Nghiên cứu xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cao khô lạc tiên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI KHUẤT VĂN MẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CAO KHÔ LẠC TIÊN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI KHUẤT VĂN MẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG DỰ THẢO TIÊU CHUẨN CAO KHÔ LẠC TIÊN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƢỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60720406 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐỖ QUYÊN HÀ NỘI – 2015 L Với lòng biết ơn sâu sắc, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Tiến sỹ Đỗ Quyên Là ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn giúp đỡ hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô kỹ thuật viên Bộ môn Dƣợc liệu nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình làm thực nghiệm môn Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng ban, thầy cô giáo cán nhân viên trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội – ngƣời dạy bảo giúp đỡ suốt thời gian học tập Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp bên, chia sẻ, động viên giúp đỡ suốt trình học tập làm luận văn Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2015 Học viên Khuất Văn Mạnh ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1.Đặc điểm chi Passiflora L 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái phân bố chi Passiflora L 1.1.3 Thành phần hóa học chi Passiflora L 1.1.4 Tác dụng dƣợc lý công dụng chi Passiflora L 11 1.2 Lạc tiên Passiflora foetida L 12 1.2.1 Đặc điểm hình thái thực vật phân bố 12 1.2.2 Thành phần hóa học 13 1.2.3 Tác dụng dƣợc lý công dụng 14 1.2.4 Tiêu chuẩn dƣợc liệu Lạc tiên 15 1.2.5 Các sản phẩm thuốc có thành phần cao Lạc tiên 16 1.3 Tiêu chuẩn cao thuốc 17 1.3.1 Hƣớng dẫn EMEA/CVMP/815/00 tiêu cao dƣợc liệu 17 1.3.2 Tiêu chuẩn cao thuốc Dƣợc điển Việt Nam IV 19 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.2 Phƣơng tiện nghiên cứu 22 2.2.1 Thuốc thử, dung môi hoá chất 22 2.2.2 Phƣơng tiện máy móc 22 2.3 Nội dung nghiên cứu 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.4.1 Nghiên cứu thực vật 24 2.4.2 Nghiên cứu hóa học 24 2.4.3 cao khô Lạc tiên 26 2.4.4 26 2.4.5 Xử lý kết thực nghiệm 27 Chƣơng 28 3.1 28 3.1.1 28 3.1.2 X 35 3.1.2.1 Đ 35 3.1.2.3 Đ dược liệu Lạc tiên 39 45 3.2.1 45 46 3.2.3 47 3.2.3.1 48 3.2.3.2 khối lượng làm khô 48 3.2.3.4 Định tính 3.2.3.5 49 51 3.2.3.6 Định lượng flavonoid toàn phần cao khô Lạc tiên 53 3.2.3.7 giới hạn nhiễm khuẩn 57 60 62 62 65 69 Ệ AlCl3 Nhôm clorid CH3COOH Acid acetic CHCl3 Cloroform DĐ Dƣợc điển DĐVN IV EtOAc Ethyl acetat EtOH FeCl3 H2SO4 Acid sulfuric HCl Acid hydrocloric HCOOH Acid formic i.p KOH Kali hydroxid MeOH Methanol Mg Magnesi MSTB NH3 NP PEG p/ƣ RSD Amoniac 2-aminoethyl diphenyl borat 1% methanol Dung dịch polyethylen glycol 4000 5% methanol SKLM TB TT tt/tt UV VN WHO STT Trang Bảng 1.1 Các loài thuộc chi Passiflora L phân bố Việt Nam Bảng 1.2 So sánh tiêu chí chuyên luận dƣợc liệu Lạc tiên P foetida Lạc tiên tây P incarnata 15 Bảng 1.3 Danh mục sản phẩm chứa Lạc tiên thị trƣờ Nam 16 Bảng 2.1 Nơi thu hái ký hiệu mẫu nghiên cứu 21 Bảng 3.1 Kết định tính mẫu dƣợc liệ 34 34 36 41 ng 3.4 tiên 47 Bảng 3.6 Mất khối lƣợng làm khô cao khô Lạc tiên 48 49 50 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 ng 3.12 Độ lặp lại phƣơng pháp định lƣợ Lạc tiên phƣơng pháp định lƣợng cao khô Lạc tiên Kết định lƣợng flavonoid toàn phần cao khô Lạc tiên 54 55 56 58 59 STT Trang Hình 1.1 Một số cấu trúc C-glycosid quan trọng chi Passiflora L 10 Hình 1.2 Một số alcaloid chi Passiflora L 11 Hình 1.3 Cấu trúc gynocardin 11 Hình 2.1 ều chế cao khô Lạc tiên từ dƣợc liệu Lạc tiên 27 Hình 3.1 Hình ảnh quan sinh dƣỡng Lạc tiên (Passiflora foetida L.) 29 Hình ảnh quan sinh sản Lạc tiên (Passiflora foetida L.) 30 Hình ả 32 Hình ả Passiflora foetida L.) Passiflora foetida L.) Passiflora foetida L.) 32 33 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu dƣợc liệu Lạc tiên UV 365 nm sau phun TT NP/PEG 38 Hình 3.7 Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn vitexin (a) dung dịch thử từ dƣợc liệu Lạc tiên (b) sau tạo màu 40 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc độ hấp thụ vào thời gian phản ứng màu 40 Hàm lƣợ 46 Hình 3.10 ết bằ 51 Sắc ký đồ mẫu cao khô Lạ phun TT NP/PEG Hình 3.11 Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn vitexin (a) dung dịch thử từ cao khô Lạc tiên (b) sau tạo màu 54 ĐẶT VẤN ĐỀ Lạc tiên (Passiflora foetida mọc hoang khắp nơi nƣớc ta, đƣợ thu hái sử dụng làm thuốc chữa ngủ, tim hồi hộp, bồn chồn Dƣợc liệu đƣợc dùng phối hợp với số dƣợc liệu khác nhƣ Lá vông, Lá dâu, Liên tâm … tạo thành thuốc có tác dụng an thần, gây ngủ tốt [2] Hiện chế phẩm cao khô Lạc tiên sử dụng nhiều so với dƣợc liệu Lạc tiên Ở dạng bào chế này, nguyên liệu dễ bảo quản vận chuyển, nhƣ dễ phối hợp với thành phần khác Tuy nhiên, Dƣợc điển Việt Nam IV chƣa có chuyên luận cao Lạ ỉ có chuyên luận Dƣợc liệu Lạc tiên (Herba Passiflorae foetidae) Để đáp ứng nhu cầu thực tế dạng cao khô Lạc tiên đƣợc sử dụng nhiều dƣợc liệu Lạc tiên, thực đề tài “Nghiên cứu xây dựng dự thảo tiêu chuẩn cao khô Lạc tiên” với hai mụ Xây dựng bổ sung , (5) CHCl3 - MeOH – NH4OH [9 : : 0,1] Các hệ dung môi gồm số hệ phân cực môi trƣờng acid phù hợp để triển khai nhóm chất glycosid, hệ số trƣờng kiềm có môi nhóm chất với hệ dung môi phun thuốc thử màu đặc hiệu cho nhóm chất flavonoid alcaloid, nhận thấy vết alcaloid quan sát đƣợc đƣa lƣợng cao lên mỏng Trong trƣờng hợp chiết vết chất khác bị chồng kéo thành đuôi - - , đặc biệt Do vậy, dùng vết flavonoid dung môi khai triển số thuốc thử NP/PEG với chất chuẩn đối chiếu vitexin điều kiện để thực phép thử định tính SKLM Theo nghiên cứu thành phần hóa học, Lạc tiên có thành phần flavonoid (cấu trúc C-glycosid) alcaloid (cấu trúc harmalin) phản ứng hóa học thể nghiên cứu tác dụng an thần, Lạc tiên mối liên quan thành phần flavonoid với hoạt tính Xu mẫu dƣợc liệu Lạc tiên thu hái ẫ Passiflora foetida L.) phƣơng pháp đo quang bƣớc song 401 nm, tính theo vitexin dao động từ 1,64 – 2,20% thu hái thu hái flavonoid dao động lạc tiên – mẫu – 1,81% Điểm đáng lƣu ý mẫu Lạc tiên 64 thu hái mẫu có nụ hoa, mẫu thu hái có cành Do vậy, hàm lƣợng flavonoid toàn phần mẫu miền Bắc dao động lớn thời điểm thu hái mẫu khác đặc biệt liên quan đến giai đoạn thu hái trƣớc sau hoa, Để đƣa đƣợc giới hạn hàm lƣợng flavonoid cho dƣợc liệu Lạc tiên, tham khảo nghiên cứu thành phần hóa học Lạc tiên Việt Nam nhƣ số nƣớc giới [24] dựa kết khảo sát hàm lƣợng flavonoid mẫu Lạc tiên mà thực hiện, Passiflora foetida Sau xây dựng đƣợc phép thử định lƣợng cho dƣợc liệu Lạc tiên định lƣợng flavonoid toàn phần phƣơng pháp đo quang, sử dụng tiêu chí để lựa chọn dung môi điều chế cao khô Lạc tiên cho cao khô có hàm lƣợng flavonoid cao Kết khảo sát với dung môi chiết xuất có độ EtOH tăng dần từ đến 90% cho thấy, hàm lƣợng flavonoid cao dùng dung môi EtOH 60% Việc sử dụng dung môi EtOH để điều chế cao sản xuất công nghiệp phù hợp với xu hƣớng hóa học xanh công nghiệp Dƣợc – Hóa – Mỹ phẩm Để nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩ dụng mẫu cao khô Trong mẫu cao khô sản xuất từ mẻ khác với nguyên liệu đƣợc kiểm tra theo phép thử định tính định lƣợng đƣợc xây dựng Và mẫu cao khô Công ty Dƣợc phẩm BV Pharma cung cấp năm 2014 (1 mẫu) 2015 (2 mẫu) mẫu cao khô đƣợc sản xuất từ dƣợc liệu lạc tiên (P foetida) thu hái miền Nam 65 Các tiêu đƣợc xây dựng gồm: - Phép thử định tính: phản ứng hóa học SKLM - Phép thử định lƣợng: định lƣợng flavonoid toàn phần Các tiêu đƣợc xây dựng theo hƣớng dẫn Dƣợc điển Việt Nam IV hƣớng dẫn „Quality control methods for herbal materials‟ Tổ chức Y tế giới (2011) xây dựng tiêu chuẩn cao khô Với phép thử định tính phản ứng hóa học, khảo sát khối lƣợng cao cho phản ứng cyanidin phản ứng với TT chung alcaloid cho phản ứng dƣơng tính rõ tƣơng tự nhƣ khảo sát dƣợc liệu Kết cho thấy với phản ứng cyanidin cần dùng 0,2 g cao khô phản ứng TT chung alcaloid g Với phép thử định tính sắc ký lớp mỏng, điều kiện sắc ký tƣơng tự nhƣ dƣợc liệu Sử dụng hệ dung môi khai triển – – – , sau quan sát UV 365 nm Để đƣa đƣợc giới hạn hàm lƣợng flavonoid toàn phần cao khô Lạc tiên, ng flavonoid mẫu cao khô foetida L.) Kết cho thấy – 3,28% Còn Pharma sản xuất Passiflora flavonoid công ty BV – 2,66% ấy, nguồn nguyên liệu Lạc tiên để sản xuất cao loài Passiflora foetida L nhƣng thu hái vùng khác nhau, quy trình chế biến cao khác nhau, cho hàm lƣợng flavonoid toàn phần cao khô khác Kết phù hợp với hàm lƣợng flavonoid toàn phần dƣợc liệu mà trình bày Kết hợp với kết nghiên cứu thành 66 phần hóa học nhƣ hàm lƣợng flavonoid số loài thuộc chi Passiflora Bên cạnh đó, c tiêu n đƣợc khảo sát mẫu cao khô Đối với tiêu chí khối lƣợng làm khô DĐVN IV yêu cầu tiêu chí phải < 5% Thực tế sản xuất cho thấy sản xuất đƣợc cao khô thuận lợi cho trình bảo quản vận chuyển, nhiên dạng cao khô dễ bị hút ẩm, làm thay đổi thể chất cao môi trƣờng thuận lợi cho vi sinh vật phát triển Do sáu mẫu cao khô nghiên cứu đƣợc đóng gói kín, hút chân không, bao bì có phủ lớp tránh ánh sáng, nên kết khảo sát khối lƣợng làm khô [...]... thƣờng 22 2.3 Nội dung nghiên cứu Để xây dựng đƣợc tiêu chuẩn cơ sở cao khô Lạc tiên, nghiên cứu của chúng tôi đƣợc thực hiện gồm có 3 nội dung chính nhƣ sau: - Thu mẫu, giám đị ể ận Lạc tiên của Dƣợc Điển Việt Nam IV - Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn định tính và định lƣợng dƣợc liệu Lạc tiên - Điều chế cao khô và xây dựng tiêu chuẩn cao khô Lạc tiên ứ Bước 1: Thu hái 8 mẫu Lạc tiên ở 5 địa điểm (Tuyên... Yên) ịnh tên khoa họ Bước 3: ểm tra theo chuyên luận Lạc tiên (Herba Passiflorae foetidae Mẫu đạt tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV đƣợc thu hái để ều chế cao Lạc tiên Bước 5: ều chế cao khô Lạc tiên Bước 6: Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩ đƣợ ạc tiên điều chế , Bước 7: Thẩm định tiêu chuẩ 23 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1 Nghiên cứu về thực vật - Nghiên cứu đặc điểm hình thái: Mô tả phân tích đặc điểm... bƣớc sóng 401 nm, m (gam): khối lƣợ và cao khô Lạc tiên 2.4.3 Các tiêu chí xây dựng tiêu chuẩn dƣợc liệu và cao khô hiện theo hƣớng d n Đối với dược liệu của DĐVN IV [5] và WHO [27] : bổ sung phép thử định tính bằng Đối với cao khô 2.4.4 26 đƣợc thực ạc tiên Sơ chế Chiết Loại tạp Cô chân không Trộn, sấy, tán, Hình 2.1 ều chế cao khô Lạc tiên từ dƣợc liệu Lạc tiên 2.4.5 Xử lý kết quả thực nghiệm Kết... vậy, để đảm bảo chất lƣợng cho các chế phẩm có sử dụng thành phần cao Lạc tiên, chúng tôi đề xuất xây dựng tiêu chuẩn cao khô Lạc tiên 1.3 Tiêu chuẩn cao thuốc Các chế phẩm thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu theo định nghĩa của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) bao gồm một số dạng nhƣ sau: dƣợc liệu, dịch chiết dƣợc liệu, cao lỏng, cao khô, cao định chuẩn … Để đảm bảo chất lƣợng thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu,... tiêu nghiên cứu trên, chúng tôi tiến hành thu hái một số mẫu Lạc tiên ở các vùng sinh thái khác nhau, sau đó kiểm tra chất lƣợng theo chuyên luận của Dƣợc điển Việt Nam IV Với các mẫu đủ điều kiện của Dƣợc điển Việt Nam IV sẽ đƣợc nghiên cứu bổ sung một số chỉ tiêu định tính và định lƣợng nhằm nâng cao tiêu chuẩn chất lƣợng dƣợc liệu Tiếp theo đó, chúng tôi điều chế cao khô và xây dựng tiêu chuẩn cao. .. do Lạc tiên tây là loài di thực vào Việt Nam, còn Lạc tiên P foetida là loài bản địa ở Việt Nam Bảng 1.2 So sánh các tiêu chí trong chuyên luận dƣợc liệu Lạc tiên P foetida và Lạc tiên tây P incarnata Tiêu chí đánh giá Chuyên luận Lạc Chuyên luận Lạc tiên tây tiên (DĐVN IV) (DĐ Châu Âu) Mô tả Có Có Vi phẫu Có Có Bột Có có Định tính - Bằng phản ứng hóa học Có Không - Bằng SKLM Không Có Định lƣợng Không... nƣớc sôi [2] 1.2.4 Tiêu chuẩn dƣợc liệu Lạc tiên Ở Việt Nam, 2 loài Lạc tiên (P.foetida) và Lạc tiên tây (P incarnata) đều đƣợc sử dụng làm thuốc nhƣng trong DĐVN IV chỉ có chuyên luận dƣợc liệu Lạc tiên (Herba Passiflorae foetidae) [5] mà không có chuyên luận dƣợc liệu Lạc tiên tây (Herba Passiflorae incarnatae) Ngƣợc lại, Dƣợc điển Châu Âu lại chỉ có chuyên luận dƣợc liệu Lạc tiên tây [24] Điều này... thời có chuyên luận cao khô từ dƣợc liệu này Chính vì lý do đó, chúng tôi dự kiến xây dựng tiêu chuẩn cao khô Lạc tiên dựa trên một số tiêu chí định lƣợng mà chuyên luận Lạc tiên tây (P incarnata L.) đang đƣợc sử dụng 1.2.3 Tác dụng dƣợc lý và công dụng 1.2.3.1 Tác dụng dược lý Trong một nghiên cứu của Santosh P, chỉ ra cao chiết MeOH của Passiflora foetida có tác dụng làm giảm hoạt động của chuột nhắt... bày một số chế phẩm từ các dạng nguyên liệu đầu vào khác nhau cũng nhƣ dạng bào chế các sản phẩm có chứa Lạc tiên Bảng 1.3 Danh mục các sản phẩm chứa Lạc tiên trên thị trường VN STT Tên sản phẩm Dạng bào chế Công ty 1 Cao Lạc tiên Cao lỏng TNHH LaVa 2 Cao Lá Lạc tiên Cao lỏng Thuận thành 3 Trà Lạc tiên Trà túi lọc Nguyên Thái Trang 4 Viên An Thần Viên nén bao film Domesco 5 Traly Valess Viên Nang cứng... nữa, chuyên luận cũng chƣa xây dựng đƣợc chỉ tiêu định lƣợng Đây là 2 chỉ tiêu quan trọng khi đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu, cần thiết phải bổ sung vào DĐVN 1.2.5 Các sản phẩm thuốc có thành phần cao Lạc tiên Hiện nay, trên thị trƣờng có rất nhiều dạng chế phẩm có chứa Lạc tiên với các dạng nguyên liệu: - Từ dƣợc liệu: có sản phẩm chè nhúng - Từ cao lỏng: có cao thuốc - Từ cao khô: chè tan và viên nang, ... dung nghiên cứu Để xây dựng đƣợc tiêu chuẩn sở cao khô Lạc tiên, nghiên cứu đƣợc thực gồm có nội dung nhƣ sau: - Thu mẫu, giám đị ể ận Lạc tiên Dƣợc Điển Việt Nam IV - Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn. .. Việt Nam IV đƣợc nghiên cứu bổ sung số tiêu định tính định lƣợng nhằm nâng cao tiêu chuẩn chất lƣợng dƣợc liệu Tiếp theo đó, điều chế cao khô xây dựng tiêu chuẩn cao khô Lạc tiên theo hƣớng dẫn... chuyên luận Lạc tiên (Herba Passiflorae foetidae Mẫu đạt tiêu chuẩn Dƣợc điển Việt Nam IV đƣợc thu hái để ều chế cao Lạc tiên Bước 5: ều chế cao khô Lạc tiên Bước 6: Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩ