềm Proteinase K: Là enzyme phân giải protein, giúp loại bỏ protein gắn kết với DNA phá hủy enzyme tế bào đảm bảo DNA tách nguyên b) Giai đoạn 2: Loại bỏ thành phần không mong muốn mẫu Mẫu sử ly dung dịch phenol phenol / chloroform(1:1) sau chloroform chloroform/ isoamyl alcolhol (24:1) Phenol chloroform chất hữu có tác dụng biến tính protein làm protein tan pha hữu không hòa tan ( DNA, RNA) nằm pha nước N goài chloroform có tác dụng loại bỏ phân tử lipit cải thiện phân tách pha nước pha hữu Isoamyl acohol thêm vào có tác dụng loại bỏ bọt ngăn cản tạo bọt dung dịch trộn ổn định pha nước phenol chloroform sau ly tâm Nguyên lý việc sử dụng phenol chiết suất DNA sau; nhiệt độ thường phenol dạng tinh thẻ rắn ( tan chảy 80Oc) lẫn với khoảng 20% nước phenol dạng nhũ tương gồm phân tử phenol với phân tử nước vây quanh Khi pha hỗn hợp vào dung dịch tế bào, phân tử phenol có tính kỵ nước nên có khuynh hướng lien kết vào vùng kỵ thủy protein bên cấu trúc phân tử này, kết cục làm protein trương phồng lên lộ xuất nhóm bên kỵ nước( gốc axit) Các nhóm kỵ nước protein kết hợp với tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein, DNA tiếp tục chất tan nước hút sang ống chứa khác Thao tác loại bỏ protein, lipit chất tan khác tan dung dịch DNA chiết suất phenol phenol-chloroform sau chloroform chloroform- isoamyl alcohol(24:1) Sử dụng loại dung môi hữu thường có hiệu cao có dung loại Tuy nhiên, nhiều cần phải loại bỏ hoàn toàn phenol khỏi dung dịch, cần phải lặp lại việc chiết suất chloroform Phenol có ưu điểm tan nước (ở mức độ định) nên không cần khuấy trộn nhiều lân làm biến tinhsprotein tan nước, sử dụng chloroform hay chloroform-isoamyl alcohol phải trộn đảo kỹ chất không tan nước Pha thêm chloroform vào phenol làm tính kỵ nước phenol tăng làm tăng hiệu biến tính protein Sau ly tâm, pha nước chứa DNA nằm phía trên, protein tủa thành lớp nằm pha nước pha hữu c) Giai đoạn 3:Tủa thu nhân DNA Mục đích việc tủa DNA nhằm thu nhận DNA dạng cô đặc, mặt nhằm bảo vệ chúng khỏi phân hủy enzyme, mặt khác hòa tan chúng lại dung dịch theo nồng độ mong muốn Sau k hi loại bỏ protein ta hút dung dịch nổi( pha nước chứa DNA) cho vào ống eppendorf mới, cho muối cation hóa trị 1( thường dùng sodium acetate) ethanol ( isopropanol) tuyệt đối lạnh để thực việc tủa DNA Việc thêm muối làm DNA trở nên giảm tính tan Khi thêm muối vào , ion mang điến tích dương muối tương tác với điện tích aamcuar DNA gắn kết với thay đẩy nhau.Ethanol tuyệt đối lạnh giúp loại bỏ phần tử nước dung môi ethanol DNA khó tan so vơi nước Đồng thời nhiệt độ lạnh tạo thuận lợi cho việc tủa DNA.Như vâỵ môi trường có nồng độ ion cao (nồng độ muối cao) nồng độ ethanol cao(2,5 thể tích ethanol/1 thể tích mẫu) kết tủa mẫu Sau tủa, DNA thu nhận cách ly tâm Để thực việc tinh DNA người ta dung ethanol 70% để rửa DNA Công đoạn nhằn mục đích loại bỏ muối lien kết với DNA, lượng ethanol dư DNA loại bỏ cách phơi mẫu nhiệt độ phòng(15-30’) hay để tủ ấm 55o(5-10’) Sở dĩ phải loại ethanol ức phản ứng PCR Sau đó,DNA hòa tan nước TE(đây dung dịch gồm có Trí HCL EDTA) để bảo quản III: Các bước tiến hành - Gồm 20 bước: - Chuẩn bị mô thực vật: Lấy mẫu từ 10-20 g mô tươi( thường phận non).- lúa Rửa mô nước lạnh vô trùng thấm khô Cho mẫu vào cối, đổ dung dịch nito lỏng nghiền kĩ thành bột( giữ mô trạng thái băng lạnh) Cắt thành mẩu nhỏ cho vào cối,lấy nito lỏng bình giữ lạnh đổ vào cối ,dùng chày nghiền từ từ ,khi hết lạnh bổ sung nito làm cho tơi mẫu thành bột mịn -Phá vỡ phân giải tế bào: Đưa bột nghiền vào ống ly tâm dung tích 250ml lập tức, đổ dung dịch chiết suất đổ vào với lượng 5-10ml dung dịch chiết xuất đổ vào g mẫu tươi khuấy trộn Thêm lượng xấp xỉ dung dịch 10%( wt/ vol) Sarkosyl để có nồng độ cuối 1% vào mẫu Ử nhiệt độ 550C 1-2 Ly tâm mẫu 10 phút với tốc độ 5500g ( v/p) nhiệt độ 40 0C để kết tủa toàn lắng cạn bã, hút lấy phần dung dịch DNA phía ống nghiệm , chuyển sang ống nghiệm khác ly tâm tiếp sang ống nghiệm khác ly tâm tiếp cần thiết để loại bỏ hết cạn bã không tan - Kết tủa DNA: II.Công việc trình thực tập Ngày 15/6/2015 a) Sáng: Thu hái,cắt, đóng gói nấm sò -Thu hái nấm: + Tiêu chuẩn rìa mũ nấm co vào dãn phẳng, thịt nấm dày, chắc, mập non + Thu hái phải hái cụm, không để sót lại phần gốc bịch nấm - Cắt: + Ta cắt bỏ phần gốc nấm + Những nấm già loại bỏ lấy non - Đóng gói nấm: + Ta đóng vào túi nilon + Mỗi túi nặng 0, kg b) Chiều: Buộc cổ nút bịch nấm linh chi phòng lạnh + Chuẩn bị giấy báo cắt hình vuông, chun buộc +Tiến hanh chụp báo vào cổ nút bịch nấm dùng chun buộc lại Ngày 16/6/2015 a) Sáng: Làm nguyên liệu trồng nấm rơm - Nguyên liệu: rơm -Cách tiến hành: + Ta rũ rơm phun nước cho ẩm rơm có rắc vôi bột + Sau rơm ẩm Ta tiến hành ủ đống + ủ đống;chuẩn bị kệ ủ, cọc thông khí Cho rơm làm ướt lên kệ ủ lớp rơm dày rắc lơp vôi bột làm cho hết phần nguyên liệu Chú ý ủ đống phải lên đống ủ vuông vắn dung chân ấn chặt để tránh đổ + Đặt cọc thông khí đống ủ để thẳng + Sau dung túi nilon buộc xung quang đống ủ lại để 3- ngày b)Chiều: Tháo nút bông, cổ nút bịch nấm kim châm vàng xếp vào phòng lạnh - Lấy bịch nấm dàn xuống Sau tháo nút bong, dây chun, bỏ cổ nút - Cho bịch nấm kim châm vàng vào xe đảy đảy vào phòng lạnh - Đưa bịch nấm lên dàn nhà lạnh để ươm sợi Ngày 17/6/2015 a) Sáng: Thu hái, cắt, đóng gói nấm sò Buộc cổ nút bịch nấm rơm Tiến hành làm ngày hôm 15/6/2015 b) Chiều: Thu hái nấm linh chi - Dùng dao cắt chân nấm sát bề mặt cổ nút bịch nấm - Lấy vôi đặc quét lên vết cắt bịch nấm để không bị bệnh Ngày 22/6/2015 a) Sáng: Tẽ giống nấm rơm, giỡ đống ủ, vào khuôn cấy giống - Tẽ giống nấm rơm: + Ta phải kiểm tra giống nấm có đạt tiêu chuẩn không Nếu phần bị mốc phải loại bỏ +Sau ta bỏ chun buộ, nút bong, nút giấy,cổ nút phần túi nilon bên ngoà +Tiến hành tẽ giống: ta chi càn bẻ tơi giống nấm đươc - Giỡ đống ủ: + Ta dung cào bổ đống ủ làm phần: phần phần lóc bên , phần phần bên đống ủ + Khi giỡ đống ủ xong ta để nguội bớt nhiệt + Sau cho vào xe chuyển vào nhà lán để vào khuôn cấy giống - Vào khuôn cấy giống: + Chuẩn bị: *Khuôn đóng mô hình thang có chiều rộng đáy 0,4 m, chiều dài đáy 1,2, chiều rộng đáy 0,3m, chiều dài đáy 1,1m, chiều cao khuôn 0,4 m * Giống nấm; 12 kg cho nguyên liệu + Đóng mô, cấy giống: * Cho lớp nguyên liệu dày 10-20 cm * Cấy lớp giống xung quanh cách mép khuôn 4-5 cm * Làm cho lớp tiếp theo, lớp rắc giống toàn bề Sau ấn chặt tay Với nguyên liệu ta đóng 70-80 mô b) chiều: Lam buổi sáng Dọn lán 12; dỡ bịch nấm linh chi, quét dọn lán 12 - Dỡ bịch nâm linh chi; + Ta tháo bỏ nút bông, dây chun, cổ nút bịch nấm linh chi +Sau vận chuyển xe đổ Ngày 25/6/2015 - Chuyển bịch nấm sò vào lán 15: + Bịch nấm sò cấy giống chuyển vào phòng nuôi sợi, đặt giàn giá, xếp bịch cách khoảng 3-4 cm, miệng bịch hướng xuống + Nhà ươm cần thoáng mát, sẽ, không cần ánh sáng + Độ ẩm không khí: 70-80 % Ngày 26/6/2015 - Chuyển bịch nấm vào lán 15, treo bịch, rạch bịch + Làm tương tự ngày 25/6/2015 + Rạch bịch: Ta dung dao rạch mỗ bịch nhát dài 3- cm III SƠ ĐỒ CÁC QUÁ TRÌNH NẤM CÔNG NGHỆ NUÔI TRỒNG NẤM SÒ Rơm rạ làm ướt nước vôi Ủ đống Đảo lần - Chỉnh ẩm Đảo lần - Băm nguyên liệu Đóng bịch - Cấy giống Ươm sợi Rạch, treo bịch Chăm sóc, thu hái, chế biến nấm 2, CÔNG NGHỆ NUÔI TRỒNG NẤM MỠ Rơm rạ khô sử lý nước vôi loãng ngày Ủ đống, bổ sung đạm ngày Đảo lần - Đảo không ngày Đảo lần - bổ sung bột nhẹ CaCO3 ngày Đảo lần - bổ sung lân ngày Đảo lần - Đảo không ngày Lên men phu -8 ngày Vào giàn, vào luống - ngày Cấy giống 12 - 15 Phủ đất ngày 12 - 15 Chăm sóc, thungày hái Chế biến nấm 3, CÔNG NGHỆ NUÔI TRỒNG NẤM LINH CHI Mùn cưa, bã mía Xử lý nước vôi, ủ giống ngày Đảo chỉnh độ ẩm ngày Phối trộn nguyên liệu đóng bịch Thanh trùng Để nguội cấy giống Ươm sợi, nới nút 10 - 12 ngày Chăm sóc, thu hái, chế biến CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY NẤM RƠM Rơm rạ phế loại Xử lý nguyên liệu nước vôi Ủ đống Đảo chỉnh độ ẩm nguyên liệu Đóng mô vào khuôn cấy giống Ươm sợi Chăm sóc thu hái chế biến [...]... kỹ thuật SSR đơn giản, thuận tiện, không tốn kém; mặt khác Microsatelites là chỉ thị đồng trội nên nó được sử dụng để phát hiện cá thể dị hợp tử và lập bản đồ gen sử dụng quần thể F2 QUÁ TRÌNH THỰC TẬP TẠI VIỆN SINH NÔNG Người hướng dẫn: Cô Vũ Thị Lan Phương Địa điểm: Đại học Hải Phòng Thời gian: 2/6/2015 -5/6/2015 I RỬA BÌNH 1 Dụng cụ hóa chất - 2 chậu đựng nước - 5 khay đựng bình - Bối rửa - Que... động mang tính đặc thù riêng cho mỗi ADN có trình tự nhất định Với mỗi loại mồi khởi động thì chỉ ADN đặc hiệu với nó được sao chép Sau khi các chuỗi bổ sung đã được tổng hợp xong, hai chuỗi kép được tạo thành qua quá trình này sẽ lại được dùng nhiệt để tách ra và quá trình tổng hợp lại được lặp lại như trên để sản sinh ra 4 chuỗi ADN và cứ như thế tiếp di n Bằng cách sử dụng một loại ADN polymerase... chép ADN được tạo ra trong môi trường in vitro như trong quá trình phân bào Để tạo được quá trình này, trước tiên chuỗi ADN kép được làm nóng đến mức bị tách thành hai nhánh đơn Làm nguội các nhánh đơn này rồi nhờ xúc tác của enzym ADN polymerase và các tiền chất deoxynucleotid tương ứng để nhánh ADN bổ sung được tổng hợp Trong ống nghiệm, quá trình này không thể tự xảy ra được mà phải có các đoạn ADN... hoạt động tổng hợp nên ADN mới Nồng độ sử dụng enzym phụ thuộc vào mỗi loại enzym và thuộc tính của nó Nếu quá nhiều enzym có thể sẽ làm tăng nồng độ glycerol trong dung dịch phản ứng, dẫn tới quá trình tổng hợp không đồng đều giữa các vị trí và tạo ra hình ảnh điện di không rõ nét Ngược lại, nếu quá ít sẽ thiếu enzym và kết quả nhận được là sản phẩm tổng hợp không đầy đủ + Dung dịch đệm PCR Dung dịch... trong quá trình PCR Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110 °C DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA Từ đó, không cần phải thêm DNApolymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình. .. một quy tắc …, 1000bp/ 1 phút Figure 2: Hình 2: Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ (1) Nóng chảy ở 96°C (2)Gắn mồi ở 68°C (3)Kéo dài ở 72°C (P=Polymerase) (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ Ví dụ Thời gian và nhiệt độ trong ví dụ này được lấy từ chương trình PCR mà đã thành công trên phân đoạn 250bp của... nó thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro) Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96 °C Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ Quy trình. .. tên giống cây đươc cấy chuyển, ngày, tháng, năm, tên người thực hiện chuẩn bị đua vào phòng nuôi Chú ý: -Khi thực hiện các thao tác cấy tuyệt đối không dược đưa ngang tay qua mặt giấy cấy để tránh nhiễm mẫu -Trước mỗi thao tác đều phải khử trùng dụng cụ dao cấy, kẹp cấy - Luôn cầm bình nghiêng 45 để tránh nhiễm mẫu - Không nói chuyện trong quá trình cấy chuyển ... mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống 1)Lịch sử: Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một... động hơn Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004) Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’ Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea