Nghiên cứu sử dụng interferon trong phòng bệnh newcastle cho gà từ 5 đến 9 tuần tuổi

Hiện nay, Inteferon được xem là liệu pháp lý tưởng để điều trị các bệnh dovirus gây ra ở người như viêm gan siêu vi B-C mãn tính, bệnh SARS, ung thư vú,ung thư xương, u hắc tố,…Những năm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN THÚ Y

LÊ QUỐC DUYỆT

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG INTERFERON TRONG PHÒNG BỆNH NEWCASTLE CHO GÀ 1 ĐẾN 2

TUẦN TUỔI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

Ngành: THÚ Y

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Ngành: BÁC SĨ THÚ Y

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

MSSV: 3042869 Lớp: Thú Y K30

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Cần Thơ, ngày …tháng…năm 2009 Cần Thơ, ngày…tháng…năm 2009

Duyệt Bộ môn Duyệt Giáo viên hướng dẫn

HỒ THỊ VIỆT THU

Cần Thơ, ngày… tháng…năm 2009

Duyệt khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tâm hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợicho em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Quý Thầy, Cô Trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt kiến thức cho

em trong suốt thời gian học tại trường

Chị Huỳnh Ngọc Trang cùng các bạn trong và ngoài lớp Thú Y K30 đã giúp

đỡ và động viên tôi trong quá trình học tập cũng như trong cuộc sống

Xin kính dâng lên ông bà, cha mẹ lòng biết ơn sâu sắc và sự quý trọng nhất,những người luôn cố gắng tạo mọi điều kiện tốt để tôi thực hiện được hoài bão củamình

Xin kính gởi đến quý Thầy, Cô, người thân và bạn bè tôi lời chúc sức khỏe,thành công và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc

Lê Quốc Duyệt

MỤC LỤC

Trang tựa i

Trang duyệt ii

Lời cảm tạ iii

Mục lục iv

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Danh mục chữ viết tắc viii

Tóm lược ix

CHƯƠNG 2.CƠ SỞ LÝ LUẬN 14

2.1 Sơ lược tình hình nghiên cứu bệnh Newcastle trên thế giới và trong nước 14

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 14

2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 14

2.2 Căn bệnh học 15

2.2.1 Phân loại 15

2.2.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus Newcastle 15

2.2.3 Tính chất sinh học 16

2.2.4 Độc lực 17

2.2.5 Sức đề kháng 18

2.3 Truyền nhiễm học 18

2.3.1 Loài mắc bệnh 18

2.3.2 Đường lây lan 19

2.4 Cơ chế sinh bệnh 19

2.5 Triệu chứng và bệnh tích 20

2.5.1 Triệu chứng 20

2.6 Chẩn đoán 20

2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng 20

2.6.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 21

2.7 Phòng và trị bệnh 21

2.7.1 Phòng bệnh 21

2.7.2 Trị bệnh 21

2.8 Interferon và sự biểu hiện interferon- α gà trên bề mặt bào tử B subtilis 22

2.8.1 Khái niệm Interferon 22

2.8.2 Phân loại Interferon 22

2.8.3 Sự tạo thành Interferon 23

2.8.4 Các đặc tính cơ bản 23

2.8.5 Tác dụng của Interferon 23

2.8.6 Cơ chế tác động của Interferon 24

2.8.7 Ứng dụng của Interferon trong phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm 24

2.9 Sự biểu hiện interferon- α gà trên bề mặt bào tử B subtilis 25

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 26

3.1 Phương tiện thí nghiệm 26

3.1.1 Thời gian và địa điểm 26

3.1.2 Đối tượng thí nghiệm 26

3.1.3 Vật liệu thí nghiệm 26

3.2 Phương pháp thí nghiệm 27

3.2.1 Chuẩn bị nuôi gà để thí nghiệm 27

3.2.2 Bố trí thí nghiệm 28

3.3.3 Phương pháp xét nghiệm 30

3.2.4 Qui trình thực hiện phản ứng HA 31

3.2.5 Qui trình thực hiện phản ứng HI 32

3.2.6 Thống kê và xử lý số liệu 35

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

4.1 Kết quả theo dõi tỷ lệ mắc bệnh trên gà thí nghiệm 36

4.2 Kết quả theo dõi tỷ lệ chết trên gà thí nghiệm 38

4.3 Kết quả khảo sát triệu chứng lâm sàn ở gà thí nghiệm 40

4.4 Kết quả khảo sát bệnh tích của bệnh Newcastle qua mổ khám 41

4.5 Kết quả kiểm tra kháng nguyên bằng phản ứng HA 42

4.6 Kết quả kiểm tra kháng nguyên bằng phản ứng HI 42

4.7 Kết quả kiểm tra HI các mẫu huyết thanh gà thí nghiệm 43

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 45

5.1 Kết luận 45

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

PHỤ CHƯƠNG 1 49

PHỤ CHƯƠNG 2 50

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Quy trình phòng bệnh chung 28

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 29

Bảng 3.3 Trình tự tiến hành thực hiện phản ứng HA 32

Bảng 3.4 Trình tự tiến hành thực hiện phản ứng HI 34

Bảng 4.1 Tỷ lệ gà mắc bệnh sau khi thí nghiệm 36

Bảng 4.2 Tỷ lệ gà chết theo nghiệm thức 38

Bảng 4.3 Triệu chứng gà mắc bệnh Newcastle 40

Bảng 4.4 Bệnh tích gà mắc bệnh Newcastle 41

Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra kháng nguyên qua phản ứng HA 42

Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra huyết thanh bằng phản ứng HI 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc virus Newcastle 16

Hình 3.1 Kết quả xét nghiệm HI 35

Hình 4.1 Tỷ lệ gà mắc bệnh theo thời gian sau khi thí nghiệm 37

Hình 4.3 Tỷ lệ gà chết ở các nghiệm thức 39

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AMP :Adenosine monophosphate

B.subtilis : Bacilus subtilis

Bacilus subtilis đang được nghiên cứu để xác định hiêu quả phòng trị bệnh của sản

phẩm này Bệnh Newcastle là bệnh đặc biệt nguy hiểm do virus gây ra với triệuchứng và bệnh tích điển hình, có tỷ lệ chết cao đến 100% nên cần thiết phải đượcnghiên cứu Do đó chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng Interferon trongphòng bệnh Newcastle cho gà từ 5 tuần tuổi đến 9 tuần tuổi”

Đề tài được thực hiện từ tháng 01/2008 đến tháng 04/2008 Chúng tôi tiếnhành bố trí thí nghiệm với 7 nghiệm thức gồm 3 nghiệm thức đối chứng là PBS,

PBS + virus Newcastle và Bacilus subtilis + virus Newcastle và 4 nghiệm thức thí

nghiệm lần lượt là vaccine + virus Newcastle, Interferon chuẩn + virus Newcastle,

B Subtilis – IFN + virus Newcastle và B Subtilis – IFN – vaccine Newcastle +

virus Newcastle Kết quả ghi nhận:

Qua 8 ngày thí nghiệm tất cả gà ở các nghiệm thức đều chết ngoại trừnghiệm chức đối chứng PBS là gà khỏe mạnh bình thường Tuy nhiên ở lô IFNchuẩn số gà chết với thời gian dài hơn các nghiệm thức còn lại Nhưng trong thí

nghiệm này chưa thấy được hiệu quả của IFN chuẩn cũng như B Subtilis – IFN

nguyên nhân có thể là do liều virus cao, liều IFN thấp, thời điểm đưa IFN chưa phùhợp, đường cấp chưa hợp lý hoặc do thời tiết lúc tiến hành thí nghiệm quá nóng ảnhhưởng đến kết quả nghiệm thức

Bên cạnh đó, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tần suất xuất hiện triệu chứng

gà bệnh Newcastle cao nhất là triệu chứng bỏ ăn, uống nhiều nước với tỷ lệ là85,71% và thấp nhất là chảy nước dãi với tỷ lệ là 28,57% Tần suất xuất hiện bệnh

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, ngành chăn nuôi gia cầm nói chung và chăn nuôi gà nói riêngngày càng phát triển với các hình thức chăn nuôi công nghiệp qui mô lớn đã gópphần cung cấp một lượng lớn thực phẩm cho con người đồng thời cũng mang lạinguồn thu nhập cho nhà chăn nuôi Tuy nhiên, dịch bệnh là điều đáng lo ngại, gâytổn thất cho người chăn nuôi đặc biệt là những bệnh do virus gây ra vì chưa cóthuốc đặc trị Do đó, chỉ áp dụng biện pháp phòng bệnh bằng cách dùng vaccine làchủ yếu Nhưng vaccine chỉ tạo được kháng thể đặc hiệu với từng kháng nguyêntương ứng nên chỉ phòng được những bệnh đã tiêm phòng Nên khi có virus xâmnhập vào mà con vật chưa tiêm phòng vaccine loại virus đó thì sẽ không miễn dịchđược và có thể gây chết với tỷ lệ cao ảnh hưởng đến kinh tế và sức khỏe con người

Interferon là một nhóm các protein tự nhiên được sản xuất bởi các tế bào của

hệ thống miễn dịch ở hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lainhư virus, vi khuẩn, kí sinh trùng và tế bào ung thư Interferon thuộc một lớp lớncủa glycoprotein được biết đến dưới tên cytokine (chất hoạt hóa tế bào) Interferonđóng vai trò quan trọng trong cửa ngõ miễn dịch đầu tiên của cơ thể Nó là mộtphần của hệ thống miễn dịch không đặc hiệu (non-specific immune system) và đượckích hoạt bởi giai đoạn đầu của quá trình cảm nhiễm trước khi hệ miễn dịch đặchiệu (specific immune system) có thời gian để đáp ứng (Hồ Nhân, 2007)

Hiện nay, Inteferon được xem là liệu pháp lý tưởng để điều trị các bệnh dovirus gây ra ở người như viêm gan siêu vi B-C mãn tính, bệnh SARS, ung thư vú,ung thư xương, u hắc tố,…Những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu ứng dụngInterferon để điều trị bệnh virus ở động vật Một sản phẩm mới là Interferon- α gà

biểu hiện trên bào tử Bacilus subtilis đang được thử nghiệm để điều trị các loại

virus trên gà Bệnh Newcastle là bệnh đặc biệt nguy hiểm gây ra những triệu chứng

và bệnh tích điển hình và tỷ lệ chết cao có thể lên đến 100% tổng đàn, do đó việcnghiên cứu phòng và trị bệnh Newcastle là vấn đề cần thiết Vì thế chúng tôi thực

hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng Interferon trong phòng bệnh Newcastle cho gà

từ 5 tuần tuổi đến 9 tuần tuổi”

Mục tiêu đề tài:

- Thử hiệu quả của Interferon trong phòng bệnh Newcastle cho gà

- So sánh hiệu quả đáp ứng miễn dịch giữa các nghiệm thức vaccine

Newcactle chuẩn, INF chuẩn, B.subtilis-IFN, B.subtilis-IFN-vaccine Newcastle.

CHƯƠNG 2

CƠ SỞ LÝ LUẬN

2.1 Sơ lược tình hình nghiên cứu bệnh Newcastle trên thế giới và trong nước

2.1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Bệnh Newcastle được xem là bùng phát lần đầu tiên vào năm 1926 tại Java,Indonesia (Kraneveld, 1926) và ở Newcastle- upon- Tyne, Anh (Doyle, 1927) Từ

đó, Doyle đã đặt tên bệnh là Newcastle để tránh nhằm lẫn với các bệnh khác Sau

đó, có nhiều bài báo cáo về sự bùng phát của bệnh ở Châu Âu giống với những gìngười ta biết về bệnh Newcastle đã từng xảy ra trước đó vào năm 1926 Levine(1964) trích dẫn của Ochi và Hashimoto, cho rằng bệnh có thể xảy ra sớm hơn ởHàn Quốc vào năm 1924

Năm 1927, Doyle mô tả bệnh Newcastle là bệnh truyền nhiễm cấp tính vớibệnh tích chủ yếu là xuất huyết ở đường tiêu hóa Đặc trưng của bệnh là virus gâybệnh có tính hướng nội tạng; bệnh do chủng velogenic gây ra Bệnh còn được gọitên là viscerotropic velogenic Newcastle diesease (VVND)

Năm 1946, Beaudette và Black mô tả đây là bệnh cấp tính xảy ra với bệnhtích xuất hiện ở đường hô hấp và thần kinh; xảy ra chủ yếu ở gà con, ở gà lớn có tỷ

lệ chết thấp, do chủng mesogenic gây ra

Năm 1948, Hitchner và Johnson mô tả bệnh xảy ra ở thể nhẹ với triệu chứng

hô hấp, có tỷ lệ chết thấp Bệnh do chủng lentogenic gây ra

Đầu những năm 1960, có nhiều báo cáo về việc sử dụng vaccine để chống lạichủng virus có độc lực cao ở Trung Đông (Chu và Rizk, 1971)

Nhiều biện pháp được áp dụng nhằm khống chế bệnh Newcastle Ở Mỹ đã

áp dụng thành công chương trình phòng bệnh ở Nam California Bệnh đã đượckhống chế thông qua việc tiêu hủy những chim bệnh và quản lý chặt chẽ việc tiêmphòng những loài gia cầm mẫn cảm bệnh (Walker và ctv, 1973)

2.1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, bệnh Newcastle đã có từ rất lâu ở khắp hai miền Nam Bắc Tuynhiên, bệnh được chính thức ghi nhận qua chẩn đoán ở phòng thí nghiệm vào năm

1949 Từ đó, Newcastle được xem là bệnh gây tác hại lớn nhất đối với nền chănnuôi gà ở Việt Nam (Trần Đình Từ, 1998)

Năm 1956, Nguyễn Văn Lương và Neter đã chẩn đoán bệnh này ở miềnNam Cũng trong thời gian này ở miền Bắc, Trần Quang Nhiên và Nguyễn Lương(1956) đã xác định bệnh Newcastle rất phổ biến ở nhiều tỉnh và đã nghiên cứuvaccine phòng bệnh này (trích dẫn Dương Nghĩa Quốc, 1997).

Phần lớn các kết quả nghiên cứu về bệnh Newcastle và áp dụng vaccinephòng bệnh do hai nhà khoa học Nguyễn Bá Huệ và Nguyễn Thu Hồng thực hiệnvào thập kỷ 70 ở viện Thú Y Nguyễn Bá Huệ và ctv đã phân lập các chủng virusNewcastle từ các ổ dịch ở các trại gà nuôi công nghiệp và nuôi thả ở các hộ gia đình(trích dẫn Nguyễn Trường Giỏi,1999)

Việc sử dụng vaccine để khống chế bệnh Newcastle được thực hiện vàonhững năm 1960 Ở thời điểm này, gia cầm được chủng ngừa bằng vaccine virussống nhược độc, đông khô Gần đây, vaccine Newcastle chịu nhiệt được chế tạo từchủng V4 và I2 được phát triển, năm 1999 gần 8000 liều vaccine chịu nhiệt đã đượccông ty Navetco sản xuất và cung cấp trên thị trường (Trần Đình Từ, 1998)

2.2 Căn bệnh học

2.2.1 Phân loại

Virus thuộc họ Paramyxoridae, giống Avulavirus, loài Paramyxovirus Virus gây bệnh Newcastle là một Paramyxovirus và trong thời gian dài được coi là một Avian Paramyxovirus duy nhất Tuy nhiên gần đây, một loạt Avian

Paramyxovirus khác được phát hiện Có 9 serotype đã được xác định ký hiệu từ

PMV1 đến PMV9 NDV thuộc PMV1

2.2.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus Newcastle

Paramyxovirus là một loại virus đa hình thái, ở dạng hình cầu có kích thước

khoảng 100-500 nm, ở dạng hình sợi có kích thước chiều ngang khoảng 100nm vớichiều dài thay đổi Hình thái của virus biến đổi theo nồng độ muối của môi trườngsống; quan sát dưới kính hiển vi điện tử, ở trong nước mảnh virus có hình tròn và códạng hình sợi kéo dài trong dung dịch muối

Bộ gen là một phân tử ARN, một chuỗi âm có trọng lượng phân tử khoảng5.106 Dalton, chiếm 5% trọng lượng của tiểu thể virus Nucleocapsid có dạng đốixứng xoắn với đường kính 18nm và khoảng cách vòng xoắn 5-6nm, được bao bọcbởi một lớp áo ngoài

Virus Newcastle chứa ít nhất 6 protein đặc hiệu; trong đó, có hai khángnguyên bề mặt là hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein và fusion (F) protein,bốn kháng nguyên nằm bên trong là polymerase (L) proteion, nucleocapsid (N)protein, phosphoprotein (P) protein và matrix (M) protein.

Hình 2.1 Cấu trúc virus Newcastle

Do vậy HI được coi là phản ứng đặc hiệu trong chẩn đoán bệnh Newcastle Hồngcầu gà thường được dùng trong phản ứng HA, nhưng virus có thể gây ngưng kếthồng cầu của các loài lưỡng thê, bò sát và chim

Kháng nguyên HN có chứa hemagglutinin và neuraminidase Enzyme

neuraminidase có mặt ở tất cả các thành viên của nhóm Paramyxovirus, enzyme này

có tác dụng làm tách dần các hồng cầu đã bị ngưng kết Còn kháng nguyên F gắnliền với sự phản ứng của virus đối với các tế bào đích và kháng thể trung hòa Cáckháng nguyên HN và F, khi mới tạo thành chưa có hoạt tính và nó chỉ thể hiện hoạttính sau khi bị phân cắt bởi các protease của tế bào chủ

+ Đặc tính gây bệnh: mặc dù các chủng virus Newcastle khá đồng nhất về tínhkháng nguyên nhưng lại rất khác nhau về khả năng gây bệnh Khả năng này thayđổi từ những chủng gây ra thể quá cấp với tỷ lệ chết 100% đàn gà đến những chủnghoàn toàn không gây bệnh khi chúng lan truyền trong điều kiện tự nhiên Các chủngvirus Newcastle gây bệnh nghiêm trọng với tỷ lệ chết cao ở gà được xếp vào nhómvelogen, tùy thuộc vào tính hướng thần kinh hay phủ tạng, nhóm này lại được chiathành hai nhóm phụ là neurotropic và viscerotropic; các chủng viscerotropicvelogen đang gây ra nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi gà tại Châu Á Nhómmesogen có độc lực trung bình, có thể gây chết đến 50% đàn gà và làm giảmnghiêm trọng tỷ lệ đẻ trứng Các chủng độc lực thấp được xếp vào nhóm lentogen,

có thể làm giảm đẻ trứng nhưng ít gây chết trừ gà con mới nở không có kháng thểhoặc gà đang mắc bệnh khác Gần đây, nhóm virus không có độc lực mà đại diện làcác chủng V4 và ulster được bổ sung thành nhóm thứ tư, nhóm virus này hoàn toànkhông gây bệnh khi chúng lan truyền trong đàn gà con qua đường xâm nhập tựnhiên

+ Sự bền với nhiệt: Spalatin và Hanson (1976) đã chứng minh có sự thay đổi

về tính bền với nhiệt của các chủng virus Newcastle và tính chất này đã được ápdụng trong nghiên cứu dịch tễ học Năm 1995, Glolam và Hanson đã chọn lọc đượcmột chủng virus Newcastle chịu nhiệt dùng trong nghiên cứu tái tổ hợp virus; pháthiện này đã gợi ý cho các nhà khoa học Úc phát triển virus Newcastle chịu nhiệt từchủng V4 Vaccine này đã được áp dụng thành công trong phòng bệnh Newcastletrên gà nuôi ở nông thôn của nhiều nước Đông Nam Á

2.2.4 Độc lực

Trong tự nhiên, virus Newcastle có biểu hiện độc lực ở những mức độ khácnhau Có những ổ dịch xảy ra rất nặng, tỷ lệ chết rất cao và bệnh tích rất điển hình;trái lại, cũng có những ổ dịch xảy ra rất nhẹ, tỷ lệ chết không đáng kể Độc lực củavirus Newcastle ở Châu Á và Châu Âu thường cao hơn ở Bắc Mỹ

Cho đến nay, người ta đã phân lập được nhiều chủng virus Newcastle, cácchủng virus khác nhau về độc lực và hướng phủ tạng nhưng lại giống nhau về tínhkháng nguyên Có 3 nhóm độc lực:

Xác định thời gian gây chết phôi trung bình (mean dead time-MDT)

Xác định thời gian gây bệnh sau khi tiêm vào não gà con 1 ngày tuổi (intracerebral pathogenicity index-IVPI)

Xác định chỉ số gây bệnh sau khi tiêm bệnh phẩm Newcastle vào tĩnh mạch

gà 6 tuần tuổi (intra venous pathogenicity index-IVPI)

2.2.5 Sức đề kháng

Virus có sức đề kháng tương đối yếu Trong thịt thối rữa, phân, xác chết,virus không thể tồn tại quá 24 giờ Trong ổ rơm, nền chuồng, virus bị tiêu diệtnhanh Trong điều kiện khô ráo, virus có thể sống trong nhiều tháng Nhiệt độ thấp

có thể bảo quản virus trong thời gian dài Ở 1-20C virus có thể tồn tại trong 3 tháng,

ở -200 C virus có thể tồn tại trong 1 năm Virus trong phôi gà bệnh được bảo quản ởtrạng thái khô, lạnh có thể giữ được tính gây bệnh trong 2 năm Trong tủy xương,thịt được giữ lạnh, virus còn độc lực trong 6 tháng

Ở nhiệt độ bình thường, trong nước sinh lý virus còn sống sau 3 tháng nhưngvirus dễ bị tiêu diệt ở nhiệt độ cao.Virus dễ dàng bị tiêu diệt bởi các chất sát trùngnhư crezyl 5%, NaOH 2% Một số hóa chất như formol, proiolacton làm vô hoạtvirus nhưng không làm thay đổi tính kháng nguyên của virus

2.3 Truyền nhiễm học

2.3.1 Loài mắc bệnh

Trong điều kiện tự nhiên, gà, gà tây, gà lôi, chim công dễ mắc bệnh Tuynhiên, sức mẫn cảm của các loại gia cầm không giống nhau Gà cảm thụ bệnh mạnhnhất rồi đến gà tây Tất cả các giống gà và gà ở mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với bệnhnhưng gà ở giai đoạn còn non mẫn cảm nhất

Nhiều loài chim hoang dã, bồ câu, chim sẻ cũng cảm thụ với bệnh, chúng lànguồn mang virus có độc lực cao Chủng virus có độc lực thấp thường gây bệnh phổbiến ở loài thủy cầm.

Bệnh lây sang người thường xuyên tiếp xúc trực tiếp với gà có bệnh hoặcqua khí dung, ủ bệnh 1-2 ngày Thông thường chỉ có một bên mắt bị bệnh Đôi khibệnh gây ra giống như bệnh cúm nên người ta dễ bỏ qua (Bùi Quý Huy, 2002)

2.3.2 Đường lây lan

Virus Newcastle xâm nhập vào cơ thể gà qua đường hô hấp, đường tiêu hóanhư hít phải không khí có mang mầm bệnh hay do thức ăn, nước uống nhiễm virus

Gà nhiễm bệnh thải virus ra không khí, dịch mũi và phân Virus bài thải suốt thời kỳnung bệnh, phát bệnh và đầu thời kỳ hồi phục

Qua không khí là phương thức truyền lây chủ yếu trong đàn và những chủngvirus có tính hướng hô hấp có khả năng lây truyền nhanh nhất

Sự nhiễm bệnh qua đường tiêu hóa cũng xảy ra nhưng đòi hỏi phải có mộtlượng virus lớn hơn và sự lan truyền qua đường phân-miệng chậm hơn qua khôngkhí

Sự di chuyển của các loài chim di trú, bồ câu làm lây bệnh khắp thế giới Sựlây lan bệnh trong phạm vi một nước thường do sự di chuyển gia cầm hoặc chimhoang dã Sự truyền lây cơ giới thông qua các phương tiện chăn nuôi bao gồm máymóc và áo quần

Ngoài ra, virus gây nhiễm trứng trong ống dẫn trứng và thường làm chết phôitrong lúc ấp, sự lây nhiễm trong máy ấp sẽ diễn ra khi trứng này vỡ Nhưng thườngthấy hơn cả là qua gia cầm non bị nhiễm lúc nở qua trung gian của vỏ trứng bịnhiễm virus

Gia cầm bị stress, thời tiết thay đổi sang lạnh và ẩm ướt có thể mở đường cho

sự bùng nổ bệnh

2.4 Cơ chế sinh bệnh

Đường xâm nhập virus Newcastle vào cơ thể gia cầm là miệng và mũi Virusthâm nhiễm qua niêm mạc hầu họng rồi vào máu, virus gây nhiễm trùng huyết, bạihuyết và đi đến hầu hết các cơ quan tổ chức của cơ thể gây viêm hoại tử Nội môthành huyết quản bị phá hủy gây xuất huyết và thâm nhiễm dịch xuất vào các xoang

Phần lớn gà bệnh ở thể cấp tính thường chết ở thời kỳ nhiễm trùng huyết.Trong trường hợp bệnh kéo dài, virus từ máu đến ký sinh ở các cơ quan phủ tạnghoặc thần kinh trung ương.

2.5 Triệu chứng và bệnh tích

2.5.1 Triệu chứng

Thời gian ủ bệnh từ 2-15 ngày, trung bình 5-6 ngày Gà có các biểu hiện chủyếu ở đường hô hấp hoặc tiêu hóa, có khi phối hợp cả đường hô hấp và tiêu hóa.Lúc đầu gà ủ rủ, bỏ ăn, mào tím tái, há mỏ ra để thở, mắt sưng, phân lỏng màutrắng, xanh có khi có máu Một số gà có triệu chứng liệt chân, liệt cánh, vặn xoắnđầu, mổ thóc không trúng Thông thường triệu chứng thần kinh chỉ có ở những ổdịch kéo dài trên 10-14 ngày

2.5.2 Bệnh tích

+ Bệnh tích đại thể

Bệnh tích điển hình thường tập trung ở đường tiêu hóa Niêm mạc dạ dàytuyến xuất huyết, lấm tấm màu đỏ tròn bằng đầu đinh ghim, điểm xuất huyết tươngứng với các lổ đổ ra của tuyến tiêu hóa, các điểm xuất huyết này có thể tập trungthành từng vệt Dạ dày cơ xuất huyết và thâm nhiễm dịch xuất kiểu gelatin Ruộtnon xuất huyết, viêm, trong trường hợp bệnh kéo dài, có thể có những nốt loét hìnhtròn, hình bầu dục, cúc áo Hạch manh tràng viêm, xuất huyết, hoại tử Trên gà đẻ

có thể thấy một số con bị vỡ trứng trong xoang bụng (Hồ Thị Việt Thu, 2006)

+ Bệnh tích vi thể

Thoái hóa và viêm không có mủ của nơron thần kinh với sự thâm nhiễm các

tế bào lympho quanh mạch quản (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

2.6 Chẩn đoán

2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng

Chẩn đoán bệnh dựa vào các dữ liệu về dịch tễ học như tỷ lệ mắc bệnh cao,lây lan nhanh, cảm thụ với mọi lứa tuổi của gà và tỷ lệ chết cao Triệu chứng lâmsàng thể hiện chủ yếu ở sự rối loạn cơ năng đường tiêu hóa, hô hấp Bệnh tích điểnhình xuất huyết và viêm loét đường tiêu hóa Hoặc ở trường hợp mãn tính, bệnh có

tử số thấp, kéo dài, có triệu chứng thần kinh

Cần phân biệt với bệnh cúm, bệnh thương hàn, bệnh tụ huyết trùng

Kiểm soát việc nhập và chuyển đàn

Hạn chế người đi lại tham quan

Sát trùng vật dụng và dụng cụ chăn nuôi

Có những biện pháp tránh lây do hoạt động của con người (mang giầy ống,quần áo bảo hộ, sát trùng lối đi và phương tiện vận chuyển, tắm và thay đồ trướckhi ra vào trại)

Miễn dịch thường được củng cố ở đàn gà đang đẻ trứng hoặc gà giống vàothời điểm rớt trứng qua sử dụng vaccine chết chế từ chủng mesogen hoặc lentogen.Chế độ tiêm chủng này nhằm cung cấp hàm lượng kháng thể thụ động cao cho gàcon

2.7.2 Trị bệnh

Tăng cường các chất điện giải

Bổ sung các kháng sinh ngăn ngừa phụ nhiễm

2.8 Interferon và sự biểu hiện interferon- α gà trên bề mặt bào tử B subtilis

2.8.1 Khái niệm Interferon

Năm 1930 , người ta thấy các sinh vật nhiễm siêu vi đề kháng với một tìnhtrạng cùng nhiễm bệnh với siêu vi thứ 2: hiện tượng này gọi là giao thoa siêu vi

Năm 1957, Alick Isaacs và Jean Lindenmann tìm ra một chất sinh học cảntrở virus nhiễm và gọi đó là Interferon

Interferon (IFN) là những glycoprotein xuất hiện ở trong tế bào bị nhiễmvirus hay sau sự kích thích cảm ứng IFN gây nên ở trong tế bào trạng thái khángvirus, những tế bào đã chịu ảnh hưởng của IFN sẽ làm giảm sự nhân lên của ARNhay AND của virus Trạng thái kháng virus ở trong tế bào có thể được truyền từ tếbào này đến tế bào khác bởi các tác dụng Các tác dụng không phụ thuộc vàoInterferon mà nó có thể lan truyền từ tế bào này đến tế bào kia, điều này có thể giảithích tại sao hoạt động bảo vệ của cơ thể lại nhanh như vậy để chống lại virus ở tất

cả các cơ quan cảm ứng Tốt nhất thể hiện ở sự tổng hợp IFN là khi nó có mặt haisợi xoắn ARN (Nguyễn Thị Chính, Trương Thị Hòa, 2005)

Như vậy, hoạt động của IFN không đặc hiệu riêng đối với một loại virus nhấtđịnh nào Nó không phản ứng với virus giống như kháng thể phản ứng với khángnguyên, mà phản ứng ức chế nhân bản virus ở bên trong tế bào là do các tế bàođược nhiễm IFN trở nên đề kháng đối với số lớn các loại virus khác nhau

2.8.2 Phân loại Interferon

Theo Phạm Văn Ty (2005), Các Interferon được chia làm 2 typ: I và II

Typ I bao gồm IFN- và IFN- IFN- có ít nhất 15 typ phụ có khối lượngphân tử khoảng 18KDa Các gen mã hóa cho cho chúng 85% có tính tương đồng.Nguồn tế bào chính sản xuất IFN- là bạch cầu đơn nhân IFN- là glycoprotein vớikhối lượng phân tử 20KDa, là sản phẩm đơn gen, tế bào chủ yếu sản xuất IFN- lànguyên bào sơ

Typ II là IFN- hay còn gọi là IFN miễm dịch vì chúng chủ yếu là do tế bào

T hoạt hóa tạo thành nên thực chất cũng là một lymphokin IFN- là glycoproteingồm 2 chuỗi giống nhau với khối lượng phân tử 21 và 24 KDa được mã hóa bởi các

2.8.3 Sự tạo thành Interferon

Interferon do tế bào sản sinh ra sau khi kích thích bởi virus hoặc một số chấtcảm ứng sinh IFN như các chất polynucleotid tổng hợp (polyIC, polyGC…), một sốthuốc gây giãn mạch như Theophillin, Dipirydamol, Cofein… Một số loại vaccinenhư vaccine phòng bại liệt Sabin, vaccine sởi, vaccine bại liệt, vaccine ho gà… cóthể kích thích tế bào tổng hợp IFN Những glycoprotein này ức chế được nhiều loạivirus nhân lên trong tế bào, kể cả virus gây ung thư (Nguyễn Thị Chính, Ngô TiếnHiển, 2001)

Tính nhạy cảm của IFN với enzym phân hủy protein: do bản chất là proteinhay glycoprotein, IFN dễ bị khử bởi các men tiêu hóa protein như trysin,chymotrypsin và papain

Tính đặc hiệu theo loài: IFN có tính đặc hiệu cho từng loài

Tính kháng nguyên: IFN từ các loài động vật khác nhau có cấu trúc khángnguyên khác nhau, tuy nhiên tính kháng nguyên này rất yếu

2.8.5 Tác dụng của Interferon

Chức năng sinh học quan trọng nhất của IFN là cảm ứng để tế bào sản sinh

ra protein ngăn cản sự khởi đầu dịch mã và phá hủy mARN của virus Bằng chứng

là ở các bệnh nhiễm virus như cúm, sởi, sốt xuất huyết, viêm não Nhật Bản…, vàonhững ngày đầu IFN xuất hiện trong máu với hàm lượng tăng dần Lượng IFN càngtăng thì số lượng virus càng giảm và bệnh càng mau bị đẩy lùi Nhiều người chorằng vai trò ức chế sự nhân lên của virus chủ yếu do IFN vì IFN được hình thành tạichỗ và nhanh chóng hơn kháng thể đặc hiệu, còn kháng thể xuất hiện sau chỉ có tácdụng lâu dài chống tái nhiễm (Phạm Văn Ty, 2005)

IFN có tác dụng ức chế sự tăng sinh nhanh chóng của tế bào ác tính, điều nàycũng do tác động ngăn cản quá trình tổng hợp protein IFN- được dùng để ức chế

IFN có vai trò hoạt hóa tế bào NK để chúng phá hủy tế bào đích nhiễm virus.IFN có tác dụng tăng cường sự biểu hiện của glycoprotein MHC-I và II trên

bề mặt tế bào, tạo điều kiện cho các tế bào của hệ thống miễn dịch nhận diện khángnguyên virus

IFN- với tư cách là lymphokin tham gia vào quá trình điều hòa miễn dịch,thúc đẩy quá trình biệt hóa của lympho T, NK, đại thực bào (Phạm Văn Ty, 2005)

2.8.6 Cơ chế tác động của Interferon

Khi virus hoặc các tác nhân khác cảm ứng sản sinh IFN xâm nhập vào tế bàoeukaryote, sau vài giờ hoặc thậm chí sau một ngày IFN sẽ được hình thành IFN sẽqua màng sinh chất ra ngoài, gắn vào thụ thể dành cho nó trên mặt tế bào lân cận

Có hai loại thụ thể đặc hiệu dành cho IFN Một loại dành chung cho cả IFN-, vàIFN- và một loại dành cho IFN- INF tác động như một hocmon, nhờ AMP vòngtác động vào nhân tế bào cảm ứng bộ gen tế bào tổng hợp ít nhất hai enzym làkinaza và 2,5–Oligoadenylat synthetaza Cả hai loại enzym này đều được hoạt hóanhờ ARN kép do virus cảm ứng tạo thành Điều đó có nghĩa là các enzym này chỉđược hoạt hóa khi có virus xâm nhập vào tế bào Kinaza làm bất hoạt một enzymcần cho sự lắp ráp riboxom, do đó ức chế tổng hợp protein còn 2,5-Olygoadenylatsynthetaza hoạt hóa enzym ribonucleaza phá hủy mARN của virus và do đó cũng ứcchế luôn quá trình tổng hợp protein của virus (Phạm Văn Ty, 2005)

2.8.7 Ứng dụng của Interferon trong phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm

Theo Hồ Nhân (2007), sử dụng Interferon- trong việc phòng, trị bệnh chogia súc, gia cầm là một giải pháp thay thế kháng sinh an toàn- hiệu quả cao

+ Đối với trâu, bò

- Bệnh viêm đường hô hấp: Bovine herpesvirus 1- BHV 1 là nguyên nhângây nên bệnh viêm đường hô hấp trên truyền nhiễm do virus ở bò - đây làmột bệnh phổ biến trên toàn thế giới với các triệu chứng điển hình như sốt,sẩy thai và kèm theo các triệu chứng hô hấp khác Khi bò mắc bệnh này nếuđược điều trị sớm với Interferon- thì sẽ giảm triệu chứng lâm sàng, giảm tỷ

lệ chết do nhiễm khuẩn kế phát

- Bệnh viêm vú: Liệu pháp sử dụng kháng sinh chỉ mang lại hiệu quả vừaphải nên việc kết hợp điều trị với Interferon đã mang lại hiệu quả cao hơn,giảm hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và vấn đề tồn dư kháng sinh trong

- Bệnh do Salmonella: Điều trị kết hợp với Interferon- đã làm giảmnhiễm trùng máu, giảm sốt, hạn chế tiêu chảy và tỷ lệ chết.

+ Đối với heo: Interferon- được sử dụng như là một chất tăng cường tácdụng của hệ miễn dịch không đặc hiệu trong trường hợp con vật mắc các bệnhtruyền nhiễm do virus như hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS-Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), bệnh viêm dạ dày ruột truyềnnhiễm(TGEV- Transmissible gastroenteritis) …

+ Đối với gia cầm

- Tăng sức đề kháng với bệnh truyền nhiễm do Salmonella, E.coli…

- Ứng dụng hiệu quả trong điều trị các bệnh do virus gây ra như: cúm,Marek, Gumboro, viêm gan B do virus ở gia cầm

2.9 Sự biểu hiện interferon- α gà trên bề mặt bào tử B subtilis

Bacillus spp là vi khuẩn Gram (+), hoại sinh, hiếu khí, hình que, tạo nội bào

tử và hiện diện trong đất, nước, thực vật và cả thực vật đang thối rữa Cho đến nay,

giống Bacillus có ít nhất 65 loài chủ yếu phân thành 5 nhóm khác nhau dựa trên trình

tự 16S rRNA (Priest, 1993) Và Bacillus subtilis thuộc nhóm II.

Các báo cáo cho thấy B subtilis gây kích thích miễn dịch hệ thống và miễn

dịch tế bào sau khi uống vào đường tiêu hóa và làm giảm tiêu chảy trên các nghiên

cứu lâm sàng (Mazza, 1994) Tác dụng của bào tử B subtilis như probiotics hay tác

nhân cạnh tranh đã được xác định khi đưa vào đường miệng gà con 1 ngày tuổi 2,5

x 108 bào tử B subtilis đã ngăn chặn được sự lây nhiễm của E coli 078:K80 (La

Ragione và ctv, 2001), với lượng 1 x 109 bào tử B subtilis đủ để ức chế Salmonella

enterica.(La Ragione và ctv, 2003).

Các nghiên cứu in vivo cho thấy, mặc dù B subtilis trong probiotics ở dạng

bào tử nhưng khi vào đường ruột sẽ vẫn tiến hành chu kỳ sống của mình: bào tử nẩy

mầm, tăng sinh và lại tạo bào tử Điều này giải thích cho sự ứng dụng rộng rãi B.

subtilis ở dạng bào tử ngủ (dormant spores) sản xuất các probiotics thương mại cho

người và động vật (Trần Thị Hoa và ctv, 2001)

Với những ưu điểm đó có nghiên cứu đã tạo ra sản phẩm biểu hiện

interferon- α gà trên bề mặt bào tử B subtilis và tiến hành thử nghiệm in vivo trên

bệnh Newcastle ở gà

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Phương tiện thí nghiệm

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 1/2009 đến tháng 4/2009

Địa điểm thí nghiệm:

+ Gà được nuôi tại trại thực nghiệm Bộ Môn Thú Y, Khoa Nông Nghiệp &SHƯD, Trường ĐHCT

+ Các mẫu bệnh phẩm và huyết thanh gà được xét nghiệm tại phòng thínghiệm bệnh truyền nhiễm bộ môn Thú Y, khoa Nông Nghiệp và SHƯD, trườngĐại Học Cần Thơ

3.1.2 Đối tượng thí nghiệm

Gà thả vườn 5 tuần đến 9 tuần tuổi, số lượng 56 con

3.1.3 Vật liệu thí nghiệm

+ Vật liệu và dụng cụ

Ống tiêm y tế 1ml, kim tiêm, ống nghiệm vô trùng, bông gòn vô trùng, găngtay, bình trữ lạnh, máy ly tâm, hematocrite, týp nhựa đựng huyết thanh, đĩamicroplate đáy tròn có 96 giếng, micropipette

+ Các hóa chất và sinh phẩm

Dung dịch PBS, dung dịch sinh lý 0,85%, dung dịch alserver, nước cất, cồn.Hồng cầu gà, huyết thanh gà

Vaccine phòng bệnh đậu gà, vaccine phòng bệnh cúm gia cầm

Virus Newcastle (Nguồn: NAVETCO, chủng cường độc - velogenic )

Huyễn dịch B subtilis (Nguồn: Bộ môn Vi sinh Ký sinh-Khoa Dược, ĐH Y

Dược Tp HCM)

Huyễn dịch B subtilis –IFN tái tổ hợp (Nguồn: Bộ môn Vi sinh Ký

sinh-Khoa Dược, ĐH Y Dược Tp HCM)

Vaccine Newcastle chủng Lasota

3.2 Phương pháp thí nghiệm

3.2.1 Chuẩn bị nuôi gà để thí nghiệm

+ Chuẩn bị chuồng nuôi

Chuồng nuôi gà là kiểu chuồng sàn, diện tích 0,75mx0,75mx1m được chuẩn

bị trước khi đem gà về Xung quanh bao lại bằng lưới chì Dưới đáy đặt tấm tole đểthuận lợi khi vệ sinh Chuồng được sát trùng bằng iodine trước khi thả gà

+ Thức ăn:

Thức ăn cho gà thí nghiệm là thức ăn của công ty Cargill Gà được cho ăn tự

do bằng thức ăn dạng viên phù hợp với từng lứa tuổi: ở giai đoạn từ 1-42 ngày tuổi

sử dụng thức ăn 5101 có hàm lượng đạm 20%; sau 42 ngày tuổi sử dụng thức ăn

5202 có hàm lượng đạm 16%

+ Qui trình chăm sóc

Gà từ 0-3 tuần tuổi được nuôi úm trên lồng, mỗi lồng úm sử dụng một bóngđèn tròn có công suất 75W Xung quanh chuồng được che kín cẩn thận để tránhmưa tạt, gió lùa, phía dưới nền lót giấy báo để dọn phân Sử dụng máng ăn tròn treo

để tránh thức ăn bị rơi vãi và bị dính phân

Tuần thứ 4 và 5 gà không còn nuôi úm, cho ăn uống bình thường, vệ sinh tốtchuồng trại

Gà được cho ăn uống tự do, bổ sung thêm vitamin C, Neo-sulfazyme, ViosolADE, Amdo-C…

Mật độ nuôi: từ 1 ngày đến 2 tuần tuổi: 50 con/m2

2 tuần đến 3 tuần: 35 con/m2

3 tuần đến 4 tuần: 30 con/m2

4 tuần đến 5 tuần: 25 con/m2

+ Quy trình phòng bệnh chung