IX. Phương pháp ly trích DNA từ tế bào thực vật (tế bào lá non):
4.Các bước tiến hành
4.1. Nghiền nhỏ mẫu thực vật
Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g lá lúa (được làm đông lạnh trước khi dùng) xay cho đến khi thành bột mịn.
Chuyển bột lá mía vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi cho vào cốc 50 ml nitơ lỏng. Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng.
4.2. Sử dụng dung dịch đệm CTAB để tách DNA và loại bỏprotein protein
Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu lá lúa đã được xử lí trên rồi tiến hành lắc nhẹ.
Ngâm trong bể nước nóng ở 56 độ trong vòng 20 phút.
Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng. Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để quay ly tâm và tiến hành quay ly tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút)
Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml.
dung dịch CTAB 10% đã được hâm nóng ở 70 độ.Sau đó trộn đều.
Cho 20 ml Chloroform: isoamyl alcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng.Sau đó quay ly tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút). Thu lớp nước trên vào ống nghiệm mới.
4.3 Kết tủa CTAB và DNA
Cho 30 ml (1.5 thể tích dung dịch thu được ở thí nghiệm trên) đệm kết tủa CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng DNA màu trắng đục nổi lên.
Quay ly tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút). Loại bỏ phần dịch lỏng thu phần kết tủa.
4.4 Loại bỏ CTAB và làm sạch DNA
Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56oC NaCl 1M và cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA.
Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa DNA.
Quay ly tâm, lấy phần tủa.
Cho 20ml cồn 70 %, quay ly tâm, lấy phần tủa.
Cho 20 ml cồn nguyên chất, quay ly tâm lấy phần tủa.
Quay phần tủa với nắp ống nghiệm được mở để làm khô DNA. Lúc này DNA sẽ chuyến sang trong suốt không màu
Hòa tan DNA thu được vào 2ml đệm TE, bảo quản ở -20oC cho thí nghiệm tiếp theo.