NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THựC VẬT, THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG VI SINH VẬT RĂNG MIỆNG CỦA CÂY NÚT ÁO Vũ Lẽ Thu HDKH: TS Hoàng Quỳnh Hoa, ThS Vũ Vân Anh Trường Đại học Dược Hà Nội Từ khóa: đặc điểm thực vật, Nút áo, Spilanthes oleraceae, Spilanthes acmela, Spilaníhes grandiflora, Streptococcus mutans, thành phần hóa học, tác dụng sinh học Tóm tắt Ba mẫu Nút áo thu hái huyện Yên Định, tỉnh Thanh Hóa phân tích đặc điểm hình thái so sánh với khoá phân loại, từ giám định tên khoa học mẫu Spilanthes oleraceae L., Spilanthes acmela L.Murr., Spilanthes grandiflora Turcz Dịch chiết cồn 9(f phận mặt đất bao gồm lả, thân cụm hoa loài Spỉlanthes oleraceae L., Spilanthes acmela L.Murr thử tác dụng ức chế vi khuẩn Streptococcus mutans cho kết dịch chiết hoa loài Spilanthes oleraceae L có khả ức chế vi khuẩn mạnh (71,16 Vo) Thực nghiên cứu thành phần hỏa học cụm hoa loài có hoạt tỉnh sinh học mạnh Xác định thành phân hóa học chất cỏ tinh dầu phương pháp sắc kí khí khối phổ liên hợp, kết thành phần lớn tinh dầu Limonene (30,71%) Chiết xuất phân lập chất từ dịch chiết cồn 9CP cụm hoa, qua trình chiết phân đoạn chạy cột sắc kí phân lập chất ß-sitosterol Đặt vấn đề Nút áo tên gọi chung số loài thuộc chi Spiỉanthes họ Cúc Cây Nút áo từ lâu thầy lang, nhà khoa học, thực vật học nghiên cứu nhiều cho thấy tác dụng hiệu điều trị nhiều bệnh như: đau răng, viêm miệng, đau họng, bại lưỡi, sốt rét, viêm phế quản, hen suyễn, bệnh da, phong thấp, đau xương, bệnh scorbut Tuy nhiên, công dụng phổ biến Nút áo chữa đau nhức răng, sâu [5], Với nhiều tác dụng vậy, Nút áo xem dược liệu đáng để khai thác, đặc biệt hưcmg đến việc điều trị bệnh liên quan tới nhiễm khuẩn miệng Tuy nhiên, thực vật, ữong số lượng loài ứong chi Spilanthes lớn phân bố rộng khắp nước chưa có nghiên cứu thực việc so sánh đặc điểm hình thái loài để tránh nhầm lẫn giám định tên khoa học loài Việt Nam, đề tài nghiên cứu hóa học, thực vật hoạt tính sinh học Nút áo hạn chế Chính vậy, tiến hành đề tài ‘‘Nghiên cứu đặc điểm thực vật tác dụng chổng vi sinh vật miệng Nút áo ” nhằm góp phần giúp cho việc khai thác sử dụng nguồn dược liệu có hiệu Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Nguyên liệu Mau tươi Nút áo gồm toàn mang hoa thu hái huyện Yên Định, tỉnh Thanh Hóa tò tháng năm 2011 đến tháng năni 2013 (ký hiệu V, L, T) dùng để nghiên cửu đặc điểm tìiực vật Tiêu mẫu khô lưu giữ Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật với mã số tiêu HNIP/17857/13, HNIP/17858/13, HNIP/17859/13 Mau tươi gồm phận txên mặt đất (thân, lá, hoa) loài V L dùng để làm nguyên liệu thử hoạt tính sinh học Cụm hoa loài V tươi phơi cho se sấy khô 60°c, bảo quản túi nilon kín, để chỗ mát làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực vật: mô tả, phân tích so sánh hình thái Thử hoạt tính sinh học: Khuếch tán đường ngang đĩa thạch đục lỗ Nghiên cứu thành phần hóa học: cất tinh dầu phương pháp cất kéo nước; định tính định lượng thành phần tinh dầu phưoTig pháp sắc kí khí khối phổ liên hợp; chiết xuất thành phần mẫu phương pháp ngâm lạnh với cồn 90°; định tính thành phần dịch chiết phản ứng hóa học sắc kí lớp mỏng (SKLM), phân lập thành phần từ dịch chiết phân đoạn phương pháp sắc kí cột Kết Nghiên cứu đặc điểm thực vật Tiến hành mô tả, phân tích so sánh điểm hình thái mẫu nhận thấy chúng dạng cỏ, có khác biệt hình dạng kích thước thân, hoa Mau L: Cây cỏ, sống hàng năm, cao khoảng 30-60 cm, mọc đÚTig, có Ichi mọc bò lan mặt đất, phân thành nhiều cành Lá mọc đối, phiến xoan tam giác hình bầu dục hình trứng, dài 3-7 cm, rộng 1-3 cm, gốc thuôn, đầu nhọn, mép có cưa to hay lượn sóng, gân 3, cuống dài 1,5-2 cm (hình 1.1) Cụm hoa đầu mọc thân hay nách lá, cuống cụm hoa dài khoảng 12 cm, cụm hoa hình nón nhọn, cao 9-11 mm, đường kính 5-7 mm Tổng bao có bắc hình bầu dục nhọn đầu Hoa hình lưỡi nhỏ bên ngoài, hoa hình ống Đài cứng Tràng hoa màu vàng, tràng hoa hình lưỡi dài 5-6 mm, tràng hoa hình ống dài 3-4 mm, cao 4-6 mm Bộ nhị 5, nhị rời Bao phấn có phần phụ hình tam giác, có tai gốc, bầu gần bầu dục, có lông Bộ nhụy có noãn dính thành bầu ô (hình 1.3, 1.4) Mau V: Cây cỏ, sống hàng năm, cao Ichoảng 20-50 cm Thân nằm, đứng, màu tía Lá mọc đối, phiến hình tam giác, rộng 3-5 cm, dài 5-6 cm mép cưa Gân gồm có gân tò gốc cặp gân phụ Cuống dài 11,5 cm (hình 1.1) Cụm hoa đầu đơn độc nhánh, cuống cụm hoa tương đối ngắn 1,5-2 cm, đế cụm hoa có hình nón nhọn cao 5-7 mm, đường kính mặt cắt ngang cụm hoa khoảng 5-7 mm Tổng bao bắc có hàng Hoa hình lưỡi nhỏ bên ngoài, hoa hình ống Hoa có màu vàng, hoa hình lưỡi nhỏ dài - mm, hoa lưỡng tính hình ống dài - mm Bộ nhị 5, nhị rời đính vào ống tràng Bao phấn dính lại với thành ổng, mở khe nứt dọc vào phía Bộ nhụy có noãn dính thành bầu (hình 1.3, 1.4) Mau T: Cây cỏ, cao đến m Thân màu xanh, mọc đứng bò lan Lá có phiến thon, rộng -1 ,5 cm, dài - cm, chót nhọn, mép có răng, gân phụ cặp với cặp to, cuống dài - cm (hình 1.1) Cụm hoa đầu, mọc đầu cành, ữên cuống cụm hoa dài - 10 cm Cụm hoa cao - mm, đường kính - mm Đế cụm hoa hình nón nhọn, cao - mm Tổng bao bắc với hàng lá, cao 2,5 - mm, không lông có lông, hoa hình lưỡi nhỏ bên hoa dài - mm, hoa hình ống hoa lưỡng tính, dài - mm Bộ nhị 5, nhị rời đừih vào ống tràng Bao phấn đính gốc, dính lại với thành ống, mở khe nứt dọc vào phía Bộ nhụy có noãn dính thành bầu ô (hình 1.3, 1.4) L V Hình 1.1 Ảnh hình thái mẫu Nút áo L V T L V T Hình 1.2 Ảnh hình thái mẫu Nút áo Hình 1.3 Hình thái cụm hoa mẫu Nút áo ỉ Cụm hoa có cuống, Cụm hoa phóng to, Cụm hoa cắt dọc, Cụm hoa cắt ngang L T HQnh 1.4 Hmh thái hoa mâu Spiỉanthes spp V, L, T chụp qua kính lúp soi V: Hoa lưỡi nhỏ, Hoa hình ống, Đ ế hoa, Đ ế hoa cẳt dọc S.Nhị hoa, Đ ế hoa cắt ngang, Bầu hoa cắt ngang, Đ ài hoa L: Hoa lưỡi nhỏ, Hoa hĩnh ổng, Đài hoa, Đ ể hoa, N h ị, Nhụy T: Hoa lưỡi nhó, Hoa hình ông, Đê hoa, Nhụy, Nhị (ô vuông có ìdch thước 1x1 mm) Đối chiếu đặc điểm mô tả với khóa phân loại thực vật có [ -5 ], mẫu dùng nghiên cứu giám định tên khoa học là: - Mầu V: Spilanthes oleracea L., họ Cúc (Asteraceae) - Mau L: Spiỉanthes acmella L Muư., họ Cúc (Asteraceae) - Mầu T: Spiỉanthes grandiflora Turcz., họ Cúc (Asteraceae) Đề tài tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu quan sinh dưỡng mẫu nghiên cứu nhận thấy chúng có đặc điểm tưcmg đồng Một số phận có đặc điểm phân biệt mẫu nghiên cứu Có thể kể đến như: phần mô mềm vỏ mẫu V T có khoảng không gian tế bào lớn, mẫu L tế bào xếp xít hơn; phía bên thân mẫu L có lông che chở; bên trong, mô mềm vỏ tế bào thưa thớt, không thấy có sợi libe mẫu V T mà có mô mềm libe bắt màu đỏ Thử hoạt tính sinh học dịch chiết cảcphần mặt đất Do loài Spỉlanthes grandiflora Turcz (T) loài phổ biến nên số lượng mẫu thu hái nhỏ Vì thế, đề tài tiến hành thử hoạt tính sinh học loài Spiỉanthes oleracea L (V) Spilanthes acmella L Muư (L) Các mẫu thân nồng độ khác tác dụng chủng Streptococcus mutans Các mẫu hoa có tác dụng tốt chủng vi khuẩn gây sâu Cụ thể kết thu cho thấy tất mẫu hoa hai loài thử có tác dụng chủng Streptococcus muíans Trong đó, mẫu VH với tỉ lệ : thể khả kháng khuẩn mạnh với đưòng kính vòng vô khuẩn truiig bình 7,28 mm Mầu LH với tỉ lệ 1:3 ức chế chủng Streptococcus mutans với đường kính vòng vô khuẩn trung bình 6,21 mm Mau VH tỉ lệ 1:2 thể hoạt tính mạnh mẫu LH tỉ lệ 1:3 Điều chứng tỏ hoa loài V có hoạt tính mạnh hai loài Vì mẫu VH (1:2) đưa vào thí nghiệm so sánh với tác dụng Gentamyin Cuối xác định hoạt lực mẫu thử so với kháng sinh R = 71,16% Qua ứình thử hoạt tính sinh học nhận thấy hoa mẫu V (VH) có hoạt tính sinh học mạnh mẫu thực nghiệm Do tiếp tục thực nghiên cứu thành phần hóa học mẫu Nghiên cứu thành phần hóa học Nghiên cứu thành phần hỏa học tinh dầu cụm hoa Nút áo Nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu chứa cụm hoa, ban đầu thực hiên chưng cất xác định hàm lưọTig tinh dầu 0,1% Qua trình chạy sắc kí khí khối phổ tinh dầu cất từ cụm hoa, xác định thành phần hóa học tinh dầu bao gồm 20 chất khác là: L-cc-Pinene, Sabinene, /3-Myrcene, Pseudolimonene, p-Cymene, dl-Limonene, trans-a-Ocimene, trans-i3Ocimene, 'T^Terpinene, Alloocimene, Trans-Caryophyllen, Gemiacrene D, (-)Caryophyllene oxide Trong đó, Limonene có hàm lượng cao với tỉ lệ 30,71% Chiết xuất xác định số thành phần cụm hoa Tiến hành chiết xuất phương pháp ngâm lạnh thu dịch chiết cồn 90° cụm hoa Nút áo cất thu hồi dung môi đem cô đến khối lượng không đổi thu 201,73 g cắn M Hòa tan cắn M khoảng 80 ml nước, đun nóng nhẹ Chiết phân bố với dung môi chloroform, ethyl acetat thu phân đoạn dịch chiết, cất quay thu hồi dung môi dịch chiết, cô cách thủy đến cắn có khối lượng không đổi cắn A (trong CHCI3), cắn B (trong EtOAc) cắn c (trong nước) Định tính cắn ừên phương pháp hóa học, kết thu cho thấy: cắn A có flavonoid, coummarin, tannin, sterol; cắn B: có coumarin tannin; cắn C: có tanin Định tính phưong pháp sắc kí lóp mỏng (SKLM) nhận thấy cắn A, B, c có khả tách với hệ dung môi CHCI3 - MeOH (9:1) Riêng với cắn A khai triển tiếp với sắc kí cột để phân lập chất hệ dung môi Phân lập chất phương pháp sắc kí cột Lần 1: chạy cột sắc kí lớn với hệ dung môi CHClaiMeOH Kiểm tra SKLM phân đoạn hứng hệ dung môi n-Hexan - EtOAc (3:1) để đánh giá khả tách Xem xét khả tách khối lượng cắn phân đoạn, nhận thấy phân đoạn gộp A20 (m = 0,38 g) triển khai tiếp với hệ dung môi n-Hexan-EtOAc Lần 2: chạy sắc kí cột nhỡ với hệ dung môi n-Hexan:EtOAc Thực chấm SKLM lại phân đoạn gộp với hệ dung môi khai triển là: n-Hexan: EtOAc (6:2, acid hóa giọt acid formic) Xem xét khả tách nhận thấy phân đoạn A20.4 có khả tốt Thực chấm SKLM phân đoạn với hệ dung môi khác nhận thấy hệ CH2CI2 - EtOAc (3:1) phân đoạn A20.4 tách tưcmg đối tốt Lần 3: chạy cột sắc kí nhỏ với hệ dung môi EtOAc:CH2Cl2, thu phân đoạn A20.4.1, A20.4.2, A20.4.3, A20.4.4, A20.4.5, A20.4.6, A20.4.7 Thực chấm lại SKLM phân đoạn với hệ dung môi n-Hexan - EtOAc (1:1), CHCI3 - MeOH (9:1), CH2CI2 - EtOAc - HCOOH (1:1:0,015) nhận thấy phân đoạn A20.4.6 vết lên rõ có vết Qua phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân xác định chất A20.4.6 phân lập p-sitosteroỉ Công thức hóa học chất sau; Bàn luận Khi tiến hành so sánh hình thái mẫu thu hái với đặc điểm số loài mô tả tài liệu tra cứu chuyên dụng, nhận thấy phần lớn đặc điểm tương đồng với tài liệu Đồng thời, so sánh mẫu với thấy hình thái chúng khác rõ rệt (như hình dạng, kích thước lá, cụm hoa, màu sắc thân ) Vì vậy, đánh giá kết giám định tên khoa học có tính xác tương đối cao Limonene chứa tinh dầu cụm hoa Nút áo /3-sitosterol theo nhiều nghiên cứu cho thấy chúng có tác dụng ức chế vi khuẩn Streptococcus muían [6 , 7], Điều mở hướng cho việc khai thác tinh dầu cụm hoa Nút áo thành phần chứa dịch chiết cụm hoa nhằm phát triển sản phẩm điều trị bệnh miệng Trên thực tế tiến hành phần lập thêm nhiều thành phần từ Nút áo phương pháp sắc kí cột Tuy nhiên, thời gian thực đề tài tương đối ngắn nên kết thu chưa triệt để Kết thử hoạt tính sinh học cho thấy nồng độ dịch chiết đậm đặc tác dụng kháng khuẩn tốt Với nồng độ 1;2 dịch VH có hoạt lực so với Gentamycin 71,16% Đây kết khả quan để định hướng phát triển loài Spiỉanthes oleracea L cho tác dụng chống sâu Kết luận Đã mô tả đặc điểm hình thái xác định tên khoa học mẫu nghiên cứu Spilanthes oleracea L., Spilanthes acmella L Murr Spilanthes grandiflora Turcz., họ Cúc Asteraceae, đồng thời tiến hành phân tích vi phẫu quan sinh dưỡng mẫu Đã xác định hàm lượng tinh dầu hoa Nút áo 0,1% (g/ml) (tính theo trọng lượng khô) xác định thành phần hóa học tinh dầu hoa Nút áo, thành phần Limonene lớn với tỉ lệ 30,71% Đã phân lập chất lỡ-sitosterol từ phân đoạn Choroform dịch chiết hoa Nút áo {Spilanthes oleracea L.) Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết phận mặt đất mẫu nghiên cứu thông qua việc thử khả ức chế vi khuẩn gây sâu Streptoccocus mutans xác định dịch chiết hoa Spilanthes olemcea L có hoạt tính mạnh với hoạt lực 71,16% so với Gentamycin Tài liệu tham khảo Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 562-563 Phạm Hoàng Hộ (2006), Cây cỏ Việt Nam, 3, NXB Trẻ, tr 230, 276 Võ Văn Chi (2003), Từ điển Thực vật Thông dụng, tập 2, NXB Khoa học Kĩ thuật, tr 2318-2319 Võ Vãn Chi (1997), Từ điển thuốc, NXB Y học Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc động vật ỉàm thuốc Việt Nam, tập I, tr 569-331 Jung EK (2009), Chemical Composition and Antimircobacterial Activity of the Essential Oil of Chrysanthenum indicum Against Oral Bacterial, Journal o f Bacteriology and Virology, Vol 39, No 2, pp 61-69 Natiya Joycharat, Sonesay Thammavong, Surasak Limsuwan, Sirilux Homlaead, Supayang Piyawan Voravuthikunchai, Boon-ek Yingyongnarongkul, Sukanya Dej-adisai, Sanan Subhadhirasakul (2013), Antibacterial substances from Albizia myriophylla wood against cariogenic Streptococcus mutans, Archives ofPharmacal Research ... mạnh mẫu thực nghiệm Do tiếp tục thực nghiên cứu thành phần hóa học mẫu Nghiên cứu thành phần hóa học Nghiên cứu thành phần hỏa học tinh dầu cụm hoa Nút áo Nghiên cứu thành phần hóa học tinh... hoạt tính sinh học Cụm hoa loài V tươi phơi cho se sấy khô 60°c, bảo quản túi nilon kín, để chỗ mát làm nguyên liệu nghiên cứu thành phần hóa học Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực vật: mô... tiến hành phân tích đặc điểm vi phẫu quan sinh dưỡng mẫu nghiên cứu nhận thấy chúng có đặc điểm tưcmg đồng Một số phận có đặc điểm phân biệt mẫu nghiên cứu Có thể kể đến như: phần mô mềm vỏ mẫu