BÁO CÁO DI TRUYỀN THỰC VẬT LY TRÍCH DNA TỪ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ĐỘNG VẬT

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM KHOA NÔNG HỌC  BÁO CÁO DI TRUYỀN THỰC VẬT CHỦ ĐỀ: “CÁCH LY TRÍCH DNA TỪ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ĐỘNG VẬT” GVHD: TS Nguyễn Phương TPHCM, tháng 10 năm 2014 I Phần giới thiệu II Nguyên tắc yêu cầu III Một số hoá chất thông dụng dùng ly trích axít nucleic IV Quy trình ly trích DNA sử dụng CTAB V Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) VI Phương pháp ly trích DNA từ bào thực vật (lá bưởi): VII Phương pháp ly trích DNA từ bào động vật (tôm): I Phần giới thiệu:  DNA - vật liệu mang thông tin di truyền, yếu tố mở đầu cho nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử  ly trích DNA nhằm mục đích thu nhận DNA khỏi cấu trúc bao bọc tế bào, để phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử  Trong phạm vi báo cáo, tìm hiểu trình ly trích DNA từ tế bào thực vật động vật II.Nguyên tắc yêu cầu  Ly trích DNA cần thiết thực nghiệm công nghệ gen tiến hành với DNA (hay RNA)  DNA ly trích cần đảm bảo độ tinh khiết độ nguyên vẹn cấu trúc để thực khâu nghiên cứu công nghệ gen thực vật động vật  Có nhiều phương pháp ly trích DNA , tuỳ thuộc mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp tách DNA cho phù hợp Chuẩn bị mẫu Giải phóng DNA Trong dd buffer TE (pH 8) => DNA không biến tính Proteinase K: loại bỏ protein CTAB: loại bỏ polysaccharide lipid Chloroform: phân tách kéo thành phần DNA xuống mặt dung dịch Phá vỡ màng TB Hòa tan DNA Loại bỏ thành phần DNA Tủa DNA Rửa DNA Làm khô DNA Kiểm tra chất lượng DNA TBĐV (thường sử dụng mô thể) TBTV (thường sử dụng mẫu lá) Nghiền nhỏ Phương pháp vật lý nitơ lỏng Đối với TBTV lớp Cellulose Phương pháp ly tâm Phương pháp hóa học ethanol 95% isoproanol ủ – 200C Hợp chất tẩy SDS Proteinase Cô đặc axít nucleic tránh phân hủy chúng enzyme Bằng ethanol 70% => loại muối dấu vết isopropanol Sấy khô hay để qua đêm => tránh ảnh hưởng ethanol sót lại Độ nguyên vẹn Độ Nồng độ axít nucleic Kiểm tra chất lượng DNA: 1.Định tính DNA phương pháp điện di  Để kiểm tra kết ly trích có thu DNA hay không, tiến hành điện di mẫu DNA ly trích gel agarose 0.8% Sau đem nhuộm ethium bromide 20 phút Gel sau nhuộm chụp tia tử ngoại (UV) Nếu mẫu có DNA băng DNA phát sáng dƣới dạng vạch gel điện di Độ tập trung độ đậm nhạt băng điện di phản ánh độ tinh nồng độ cao hay thấp mẫu DNA Kiểm tra mẫu phương pháp điện di:  Sau thu sản phẩm ly trích, tiến hành kiểm tra kết ly trích phương pháp điện di agarose dựa đặc tính tích điện âm DNA, vậy, đặt vào điện trường dung dịch có pH trung tính, DNA bị hút cực dương (anod) bị đẩy khỏi cực âm (catod) Kiểm tra mẫu phương pháp điện di:  Trong trình điện di, phân tử DNA phân loại theo kích thước, phân tử nhỏ bị hút cực dương trước phân tử nhỏ qua lỗ gel dễ dàng Có thể nói khoảng cách mà đoạn DNA qua tỉ lệ nghịch với trọng lượng phân tử  Thông qua bước điện di kiểm tra kết ly trích cho ta biết độ nguyên vẹn cao DNA băng DNA gọn, tập trung rõ nét Qua kiểm tra độ nguyên vẹn DNA xác định mức độ tinh sản phẩm DNA ly trích Định lượng DNA quang phổ kế  Các mẫu DNA ly trích sau định tính kiểm tra độ tinh ước lượng hàm lượng DNA cách đo mật độ quang OD (optical density) với bước sóng 260nm 280nm máy quang phổ kế với độ pha loãng 100 lần Hàm lượng DNA tính theo công thức:  DNA (ng/µl) = [(62.9 x OD260nm) – (36 x OD280nm)] x 100  DNA xem tỉ số OD260nm/OD280nm nằm khoảng 1.7 đến 2.2 IX Phương pháp ly trích DNA từ tế bào thực vật (tế bào non): Hóa chất:  • • • • Dung dịch đệm 1,5 CTAB 1,5% CTAB 75mM Tris-HCL 15mM EDTA 1,05M NaCl  Đệm TE • 10mM Tris-HCl • 1mM EDTA  • • • Đệm kết tủa CTAB 1% CTAB 50mM Tris-HCL 10mM EDTA  Đá khô CO2  Nitơ lỏng  Chloroform: isoamylalcohol (24:1)  10mg/ml enzyme RNase  99.5% , 70% ethanol  1M NaCl  10% CTAB Máy móc:  Máy xay  Máy ly tâm  Tuýp Eppendorf 1.5ml  Ống dùng để quay ly tâm loại 50 ml  Vi pi-pét Micropipette 20, 200, 1000µl  Bình tam giác Nguyên tắc  Để tiến hành ly trích DNA từ tế bào ta phải tiến hành phá bỏ màng tế bào màng nhân, sau biến tính protein để loại bỏ lượng protein chứa dịch tách, loại bỏ RNA sau kết tủa DNA cồn Tủa sau thu được hòa tan lại dung dịch đệm TE nước cất vô trùng tùy theo mục đích nghiên cứu  Khác với ly trích tế bào động vật, ly trích tế bào thực vật ta phải tiến hành loại bỏ đường thành phần có nhiều mô thực vật Ở ta dùng phương pháp tách CTAB tức dùng dung dịch đệm CTAB để tách DNA khỏi mô thực vật Chất hòa tan DNA không hòa tan đường, nhờ mà loại bỏ đường khỏi dịch chiết tách DNA 3.1 Phá bỏ màng tế bào màng nhân  Người ta phá bỏ màng tế bào màng nhân phương pháp hóa học hay học Ở dùng phương pháp học, nghiền nát máy xay dùng nitơ lỏng để phá bỏ tế bào thực vật 3.2 Chiết DNA loại bỏ protein  Sau phá bỏ màng tế bào nhân dùng dung dịch đệm CTAB để hòa tan DNA Nhưng dịch chiết có lẫn protein RNA nên để thu nhận DNA tinh ta phải tiến hành bước loại bỏ protein RNA Ở thường dùng phenol, chloroform isoamylalcohol • Phenol có tác dụng làm biến tính protein không hòa tan axít nucleic • Chloroform có tác dụng làm biến tính protein có tác dụng loại bỏ hoàn toàn phenol khỏi phần dung dịch có chứa DNA • Isoamylalcohol có tác dụng ổn định hai pha nước pha chloroform 3.3 Kết tủa CTAB DNA  Để loại bỏ CTAB cần phải kết tủa CTAB DNA sau hòa tan DNA dung dịch NaCl mà tủa CTAB không tan dung dịch 3.4 Loại bỏ CTAB làm DNA  Sau loại bỏ CTAB dung dịch HCl 1M, ta tiến hành kết tủa DNA Ethanol nguyên chất lạnh, để tăng khả kết tủa ta pha thêm dung dịch muối CH3COONa 3M (2 thể tích Ethanol/thể tích dung dịch cần tủa, 0.1 thể tích dung dịch muối/ thể tích dung dịch cần tủa Ngoài tủa isopropanol (0.8-1 thể tích Isopropanol/ thể tích dung dịch cần tủa  Muối lẫn DNA ảnh hường đến kết thí nghiệm sau nên người ta thường tiến hành rửa tủa DNA dung dịch ethanol 70% Các bước tiến hành 4.1 Nghiền nhỏ mẫu thực vật  Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau cho g lúa (được làm đông lạnh trước dùng) xay thành bột mịn  Chuyển bột mía vào cốc làm lạnh nitơ lỏng trước cho vào cốc 50 ml nitơ lỏng Đặt -20 độ vòng tiếng 4.2 Sử dụng dung dịch đệm CTAB để tách DNA loại bỏ protein  Cho 20 ml dung dịch đệm đun sôi vào mẫu lúa xử lí tiến hành lắc nhẹ  Ngâm bể nước nóng 56 độ vòng 20 phút  Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào lắc nhiệt độ phòng Sau lắc chuyển dịch chiết tách qua ống dùng để quay ly tâm tiến hành quay ly tâm nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút)  Chuyển lớp nước phía vào ống nghiệm sau cho ml  dung dịch CTAB 10% hâm nóng 70 độ.Sau trộn  Cho 20 ml Chloroform: isoamyl alcohol (24:1) vào lắc nhiệt độ phòng.Sau quay ly tâm nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút) Thu lớp nước vào ống nghiệm 4.3 Kết tủa CTAB DNA  Cho 30 ml (1.5 thể tích dung dịch thu thí nghiệm trên) đệm kết tủa CTAB sau trộn có màng DNA màu trắng đục lên  Quay ly tâm nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút) Loại bỏ phần dịch lỏng thu phần kết tủa 4.4 Loại bỏ CTAB làm DNA  Hòa tan kết tủa 5ml dung dịch muối nhiệt độ 56oC NaCl 1M cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA  Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất lắc để kết tủa DNA  Quay ly tâm, lấy phần tủa  Cho 20ml cồn 70 %, quay ly tâm, lấy phần tủa  Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay ly tâm lấy phần tủa  Quay phần tủa với nắp ống nghiệm mở để làm khô DNA Lúc DNA chuyến sang suốt không màu  Hòa tan DNA thu vào 2ml đệm TE, bảo quản -20oC cho thí nghiệm 4.5 Tiến hành kiểm tra chất lượng dung dịch ly trích X Phương pháp ly trích DNA từ tế bào động vật: Chuẩn bị:  Nitơ lỏng  Glucose TE100 đệm:  Cối, chày, ống hút, tuýp • Glucose 1% Eppendorfs; • 10 mM Tris-HCl, pH 8.0  Ethanol (95%, 70%) • 100 mM EDTA, pH 8.0  Vi pi-pét p1000, p200, p20  Dung dịch CI:  Máy ly tâm • Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1)  Đệm TE (pH 8.0):  10% SDS (sodium dodecyl • 10 mM Tris-HC1, pH 8.0 sulfate) • mM EDTA, pH 8.0  Proteinase K  Dung dịch Chelex  Đệm Phenol  Đệm STE:  Dung dịch PCI: • 0,1M NaCl • Phenol • 0,05M Tris-HCl (pH 7,5) • Chloroform • 0,001 EDTA • Isoamyl alcohol  Sodium acetate 3M (tỷ lệ tương ứng 25:24:1) Nguyên tắc  Có thể ly trích DNA từ nguyên liệu khác máu, nước bọt, mô cơ, lông, tóc (còn nguyên chân tóc, chân lông) loại mô khác Có nhiều phương pháp ly trích khác Tuy nguyên tắc chung ly trích DNA động vật là: • Tách tế bào có nhân khỏi vật mang; • Phá vỡ tế bào, màng phân hủy protein, giải phóng DNA khỏi nhân • Tách DNA khỏi đệm bảo quản 4oC Các bước tiến hành: tùy theo nguyên liệu khác mà áp dụng số bước tiến hành sau: 3.1 Ly trích DNA từ mô thực vật Cắt mô thành miếng nhỏ Nghiền mô nitơ lỏng để thành bột mịn Cho mẫu vào ống nghiệm chờ cho nitơ bay hết Cho khoảng 100 mg mẫu vào tuýp Eppendorfs loại 1,5 ml Thêm 500 μl đệm STE, hòa trộn nhẹ nhàng Bổ sng 12 μl proteinase K (nồng độ 10 mg/ml) 37 μl SDS 10% Trộn hỗn hợp ủ 55oC, lác nhẹ Thêm lượng dung dịch PCI thể tích mẫu, trộn nhẹ để nhiệt độ phòng phút Ly tâm 9000 rpm phút Chuyển phần dịch sang tuýp Eppendorfs Lặp lại lần Thêm lượng dung dịch CI thể tích mẫu, trộn nhẹ, để nhiệt độ phòng phút Ly tâm 9000 rpm phút Chuyển phần dịch sang tuýp Eppendorfs Thêm lượng Sodium acetate 3M 1/10 lượng mẫu lượng Ethanol 2,5 lần lượng mẫu -20oC qua đêm Ly tâm 9000 rpm 10 phút Rửa Ethanol 70%, hút Ethanol Hòa tan kết tủa 500 μl dung dịch TE, bảo quản 4oC Tiến hành kiểm tra chất lượng dung dịch ly trích 3.2 Ly trích DNA từ máu Chelex: lấy 100 μl máu tươi, miếng giấy, vải thấm máu kích thước 0,5 x 0,5 cm cho vào tuýp Eppendorfs Thêm ml đệm chiết PSP (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, mM KH2PO4) lắc đều, sau để yên nhiệt độ phòng 30 phút Ly tâm 15000 prm phút Thu kết tủa Lập lại bước khoảng – lần Thêm 130 μl Chelex, bảo quản 4oC đến -20oC 3.3 Ly trích DNA từ máu từ muối: Lấy khoảng 0,1 ml máu tĩnh mạch cho vào tuýp Eppendorfs có chứa 25 μl EDTA 0,4 M, lắc Thêm vào tuýp Eppendorfs đệm phá hồng cầu (1 mM NH4CO3, 115 mM NH4Cl) Ly tâm 500 rpm Thu kết tủa, loại bỏ phần dịch phía Thêm vào 200 μl đệm phá hồng cầu (100 mM Tris-HCl pH 7.6, 40 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2% SDS, 0,05 Sodium azdie NaN3) Lắc Thêm 20 μl proteinase K (10 mg/ml) Ủ 50oC Thêm 80 μl NaCl bão hòa 6M Lắc mạnh Vortex Ly tâm 5000 rpm 10 phút, thu dịch cho vào tuýp Eppendorfs Kết tủa Ethanol tuyệt đối Hòa tan kết tủa dung dịch TE, bảo quản 4oC đến -20oC Tiến hành kiểm tra chất lượng dung dịch ly trích [...]... lông) và các loại mô khác Có nhiều phương pháp ly trích khác nhau Tuy vậy nguyên tắc chung khi ly trích DNA động vật là: • Tách tế bào có nhân ra khỏi vật mang; • Phá vỡ tế bào, màng và phân hủy protein, giải phóng DNA ra khỏi nhân • Tách DNA ra khỏi đệm và bảo quản ở 4oC 3 Các bước tiến hành: tùy theo nguyên liệu khác nhau mà có thể áp dụng một số bước tiến hành như sau: 3.1 Ly trích DNA từ mô thực vật. .. nghiên cứu  Khác với ly trích tế bào động vật, khi ly trích tế bào thực vật thì ta phải tiến hành loại bỏ đường thành phần có nhiều trong mô thực vật Ở đây ta dùng phương pháp tách CTAB tức là dùng dung dịch đệm CTAB để tách DNA ra khỏi mô thực vật Chất này chỉ hòa tan DNA chứ không hòa tan được đường, nhờ vậy mà có thể loại bỏ đường ra khỏi dịch chiết tách DNA 3.1 Phá bỏ màng tế bào và màng nhân  Người... màng tế bào và màng nhân bằng phương pháp hóa học hay cơ học Ở đây chúng ta dùng phương pháp cơ học, nghiền nát bằng máy xay và dùng nitơ lỏng để phá bỏ tế bào thực vật 3.2 Chiết DNA và loại bỏ protein  Sau khi phá bỏ màng tế bào và nhân thì dùng dung dịch đệm CTAB để hòa tan DNA Nhưng trong dịch chiết có lẫn protein và RNA nên để thu nhận được DNA tinh sạch ta phải tiến hành bước loại bỏ protein và. .. tâm, lấy phần tủa  Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay ly tâm lấy phần tủa  Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô DNA Lúc này DNA sẽ chuyến sang trong suốt không màu  Hòa tan DNA thu được vào 2ml đệm TE, bảo quản ở -20oC cho thí nghiệm tiếp theo 4.5 Tiến hành kiểm tra chất lượng dung dịch ly trích X Phương pháp ly trích DNA từ tế bào động vật: 1 Chuẩn bị:  Nitơ lỏng  Glucose TE100 đệm:... này dao động trong khoảng 30 – 70 độ C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tùy thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng  Bước 3: Kéo dài (Extension)  Đây là giai đoạn tổng hợp dây đơn bổ sung dọc theo chiều 5’ - 3’ của 2 primer nhờ hoạt động của polymerase  Nhiệt độ được tăng lên 72oC giúp cho DNA IX Phương pháp ly trích DNA từ tế bào thực vật (tế bào lá... sợi DNA trong ống nghiệm III Một số hoá chất thông dụng dùng trong ly trích axít nucleic Hóa chất Chức năng Nitơ Lỏng Phá màng tế bào EDTA Ngăn chặn sự hoạt động của các (Ethylenediaminetetraacetic acid) enzyme phân hủy DNA Dung dịch đệm Tris CTAB (Cetryl Ammonium Bromide) Chloroform Isoamyl Alcohol Ethanol 70% Tạo môi trường ly trích có pH 8.0, pH giúp này giúp DNA ổn định Phá vỡ vách tế bào và màng... CTAB 2 Máy móc:  Máy xay  Máy ly tâm  Tuýp Eppendorf 1.5ml  Ống dùng để quay ly tâm loại 50 ml  Vi pi-pét Micropipette 20, 200, 1000µl  Bình tam giác 3 Nguyên tắc  Để tiến hành ly trích DNA từ tế bào thì ta phải tiến hành phá bỏ màng tế bào và màng nhân, sau đó biến tính protein để loại bỏ lượng protein chứa trong dịch tách, loại bỏ RNA và sau cùng là kết tủa DNA bằng cồn Tủa sau khi thu được... Protein; tách lớp dung dịch sau ly trích Giúp mẫu không bị sủi bọt trong khi vortex hay ly trích tốc độ cao Rửa DNA thu được III Một số hoá chất thông dụng dùng trong ly trích axít nucleic (tt) Hóa chất Chức năng Isopropanol ở -200C Kết tủa DNA Enzyme Rnase Loại bỏ RNA Nước cất hoặc dd buffer TE Giúp DNA không bị biến tính SDS - Sodium Dodecyl Sulfate Phá vỡ màng tế bào Proteinase K Loại bỏ các protein;... nhanh một đoạn phân tử DNA trong ống nghiệm Đây là một kỹ thuật nhằm tạo ra hàng triệu đoạn DNA đồng nhất từ một hỗn hợp các phân tử bao gồm RNA, protein, polysacharide, DNA không có chức năng và DNA có chức năng di truyền Người ta còn gọi đó là kỹ thuật tạo dòng DNA invitro  PCR được dùng rất phổ biến trong nhiều lĩnh vực về sinh học PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ... giải các enzyme nuclease IV Quy trình ly trích DNA sử dụng phương pháp CTAB:  Được sử dụng để chiết suất DNA đạt chất lượng cao và với số lượng lớn  Quy trình ly trích DNA sử dụng phương pháp CTAB: 1 Chọn mẫu từ 0,5 – 3g hoặc nhiều hơn, rửa sạch, lau khô 2 Nghiền mẫu trong Nitơ lỏng 3 Xử lý mẫu trong CTAB 4 Ủ 1 giờ ở 60oC => phá vở màng sinnh chất, màng nhân 5 Ly tâm ở 9000 rpm trong 10 phút thu lấy ... bọc tế bào, để phục vụ cho nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử  Trong phạm vi báo cáo, tìm hiểu trình ly trích DNA từ tế bào thực vật động vật II.Nguyên tắc yêu cầu  Ly trích DNA cần thiết thực. .. dùng ly trích axít nucleic IV Quy trình ly trích DNA sử dụng CTAB V Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) VI Phương pháp ly trích DNA từ bào thực vật (lá bưởi): VII Phương pháp ly trích DNA từ. .. với ly trích tế bào động vật, ly trích tế bào thực vật ta phải tiến hành loại bỏ đường thành phần có nhiều mô thực vật Ở ta dùng phương pháp tách CTAB tức dùng dung dịch đệm CTAB để tách DNA