X. Phương pháp ly trích DNA từ tế bào động vật: 1 Chuẩn bị:
3.Các bước tiến hành: tùy theo nguyên liệu khác nhau mà có thể áp dụng một số bước tiến hành như sau:
áp dụng một số bước tiến hành như sau:
3.1 Ly trích DNA từ mô thực vật
1. Cắt mô thành từng miếng nhỏ. Nghiền mô trong nitơ lỏng để thành bột mịn. Cho mẫu vào ống nghiệm chờ cho nitơ bay hơi hết. Cho khoảng 100 mg mẫu vào tuýp Eppendorfs loại 1,5 ml. 2. Thêm 500 μl đệm STE, hòa trộn nhẹ nhàng. Bổ sng 12 μl
proteinase K (nồng độ 10 mg/ml) và 37 μl SDS 10%. Trộn đều hỗn hợp ủ trong 2 giờ ở 55oC, thỉnh thoảng lác nhẹ.
3. Thêm 1 lượng dung dịch PCI bằng thể tích mẫu, trộn nhẹ để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 9000 rpm trong 5 phút.
4. Chuyển phần dịch nổi sang tuýp Eppendorfs sạch. Lặp lại 3 và 4 lần nữa.
5. Thêm một lượng dung dịch CI bằng thể tích mẫu, trộn nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 5 phút. Ly tâm 9000 rpm trong 5 phút. Chuyển phần dịch nổi sang tuýp Eppendorfs sạch.
6. Thêm một lượng Sodium acetate 3M bằng 1/10 lượng mẫu và một lượng Ethanol bằng 2,5 lần lượng mẫu ở -20oC ít nhất trong 2 giờ hoặc qua đêm. Ly tâm 9000 rpm trong 10 phút.
7. Rửa sạch bằng Ethanol 70%, hút sạch Ethanol
8. Hòa tan kết tủa bằng 500 μl dung dịch TE, bảo quản ở 4oC. 9. Tiến hành kiểm tra chất lượng dung dịch ly trích.
3.2 Ly trích DNA từ máu bằng Chelex:
1. lấy 100 μl máu tươi, hoặc 1 miếng giấy, vải thấm máu kích thước 0,5 x 0,5 cm cho vào tuýp Eppendorfs.
2. Thêm 1 ml đệm chiết PSP (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4) lắc đều, sau đó để yên ở nhiệt độ
phòng trong 30 phút. Ly tâm 15000 prm trong 5 phút. Thu kết tủa.
3. Lập lại bước 2 khoảng 2 – 3 lần.
3.3 Ly trích DNA từ máu từ muối:
1. Lấy khoảng 0,1 ml máu tĩnh mạch cho vào tuýp Eppendorfs có chứa 25 μl EDTA 0,4 M, lắc đều.
2. Thêm vào tuýp Eppendorfs đệm phá hồng cầu (1 mM NH4CO3, 115 mM NH4Cl). Ly tâm 500 rpm. Thu kết tủa, loại bỏ phần dịch nổi phía trên.
3. Thêm vào 200 μl đệm phá hồng cầu (100 mM Tris-HCl pH 7.6, 40 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2% SDS, 0,05 Sodium azdie NaN3). Lắc đều.
4. Thêm 20 μl proteinase K (10 mg/ml). Ủ ở 50oC trong 2 giờ.
5. Thêm 80 μl NaCl bão hòa 6M. Lắc mạnh bằng Vortex. Ly tâm 5000 rpm trong 10 phút, thu dịch nổi trên cho vào tuýp Eppendorfs sạch.
6. Kết tủa bằng Ethanol tuyệt đối.
7. Hòa tan kết tủa bằng dung dịch TE, bảo quản ở 4oC đến -20oC. 8. Tiến hành kiểm tra chất lượng dung dịch ly trích.