Phần 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc
3.2.2. Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao đặc
Chiết xuất: Hòa tan 2g cao đặc vào 10ml nước cất, đun nóng nhẹ cho tan, lọc ( gấp nếp). Lắc với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần với 10ml để loại tạp. Lấy lớp nước, đem lắc với ethyl acetat 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp dịch chiết ethyl acetat, bốc hơi dung
môi đến cắn, hòa tan cắn vào 10ml ethanol 90% được dịch chiết để làm phản ứng định tính.
Định tính:
a. Phản ứng với dung dịch kiềm loãng:
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 3 giọt NaOH 10%, lắc kỹ.Phản ứng dương tính khi màu vàng của dung dịch tăng lên rõ rệt.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu da cam (phản ứng dương tính).
b. Phản ứng với hơi NH3:
Tiến hành: Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên 2 vị trí khác nhau của giấy lọc, để khô, 1 vết che kín, 1 vết hơ trên miệng lọ chứa NH3 đặc. Phản ứng dương tính khi vết được hơ có màu vàng tăng lên.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: vết được hơ có màu vàng tăng lên (phản ứng dương tính).
c. Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%:
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt FeCl3 5%. Lắc đều.
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh đen.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang xanh đen (phản ứng dương tính).
d. Phản ứng Cyanidin:
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1 ít bột magie, nhỏ từ từ 3 giọt HCl đặc, đun nóng cách thủy. Phản ứng dương tính nếu có màu từ vàng, đỏ.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ (phản ứng dương tính).
e. Phản ứng diazo hóa:
Tiến hành: Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2ml dung dịch Na2CO3, thêm 3 giọt TT diazoni, lắc đều, đun nóng cách thủy trong vài phút. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hồng, đỏ, đỏ cam.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng → màu cam (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Qua các phản ứng trên sơ bộ nhận định cao đặc chiết ethanol 40% có flavonoid.
3.2.2.2. Định tính saponin
Chiết xuất: Hòa tan 2g cao đặc vào 10ml nước, đun nóng nhẹ cho tan hết. Để nguội, lắc với ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml để loại tạp, lấy lớp nước, đun nóng để đuổi hết ether dầu hỏa. Chiết với n – butanol 3 lần, mỗi lần 10ml. Gộp các dịch chiết n – butanol lại, bốc hơi dung môi đến cắn, hòa tan cắn vào 10ml ethanol 90% được dịch chiết để làm phản ứng định tính.
Định tính:
a. Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Tiến hành: Lấy 1g cao đặc, thêm 10ml nước cất, đun cách thủy cho tan hết, để nguội, lắc mạnh theo chiều dọc ống trong vòng 5 phút. Phản ứng dương tính nếu cột bọt bền sau 15 phút.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: sau 15 phút cột bọt vẫn bền vững (phản ứng dương tính).
b. Phản ứng Liebermann – Burchardt:
Tiến hành: Lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, bốc hơi đến cắn, hòa tan cắn trong 1ml anhydride acetic, thêm 1 giọt H2SO4 đặc. Phản ứng dương tính khi: cho màu xanh lá (dẫn chất steroid), màu đỏ (dẫn chất triterpenoid).
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ sẫm (phản ứng dương tính).
c. Phản ứng Salkowski:
Tiến hành: Lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, bốc hơi tới cắn. Hòa tan cắn bằng 1ml Cloroform, thêm 1 giọt H2SO4 đặc. Phản ứng dương tính nếu có màu vàng chuyển sang đỏ sẫm hay xanh, xanh tím.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch chuyển từ màu vàng sang đỏ sẫm (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Qua các phản ứng trên sơ bộ nhận định cao đặc chiết ethanol 40% có saponin.
3.2.2.3. Định tính alcaloid:
Chiết xuất: Lấy 2g cao đặc hòa tan với 10ml nước, đun nóng nhẹ cho tan hết, lọc.
Thêm ammoniac đến pH = 8 – 9. Lắc tiếp với Cloroform 3 lần, mỗi lần 15ml thu được dịch chiết Cloroform. Cô cách thủy đến cắn. Hòa tan cắn trong 10ml H2SO4
1N được dịch chiết để làm phản ứng định tính.
Định tính: Lấy 3 ống nghiệm:
Ống 1: 2ml dịch chiết + 3 giọt TT Mayer.
Ống 2: 2ml dịch chiết + 3 giọt TT Dragendorff.
Ống 3: 2ml dịch chiết + 3 giọt TT Bouchardat.
Phản ứng dương tính nếu: ống 1 xuất hiên kết tủa trắng hoặc vàng, ống 2 xuất hiện tủa đỏ cam, ống 3 xuất hiện tủa nâu.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: sau 1 thời gian cả 3 ống không xuất hiện kết tủa (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định cao đặc chiết ethanol 40% không có alcaloid.
3.2.2.4. Định tính coumarin:
Chiết xuất: Lấy 2g cao đặc cho vào cốc có mỏ, pha loãng bằng 50ml nước cất.
Đun trên bếp cách thủy cho tan hết, để lắng, lọc. Dịch lọc đem lắc với ether dầu
hỏa để loại tạp, lắc 3 lần, mỗi lần 15ml. Gộp các dịch chiết nước, bốc hơi dung môi, cắn thu được hòa tan trong 10ml ethanol (TT) để làm phản ứng định tính.
Định tính:
a. Phản ứng đóng mở vòng lacton:
Tiến hành: - Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch chiết:
Ống 1: Thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%.
Ống 2: Để yên.
Đun cả 2 ống nghiệm đến sôi, để nguội, quan sát. Phản ứng dương tính nếu: ống 1 có tủa đục màu vàng, ống 2 không thay đổi.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml nước cất. Lắc đều, quan sát. Phản ứng dương tính nếu: ống 1 trong suốt, ống 2 có tủa đục.
Thêm vào ống 1 vài giọt HCl đặc. Phản ứng dương tính nếu ống 1 đục trở lại giống ống 2.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: phản ứng âm tính.
b. Quan sát huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại khi tác dụng với dung dịch kiềm:
Tiến hành: Nhỏ 3 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, nhỏ tiếp 3 giọt dung dịch NaOH 10%, sấy nhẹ cho đến khô. Che 1 nửa diện tích bằng 1 bản nhỏ kim loại, soi đèn tử ngoại trong vài phút, bỏ bản kim loại ra. Phản ứng dương tính nếu phần không bị che sáng hơn phần bị che và nếu tiếp tục chiếu sáng thấy phần bị che sáng dần lên bằng phần không bị che.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: phản ứng âm tính.
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định cao đặc chiết ethanol 40% không có coumarin.
3.2.2.5. Định tính tanin:
Tiến hành:
- Lấy khoảng 1g cao, cho thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút. Để nguội, lọc.
Dịch lọc được dùng để định tính.
- Lấy 2ml dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm khác nhau để làm phản ứng:
Ống 1: Thêm tiếp vài giọt dung dịch Gelatin 1%.
Ống 2: Thêm tiếp vài giọt dung dịch FeCl3 5%.
Ống 3: Thêm tiếp vài giọt dung dịch Chì acetat 10%.
Phản ứng dương tính nếu ống 1 xuất hiện tủa bông trắng, ống 2 xuất hiện màu hoặc tủa xanh đen, ống 3 xuất hiện tủa bông trắng.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: ống 1 xuất hiện tủa bông trắng, ống 2 xuất hiện màu xanh đen, ống 3 xuất hiện tủa bông trắng ngay (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định cao đặc chiết ethanol 40% có tanin.
3.2.2.6. Định tính anthranoid:
Tiến hành:
- Lấy 1g cao đặc, hòa tan vào 20 ml nước, đun nóng cho tan, lọc, thêm 10ml Cloroform, lắc nhẹ, loại bỏ lớp nước, lấy lớp chloroform làm phản ứng.
- Lấy 2ml dịch chloroform, thêm 2 ml amoniac vào ống nghiệm, lắc nhẹ cho phân lớp, quan sát, sau đó cho thêm 2 giọt NaOH 10%, quan sát. Phản ứng dương tính nếu lớp amoniac có màu đỏ tăng lên khi cho NaOH 10%.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: lớp amoniac trong suốt, có màu vàng khi cho NaOH 10% (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 40% có anthranoid.
3.2.2.7. Định tính polysaccharid, định tính đường khử:
Chiết xuất: Hòa tan 2g cao đặc trong 20 ml nước nóng, để nguội, lọc. Dịch lọc được dùng để định tính.
a. Định tính polysaccharid:
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 4 ml dịch lọc và 4 giọt TT Lugol, lắc đều. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu xanh đen.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: xuất hiện màu xanh đen (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 40% có polysaccharid.
b. Định tính đường khử:
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc và 1ml TT Fehling A, 1ml TT Fehling B, lắc đều, đun nóng cách thủy. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa đỏ gạch.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: dung dịch có màu cam, xuất hiện kết tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 40% có đường khử.
3.2.2.8. Định tính acid hữu cơ:
Tiến hành: Lấy 0,5g cao đặc, thêm 10 ml nước, đun nóng cho tan, lọc. Thêm 1 ít bột Na2CO3, lắc nhẹ. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện bọt khí.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: không xuất hiện bọt khí (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 40%
không có acid hữu cơ.
3.2.2.9. Định tính acid amin:
Chiết xuất: Hòa tan 2g cao đặc trong 10 ml nước cất, lắc với ether dầu hỏa để loại tạp, thêm đồng lượng aceton lắc đều, để tủ lạnh 3 giờ, lọc lấy dịch lọc, loại màu bằng than hoạt, cô dịch lọc còn 5 ml để làm phản ứng định tính.
Định tính: Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 3 giọt TT Ninhydrin, đun cách thủy 2 – 3 phút. Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu tím.
Kết quả:
- Cao đặc chiết ethanol 40%: xuất hiện màu tím (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Qua phản ứng trên sơ bộ nhận định trong cao đặc chiết ethanol 40% có acid amin.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cao đặc chiết ethanol 40% được tóm tắt ở bảng 3.8
Bảng 3.8. Tóm tắt kết quả định tính một số nhóm chất của cao đặc bài thuốc TT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận
1 Flavonoid
Phản ứng với kiềm loãng ++
Có
Phản ứng với hơi NH3 ++
Phản ứng với FeCl3 5% ++
Phản ứng Cyanidin +++
Phản ứng diazo hóa +
2 Saponin
Hiện tượng tạo bọt +++
Có Phản ứng Liebermann-Burchardt ++
Phản ứng Salkowski +++
3 Alcaloid
Phản ứng với TT Mayer -
Không Phản ứng với TT Dragendorff -
Phản ứng với TT Bouchardat - 4 Coumarin Phản ứng mở vòng lacton -
không Phản ứng quan sát huỳnh quang -
5 Tanin
Phản ứng với Gelatin 1% + Phản ứng với FeCl3 5% +++ Có Phản ứng với chì acetat +++
6 Anthranoid Phản ứng với NaOH + Có
7 Polysaccharid Phản ứng với TT Lugol + Có
8 Đường khử Phản ứng với TT Fehling +++ Có
9 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Không
10 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin +++ Có
Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính (+): Phản ứng dương tính (++): Phản ứng dương tính rõ (+++): Phản ứng dương tính rất rõ
Kết luận: Cao đặc chiết ethanol 40% có chứa các nhóm chất: flavonoid, saponin, tanin, anthranoid, polysaccharid, đường khử, acid amin, không có alcaloid, coumarin, acid hữu cơ.
Các nhóm chất này đều có mặt trong các vị thuốc của bài thuốc tương ứng:
- Flavonoid: Bạch tật lê, Dâm dương hoắc, Bá bệnh
- Saponin: Bạch tật lê, Bá bệnhHoàng kỳ.
- Tanin: Bạch tật lê, Ba kích - Anthranoid: Ba kích
- Polysaccharid: Hoàng kỳ, Đương quy, Câu kỉ tử, Dâm dương hoắc - Đường khử: Hoàng kỳ, Đương quy, Ba kích, Câu kỉ tử
- Acid amin: Hoàng kỳ, Đương quy, Câu kỉ tử