Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc testin II

- Dựa vào tác dụng dược lý và thành phần hoá học của các vị thuốc đã được chứng minh có tác dụng điều trị bệnh suy giảm chức năng sinh dục, sinh sản.. Định nghĩa Cao thuốc là chế phẩm đ

NGUYỄN MINH THU

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO ĐẶC BÀI THUỐC

TESTIN II

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Hà Nội - 2015

đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin gửi tới các thầy cô và cán bộ Trường đại học Dược Hà Nội lời cảm

ơn chân thành vì đã dạy dỗ, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập dưới mái trường Đại học Dược Hà Nội

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè, những người

đã luôn động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên

NGUYỄN MINH THU

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần1: TỔNG QUAN 2

1.1Thông tin về bài thuốc testin II 2

1.2.Tóm tắt thông tin các vị thuốc trong bài thuốc 3

1.2.1 Ba kích 3

1.2.2 Bá bệnh 4

1.2.3 Bạch tật lê 5

1.2.4 Câu kỉ tử 6

1.2.5 Đương quy 7

1.2.6 Hoàng kỳ 8

1.2.7 Xà sàng tử 9

1.2.8 Dâm dương hoắc 10

1.3 Tóm tắt đặc điểm cao thuốc từ dược liệu 11

1.3.1 Định nghĩa 11

1.3.2 Phân loại cao thuốc 11

1.3.3 Phương pháp bào chế cao thuốc 11

1.3.4 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm 12

Phần 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 14

2.2 Nội dung nghiên cứu: 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

Phần 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Điều chế cao đặc 18

3.1.1 Xác định độ ẩm dược liệu 18

3.1.2 Điều chế cao đặc 18

3.1.3 Tính hiệu suất điều chế cao 21

3.2 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc 22

3.2.1 Khảo sát các chỉ tiêu hóa lý 22

3.2.1.1 Hình thức, cảm quan 22

3.2.1.2 Mất khối lượng do làm khô 22

3.2.1.3 Xác định chất chiết được bằng nước trong cao 23

3.2.1.4 Xác định pH của dung dịch cao đặc nồng độ 1% (kl/tt) 24

3.2.1.5 Xác định tro toàn phần của cao đặc 25

3.2.2 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao đặc 25

3.2.3 Kiểm tra các vị thuốc trong cao đặc bằng SKLM 33

3.2.3 1 Bá bệnh 34

3.2.3 2 Bạch tật lê 34

3.2.3 3 Xà sàng tử 34

3.2.3 4 Ba kích 34

3.2.3 5 Đương quy 35

3.2.3 6 Dâm dương hoắc 35

3.2.3.7 Hoàng kỳ 35

3.2.3 8 Câu kỷ tử 35

3.2.4 Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn 38

3.2.5 Định lượng flavonoid toàn phần 38

3.3 Bàn luận 39

3.3.1 Điều chế cao đặc 39

3.3.2.Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn 40

Phần 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44

Kết luận 44

Đề xuất 44 PHỤ LỤC

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Hóa chất, dung môi 14 Bảng 2.2 Trang thiết bị sử dụng 15 Bảng 3.1 Độ ẩm của dược liệu 18 Bảng 3.2 Độ ẩm của cao đặc 21 Bảng 3.3 Hiệu suất điều chế cao đặc 22

Bảng 3.4 Độ ẩm cao đặc 40% điều chế theo phương pháp chiết

Bảng 3.5 Hàm lượng chất chiết được bằng nước trong cao đặc 24 Bảng 3.6 pH của cao đặc 24 Bảng 3.7 Tro toàn phần của cao đặc 25

Bảng 3.8 Tóm tắt kết quả định tính một số nhóm chất của cao

đặc bài thuốc 32 Bảng 3.9 Kết quả thử nghiệm đối với vi khuẩn, vi nấm 40 Bảng 3.10 Giới hạn nhiễm khuẩn cao đặc 40

Bảng 3.11 Kết quả định lượng flavonoid trong cao đặc chiết

ethanol 40% 41

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Số trang Hình 3.1 Sơ đồ điều chế cao đặc chiết ethanol 40% 20 Hình 3.2 Sắc ký đồ bá bệnh và cao đặc 36 Hình 3.3 Sắc ký đồ bạch tật lê và cao đặc 36 Hình 3.4 Sắc ký đồ xà sàng tử và cao đặc 36 Hình 3.5 Sắc ký đồ ba kích và cao đặc 36 Hình 3.6 Sắc ký đồ đương quy và cao đặc 37 Hình 3.7 Sắc ký đồ dâm dương hoắc và cao đặc 37 Hình 3.8 Sắc ký đồ hoàng kỳ và cao đặc 37 Hình 3.9 Sắc ký đồ câu kỷ tử và cao đặc 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với các chứng bệnh khác, chứng suy giảm chức năng sinh dục ở nam giới và các chứng bệnh liên quan đến mãn dục nam, ngày càng gia tăng Nguyên nhân có thể do tác động của mặt trái sự phát triển công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước mà ta chưa kiểm soát được, gia tăng như: Ô nhiễm môi trường, ô nhiễm thực phẩm do sử dụng thuốc trừ sâu, thuốc bảo quản, thuốc kích thích sinh trưởng không đúng nguyên tắc, các cơ sở sản xuất thải nhiều khí độc, chất độc hại ra môi trường và cường độ làm việc cao dẫn tới stress, tiếp xúc với các thiết bị máy móc

có từ trường kéo dài v v [1]

Thuốc điều trị các chứng này còn hạn chế, thuốc tây y chủ yếu là dùng liệu pháp hormon thay thế, nhưng hiệu quả chưa cao và có rất nhiều tác dụng bất lợi; thuốc có nguồn gốc thảo dược hầu như rất ít, mà chủ yếu là thực phẩm chức năng giá lại rất đắt

Chính vì vây mà PGS.TS Vũ Văn Điền đã xây dựng bài thuốc Testin II, với

hy vọng tạo ra sản phẩm hỗ trợ điều trị sự suy giảm chức năng sinh dục nam Đây

là bài thuốc được phát triển trên công thức bài thuốc Testin I, bài thuốc này bước đầu nghiên cứu dược lý đã có tác dụng và đã xây dựng dạng bào chế dạng viên nang mềm

Cao đặc là sản phẩm trung gian cho các nghiên cứu về độc tính, tác dụng dược lý và bào chế nên cần được chuẩn hóa, nếu không chuẩn hóa thì các kết quả nghiên cứu tiếp theo sẽ không có ý nghĩa Do đó chúng tôi tiến hành đề tài:

“ Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc Testin II” với 2 mục tiêu:

Điều chế cao đặc từ dịch chiết ethanol 40%

Bước đầu nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao dặc

Phần1: TỔNG QUAN

1.1 Thông tin về bài thuốc testin II

+ Cấu trúc của bài thuốc gồm các vị thuốc sau:

Bá bệnh ( Radix Eurycomae) 10g

Xà sàng tử (Fructus Cnidii) 12g

Dâm dương hoắc (Herba Epimedii) 10g

Đương quy (Radix Angeliace sinensis) 14g

Bạch tật lê (Fructus Tribuli terrestris) 12g

Hoàng kì (Radix Astragali membrancei) 14g

Câu kỉ tử (Fructus Lycii) 16g

Ba kích (Radix Morindae officinalis) 10g

+ Xuất xứ bài thuốc: Bài thuốc do PGS.TS Vũ Văn Điền thiết kế

+ Cơ sở thiết kế bài thuốc:

- Dựa vào lý luận của Y học cổ truyền về các bệnh do thận hư gây ra, trong đó

đi sâu vào các chứng liên quan đến suy giảm sinh sản, sinh dục nam

- Dựa vào tính năng của các vị thuốc để chọn vị thuốc kê đơn cho phù hợp với điều trị bệnh suy giảm chức năng sinh sản nam

- Dựa vào tác dụng dược lý và thành phần hoá học của các vị thuốc đã được chứng minh có tác dụng điều trị bệnh suy giảm chức năng sinh dục, sinh sản

- Trong bài thuốc có 5 vị thuốc là Bá bệnh, Bạch tật lê, Xà sàng tử , Dâm dương hoắc và Ba kích đã chứng minh có tác dụng cải thiên sự suy giảm chức năng sinh sản, sinh dục nam, phối hợp thêm Hoàng kì, Đương quy và Câu kỉ tử để

bổ khí huyết, bổ can thận Như vậy khi có cả thuốc cải thiên chức năng sinh dục lẫn thuốc bồi bổ cơ thể thì tác dụng cải thiện sự suy giảm chức năng sinh sản, sinh dục sẽ tốt hơn

+ Tác dụng của bài thuốc: Bổ thận sinh tinh, ích khí huyết

+ Công dụng: Chữa suy giảm sinh dục nam

+ Cách dùng: Ngày uống 1 thang, sắc 3 lần, cô còn 3 bát thuốc (300ml), chia 3 lần

uống trong ngày

+ Kiêng kị: Không dùng cho phụ nữ có thai, trẻ em dưới 16 tuổi Thận trọng khi

dùng cho người bị tiêu chảy

1.2 Tóm tắt thông tin các vị thuốc trong bài thuốc

1.2.1 Ba kích

Tên khoa học vị thuốc: Radix Morindae officinalis [3]

Tên khác: Ba kích thiên, dây ruột gà

Bộ phận dùng: Rễ đã phơi hay sấy khô của cây Ba kích (Morinda officinalis How)

Họ Cà phê (Rubiaceae) [3][5]

1.2.1.1 Tóm tắt thành phần hóa học

Rễ ba kích chứa các antraglucosid: Tectoquinon, alizarin, rubiadin;

Các iridoid glycosid gồm: Asperulosid, monotrpein, morindolid;

Các sterol: β-sitosterol, oxositosterol, 1 triterpen loại ursan Lacton

Ngoài ra, còn các chất vô cơ, acid hữu cơ, tinh dầu, tanin, vitamin C [5][[32]

1.2.1.2 Tóm tắt tác dụng sinh học

Theo Y học cổ truyền:

Tính vị, quy kinh: Vị cay, ngọt, tính hơi ôn Quy vào kinh thận

Công năng: Bổ thận dương, mạnh gân cốt, thận dương suy nhược dẫn đến di tinh, liệt dương, xuất tinh sớm, cao huyết áp, phong thấp [3]

Theo Y học hiện đại:

* Tác dụng trên hệ sinh dục nam

-Tăng cường hiệu lực của androgen trên chuột cống và chuột nhắt [5]

-Ba kích có tác dụng bảo vệ tế bào leydig khi gây độc bằng H2O2 trên tế bào leydig của chuột nuôi cấy [8]

-Bảo vệ màng tế bào tinh trùng khi oxy hóa màng bằng chất oxy hóa [29]

* Tác dụng tăng sức đề kháng

-Ba kích có tác dụng tăng sức đề kháng đối với yếu tố độc hại của cơ thể [5]

Polysaccharid toàn phần trong dịch chiết rễ ba kích giúp tăng khả năng bơi của chuột nhắt tải nặng so với lô không dùng thuốc [36]

* Một số tác dụng khác

Chống viêm, hạ huyết áp, tăng sức co bóp của ruột,… [5]

Anthraquinon và polysaccharid có tác dụng ức chế tiêu xương ở chuột cống cắt buồng trứng [28]

1.2.1.3 Công dụng

Chữa thận dương hư, phụ nữ vô sinh, kinh nguyệt không đều, nam giới yếu sinh lý, hiếm muộn, liệt dương, di mộng tinh, chữa phong thấp, tăng huyết áp, táo bón Kiêng kỵ: Thận trọng với phụ nữ có thai, người bị tiêu chảy [5]

1.2.2 Bá bệnh

Tên khoa học vị thuốc: Radix Eurycomae

Tên khác: Bách bệnh, lòng bẹt, sâm alipas

Bộ phận dùng: Rễ phơi hay sấy khô của cây Bá bệnh (Eurycoma longifolia J.) Họ

Thanh thất (Simaroubaceae) [5]

1.2.2.1 Tóm tắt thành phần hóa học

Trong rễ bá bệnh đã tách được 65 chất gồm các quassinoid, alcaloid loại one, alcaloid loại carbolin, triterpen và một số flavonoid khác đánh số từ 1 đến 65 (21 chất thuộc nhóm alcaloid β-carbolin) [5][26]

canthin-6-1.2.2.2 Tóm tắt tác dụng sinh học

Theo Y học cổ truyền:

Bá bệnh mới được dùng trong nhân dân, chưa đưa vào danh sách thuốc cổ truyền Dân gian dùng vỏ chữa các chứng rối loạn tiêu hóa, đau khớp, sốt rét, quả chữa lỵ,

rễ chữa ngộ độc, tẩy giun, lá nấu nước tắm chữa ghẻ [5]

Theo Y học hiện đại:

* Tác dụng trên chức năng sinh dục nam

+ Thử nghiệm lâm sàng:

Thử 12 tuần với 109 nam giới, tuổi từ 30 - 55 đã cải thiện chức năng sinh lý với P

< 0,006, tăng cương dương với P < 0,001, tăng hành vi tình dục 14%, tăng sự di động của tinh trùng 44,4%, tăng thể tích tinh dịch 18,2% [15]

Cao chiết nước đã chuẩn hóa, thử trên 75 bệnh nhân vô sinh tự phát trong 3 tháng giúp cải thiện về tinh trùng (11 người đã làm cho vợ họ có thai) [25]

Tên khoa học vị thuốc: Fructus Tribuli terrestris[3]

Tên khác: Gai chống, gai sầu, thích tật lê, quỷ kiến sầu, gai ma vương,

Bộ phận dùng: Quả chín phơi hay sấy khô của cây gai chống (Tribulus terrestris

L) Họ Gai chống (Zygophyllaceae) [5]

1.2.3.1 Tóm tắt thành phần hóa học

Các saponin sterolic, trong đó genin là diosgenin, ruscogenin, gitogenin,

25D-spirosta-3,5-dien, clorogenin, hecogenin, neotigogenin;

Flavonoid: β-sitosterol, kaempferol,… các lignanamid [16]

Ngoài ra, còn có alcaloid, tinh dầu, dầu béo,tanin… [5]

1.2.3.2 Tóm tắt tác dụng sinh học

Theo Y học cổ truyền:

Tính vị, quy kinh: Vị đắng tính bình Quy vào kinh can, phế

Công năng: Sơ can giải uất, bình can sáng mắt, thông huyết, trừ thấp, tả phế giải độc, cường dương [3][5]

Theo Y học hiện đại:

* Tác dụng trên sinh dục nam

-Dịch chiết ethanol làm giảm tổn thương tinh hoàn trên chuột cống gây độc tinh hoàn bằng cadimium [23]

-Trên linh trưởng, thỏ, chuột cống bình thường, dịch chiết bạch tật lê có tác dụng làm tăng testosteron, dihydrotestosteron và dehydroepiandrosteron sulphat một cách có ý nghĩa so với lô chứng sinh lý [13]

* Một số tác dụng khác

Tác dụng bảo vệ cơ tim khi thiếu oxy [35]

1.2.3.3 Công dụng

Chữa đau mắt đỏ, bổ thận, trị đau lưng, xuất tinh sớm

Kiêng kỵ: Người huyết hư Ngày dùng 12-16g dạng thuốc sắc hay thuốc bột [5]

1.2.4 Câu kỉ tử

Tên khoa học vị thuốc: Fructus Lycii [3]

Tên khác: Cam câu kỉ, hồng câu kỉ, câu kỉ, kỉ tử, khủ khởi, khởi tử

Bộ phận dùng: Quả chín, vỏ rễ phơi khô của cây Khủ khởi (Lycium sinense Mill)

Họ Cà (Solanaceae) [3][5]

1.2.4.1 Tóm tắt thành phần hoá học

Quả chứa betain, zeaxanthin, physalien, acid béo, các loại đường tự do, acid amin

tự do, vitamin C, caroten, acid nicotinic, sterol, tinh dầu

Ngoài ra, còn có polyssacharid, flavonoid, sesquiterpen Lá có betain [5]

1.2.4.2 Tóm tắt tác dụng sinh học

Theo Y học cổ truyền:

Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, hơi đắng, tính bình Quy vào kinh phế, thận, can, tỳ

Công năng: Bổ can thận, dưỡng huyết, sáng mắt, sinh tân chỉ khát, bổ phế âm, ích

khí huyết [3]

Theo Y học hiện đại:

* Tác dụng trên chức năng sinh dục nam

Polysaccharid làm tăng trọng lượng của tinh hoàn, mào tinh, tăng nồng độ testosteron, trên chuột gây tổn thương tinh hoàn bằng bisphenol A [37]

có tác dụng chống lão hóa, thông qua chống oxy hóa trên chuột già [17]

Tên khoa học vị thuốc: Radix Angelicae sinensis [3]

Tên khác: Tần quy, đương quy, vân quy

Bộ phận dùng: Rễ đã phơi hay sấy khô của cây Đương quy Trung Quốc (Angelica

sinensis (Oliv) Diels) Họ Hoa tán (Apiaceae) [5]

1.2.6.1 Tóm tắt thành phần hoá học

Rễ đương quy Trung Quốc chứa:

Tinh dầu 0,2-0,4%, các acid amin, acid hữu cơ, các polyacetylen, ;

Coumarin: Scopoletin, umbeliferon, acutilobin, ;

Các vitamin, polysaccharid, sterol và nhiều nguyên tố vi, đa lượng[5] [9]

1.2.6.2 Tóm tắt tác dụng sinh học

Theo Y học cổ truyền:

Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, hơi đắng, tính ấm Quy vào 3 kinh tâm, can, tỳ

Công năng: Bổ huyết, hoạt huyết, nhuận tràng thông tiện, giải độc, [3][5]

Theo Y học hiện đại:

* Tác dụng bảo vệ não thần kinh:

Z-ligustilide làm giảm tổn thương não bảo vệ thần kinh [10]

Chữa thiếu máu, gầy yếu, viêm khớp, kinh nguyệt không đều, suy giảm miễn dịch

Kiêng kỵ: Tỳ thấp ỉa chảy không dùng, thận trọng với phụ nữ có thai Ngày dùng

5-15g dưới dạng thuốc sắc [5]

1.2.6 Hoàng kỳ

Tên khoa học vị thuốc: Radix Astragali membranacei [3]

Tên khác: Miên hoàng kỳ, tiễn kỳ, khẩu kỳ

Bộ phận dùng: Rễ phơi hay sấy khô của cây Hoàng kỳ (Astragalus membranaceus

Fish.) Họ Đậu (Fabaceae) [3][5]

1.2.7.1 Tóm tắt thành phần hóa học

Polysaccharid: Gồm có 3 astragalan I,II,III

Saponin: Gồm 9 saponin trong đó astragalosid I, II, II, IV, V,VI, VII và isoastragalosid I, II; 2 saponin kiểu olean là astragalosid VIII, soyasaponin I và các saponin khác như cis-tramembranin I, astramembranin II [20]

Ngoài ra, còn có sucrose, β-sitosterol, calycosin, focmononetin [5]

1.2.7.2 Tóm tắt tác dụng sinh học

Theo Y học cổ truyền:

Tính vị, quy kinh: Vị ngọt, tính ấm Quy vào kinh phế, tỳ

Công năng: Bổ khí, ích huyết, cố biểu liễm hãn, lợi thủy, sinh tân [3][5]

Theo Y học hiện đại:

* Tác dụng bảo vệ gan

Saponin astramembranin I Làm tái tạo gan, làm tăng sinh tế bào gan

* Tác dụng điều hòa miễn dịch

Làm tăng khả năng thực bào của các đại thực bào và bạch cầu đa nhân Điều chỉnh chức năng tế bào T đã bị suy giảm, tăng hoạt tính interleukin-2 [5]

* Một số tác dụng khác: phòng đái tháo đường cho người béo phì [18] chống oxy

hóa làm giảm các gốc oxy hoạt động và kích hoạt men chống oxy hóa SOD [22]

1.2.7.3 Công dụng

Chữa đái tháo đường, người khí hư, phong thấp, đau xương, tự ra mồ hôi

Kiêng kỵ: Người âm hư hỏa vượng, phụ nữ có thai Ngày dùng 6-12g dạng sống,

3-9g dạng sao tẩm, dùng dưới dạng thuốc sắc hoặc cao, viên [5]

1.2.7 Xà sàng tử

Tên khoa học vị thuốc: Fructus Cnidii

Tên khác: Cây giần sàng

Bộ phận dùng: Quả chín phơi hay sấy khô của cây Xà sàng (Cnidium monnieri (L.) Cuss); (Selinum momnnieri L.) Họ Hoa tán (Apiaceae) [6]

1.2.7.1 Tóm tắt thành phần hoá học

Tinh dầu: Chủ yếu là L pinen, camphen, bocnylisovalerianat,

Coumarin: Osthole, umbelliferon, bergapten, xanthotoxol, angelicin,

Ngoài ra, có autraptenol, isogosferol, cniforin, enidimol diosmetin , [19]

1.2.7.2 Tóm tắt tác dụng sinh học

Theo Y học cổ truyền:

Tính vị, quy kinh: Vị cay đắng, tính ôn Quy vào kinh thận

Công năng: Ôn thận tráng dương, sát khuẩn [6]

Theo Y học hiện đại:

* Tác dụng trên sinh dục nam

Bốn coumarin là osthole, imperatorin, xanthotoxin và isopimpinellin có tác dụng làm giãn cơ trơn thể hang thỏ cô lập [33], kéo dài thời gian động dục, tăng trọng lượng buồng trứng, trọng lượng tử cung trên chuột cái Trên chuột đực gây tăng

trọng lượng tiền liệt tuyến, túi tinh, cơ nâng hậu môn [6], làm tăng testosteron, FSH, LH trong huyết thanh, tăng NOS trong mô dương vật [12]

* Một số tác dụng khác:

Bảo vệ tim, chống loạn nhịp tim, kháng loãng xương , làm giãn phế quản [6][38]

1.2.7.3 Công dụng

Chữa liệt dương, nhiễm trùng ngoài da, chữa viêm âm đạo do trùng roi

Liều dùng: 4-12g dưới dạng thuốc sắc, dùng riêng hoặc phối hợp với vị thuốc

khác[6]

1.2.8 Dâm dương hoắc

-Tên khoa học vị thuốc: Herba Epimedii [3]

-Bộ phận dùng: Phần trên mặt đất đã phơi hay sấy khô của các loài Dâm dương

hoắc lá hình tim (Epimedium brevicornum Maxim.), họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)[3][5]

Ngoài ra, dâm dương hoắc còn có polysaccharide.[5]

1.2.8.2 Tác dụng sinh học

Dâm dương hoắc có các tác dụng sau:

- Làm tăng lưu lượng mạch vành tim [5]

- Tăng cường thực bào của các đại thực bào, thúc đẩy chuyển dạng của tế bào lympho

- Thúc đẩy tăng trưởng tế bào tủy In vitro

- Làm tăng lượng Testosteron trong máu và làm tăng trọng lượng cơ nâng hậu môn[5]

- Chất Icarin có tác dụng bảo vệ tế bào Sertoli in vitro điều này giúp ích cho sinh sản ở nam [21]

1.3 Tóm tắt đặc điểm cao thuốc từ dược liệu

1.3.1 Định nghĩa

Cao thuốc là chế phẩm được bào chế bằng cách cô hoặc sấy đến thể chất quy định các dịch chiết từ dược liệu, thực vật hay động vật với các dung môi thích hợp bằng các phương pháp chiết thích hợp như ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm nhỏ giọt hay

chiết ngược dòng [2]

1.3.2 Phân loại cao thuốc

Cao thuốc được chia làm 3 loại:

Cao lỏng: Là chất lỏng hơi sánh, có mùi vị đặc trưng của dược liệu sử dụng, trong

đó cồn và nước đóng vai trò làm dung môi chính (hay chất bảo quản hoặc cả hai) Nếu không có chỉ dẫn khác, quy ước 1ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu dùng để chế cao thuốc

Cao đặc: Là khối đặc quánh Độ ẩm không quá 20%

Cao khô: Là khối hoặc bột khô, đồng nhất nhưng rất dễ hút ẩm Độ ẩm không quá 5% [2]

1.3.3 Phương pháp bào chế cao thuốc

Các dược liệu trước khi chiết xuất được xử lý sơ bộ (rửa sạch, phơi hoặc sấy khô

và chia nhỏ đến kích thước thích hợp) Nếu dược liệu có chứa men làm phân hủy hoạt chất, cần phải diệt men trước khi đưa vào sử dụng bằng hơi cồn sôi, hơi nước sôi hoặc bằng phương pháp khác thích hợp Quá trình điều chế cao thuốc thường

có 2 giai đoạn:

Giai đoạn I: Chiết xuất

Chiết xuất bằng các dung môi thích hợp Tùy theo bản chất của dược liệu, bản chất dung môi và tiêu chuẩn chất lượng của thành phẩm và điều kiện, quy mô sản xuất

và trang thiết bị, có thể sử dụng các phương pháp chiết xuất như ngâm, hầm, hãm, sắc, ngâm nhỏ giọt, chiết xuất ngược dòng, chiết xuất bằng thiết bị siêu âm, chiết xuất bằng phương pháp sử dụng điện trường và các phương pháp khác cho phù hợp với mục đích sử dụng

Giai đoạn II: Cô cao

Cao lỏng: Để dịch chiết ở nơi mát khoảng 3 ngày, lọc loại tủa, cô phần dịch loãng

trước (Cô ở áp suất giảm hoặc cách thủy), sau đó thêm dịch chiết đầu vào để đạt tỷ

lệ cao lỏng theo quy ước (1ml cao lỏng tương ứng với 1g dược liệu).Cao lỏng có

khuynh hướng bị lắng cặn vì vậy để cao lỏng ở chỗ mát trong thời gian ít nhất 3 ngày, rồi lọc

Cao đặc: Dịch chiết được cô đặc đến khi tỷ lệ dung môi còn lại không quá 20%

Cô bằng thiết bị dưới áp suất giảm hoặc sấy dưới áp suất giảm ở nhiệt độ không quá 60oC, hoặc cô cách thủy (không được cô trực tiếp trên lửa) và sấy ở nhiệt độ

không quá 80oC

Muốn loại bớt tạp chất của cao cần căn cứ vào bản chất dược liệu, bản chất tạp chất cần loại để chọn phương pháp chiết và dung môi chiết cho thích hợp Có thể cho thêm chất bảo quản hoặc các chất trơ làm chất mang để cải thiện tính chất vật lý[2]

1.3.4 Tiêu chuẩn kiểm nghiệm

- Độ tan: Cao lỏng phải tan hoàn toàn trong dung môi đã sử dụng để điều chế cao[2]

- Độ trong, mùi vị, độ đồng nhất và màu sắc: Cao thuốc phải đúng màu sắc đã mô

tả trong chuyên luận riêng, có mùi và vị đặc trưng của dược liệu sử dụng Ngoài ra, cao lỏng còn phải đồng nhất, không có váng mốc, không có cặn bã dược liệu và vật lạ [2]

- Mất khối lượng do làm khô [2]

Cao đặc không quá 20 %

Cao khô không quá 5 %

- Kim loại nặng: Đáp ứng yêu cầu qui định trong chuyên luận riêng

- Dung môi tồn dư: Nếu điều chế với dung môi không phải là cồn, nước hay hỗn hợp cồn - nước, dư lượng dung môi sử dụng phải đáp ứng yêu cầu qui định trong Phụ lục 10.14 - Xác định dung môi tồn dư – DĐVN IV

- Dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật: Đáp ứng yêu cầu theo Phụ lục 12.17 – DĐVN IV

- Giới hạn nhiễm khuẩn: Đáp ứng yêu cầu theo Phụ lục 13.6 – DĐVN IV

Phần 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

+ Nguyên liệu

- Các vị thuốc trong bài thuốc Testin II: được mua tai chợ Ninh Hiệp Hà Nội về sơ chế, kiểm tra đạt tiêu chuẩn DĐVN IV mới đưa vào bào chế thành thuốc phiến để điều chế cao đặc; riêng vị thuốc Bá bệnh chưa có trong DĐVN IV chúng tôi đã lấy mẫu cây và nhờ Viện tài nguyên sinh thái Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam xác định tên cây và lấy rễ sơ chế thành thuốc phiến để nghiên cứu và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu

- Cao đặc: Đã được điều chế theo quy trình ổn định, dùng cao này để nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn

+Các hóa chất, dung môi Các hóa chất, dung môi sử dụng trong thí nghiệm được

mua tại thị trường Hà Nội, nguồn gốc được tóm tắt ở bảng 2.1

Bảng 2.1 : Hóa chất, dung môi

STT Tên hóa chất dung môi Xuất xứ

1 Acid formic Trung Quốc

2 Cloroform Trung Quốc

3 Ethanol 96% Việt Nam

4 Ether dầu hỏa Trung Quốc

5 Ethyl aceta Trung Quốc

6 n-Hexan Trung Quốc

7 Methanol Trung Quốc

8 Toluen Trung Quốc

9 Bản mỏng Silicagen GF 254 (Merk) Đức

+ Một số trang thiết bị:

Bảng2.2 : Trang thiết bị sử dụng

STT Tên thiết bị Xuất xứ

1 Bếp đun cách thủy Bath HH-S4 Trung Quốc

2 Bếp hồng ngoại Sanaky AT-2521 HGN Trung Quốc

3 Tủ sấy Memmerk, shellab Đức

4 Cân kĩ thuật Precisa- XB320C Thụy Sĩ

5 Cân phân tích Sartorius Thụy sĩ

6 Cân sấy ẩm Đức

7 Máy ly tâm Đài Loan

8 Đèn tử ngoại Viber Lourmat Pháp

Và các dụng cụ, thiết bị khác được làm nhờ ở Bộ môn Vi sinh -Sinh học

2.2 Nội dung nghiên cứu

a Điều chế cao:

- Sơ chế, bào chế các vị thuốc thành thuốc phiến phơi hay sấy khô

- Xác định độ ẩm của các vị thuốc

- Tiến hành chiết dịch chiết bài thuốc, để lắng, lọc

- Tiến hành cô chân không và cô cách thủy để được cao đặc

- Xác định độ ẩm của cao đặc

- Điều chế 5 mẻ để tính hiệu suất trung bình

b Xây dựng tiêu chuẩn cao đặc

- Khảo sát các tiêu chuẩn hóa lí

- Định tính trong ống nghiệm các nhóm chất hữu cơ

- Định tính bằng sắc kí lớp mỏng các vị thuốc trong cao đặc

- Kiểm tra độ nhiễm khuẩn

-Định lượng flavonoid toàn phần

c Sơ bộ dự kiến tiêu chuần cao đặc

2.3 Phương pháp nghiên cứu

a Điều chế cao đặc

Qua thăm dò tác dụng dược lí của cao chiết bằng nước, chiết bằng ethanol 40%, ethanol 70%, thấy rằng cao điều chế từ ethanol 40% và 70% có tác dụng rõ rệt , cho nên trong đề tài này chọn cao đặc chiết với ethanol 40% để tiến hành nghiên

cứu vì kinh tế hơn dùng các dung môi khác để chiết

+ Điều chế dịch chiết ethanol bằng phương pháp chiết hồi lưu với dung môi là ethanol 40%

+ Cô dịch chiết thành cao đặc bằng phương pháp cô cách thủy

+ Xác định độ ẩm của cao đặc và các vị dược liệu bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô theo Phụ lục 9.6- DĐVN IV

Tính được hiệu suất điều chế cao đặc theo khối lượng khô tuyệt đối

b Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao

trong tài liệu hóa thực vật [4]

- Định tính các vị thuốc trong cao đặc bằng SKLM:

Chiết riêng từng vị thuốc với lượng tương ứng có trong 1 g cao đặc của bài thuốc với cùng một quy trình chiết, chấm cùng một lượng trên bản mỏng, khảo sát

trên nhiều hệ dung môi để chọn hệ thích hợp tách được các vết, có thể nhận biết được sự có mặt của vị thuốc trong cao [5], [16]

Sau khi khai triển sắc ký, hiện màu trên đèn tử ngoại, ghi lại hình ảnh sắc

ký đồ

- Định lượng flavonoid toàn phần: Định lượng theo phương pháp cân

- Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn: Theo phương pháp đĩa thạch, tiến hành theo

DĐVN IV phụ lục 13.6 – DĐVN IV

c Dự kiến tiêu chuẩn cao đặc

Dựa vào kết quả nghiên cứu và căn cứ vào quy trình xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao thuốc để dự kiến tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao thuốc

Phần 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Điều chế cao đặc

3.1.1 Xác định độ ẩm dược liệu

Áp dụng phương pháp mất khối lượng do làm khô ( DĐVN IV PL 9.6) để đo độ

ẩm của dược liệu, mỗi dược liệu làm 3 lần, lấy kết quả trung bình

Kết quả được trình bày ở bảng3.1

Bảng3.1 : Độ ẩm của các dược liệu

Trong đó: m1 là khối lượng dược liệu khô (g)

mi là khối lượng mỗi dược liệu (g)

Xi là độ ẩm của mỗi dược liệu tương ứng (%)

n là số thang thuốc chiết trong một lần

Khối lượng dược liệu khô của 5 thang (n=5) Testin là: m1 = 445.52 g

3.1.2 Điều chế cao đặc

a Điều chế dịch chiết:

Dược liệu được bào chế thành dạng thuốc phiến, chiết xuất với dung môi ethanol 40% bằng phương pháp chiết hồi lưu; tiến hành chiết 3 lần, mỗi lần đun sôi 1giờ

-Lần 1: Cân lượng dược liệu tương ứng 5 thang thuốc (490g) Tất cả dược liệu được cho vào giỏ sắc thuốc theo thứ tự sau( từ dưới lên trên)

1 dâm dương hoắc → 2 Đương qui →3 Bá bệnh → 4 Xà sàng → 5 Bạch tật

lê → 6 Câu kỉ tử →7 Hoàng kỳ → 8 Ba kích

Thêm dung môi ethanol 40% (3lít) vào đến ngập dược liệu Đun sôi trong 1 giờ thì rút dịch chiết, để lắng, gạn lấy dịch trong Phần còn lại lọc qua bông

-Lần 2: Thêm tiếp dung môi ethanol 40% đến ngập dược liệu Đun sôi trong 1 giờ rồi rút dịch chiết

-Lần 3: tiến hành tương tự lần 2

Gộp dịch chiết lần 2,3 lại, để lắng, gạn lấy dịch trong Phần còn lại lọc qua bông

b Cô thành cao đặc:

+ Cất chân không thu hồi dung môi:

Cất thu hồi dung môi ethanol, cất riêng dịch chiết lần 2, 3 và lần 1; sau khi thu hồi hết dung môi, cho cao vào cốc rộng miệng đem cô cách thủy, khi cô gần được, trộn đều 3 lần chiết và cô thành cao đặc, trong quá trình cô cần phải khấy đảo thường xuyên bằng đũa thủy tinh để phá lớp màng trên bề mặt cho cao bốc hơi nhanh, cô đến khi cao đặc sánh, lấy ra để nguội và xác định độ ẩm

Tiến hành điều chế 5 mẫu để tính hiệu suất trung bình

Quá trình điều chế cao được tóm tắt ở sơ đồ sau (Hình 3.1)

Cân dược liệu phiến

Đun hồi lưu sôi 1h

Hình 3.1: Sơ đồ điều chế cao đặc chiết ethanol 40%

Cho DL vào giỏ chiết

Ethanol 40% Cân dược liệu phiến

Đun hồi lưu sôi 1h

Hình 3.1: Sơ đồ điều chế cao đặc chiết ethanol 40%

3.1.3 Tính hiệu suất điều chế cao

a Xác định độ ẩm cao đặc: Tiến hành theo phụ lục 9.6 DĐVN IV

Lấy chính xác khoảng 1,000 g cao đặc sấy ở nhiệt độ 1000C đến khối lượng không đổi , làm 5 mẫu rồi tính kết quả trung bình

Mất khối lượng do làm khô được tính theo công thức:

(1)

Trong đó: X: Mất khối lượng do làm khô của cao thuốc (%)

Mt: Khối lượng cao trước khi sấy (g)

Ms: Khối lượng cao sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g)

Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

b, Tính hiệu suất điều chế cao đặc:

Hiệu suất điều chế trung bình theo phần trăm cao khô tuyệt đối trên dược liệu khô tuyệt đối theo công thức sau:

Trong đó m1 : Khối lượng dược liệu khô tuyệt đối (m1 = 445,52g)

m2: Khối lượng cao đặc (g)

X: Độ ẩm của cao đặc (%)

H: Hiệu suất cao khô tuyệt đối/ dược liệu khô tuyệt đối

Kết quả được trình bày ở bảng3.3

Bảng 3.3: Hiệu suất điều chế cao đặc

Mẫu Khối lượng cao- m2 (g) Độ ẩm cao đặc - X(%) Hiệu suất-H (%)

3.2 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc

3.2.1 Khảo sát các chỉ tiêu hóa lý

3.2.1.1 Hình thức, cảm quan

- Độ đồng nhất: Cho một ít cao và dàn đều trên lam kính, đặt lamen ép sát Đem soi dưới kính hiển vi (vật kính 40) nhận thấy cao thuốc đồng nhất, không có kết tủa, phân lớp

- Độ tan: Lấy 1g cao đặc hòa với 25 ml ethanol 40%, cao tan hoàn toàn

- Màu sắc: Lấy khoảng 1 g cao lên tờ giấy trắng, quan sát thấy cao thuốc có màu nâu đen

- Mùi (xác định bằng khứu giác): Cao thuốc có mùi thơm đặc trưng của dược liệu

- Vị (xác định bằng vị giác): Cao thuốc có vị cay nhẹ, hơi ngọt

3.2.1.2 Mất khối lượng do làm khô

Tiến hành theo Phụ lục 9.6 – DĐVN IV

Cân chính xác khoảng 1,000 g cao đặc cho vào bát sứ (đã cân bì), cho vào tủ sấy ở

100 độ C, sấy đến khối lượng không đổi Làm 5 mẫu, tính kết quả trung bình Tính hàm ẩm theo công thức (1), kết quả được trình bày ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Độ ẩm cao đặc 40% điều chế theo phương pháp chiết hồi lưu

3.2.1.3 Xác định các chất chiết được bằng nước

Tiến hành theo phương pháp chiết lạnh ( Phụ lục 12.10 – DĐVN IV)

-Cân chính xác 4,000g cao cho vào bình nón 250ml

-Thêm chính xác 100,00ml nước, đậy kín, ngâm lạnh, thỉnh thoảng lắc trong 6h đầu, để yên 18h

- Lọc qua phễu lọc khô vào 1 bình hứng khô thích hợp

- Lấy chính xác 20,00ml dịch lọc cho vào 1 cốc thủy tinh đã cân bì trước Cô cách thủy đến cắn khô, sấy cắn ở 1050C trong vòng 3h Lấy ra để nguội trong bình hút

ẩm 30 phút, cân nhanh xác định khối lượng cắn sau khi sấy và tính % chất chiết được trong dịch lọc theo công thức:

4

2

10.)100.(

).(

5

X m

m m A







Trong đó:

A: Hàm lượng chất chiết được bằng nước của cao (%)

m2: Tổng khối lượng cốc và cắn của 20,00 ml dịch lọc (g)

m1: Khối lượng cốc (g)

m: Khối lượng cao đem thử (g)