+ Nguyên liệu.
- Các vị thuốc trong bài thuốc Testin II: được mua tai chợ Ninh Hiệp Hà Nội về sơ chế, kiểm tra đạt tiêu chuẩn DĐVN IV mới đưa vào bào chế thành thuốc phiến để điều chế cao đặc; riêng vị thuốc Bá bệnh chưa có trong DĐVN IV chúng tôi đã lấy mẫu cây và nhờ Viện tài nguyên sinh thái Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam xác định tên cây và lấy rễ sơ chế thành thuốc phiến để nghiên cứu và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở dược liệu.
- Cao đặc: Đã được điều chế theo quy trình ổn định, dùng cao này để nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn
+Các hóa chất, dung môi. Các hóa chất, dung môi sử dụng trong thí nghiệm được mua tại thị trường Hà Nội, nguồn gốc được tóm tắt ở bảng 2.1
Bảng 2.1 : Hóa chất, dung môi
STT Tên hóa chất dung môi Xuất xứ
1 Acid formic Trung Quốc
2 Cloroform Trung Quốc
3 Ethanol 96% Việt Nam
4 Ether dầu hỏa Trung Quốc
5 Ethyl aceta Trung Quốc
6 n-Hexan Trung Quốc
7 Methanol Trung Quốc
8 Toluen Trung Quốc
9 Bản mỏng Silicagen GF 254 (Merk) Đức
+ Một số trang thiết bị:
Bảng2.2 : Trang thiết bị sử dụng
STT Tên thiết bị Xuất xứ
1 Bếp đun cách thủy Bath HH-S4 Trung Quốc
2 Bếp hồng ngoại Sanaky AT-2521 HGN Trung Quốc
3 Tủ sấy Memmerk, shellab Đức
4 Cân kĩ thuật Precisa- XB320C Thụy Sĩ
5 Cân phân tích Sartorius Thụy sĩ
6 Cân sấy ẩm Đức
7 Máy ly tâm Đài Loan
8 Đèn tử ngoại Viber Lourmat Pháp
Và các dụng cụ, thiết bị khác được làm nhờ ở Bộ môn Vi sinh -Sinh học 2.2. Nội dung nghiên cứu
a. Điều chế cao:
- Sơ chế, bào chế các vị thuốc thành thuốc phiến phơi hay sấy khô - Xác định độ ẩm của các vị thuốc
- Tiến hành chiết dịch chiết bài thuốc, để lắng, lọc
- Tiến hành cô chân không và cô cách thủy để được cao đặc - Xác định độ ẩm của cao đặc
- Điều chế 5 mẻ để tính hiệu suất trung bình b. Xây dựng tiêu chuẩn cao đặc
- Khảo sát các tiêu chuẩn hóa lí
- Định tính trong ống nghiệm các nhóm chất hữu cơ
- Định tính bằng sắc kí lớp mỏng các vị thuốc trong cao đặc - Kiểm tra độ nhiễm khuẩn
-Định lượng flavonoid toàn phần
c. Sơ bộ dự kiến tiêu chuần cao đặc 2.3. Phương pháp nghiên cứu a. Điều chế cao đặc
Qua thăm dò tác dụng dược lí của cao chiết bằng nước, chiết bằng ethanol 40%, ethanol 70%, thấy rằng cao điều chế từ ethanol 40% và 70% có tác dụng rõ rệt , cho nên trong đề tài này chọn cao đặc chiết với ethanol 40% để tiến hành nghiên cứu vì kinh tế hơn dùng các dung môi khác để chiết
+ Điều chế dịch chiết ethanol bằng phương pháp chiết hồi lưu với dung môi là ethanol 40%.
+ Cô dịch chiết thành cao đặc bằng phương pháp cô cách thủy.
+ Xác định độ ẩm của cao đặc và các vị dược liệu bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô theo Phụ lục 9.6- DĐVN IV.
Tính được hiệu suất điều chế cao đặc theo khối lượng khô tuyệt đối.
b. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao - Xác định độ ẩm:
Tiến hành theo phương pháp mất khối lượng do làm khô theo Phụ lục 9.6 – DĐVN IV.
- Xác định chất chiết được bằng nước: Theo phương pháp chiết nóng lạnh theo phụ lục 12.10 DĐVN IV.
- Xác định pH cao: Đo pH dung dịch 1% (kl/tt) cao đặc bằng máy đo pH. Thử theo Phụ lục 6.2 – DĐVN IV.
- Định tính các nhóm chất hữu cơ:
Căn cứ vào các nhóm chất có trong các vị thuốc của bài thuốc để định hướng định tính. Tiến hành các phản ứng định tính với các thuốc thử chung và thuốc thử đặc hiệu của từng nhóm chất theo phương pháp thường quy được ghi trong tài liệu hóa thực vật [4].
- Định tính các vị thuốc trong cao đặc bằng SKLM:
Chiết riêng từng vị thuốc với lượng tương ứng có trong 1 g cao đặc của bài thuốc với cùng một quy trình chiết, chấm cùng một lượng trên bản mỏng, khảo sát
trên nhiều hệ dung môi để chọn hệ thích hợp tách được các vết, có thể nhận biết được sự có mặt của vị thuốc trong cao [5], [16].
Sau khi khai triển sắc ký, hiện màu trên đèn tử ngoại, ghi lại hình ảnh sắc ký đồ.
- Định lượng flavonoid toàn phần: Định lượng theo phương pháp cân.
- Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn: Theo phương pháp đĩa thạch, tiến hành theo DĐVN IV phụ lục 13.6 – DĐVN IV.
c. Dự kiến tiêu chuẩn cao đặc
Dựa vào kết quả nghiên cứu và căn cứ vào quy trình xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao thuốc để dự kiến tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao thuốc.