Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm vị thuốc hà thủ ô trắng

Để tạo điều kiện thuận lợi cho công tác kiểm nghiệm dược liệu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: " Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm vị thuốc Hà thủ ô trắng", với mục ti

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • Dược • HÀ NỘI •

— OÌSO —

NGUYỄN THANH XUÂN

^^(ỈH1ÊK CỨU XÂY Dựìv« TIĨỈU CIIVẨIV KIỂM !V«lfIỆ»l VỊ 1'HUỐ€ • • •

L Ờ 3 c á m Ơ R

Trong quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị trong các bộ môn của trường Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm cm

TS Nguyễn Viết Thân

Người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn trân trọng tới gia đình, thầy cô và bè bạn, những người luôn ở bên cạnh động viên, tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2007.

1.2.2 Đặc điểm thực vật và phân loại thực vật chi Streptocaulon 5

2.1.2.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái bên ngoài, 10

2.1.2.5 Xác định vết Saponin trên sắc ký đồ bằng phương pháp 13

Gelatin huyết

2.1.2.6 Xác định độ ẩm của dược liệu bằng phương pháp sấy 14

ĐẶT VẤN ĐỂ

Dược điển Việt Nam là công cụ, cơ sở pháp lý cho việc kiểm nghiệm dược liệu, góp phần nâng cao hiệu quả việc sử dụng thuốc đông dược Hiện nay, Dược điển Việt Nam III có khoảng 310 chuyên luận dược liệu, so với số lượng dược liệu được sử dụng làm thuốc (khoảng 500 vị dược liệu thông dụng) thì con số này còn hạn chế

Hà thủ ô trắng là vị thuốc đã được nhân dân ta sử dụng từ lâu Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm dược liệu này lại gặp không ít khó khăn do chưa có chuyên luận trong Dược điển Để tạo điều kiện thuận lợi cho công tác kiểm nghiệm dược liệu này, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: " Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm vị thuốc Hà thủ ô trắng", với mục tiêu:

- Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm vị thuốc Hà thủ ô trắng cho DĐVNIV

- Hình ảnh hoá, lượng hoá các dữ liệu về vị thuốc trong quá trình kiểm nghiệm tạo điều kiện cho việc kiểm nghiệm dễ dàng và chính xác hơn,Nội dung khoá luận:

- Thành lập tiêu chuẩn về đặc điểm hình thái bên ngoài, đặc điểm hiển vi của vị thuốc (gồm đặc điểm vi phẫu và đặc điểm bột)

- Thành lập một số tiêu chuẩn hoá học của vị thuốc:

+ Sắc ký đồ của dịch chiết dược liệu trong một số điều kiện nhất định

+ Định tính nhóm chức chính trong dược liệu

- Thành lập một số tiêu chuẩn khác: Độ ẩm, tỷ lệ tro toàn phần và tạp chất có trong dược liệu

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Vị trí phân loại cây Hà thủ ô trắng.

Theo hệ thống phân loại Takhtajan 1987 : Hà thủ ô trắng thuộc loài

(juventas), chi (Streptocaulon), họ Thiên lý (Asclepiadaceae), bộ Long đởm {Gentianales), liên bộ Long đởm (Gentiananae), phân lớp Hoa môi (Lamiidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoỉiophyta),

Theo sách Thực vật dược, họ Thiên lý có các đặc điểm sau:

Cây thường là dây leo, cây thảo nhiều năm, cây bụi, ít khi là cây gỗ Toàn cây có nhựa mủ Lá đơn nguyên, thưcmg mọc đối, đôi khi mọc vòng

Không có lá kèm, Cụm hoa thưcmg là xim có khi là chùm hoặc trông như tán Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5: 5 lá đài dính nhau ở gốc thành ống ngắn, 5 cánh hoa dính lion thành hình ống, tiền khai hoa vặn, thường có phần phụ ở mặt trong và có tuyến mật, 5 nhị, bao phấn dính vói núm nhụy hình khối 5 mặt Hạt phấn dính liền tạo thành khối 4 hạt phấn (tetrad) hoặc thành khối phấn có chuôi và gót dính để dính vào sâu bọ, chúng sẽ đưa khối phấn này sang hoa

khác để thụ phấn cho hoa sau Bộ nhụy gồm 2 lá noãn, bầu trên, rời nhau ở

bầu và vòi, dính nhau ở núm nhụy, nhiều noãn Quả gồm 2 đại Hạt thường có mào lông ở một đầu [4]

I.2.I.2 Phân loại thực vật họ Thiên lý.

Theo sách Thực vật dược, họ Thiên lý có 240 chi, 2000 loài Phân bố chủ

yếu ở vùng nhiệt đối, cận nhiệt đói, một số ít ở ôn đới, ở Việt Nam có gần 50

chi, khoảng 110 loài

Theo Phạm Hoàng Hộ, họ Thiên lý gồm các chi:

ơ ii Gymnema

Chi Gymnanthera, Chi Gymnemopsis

Chi Sacolobus

Chi Sarcostemma

Chi Heterostemma Chi Secamone

Theo Thực vật chí Đông Dương , họ Thiên lý còn có thêm các chi;

1.2.2 Đặc điểm thực vât và phân loại thực vật chi Streptocaulon:

I.2.2.I Đặc điểm thực vật chi Streptocaulon:

Cỏ hay cây bụi leo Lá mọc đối Cụm hoa xim các chuỳ, tam phân, không cuống hay có cuống theo trật tự khác nhau, thường có lông mềm, ở nách

những lá mọc đối và ở ngọn; cuống hoa thường có lông nhung; nụ rất nhỏ, hoa

rất nhỏ Đài nhỏ chia 5, với 5 vẩy ở gốc phía trong, Tràng hình bánh xe; ống rất ngắn, thuỳ hình trái xoan, h d phủ sang bên phải Tràng phụ gồm có 5 sợi đính trên lưng của các chỉ nhị Nhị đính ở gốc của tràng, chỉ nhị ngắn, xen kẽ

với các tuyến nhỏ, bao phấn thuôn, dính ở đỉnh của vòi nhuỵ lõm ở giữa, phần phụ trung đới nhỏ, dính ở đỉnh của vòi Chuôi gồm những tuyến dính gắn gần đỉnh của vòi nhuỵ; khối phấn 2 trong mỗi ô, gồm những hạt lớn chứa mỗi cái 3-4 hạt phấn xếp thành hàng hay tứ tử Nhuỵ gồm 2 lá noãn, rời; vòi nhuỵ ngắn, đầu nhuỵ có 5 góc Quả gồm 2 quả đại, có lông mềm; hạt dẹp, mang một mào lông mềm; vỏ mỏng, phôi nhũ hẹp; lá mầm xoan thuôn [4].

I.2.2.2 Phân loại thực vật chi Streptocaulon:

Theo tài Chi Streptocaulon gồm 5 loài ở vùng Ấn độ- Mã Lai ở nước ta có 4

loài trong đó có vài loài thông dụng

Theo Thực vật chí Đông Dương, trên thế giới có thêm 2 loài:

s wallichii Wight: Bạc căn Wallich

s tomentosum Wight [19]

Bảng 1: Các loài thuộc chi Streptocaulon phân bố ở Việt Nam.

Hà Bắc, Quảng Ninh, Bắc Thái, Vĩnh Phú, Nghệ An

Vũng Tàu

1.2.3 Đặc điểm thực vật loài Streptocaulon juventas.

Theo Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Hà thủ ô trắng còn có tên gọi khác:

Củ vú bò, dây sữa bò, cây sữa bò, dây mốc, mã liên an, khâu nước, khâu cần cà (Tày), chừa ma sin (Thái), xạ ú pẹ (Dao), sân rạ, zờ nạ (K’Ho), pắt (K’Dong), có đặc điểm thực vật là:

Dây leo, bằng thân quấn, dài hàng mét Thân màu nâu đỏ sẫm hoặc nâu nhạt, có nhiều lông, dày hơn ở ngọn non, ít phân nhánh Lá mọc đối, hình trứng ngược, gốc tròn hoặc hơi hình nón cụt, đầu nhọn, dài 8-14 cm, rộng 4-9

cm, mặt trên xanh sẫm ít lông, mặt dưới trắng nhạt phủ lông rất mịn; cuống lá ngắn, có nhiều lông Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành xim phân đôi; hoa nhỏ màu vàng nâu; đài có 5 răng thuôn, có lông; tràng hình chuông gồm 5 cánh hình mác dài gấp 3 lần lá đài; nhị dính liền thành khối Quả là 2 đại, toả ra như

sừng bò, mỗi đại dài 7-9 cm, rộng 5-6 cm, thuôn nhọn ở đầu, khi chín màu

vàng nâu, có nhiều lông; hạt nhỏ, dẹt, có chùm lông trắng mịn.Toàn cây có nhựa mủ.[18]

1.3 Thành phần hoá học của rễ Hà thủ ô trắng.

Theo một số tài liệu, rễ Hà thủ ô trắng có nhiều tinh bột và alcaloid [14] [15] [18]

Theo bài viết của một số tác giả thuộc Viện y học tự nhiên Trường đại học

y dược Toyama và trường đại học y dược Thành phố Hồ Chí Minh cho rằng dịch chiết trong Methanol của rễ cây Hà thủ ô trắng chứa 16 Cardenolid bao gồm 5 loại mới: Acovenosigenin A 3-O-ß- digitoxipyranosid (1), digitoxigenin gentiobioside (2), digitoxigenin 3-0-[0-ß-glucopyranosyl- (l->6)-0-ß-glucopyranosyl-(l->4)-3-0-acetyl-ß-digitoxopyranosid] (3), digitoxigenin 3-0-[0-ß- glucopyranosyl-( 1 ^6)-0-ß-glucopyranosyl-( 1 ->4)-0-ß-digitalopyranosyl-(1^4)- ß-cymaropyranoside] (4), và periplogenin 3-0- (4-0-ß-glucopyranosyl-ß-digitalopyranoside) (5), và 2 hemiterpenoid mới, (4R)-4-hydroxy-3-isopropylpentyl ß-rutinoside (6) và (R)-2- ethyl- 3-

methylbuthyl ß-mtinoside (7) cùng với 2 loại phenylpropanoid đã biết và 1 loại phenylethanoid.[20]

Digitoxigenin gentiobiosid (2)

1.4 Phân bố, sinh thái.

Theo tài liệu Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam:

Hiện đã biết khoảng 10 loài thuộc chi Streptocaulon Wight.et Am.ở vùng

nhiệt đói châu Á, trong đó ở Việt Nam có 4 loài Loài Hà thủ ô trắng phân bố

chủ yếu ở 3 nước Việt Nam, Lào, Campuchia và một số vùng phía nam Trung Quốc

ở Việt Nam, Hà thủ ô trắng phân bố rải rác khắp các tỉnh vùng núi, trung du

và đôi khi cả ở đồng bằng Cây thường mọc lẫn vói các loại cỏ hoặc cây bụi thấp ở các đồi cây bụi, đất sau nương rẫy hoặc ven rừng, ở vùng đồng bằng và ven biển, cây thường mọc nơi đất cao hoặc trong các vườn cây ăn quả Hà thủ

ô trắng thuộc loại cây ưa sáng, chịu hạn cao và có thể sống được trên nhiều loại đất, kể cả đất khô cằn, trơ sỏi đá về mùa đông và mùa khô ( ở phía

Nam), cây có hiện tượng rụng lá; phần rễ củ nằm sâu dưới mặt đất có sức sống khoẻ, tồn tại qua các đợt cháy rừng và chặt phá thường xuyẽn Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt Hạt có túm lông, phát tán nhờ gió,[18]

1.5 Bộ phận dùng.

Rễ thu hái vào mùa thu, rửa sạch, cắt bỏ rễ con, phơi hay sấy khô

Rễ giống củ sắn, mặt ngoài màu trắng ngà

1.6 Tác dụng và công dụng.

1.6.1 Tác dụng dược lý.

Theo tài liệu Cây thuốc và động vật làm thuốc, Hà thủ ô trắng có tác dụng nâng cao tỷ lệ sống hoặc kéo dài thời gian cầm cự đốỊ với động vật đã tiêm liều độc nọc rắn hổ mang và tác dụng ức chế sự co thắt cơ trơn ruột cô lập gây bỏfi Histamin và Acetylcolin

Hà thủ ô trắng có độc tính thấp, có tác dụng kích thích nhẹ sự co bóp cơ trơn, làm co mạch ngoại vi, kích thích hô hấp, nhưng không làm thay đổi huyết áp, kích thích nhẹ nhu động ruột và lợi tiểu, kích thích tiêu hoá làm ăn được nhiều, tăng cân, tăng sức lực, hạ thân nhiệt, tiêu viêm và an thần nhẹ.Các thử nghiệm dược lý với Hà thủ ô trắng có tiếp xúc và không tiếp xúc vói kim loại( sắt) không cho thấy có sự khác biệt về tác dụng giữa hai loại này Các thử nghiệm dược lý bào chế theo phương pháp cổ truyền dùng vồ đập rồi ngâm nước vo gạo, đồ với đậu đen (cửu chưng, cửu sái) cho thấy tuy hoạt chất đắng giảm nhưng các tác dụng dược lý không thay đổi

Dây và lá Hà thủ ô trắng phối hợp với lá Bồ cu vẽ đã được áp dụng cho 86 bệnh nhân bị viêm hắc võng mạc ( màng mạch- võng mạc) trung tâm thanh

dịch và thấy có tác dụng làm tăng thị lực trên 87% số bệnh nhân, ở bệnh nhân thị lực tăng từ 6/10 trở lên hết ám điểm, ở bệnh nhân thị lực tăng dưới 5/10,

một số hết ám điểm, một số giảm [18]

1.6.2 Công dụng.

Theo Từ điển thực vật thông dụng:

Rễ Hà thủ ô trắng có tác dụng thanh nhiệt giải độc, chữa cảm sốt, viêm ruột, ỉa chảy, viêm thận mãn tính, đau vùng tâm vị, bị thương sưng đau, làm

thuốc lợi sữa Hà thủ ô trắng còn dùng chữa thiếu máu, thận gan yếu, thần kinh suy nhược, ăn ngủ kém, đau nhức gân xương, kinh nguyệt không đều, bạch đới, râu tóc bạc sớm, bệnh ngoài da mẩn ngứa Ngày 12-20g dạng thuốc sắc cao hoặc rượu thuốc.

Lá Hà thủ ô trắng sắc uống chứa đái rắt, đái buốt Rễ hoặc lá Hà thủ ô trắng, nhai nuốt nước, bã đắp chữa rắn cắn Còn dùng lá và cành đun nước tắm

và rửa để chữa lở ngứa Có thể phối hợp với lá Ngải cứu Không dùng Hà thủ ô trắng đối vói người hư yếu, tạng lạnh, đồng thời kiêng ăn tiết lợn, cá lưofn, rau cải, hành tỏi [6]

PHẦN 2 : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.

2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu.

2.1.1 Nguyên liệu.

Mẫu nghiên cứu được thu hái trực tiếp tại Hoà Bình, đã được xác định là

loài Streptocaulon juventas, họ Thiên lý- Asclepiadaceae.

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu.

2.1.2.1 Xử lý và bảo quản mẫu.

Mẫu dược liệu nghiên cứu là dược liệu tươi và dược liệu đã qua chế biến phoi khô, sau khi thu về được xử lý, bảo quản theo phương pháp chung, cụ thể:

- Mẫu dược liệu cắt vi phẫu dùng mẫu tươi bảo quản trong hỗn hợp Cồn- Nước( 1:1)

- Mẫu dược liệu dùng soi bột được thái nhỏ, sấy khô, nghiền thành bột, bảo quản trong lọ có nút kín, ghi nhãn, để n d khô ráo

- Mẫu dược liệu dùng để chạy sắc ký được thái nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ < 60-

°c, bảo quản noi khô ráo

2.1.2.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái bên ngoài.

- Mô tả đặc điểm cây dược liệu

Cây dược liệu được chụp ảnh, mô tả đặc điểm tại noi thu hái trực tiếp

- Mô tả đặc điểm dược liệu

Các mẫu nghiên cứu được chụp ảnh, mô tả tỉ mỉ về hình dạng, kích

thước, màu sắc, thể chất, mùi vị

2.1.2.3 Nghiên cứu đặc điểm vi học.

- Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu của dược liệu

Tiến hành làm tiêu bản vi phẫu cố định theo các bước sau:

Cắt vi phẫu :Dược liệu tươi hay khô đã ngâm mềm được cắt ngang bằng lưỡi dao cạo hoặc dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, chọn các lát cắt mỏng

Tẳy : Ngâm các lát cắt trong dung dịch Cloramin hoặc nước Javen, thời gian ngâm tuỳ từng mẫu cụ thể, có thể rút ngắn thời gian bằng cách đun nóng Rửa bằng nước cộ Rửa bằng dung dịch Axit axetic 5% cộRửa lại bằng nước cho hết Axit axetic.

Nhuộm : Theo phương pháp nhuộm kép với đỏ son phèn và xanh Metylen Nhuộm đỏ son phèn,^ Rửa bằng nước Nhuộm xanh Metylen [-«>Rửa bằng nước.Thòi gian nhuộm tuỳ thuộc vào tính chất bắt màu của từng mẫu cụ thể

Cố định : Vi phẫu sau khi nhuộm được khử nước từ từ bằng cồn với độ cồn tăng dần (10°, 20°, 90®,sau cùng là cồn tuyệt đối) Lắc vi phẫu 3 lần trong Xilen Đặt vi phẫu vào một giọt bôm Canada trên phiến kính,đậy lá kính Để

tiêu bản ở chỗ thoáng 2-3 tuần cho ổn định.

Tiêu bản vi phẫu cố định được quan sát mô tả đặc điểm và chụp ảnh dưới kính hiển vi

- Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu

Xác định màu sắc, mùi, vị bột dược liệu bằng cảm quan

Sử dụng các dung dịch khác nhau để lên bàn kínhinước, cloral hydrat,

glycerin Quan sát dưới kính hiển vi, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm bột dược liệu

(Các ảnh cây , ảnh dược liệu, ảnh vi phẫu, ảnh đặc điểm bột sau khi chụp được lưu trong máy vi tính dưới dạng các file ảnh, được sắp xếp trong máy vi tính

sắc ký đồ dịch chiết trong các điều kiện khác nhau đặc trưng cho các mẫu phân tích là cơ sở để kiểm nghiệm dược liệu theo phương pháp “dấu vân tay” (Finger-pint).

- Các bước tiến hành :

+ Chuẩn bị dịch chấm sắc ký :

Lấy 20g dược liệu cho vào bình gạn dưốd có lót bông

Ngâm 24h trong khoảng lOOml ethanol 75®

Tháo lấy dịch chiết đun sôi cách thuỷ đến còn khoảng 20m l Thêm vào dịch chiết lOml dung dịch HCl 10%

Đưa dịch chiết vào bình trứng có lắp sinh hàn khí trong 24h

Bỏ sinh hàn cho dịch chiết vào bình gạn lắc với lOml Clroform lấy lớp dưới

Cô cách thuỷ dịch vừa thu được đến còn 1-2 ml Lấy dịch đó để chấm sắc ký

- Chất hấp thụ : Bản mỏng tráng sẵn Silicagen GF254 chuẩn của hãng

MERCK.Bản mỏng được hoạt hoá ở 110°c trong Igiờ, cắt thành các bản 20xl0(cm^)

- Chấm sắc ký : Sử dụng máy chấm sắc ký CAMAG-Linomat 5.0 vói phần mềm điều khiển WINCATS.Cu thể :

Kẹp bản mỏng vao đúng vị trí trên máy chấm Linomat 5.0

Lấy vào xilanh chuẩn một thể tích mẫu chấm thích hợp và đặt lên máy

Điều khiển quá trình chấm bằng máy vi tính ; Dữ liệu cho mỗi lần chấm được khai báo và lưu trong một file Đánh dấu các lựa chọn và nhập các thông

số cần thiết: chế độ vết (sử dụng dạng vết dài 0.6 cm), vị trí vết (có thể chấm một vết hoặc nhiều vết trong một lần chấm), chế độ thổi khí (dùng không khí nén) thể tích mẫu chấm (có thể điều khiển các thể tích khác nhau của các vết trong một lần chấm để khảo sát) Sau khi nhập dữ liệu, quá trình chấm vết

được tự động tiến hành, xylanh di chuyển đều theo chiều ngang vết để phun mẫu, đồng thòi có sự thổi khí nén làm khô vết chấm.

- Triển khai sắc ký: Hệ dung môi: Cloroíorm: Ethyl acetat [9:1]

Quá trình triển khai được tiến hành trong bình sắc ký tiêu chuẩn, đặt trên mặt phẳng, tránh chấn động, dung môi bão hoà tốt Đặt bản sắc ký vào bình đúng

kỹ thuật, trong quá trình chạy, dung môi phải lên đều (vết dung môi phẳng) Sau khi triển khai, bản mỏng được lấy ra khỏi bình, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi

Quan sát và chụp ảnh: Quan sát và chụp ảnh trong buồng quan sát của hệ

thống CAMAG Reprosta 3 với sự hỗ trợ của phần mềm WINCATS ở ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, 366 nm và ở ánh sáng trắng sau khi phun

thuốc thử hiện màu

(Thuốc thử hiện màu: H2SO4 đặc, sấy ngay bản mỏng đã phun ồ 250°c trong

+ Để nguội đến nhiệt độ 40°c, cho máu dê (đã chống đông bằng Natri Citrat) vào dịch gelatin ta được dung dịch gelatin huyết

+ Tráng dung dịch trên lên phiến kính (kích thước 3x1 Ocm) ta được bản mỏng Gelatin-huyết

+ Để bản mỏng Gelatin-huyết khô nhẹ trên bề mặt

+ Áp bản mỏng sắc ký lên bản mỏng Gelatin-huyết sao cho hai bề mặt tiếp xúc đều tránh để có bọt khí.

+ Quan sát vết phá huyết

2.1.2.6 Xác định độ ẩm của dược liệu bằng phương pháp sấy,

- Định nghĩa: Độ ẩm là lượng nước chứa trong lOOg dược liệu

- Tiến hành:

+ Dược liệu được chia nhỏ đường kính không quá 3mm

+ Cho vào chén cân dùng để xác định độ ẩm, có nắp và đã được cân

bì trước 5-lOg dược liệu

+ ƠIO chén chứa dược liệu (đã mở nắp) vào tủ sấy, sấy ờ nhiệt độ

P: Số gam của mẫu thử trước khi sấy

A: Số gam của mẫu thử sau khi sấy

2.1.2.7 Xác định tro toàn phần trong dược liệu.

- Cách xác định:

+ ƠIO khoảng 2-3 g bột dược liệu đem thử vào một chén sứ đã nung và cân

bì Nung ở nhiệt độ 450°c tới khi không còn Cacbon, làm nguội rồi cân.+ Nếu tro chưa loại được hết Cacbon thì dùng một ít nước nóng cho vào khối chất đã than hoá, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều, lọc qua giấy lọc không tro

+ Rửa đũa thuỷ tinh và giấy lọc, tập trung nước rửa vào dịch lọc