Báo cáo thực tập tại Viện Di truyền nông nghiệp

Viện Di truyền nông nghiệp được thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân của Viện là Trung tâm di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984). Hiện nay, Viện nằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội

Lời cảm ơn

Trớc hết em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Phòng bệnh học phân tử - Viện di truyền nông nghiệp cùng các cán bộ công nhân viên trong phòng đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập vừa qua.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Đại học Bách Khoa Hà Nội và cô Nguyễn Xuân Sâm tạo điều kiện cho em hoàn thành đợt thực tập kỹ thuật.

Lời mở đầu

Viện Di truyền nông nghiệp đợc thành lập ngày 10/10/1989, tiền thân củaViện là Trung tâm Di truyền Nông nghiệp (thành lập năm 1984) Hiện nay, Việnnằm trên địa bàn huyện Từ Liêm, Hà Nội

Chức năng chính của Viện là :

-Nghiên cứu, ứng dúng các phơng pháp di truyền học hiện đại và côngnghệ sinh học để chọn tạo các giống cây trồng có năng suất cao, phẩm chất tốt,chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất lợi của môt trờng

-Tạo các chủng vi sinh vật mới phục vụ bảo quản và chế biến lơng thực phẩm, sản xuất các loại chế phẩm sinh học phục vụ nền nông nghiệp bềnvững và bảo vệ môi trờng

thực Tăng cờng hợp tác quốc tế và tham gia đào tạo cán bộ về lĩnh vự Ditruyền và Công nghệ sinh học

Để thực hiện đợc các chức năng trên, Viện đã tổ chức thành 10 đơn vịnghiên cứu và chuyển giao công nghệ với tổng số cán bộ là 116 ngời trong đó có

3 tiến sĩ , 6 phó giáo s, 16 phó tiến sĩ và 8 thạc sĩ

Trong những năm qua, Viện đã đạt đợc rất nhiều thành tựu, đã thực hiện

và chủ trì 18 đề tài nhà nớc, 42 đề tài cấp ngành, 8 dự án sản xuất thử, tạo đợcnhiều giống lúa mới và các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, tạo ra cácquy trình tiến bộ kỹ thuật đợc công nhận Ngoài ra, Viện còn thực hiện các dự ánhợp tác quốc tế với các tổ chức UNDP, FAO Nhờ các thành tự trên mà Viện đãnhận đợc nhiều giải thởng có giá trị cả trong và ngoài nớc: Giải thởng quốc tế về

đóng góp phát triển nông nghiêph Châu á Thái Bình Dơng, huân chơng lao độnghạng 3

giới thiệu chung về bệnh học thực vật

I Quan niệm về bệnh hại thực vật

Việc chỉ ra đợc chính xác lúc nào cây bị bệnh luôn là một vấn đề khókhăn và đợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Ngời ta cho rằng một cây đ-

ợc coi là khoẻ mạnh và phát triển bình thờng khi nó biểu hiện các chức năng sinh

lý ở mức tối đa tiềm năng di truyền của nó Các tế bào mô phân sinh của cây

cần thiết Các kiểu tế bào chuyên hoá khác nhau hấp thụ nớc và dinh dỡng từ đất,

đa nớc và dinh dỡng đến tất cả các bộ phận của cây, tiến hành quá trình quangtổng hợp, các quá trình chuyển hoá và trao đổi chất, hoặc lu giữ các sản phẩmcủa quá trình quang tổng hợp và tạo hạt hoặc các cơ quan tái tạo khắc cho khảnăng sinh tồn và phát triển Bất cứ khi nào các tế bào của một cây hay một bộphận nào đó của cây có khả năng thực hiện một hay nhiều chức năng đặc biệt bịcan thiệp do các vi sinh vật hoặc là yếu tố môt trờng bất lợi thì các hoạt động củacác tế bào bị gián đoạn, bị thay đổi hay bị ức chế hoặc bị chết và cây trồng trởnên bị bệnh

Đầu tiên bệnh mới chỉ xảy ra ở một vài tế bào và vẫn cha biểu hiện ra

nh-ng chỉ tronh-ng một thời gian nh-ngắn, bệnh lan rộnh-ng và các bộ phận cây bị bệnh bắt

đầu thay đổi và biểu hiện ra ngoài các triệu chứng bệnh mà mắt thờng có thểthấy đợc Dựa vào những thay đổi mà cây thể hiện khi phản ứng lại sự xâmnhiễm của vi sinh vật hay ảnh hởng của các yếu tố môi trờng bất lợi mà chúng ta

có thể biết đợc mức độ bệnh của cây Từ đó bệnh của cây có thể đợc định nghĩa

là : một chuỗi các phản ứng của các tế bào và các mô thực vật với các vi sinh vật gây bệnh hoặc với các yếu tố môi trờng mà ta có thể nhìn thấy đợc hoặc không nhìn thấy đợc, dẫn đến những thay đổi bất lợi theo hình dạng, chức năng, hoặc tình trạng nguyên vẹn của cây trồng và có thể dẫn đến sự suy yếu hoặc có thể gây chết toàn phần hoặc từng phần của cây.

Các tác nhân gây bệnh vi sinh vật thờng gây bệnh bằng cách can thiệp vàoquá trình trao đổi chất của tế bào cây thông qua các enzyme, các chất độc tố, cácchất điều hoà sinh trởng và các loại chất khác mà chúng tiết ra khi tiếp xúc vớicây chủ, hoặc hấp thụ dinh dỡng của tế bào chủ phục vụ cho mục đích sử dụngcủa chúng Một số sinh vật khác lại gây bệnh bằng cách sống ký sinh và pháttriển, sinh sản trong hệ thống bó mạch mô gỗ hay bó mạch libe và hậu quả tấtyếu là làm tắc nghẽn đờng vận chuyển lên xuống của nớc và của đờng Ngoài ra,các yếu tố môi trờng cũng gây bệnh trên thực vật khi tác động với mức ngoài ng-ỡng chống chịu của cây

Có rất nhiều loại bệnh hại cây trồng, chúng đợc phân nhóm theo rất nhiềutiêu chuẩn: theo triệu chứng bệnh, theo bộ phận cây bị bệnh, theo loại cây bịbệnh Hiện nay, phổ biến nhất là ngời ta phân loại bệnh cây dựa vào loại tácnhân gây bệnh Theo tiêu chuẩn này, bệnh thực vật đợc chia làm 2 loại: bệnh gây

ra do các yếu tố sinh học và bệnh gây ra bởi các yếu tố không sinh học Theotiêu chuẩn này, ta có thể chỉ ra đợc nguyên nhân gây bệnh, quá trình tiến triển vàcách lan truyền bệnh từ đó suy ra đợc biện pháp phòng trừ bệnh

Phần i: Nuôi cấy mô tế bào thực vật

I Khái niệm chung:

Nuôi cấy mô tế bào là một phạm trù khái niệm chung cho tất cả các loạinuôi cấy những nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi tr-ờng dinh dỡng nhân tạo và trong điều kiện vô trùng Bao gồm:

- Nuôi cấy các cơ thể thực vật hoàn chỉnh

- Nuôi cấy các cơ quan, bộ phận tách rời của thực vật nh mẩu lá, mẩu rễ,một đoạn thân, một bộ phận của hoa, quả

- Nuôi cấy phôi non (phôi cha phân hoá hoàn toàn), phôi trởng thành

- Nuôi cấy mô sẹo (callus)

- Nuôi cấy tế bào: Tế bào thực vật đơn (nuôi cấy huyền phù tế bào), tế bàotrần

Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên tính toàn năng của tế bào

do Haberlandtf phát biểu (1898): Mỗi tế bào của cơ thể đa bào có khả năng tiềmtàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh trong điều kiện phù hợp Cơ sởvật chất của tính toàn năng là mỗi tế bào trong cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ vậtchất thông tin di truyền Khi tạo đợc môi trờng nuôi cấy phù hợp, sử dụng cácchất điều khiển sinh trởng thực vật, ta có thể hoạt hoá gen cần thiết để bắt một tếbào bất kỳ của cơ thể thực vật phát triển đợc thành cây hoàn chỉnh

Phân hoá và phản phân hoá của tế bào cũng là cơ sở lý thuyết của côngnghệ này Trong đó, sự phân hoá là việc chuyển những tế bào phôi sinh trở thànhcác tế bào chuyên hoá để thực hiện những chức năng khác nhau về sinh lý, sinhhoá; còn sự phản phân hoá là sự chuyển các tế bào đã chuyên hoá trở lại trạngthái phôi sinh, có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới

Điều kiện để tế bào thể hiện tính toàn năng qua con đờng phân hoá và phảnphân hoá là môi trờng nuôi cấy

II.Môi trờng nuôi cấy mô tế bào thực vật:

Môi trờng nuôi cấy là yếu tố quan trọng, nó quyết định cho sự thành côngcủa việc nuôi cấy mô tế bào thực vật tách rời Thành phần chính bao gồm:

1 Nguyên tố khoáng đa lợng: Là các nguyên tố nh N, P, K, Mg, S,

tố thờng lớn hơn 30mg/l Chúng là nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xâydựng nên thành phần cấu trúc.

2 Các nguyên tố khoáng vi lợng: Là các nguyên tố nh Fe, Mn, Mo, B, I,

Cu, Zn, Co với hàm lợng mỗi nguyên tố nhỏ hơn 30mg/l Chúng là thànhphần của coenzim để xúc tác phản ứng hoá sinh diễn ra trong tế bào sống

3 Nguồn cacbon: Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, các mô và tế bào

chuyển sang phơng thức sống dị dỡng nên cần phải cung cấp cho chúngmột nguồn cacbon hữu cơ, thờng là đờng mía saccaroza (trong một số tr-ờng hợp còn sử dụng glucoza, maltoza, lactoza )

Ngoài ra, manitol, sorbitol đợc sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy huyền phù

và tế bào trần với chức năng ổn định áp suất thẩm thấu

4 Vitamin: Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng

tổng hợp vitamin nhng lợng tổng hợp đợc không đủ nên phải bổ sungvitamin ngoại sinh vào môi trờng cấy Vitamin thờng dùng là nhóm B dễhoà tan vào trong nớc nh B1, B2, B3, B5, B6 với hàm lợng từ một đếnmột vài mg/l Chúng là thành phần coenzim của hàng loạt enzim xúctác cho các phản ứng hoá sinh, vì vậy không thể thiếu trong môi tr-ờng nuôi cấy

*Myo-Inositol là một hợp chất thứ cấp có vòng thơm (cha đợc xếp vàovitamin), do sự tham gia hình thành hợp chất pectin tạo thành tế bào, cótác động kích thích mạnh mẽ sự phân chia của tế bào, đợc sử dụng với l-ợng lớn ~ 100 mg/l

5 Chất điều khiển sinh trởng: Là thành phần quan trọng nhất của môi

trờng nuôi cấy, giúp điều khiển đợc quá trình phân hoá và phản phânhoá tế bào, thể hiện đợc tính toàn năng của tế bào trong nuôi cấy tế bào

và mô thực vật tách rời Ngời ta thờng sử dụng chủ yếu hai nhóm chất

điều khiển sinh trởng thực vật sau:

- Auxin: kích thích quá trình tăng trởng của tế bào, kích thích sựhình thành mô sẹo và rễ bất định Các loại thờng dùng làIAA(axit indolaxetic), αNAA(axit naphtyl axetic), IBA(axitindol butyric), 2,4DAA(axit Diclofenoxy axetic) Hàm lợngdùng nhỏ 10-5-10-7 mol/l

- Xytokinin: kích thích sự phân chia tế bào và tạo chồi bất định.Các loại thờng dùng là Kinetin, BAP(6-benzylaminopurin),

Ngời ta sử dụng phối hợp auxin và cytokinin với tỷ lệ và hàm lợngphù hợp để đạt mục đích mong muốn Quy luật tơng đối: tỷ lệ auxintrên xytokinin lớn thì các mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình thìmẫu cấy tạo mô sẹo, còn tỷ lệ thấp thì tạo chồi.

Ngoài ra hợp chất Gibberillin có vai trò quan trọng trong sinh lý ngủnghỉ của hạt, chồi, phát triển của hoa, tăng tởng chiều dài thực vật, sửdụng nhiều trong nuôi cấy mô phân sinh; các hợp chất ức chế sinh tr-ởng: axit absisic (ABA), CCC… sử dụng trong bảo quản nguồn gen sử dụng trong bảo quản nguồn geninvitro

5 Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên: đây là thành phần thờng dùng

nhng không bắt buộc trong môi trờng nuôi cấy Bao gồm nớc dừa,dịch nghiền một số rau, củ, quả: khoai tây, chuối, táo, cà rốt dịchchiết nấm men, hợp chất cazein, pepton để gia tăng các chất dinh d-ỡng, các chất có hoạt tính điều khiển sinh trởng và sự phát triển củamẫu cấy

6 Chất làm đông cứng môi trờng: Là giá thể cho mẫu cấy Thờng

dùng nhất là Agar agar Đây là polysaccarit của tảo biển, hoà tan vớinớc khi ở nhiệt độ lớn hơn 800C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏhơn 400C lại ở dạng rắn(gel) Agar có khả năng ngậm nớc cao, chỉcần 6-12 g có thể làm đông đặc 1l nớc và khi ở trạng thái rắn thì tếbào và mô thực vật vẫn dễ dàng hấp thu đợc các chất dinh dỡng từmôi trờng

III Nguyên tắc, kỹ thuật chung trong nuôi cấy mô tế bào:

Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thànhcông của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt đợc khi nó trải qua 5 bớc sau:

Bớc 0: Bớc chuẩn bị

Chọn lọc cây mẹ đạt tiêu chuẩn sau:

- Cây mẹ có đặc điểm di truyền, đặc điểm nông, sinh học quý ta cần

- Có khả năng sinh trởng và phát triển tốt

- Sạch bệnh, đặc biệt là sạch virus

- Nếu trong tự nhiên không có những cây đạt tiêu chuẩn trên, phải trồng cáccây mẹ trong điều kiện cách ly với nguồn bệnh hoặc tối u về điều kiệnchăm sóc, dinh dỡng, bảo vệ thực vật… sử dụng trong bảo quản nguồn gen để có cây mẹ đạt tiêu chuẩn.

Bớc 1: Nuôi cấy khởi động

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh mẫu nuôi cấy Mẫu nuôi cấy thờng

sử dụng trong phòng thí nghiệm là chồi đỉnh, chồi nách của cây mẹ Ngoài ra,tuỳ thuộc từng đối tợng nuôi cấy ngời ta còn có thể sử dụng các mẫu nuôi cấy

nh mẩu lá, đài hoa, cánh hoa, mẩu rễ, phôi non

Cần xác định chế độ khử trùng cho mẫu cấy trớc khi tiến hành để đảm bảo mẫusạch vi sinh vật nhng tỉ lệ sống cao Hiện nay sử dụng chủ yếu là phơng pháp sáttrùng bề mặt bằng chất hoá học, thờng là HgCl2 0,1% sát trùng trong 5-10 phút

ít phổ biến hơn là các dung dịch hypoclorit nh NaOCl, Ca(OCl)2 5% trong 20-30phút Ngoài ra còn dùng H2O2 15%,dung dịch Brom 5-10% nhng hiệu quả khôngcao

Sau khi khử trùng mẫu cấy, ta tiến hành đa mẫu cấy vào môi trờng thích hợp đểmẫu cấy tạo thành chồi mầm hoặc phôi vô tính Việc lựa chọn môi trờng thíchhợp là rất khó khăn, cần phải đặc biệt chú ý đến tỷ lệ, hàm lợng các chất điềukhiển sinh trởng trong môi trờng để làm cho mẫu cấy phát sinh đợc hình thái

Bớc 2: Nhân nhanh mẫu

Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đíchchính là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất Chính vì vậy giai đoạn này đợc coi làgiai đoạn đánh giá tính u việt hay không u việt của phơng pháp nuôi cấy mô tếbào

ở giai đoạn này, môi trờng dinh dỡng nhân tạo để nuôi cấy thờng đợc đathêm vào chất điều khiển sinh trởng, các chất bổ sung khác nh nớc dừa, nớc chiếtnâm men, dịch thuỷ phân casein kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sángnhằm đạt đợc hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất ditruyền, có thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau Tuy nhiên, tuỳ từng đối tợng nuôi cấy, ngời ta có thể đạt đợc hệ số nhân caobằng việc kích thích sự hình thành các cụm chồi hay kích thích sự phát triển củacác chồi nách hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

Bớc 3: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt đợc một kích thớc nhất định, các chồi đợc chuyển từ môi trờngtrong bớc 2 vào môi trờng tạo rễ Thờng sau 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này

sẽ xuất hiện rễ ở giai đoạn này, ngời ta bổ sung vào môi trờng các auxin vìauxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôicấy Tuy nhiên, ở một số loài nh chuối hoặc cây ngái sự hình thành rễ tốt hơn cả

đạt đợc trong môi trờng không có chất điều hoà sinh trởng

Bớc 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên

Giai đoạn đa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bớc cuối cùng củaquy trình nuôi cấy mô tế bào

Cây lấy ra ống nghiệm phải đợc rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sựxâm nhập của côn trùng và nấm mốc.Theo Bhojwani và Razdan(1983), quy trìnhnày sẽ thành công hơn nếu trớc khi đa cây con ra đất ta ơm cây trên cát có độ ẩm90% từ 10 đến 15 ngày Trong những khoảng thời gian này, rễ mới đợcc sinh ra

và bắt đầu hình thành lá mới Sau đó chuyển cây ra đất với chế độ chăm sóc bìnhthờng

Tuy nhiên vẫn còn một số các vấn đề tồn tại trong việc nuôi cấy mô tếbào.Đó là:

- Sự bất định di truyền

+ Khi sử dụng kĩ thuật nuôi cấy mô để nhân giống vô tính, có xảy

ra hiện tợng biến dị soma: sự sai khác về hình thái, đặc điểm sinh lí,sinh hoá, di truyền của những cây tái sinh nhận đợc ở ngay giai

đoạn invitro hoặc giai đoạn exvitro

+ Khắc phục: Chọn mẫu cấy là mô non ít chuyên hoá để dễ điềukhiển và phát triển hình thái, giảm lợng chất điều khiển sinh trởng

sử dụng, từ đó giảm đợc ảnh hởng của chúng Đồng thời, phải hạnchế số lần cấy chuyển khi nhân nhanh (5-6 lần), để giảm sự tíchluỹ, gia tăng ảnh hởng của các chát điều khiển sinh trởng

- Sự nhiễm mẫu cấy

+ Có một số vi sinh vật có khả năng xâm nhập và tồn tại rất sâutrong hệ thống mô dẫn của thực vật Khi tế bào thực vật bắt đầuphát triển, phân chia, chúng làm nhiễm mẫu vào môi trờng sau 2-3tuần nuôi cấy

+ Khắc phục: Chọn và nuôi trồng cây mẹ đúng tiêu chuẩn, nếu cây

mẹ bị bệnh có thể dùng kháng sinh để khử trùng mẫu

- Sự tiết độc tố từ mẫu cấy

+ Sau 1-2 ngày đa vào môi trờng, mẫu cấy tiết ra những chất màu

đen, nâu làm hỏng môi trờng, chết mẫu Các chất đó có thể là tanin,polyphenol bị oxy hoá

+ Khắc phục: Chọn mẫu non để giảm hàm lợng tanin, polyphenol ;gây vết thơng cơ giới tối thiểu nhất; xử lý mẫu cấy bằng cách ngâmtrong dung dịch axit hữu cơ có tính khử mạnh: axit ascorbic, axitxitric; bổ sung vào môi trờng than hoạt tính để hấp phụ các chất nóitrên

- Hiện tợng thuỷ tinh hoá mẫu cấy

+ Khi nuôi cấy trong môi trờng lỏng và bình nuôi bị hạn chế về khảnăng trao đổi khí thì tế bào và mô thực vật bị mọng nớc, trở nêntrong suốt, có hình dạng không bình thờng

+ Khắc phục: Bổ sung vào môi trờng chất gây áp suất cao, chất ứcchế tổng hợp etilen, tăng cờng độ chiếu sáng và giảm nhiệt độphòng nuôi

IV ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào trong công tác giống cây trồng:

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khác nhau.Trong công tác giống cây trồng, nuôi cấy in vitro đợc ứng dụng để:

- Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống

- Duy trì, bảo quản, nhân nhanh các giống và cá thể có ý nghĩa khoa học, cógiá trị kinh tế cao

- Làm sạch virus, phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh

Trong số đó, ứng dụng để nhân nhanh giống vô tính cây trồng bằng phơngpháp nuôi cấy in vitro đợc quan tâm hơn cả Ngời ta ớc tính có khoảng 300 loạicây có thể đợc nhân giống bằng phơng pháp này Lợi ích của nó là ở chỗ: có thểtạo ra một quần thể cây con với số lợng lớn mà vẫn giữ nguyên đặc tính cây mẹ,

đó cũng là những cây giống khoẻ mạnh, sạch virus, sinh trởng tốt và cho năngsuất cao; có thể phục tráng một quần thể thực vật có nguy cơ diệt vong; có thểtrao đổi quốc tế nguồn gen và lu giữ, bỏ quản dạng cây in vitro Chính nhờ kỹthuật nuôi cấy mô tế bào, ngời ta có thể tạo ra đợc hệ số nhân giống cao, sớmphát huy đợc hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhân giống, dễ chăm sóc

và dễ dàng khắc phục đợc những điều kiện bất lợi Phơng pháp này tỏ ra đặc biệthiệu quả với những loại cây khó nhân giống bằng con đờng hữu tính, các giốngquý hiếm có số lợng giống ban đầu hạn chế mà lại cần nhân nhanh

ở Việt Nam, từ năm 1975, nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nớc đã đợcthành lập và cho đến nay đã thu đợc một số kết quả đáng kể Tại viện Sinh vật-Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia đã hoàn thiện quy trình nhân giống

in vitro một số giống cây trồng có khả năng chống chịu nh lúa, thuốc lá, khoailang, dứa sợi Tại trờng Đại học Nông nghiệp I Hà Nội đã hoàn thiện quy trìnhnhân giống khoai tây chất lợng cao, bớc đầu đi vào sản xuất.Tại các tỉnh phíaNam đã xây dựng đợc ngân hàng cà phê với 10 dòng khác nhau, hoàn thiện quytrình nhân giống cây cao su Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bàotrong cả nớc đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhân giống cây hoa, cây

ăn quả, cây rừng, cây quý hiếm có giá trị cao

Tóm lại, nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện nay đợc đa vào trong các chơngtrình chọn giống và nhân giống hiện đại, nó góp phần tích cực vào lý luận sinhhọc cây trồng, vào thực tiễn nông nghiệp, mở ra một hớng đi mới cho nghiên cứu

di truyền học, hoá sinh, sinh lý thực vật , đặc biệt nó đem lại những ứng dụng tolớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng

V.Kết quả và thảo luận

Thực hiện nuôi cấy mô đối với loại mẫu là cây hoa cúc lấy từ vờn của viện

Di truyền nông nghiệp

- Mẫu cây đợc cắt bỏ lá và cắt thành những đoạn dài 5-7 cm

- Rửa mẫu bằng nớc rửa bát loãng sau đó rửa lại bằng nớc sạch 3 lần

- Rửa mẫu bằng cồn 70 độ trong 1 phút để sát trùng sơ bộ sau rửa lại bằng n ớcsạch 3 lần

- Khử trùng mẫu bằng hydroperoxide trrong 10-15 phút sau đó tráng sạch bằngnớc cất

- Cắt cành thành từng đoạn ngắn, mỗi đoạn có ít nhất một mắt ngủ

- Cấy mẫu vào môi trờng nuôi cấy có nồng độ aucin-cytokinin thích hợp, sau 3tuần các mắt ngủ sẽ phát triển thành chồi

- Thờng sau quá trình này câty đợc nuôi cấy bằng phơng pháp cắt lát mỏng để

- Một thời gian sau,nếu tỷ lệ cây sống đạt hơn 85% có thể đem cây con trồngtrong điều kiện bình thờng

Phần ii: chẩn đoán bệnh

I.Khái niệm

1.Tình hình bệnh hại trên giống cây trồng thực vật ở Việt Nam.

Để đảm bảo an ninh lơng thực đồng thời phát triển nhanh nền kinh tế, trongnhững năm gần đây Việt Nam đã nhập nhiều giống cây trồng và hoa cây cảnh từnhiều quốc gia trên thế giới Điều này luôn kèm theo các nguy cơ xân nhập của

vi sinh vật gây hại, đặc biệt là các bệnh hại thực vật thuộc diện KDTV ở ViệtNam

Trên thế giới cũng nh ở Việt Nam, bệnh hai thực vật gây nên những thiệthại vô cùng to lớn và chúng đang làm ảnh hởng đáng kể đến chất lợng sản phẩmcũng nh năng suất cây trồng Đặc biệt là bệnh hại do virus gây ra: Virus PVY làvirus gây bệnh thối củ khoai tây, làm giảm năng suất củ tới 80%, nó cũng gâythiệt hại đáng kể trên cây cà chua, ớt, thuốc lá Khi thuốc lá bị nhiễm virus nàythì năng suất giảm tới 30% Trong lĩnh vực hoa cây cảnh còn trầm trọng hơn.Việc áp dụng những thành tựu khoa học kỹ thuật của CNSH, đặc biệt là sinh họcphân tử và Miễn dịch liên kết gắn enzim vào sản xuất là rất cần thiết nhằm tăngnăng suất cây trồng, chẩn đoán nhanh và chính xác tác nhân hại cây trồng, đápứng đợc đòi hỏi cấp bách của KDTV

Một số tác nhân gây bệnh thờng thấy trên cà chua, khoai tây, thuốc lá

1.1Virus khảm da chuột – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) Cucumber Mosaic Viruses (CMV)

Loại virus này gây ra các loại khảm và biến dạng lá khác nhau, điển hìnhnhất là dạng biến dạng hình kim, gây nên những thiệt hại nghiêm trọngtrong sản xuất cà chua và thuốc lá Virus này đợc lan truyền qua Aphis

gossyphii Nó thuộc nhóm Cucumovirus có cấu trúc ARN mạch đơn Xuất

hiện dịch bệnh không có quy luật báo trớc

1.2 Virus khảm thuốc lá - Tobacco Mosaic Viruses (TMV)

Loại virus này gây ra các loại khảm và phồng lá khác nhau, điển hình nhất

là dạng khảm san hô gây nên những thiệt hại nghêim trọng trong sản xuất

cà chua, gây ảnh hởng đến chất lợng thuốc lá Virus này đợc lan truyềnbằng con đờng cơ học, đồng thời đối với cà chua virus này còn lan truyềnqua hạt Nó thuộc nhóm Tobamovirus có cấu trúc ARN mạch đơn

1.3 Virus Y khoai tây – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) Potato Y Viruses (PVY).

Loại virus này gây ra các loại khảm và các dạng hoại tử ở thịt và gân lákhác nhau, gây nên những thiệt hại nghiêm trọng trong sản xuất cà chua vàthuốc lá Vectơ của virus này là các loại muội khác nhau Nó thuộc nhóm

2.Sự lan truyền virus trong tự nhiên

Virus thực vật không thể tự lây nhiễm vào các mô, tế bào của vật chủ màchúng chỉ thâm nhập vào khi các tế bào hoặc các mô của vật chủ bị tổn thơng.Trong tự nhiên quá trình này đợc thực hiện thông qua các vi sinh vật khác,những sinh vật mang virus từ cây này truyền cho cây khác gọi là vectơ truyềnbệnh Ngày nay những phơng thức truyền bệnh của virus đã đợc xác định, baogồm những phơng thức sau:

2.1 Lây lan cơ học

Các virus thực vật truyền từ cây bệnh sang cây khoẻ nếu nồng độ virustrong cây bệnh và độ bền vững của virus là cao nh các bệnh khảm thuốc lá,khảm cà chua, khảm da chuột… sử dụng trong bảo quản nguồn gen chúng có thể truyền trực tiếp từ cây nàysang cây khác khi lá chạm vào nhau, hoặc gián tiếp qua môi trờng đất, nớc,quần áo ngời lao động, chân tay… sử dụng trong bảo quản nguồn gen Nhân giống vô tính cũng là phơng thức

là cho virus xâm nhập vào các vật chủ thông qua các dụng cụ chiết, cắt,ghép… sử dụng trong bảo quản nguồn gen

2.2 Lan truyền qua chất dinh dỡng

Virus có khả năng lây nhiễm vào tất cả các bộ phận của cây nh lá, thân, rễ,

củ mầm… sử dụng trong bảo quản nguồn gen Những cây mới phát triển từ vật nhiễm virus đều duy trì chovirus sống từ mùa này sang mùa khác là nguồn lan truyền bệnh virus ranhiều vùng trên thế giới

2.3 Lan truyền qua hạt.

Trớc đây ngời ta cho rằng bệnh virus không lây lan qua hạt, đến năm 1910

đã phát hiện virus khảm cà chua, 1919 virus khảm đậu và ngày nay đã cónhững bằng chứng về sự lây lan của bệnh virus thông qua hạt

2.4 Lan truyền nhờ các vectơ truyền bệnh

Các vectơ truyền bệnh có thể là công trùng, rệp, bét, nấm… sử dụng trong bảo quản nguồn gen ngời ta chiacôn trùng truyền bệnh thành 4 nhóm:

- Côn trùng sau khi mang virus lấy từ cây lây bệnh chỉ có khả năng truyềnbệnh sau đó 1-2h, lâu hơn nữa thì virus không còn khả năng lây nhiễm, đợcgọi là tồn tại không vĩnh viễn (Non persistent)

- Côn trùng sau vài giờ mang virus từ cây bệnh mới có khả năng truyền

bệnh sang cây khác Khả năng này chỉ tồn tại trong vài ngày liên tục, trờnghợp này gọi là bán vĩnh viễn (semi-persistent)

- Côn trùng chỉ cần 15 phút lây nhiễm virus từ cây bệnh nhng chỉ có thể

truyền bệnh sau đó vài giờ và truyền bệnh liên tục trong một vài tuần, gọi làtruyền bệnh vĩnh viễn tuần hoàn (persistent circulative)

- Côn trùng sau 15 phút lây virus có thể truyền bệnh liên tục suốt cả chu

kỳ sống và cả thế hệ sau đó vẫn còn nguyên khả năng truyền bệnh, gọi làtruyền bệnh vĩnh viễn lan truyền (persistent psopagative)

3 Kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym

( ELISA – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) enzym linked immuno _sorbent assay)

Phơng pháp thử miễn dịch dựa trên phản ứng giữa một kháng nguyên vàmột kháng thể là những protein có trọng lợng phân tử lớn thu đợc do tạo miễndịch ở máu nóng của động vật có vú ( chuột, thỏ, ngựa, dê ) bằng những phân tửgây miễn dịch ( protein, polysaccharides, ARN 2 mạch bổ xung , ).Trong trờnghợp này kháng thể đợc gọi là kháng thể đa dòng (polyclonaux) vì chúng đợc tạo

ra từ các dạng hoạt hoá của một quần thể dị chất của những tế bào limpho Btrong máu động vật Chúng là một hỗn hợp của các kháng thể khác nhau phảnứng với nhiều điểm cuối của kháng nguyên hoạc những đỉnh của phân tử gâymiễn dịch Phản ứng kháng thể – Cucumber Mosaic Viruses (CMV) kháng nguyên là một công cụ rất hiệu nghiệm

để chuẩn đoán bệnh virut, vi khuẩn, nấm, mycoplasma, tuyến trùng và các véc tơtruyền bệnh Hiện nay kỹ thuật ELISA còn giúp chúng ta xác định đợc hàm lợngthuốc trừ sâu (pesticide) tồn d trong đất Các phân tử đánh dấu cũng là một phứchợp kháng thể – Cucumber Mosaic Viruses (CMV)kháng nguyên đã đợc sử dụng từ lâu để chuẩn đoán bệnh chophép nhận thấy kết quả bằng mắt thờng Hiện nay việc sử dụng các phân tửphóng xạ để đánh dấu đã bị hạn chế Bên cạnh đó, ngời ta thờng dùng enzym(Alkaline phosphatasa), peroxidaza, chất floresence và Avidin – Cucumber Mosaic Viruses (CMV)Biotin để tăng

độ nhạy của phép chuẩn đoán ta cũng có thể sử dụng các chất huỳnh quang,phosphattase alkaline

Phơng pháp miễn dịch liên kết enzym đợc nhiều tác giả hoàn thiện vào năm

1971 (Avrameanvà Cs; Van Weemen và Cs; Engvall và Cs ) Nhóm cuối cùng đã

sử dụng thuật ngữ ELISA (Enzym linked immuno – Cucumber Mosaic Viruses (CMV)sorbent assay) lần đầu tiênvào năm 1971 để áp dụng vào phơng pháp định lợng một vài kháng thể đặc hiệu

Đây là phơng pháp đợc phát triển bởi rất nhiều tác giả và là một phơng phápnhanh nhậy trong chuẩn đoán và định lợng một số kháng nguyên, kháng thể Nó

đã đợc Voller và đồng nghiệp ứng dụng trong chuẩn đoán bệnh virut thực vậtnăm 1976 Clack và Adams ở Anh là hai trong những ngời đầu tiên dùng phơngpháp này để chuẩn đoán 2 bệnh virut là AWM ( Arabis Mosaic Virus) và PPV( Plum PoxVirut) Phơng pháp này rất nhạy, cho phép thăm dò ở mức nhiễm rất