Thử nghiệm dịch ép lá ổi và củ tỏi trong phòng trị bệnh do vi khuẩn streptococcus trên cá trê lai (clarias macrocephalus female x clarias gariepinus male) luận văn thạc sĩ nông lâm ngư

Đường kính vòng vô khuẩn của dịch ép củ tỏi và 2 loại kháng sinh đối với vi khuẩn Streptococcus spp 3.10.Tỷ lệ sống cá nhiễm bệnh ở thí nghiệm trị bệnh của dịch ép lá ổi 443.11.. Việt Na

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

LÊ HỮU THÀNH

THỬ NGHIỆM DỊCH ÉP LÁ ỔI VÀ CỦ TỎI TRONG

PHÒNG TRỊ BỆNH DO VI KHUẨN Streptococcus spp TRÊN CÁ

TRÊ LAI (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SỸCHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

VINH – 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

THỬ NGHIỆM DỊCH ÉP LÁ ỔI VÀ CỦ TỎI TRONG

PHÒNG TRỊ BỆNH DO VI KHUẨN Streptococcus spp TRÊN CÁ

TRÊ LAI (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SỸCHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

MÃ SỐ: 60.62.70

Người thực hiện: Lê Hữu Thành Người hướng dẫn khoa học: TS Trần Ngọc Hùng

VINH, 2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chânthành và sâu sắc tới Thầy giáo TS Trần Ngọc Hùng, người đã định hướngnghiên cứu đề tài cũng như hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡtôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ Khoa Nông Lâm Ngư, cán bộ Trung tâmTHTN, Khoa Sau đại học Trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện và giúp đỡtôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, gia đìnhbạn bè đã động viên và nhiệt tình ủng hộ để tôi hoàn thành khóa học này

Nghệ An, ngày 12 tháng 10 năm 2012

Tác giả

Lê Hữu Thành

CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU TRONG LUẬN VĂN

TT: Thứ tựNTTS: Nuôi trồng thủy sảnCTTA: Công thức thức ănCT: Công thức

TN: Thí nghiệm Nxb: Nhà xuất bản

DANH MỤC CÁC BẢNG

Số bảng Tên bảng Trang

3.1 So sánh khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus spp của dịch ép

lá ổi và củ tỏi với các thuốc kháng sinh

2.2 Sơ đồ các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn 23

3.1 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch ép lá ổi và 2 loại kháng sinh

đối với vi khuẩn Streptococcus spp

32

3.2 Đường kính vòng vô khuẩn của dịch ép củ tỏi và 2 loại kháng sinh

đối với vi khuẩn Streptococcus spp

3.10.Tỷ lệ sống cá nhiễm bệnh ở thí nghiệm trị bệnh của dịch ép lá ổi 443.11 Tỷ lệ sống của cá của ở các công thức trong thí nghiệm trị bệnh 453.12 Tỷ lệ sống cá nhiễm bệnh ở thí nghiệm trị bệnh của dịch ép củ tỏi 463.13 Tỷ lệ sống của cá của ở các công thức trong thí nghiệm trị bệnh 47

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong phòng, trị bệnhnhiễm khuẩn trên động vật thủy sản

2.3.2 Phương pháp định lượng mật độ vi khuẩn 22

3.1 Kết quả thử kháng sinh đồ của dịch ép lá ổi và củ tỏi đối với vikhuẩn Streptococcus spp

3.4 Kết quả thử nghiệm khả năng phòng bệnh của lá ổi và củ tỏi đối với

vi khuẩn Streptococcus spp gây ra trên cá trê lai

Cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) là

loài cá dễ nuôi và có khả năng chống chịu với môi trường khắc nghiệt Đây làđối tượng trong những năm qua đã được nuôi khá phổ biến Song người nuôivẫn còn gặp một số khó khăn bất cập bởi thị trường chưa thực sự ổn định hơnnữa còn bị tác động bởi dịch bệnh Một trong những tác nhân gây bệnh nguyhiểm cho đối tượng cá trê lai nói riêng và cho cá nước ngọt nói chung là vikhuẩn Streptococcus spp Ở nước ta, dù chưa xảy ra những trận dịch nghiêm

trọng nhưng đã có những thiệt hại cảnh báo về dịch bệnh do đối tượng này gây

ra, ước tính thiệt hại hằng năm khoảng 150 triệu USD [22]

Một trong những giải pháp để phòng trị các bệnh do vi khuẩn hiện nay

là sử dụng các loại kháng sinh, tuy nhiên đây cũng là con dao hai lưỡi Nếu sửdụng kháng sinh không đúng cách thì không những không chữa được bệnhcho đối tượng nuôi mà còn có thể ảnh hưởng xấu tới sức khỏe, môi trườngsinh thái và tạo ra các dòng vi khuẩn kháng thuốc Ngoài ra, việc sử dụngkháng sinh trong điều trị bệnh động vật thủy sản có thể để lại dư lượng trongsản phẩm sẽ gây hại cho người tiêu dùng và khả năng tiêu thụ sản phẩm

Từ giai đoạn những năm 80, 90 trên thế giới đã thống kê có xấp xỉ 20%các loài thực vật có các hoạt tính sinh học phù hợp để tạo thành dược phẩm

Và hiện nay, phần lớn các loại kháng sinh được giới thiệu trên thị trườngđược nhiều người tiêu dùng ưa chuộng đều có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc bántổng hợp [13] Chính vì những ưu điểm đó, con người cũng đã nghiên cứu sửdụng các loại thảo dược trong phòng và trị bệnh nhiễm khuẩn cho các đốitượng nuôi trong đó động vật Thủy sản cũng đã có khá nhiều nghiên cứu thửnghiệm cho thấy kết quả khả quan Đặc biệt, trong những năm qua khi vấn đềkháng thuốc và tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm Thủy sản đang là mốiquan tâm của người tiêu dùng thì việc sử dụng kháng sinh nguồn gốc từ tựnhiên là giải pháp vừa đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và thân thiện vớimôi trường sinh thái [14]

Việt Nam là một trong những quốc gia có tiềm năng đa dạng sinh họccao, nhiều loại thảo dược quý đã được ghi nhận là có khả năng kháng khuẩn

và đã được ứng dụng vào việc chữa trị các bệnh nhiễm khuẩn trên người vàmột số loại động vật khác [19] Do đó cũng đã có một số nghiên cứu về tácdụng của các loại thảo dược như: tỏi, lá húng, trầu không, nghệ, hẹ, lá ổi….trên các đối tượng cá chép, tôm sú, cá trắm cỏ, cá rô phi vằn,… Nhưng hầunhư các nghiên cứu này chỉ mới dừng ở thử nghiệm tính kháng khuẩn của cácloại thảo dược đó

Chính vì vậy, được sự cho phép của Khoa Sau đại học, Trường Đại hocVinh và kế thừa những nghiên cứu trước chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Thử nghiệm dịch ép lá ổi và củ tỏi trong phòng trị bệnh do vi khuẩn

Streptococcus spp trên cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias

gariepinus male)”

2 Mục tiêu nghiên cứu đề tài

Xác định khả năng phòng trị bệnh lở loét do vi khuẩn Streptococcus

spp gây ra trên cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus

male) của dịch ép lá ổi và dịch ép củ tỏi trong điều kiện thực nghiệm

3 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài triển khai các nội dungsau:

- Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của dịch ép lá ổi và dịch ép củ tỏi đốivới vi khuẩn Streptococcus spp

- Thử nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dịch ép củ tỏi và dịch ép lá ổi tới khảnăng kháng vi khuẩn Streptococcus spp

- Thử nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng kháng vi khuẩnStreptococcus spp của dịch ép lá ổi và dịch ép củ tỏi

- Thử nghiệm khả năng phòng bệnh lở loét cho cá trê lai (Clarias

macrocephalus female x Clarias gariepinus male) do vi khuẩn Streptococcus

spp gây ra của dịch ép lá ổi, dịch ép củ tỏi trong điều kiện thực nghiệm

- Thử nghiệm khả năng trị bệnh lở loét cho cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias gariepinus male) do vi khuẩn Streptococcus spp gây ra của

dịch ép lá ổi, dịch ép củ tỏi trong điều kiện thực nghiệm

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá trê lai được lai giữa cá trê phi và cá trê vàng, có ngoại hình tương tự

cá trê vàng, da trơn nhẵn, đầu dẹp, thân hình trụ, dẹp ở đuôi Thân có màuxám có những chấm nhỏ mờ, u lồi xương chẩm có hình gần giống chữ M vớicác góc tròn, trong khi ở cá trê vàng là chữ U còn có trê phi là chữ M có cácgóc nhọn và rõ nét [38]

- Đặc điểm thích ứng môi trường:

Cá trê lai thích ứng rộng với môi trường nước, cá có thể sống trong giớihạn nhiệt độ từ 11-39,5oC; pH: 3,5-10,5; độ mặn dưới 15‰ Do có cơ quan hôhấp phụ nên cá trê có thể thở bằng oxy không khí, sống được ở môi trườngnước có hàm lượng oxy thấp thậm chí sống được ở trên cạn 1 giờ nếu giữđược độ ẩm cho cá [38]

- Đặc điểm dinh dưỡng:

Từ khi cá mới nở đến 48 giờ cá sử dụng noãn hoàng Sau đó bắt đầu ănđộng vật phù du cỡ nhỏ như trứng nước, ấu trùng muỗi… Sau vài ngày có thể

ăn bọ gậy… Khi cá đạt cỡ 4-6cm bắt đầu ăn tạp thiên về động vật thối rữa,tôm cá nhỏ, ruốc, tép, côn trùng, các loại phế phẩm chế biến và thức ăn tinhkhác như cám gạo, bã rượu, phân gia súc… [38]

- Đặc điểm sinh trưởng:

Cá trê lai lớn rất nhanh, trong điều kiện môi trường nuôi tốt, mật độthích hợp và chăm sóc tốt có thể tăng trọng 100-150g/con/tháng Sau 6 thángnuôi đạt trọng lượng bình quân 0,4-0,6kg/con [38]

- Tập tính sống:

Cá trê lai nuôi ít bị bệnh, chúng thường chui rúc đào hang dễ làm hỏng

bờ ao Khi mặt nước ao nuôi cao xấp xỉ bờ ao, cá thường phóng lên bờ Cá trêlai hoạt động bơi lội và ăn mạnh vào chiều tối và mờ sáng

- Cá trê lai có những đặc điểm nổi trội hơn so với cá trê vàng và cá trê phi

+ Cá trê phi: Có nguồn gốc từ Châu Phi Tên khoa học là Clarias

gariepinus Thân có màu xám có những mảng vân đen to, cá lớn nhanh.

Cá trê phi trong vòng 6 tháng đạt bình quân 1kg/con Trọng lượng cá đạt tối

đa là 12,8kg nhưng thịt mềm ít thơm

Vì vậy ít được sử dụng nuôi thương phẩm vì giá trị tiêu thụ của loài này thấp

+ Cá trê vàng: Tên khoa học Clarius macrocephalus có màu vàng nâu

điểm đốm nhỏ màu vàng thành hàng trên thân, thịt rất thơm ngon nhưng cókích thước nhỏ, nuôi chậm lớn, nuôi 1 năm chỉ đạt 300g/con

+ Cá trê lai: Cá trê lai dễ nuôi, mau lớn, nuôi tốt có thể tăng trọng

bình quân 100g/con/tháng Do được lai giữa 2 loài cá trê phi và cá trê vàngnên nó có nhiều đặc điểm nổi trội của cả 2 loài trên Tuy nhiên cá Trê lai sinhsản kém, không có hiệu quả trong sản xuất Chủ yếu chỉ sử dụng con lai F1 đểlàm cá thịt

1.1.2 Vi khuẩn Streptococcus spp

Có rất nhiều hệ thống phân loại vi khuẩn Streptococcus spp khác nhau.Theo Bergey 1957, Streptococcus spp thuộc:

Vi khuẩn có kích thước 0,5 x 1- 1,5 μm.

Streptococcus spp là vi khuẩn thường gây bệnh lở loét trên cá hay còngọi là bệnh đốm đỏ [2] Nó thường tìm thấy trong các khu vực có khí hậu ấm,ngoài ra chúng ta còn tìm thấy trong muối tươi, biển và nơi cửa sông, đượcphân lập từ người và động vật Vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên cá,người và động vật lưỡng cư như ếch, thằn lằn, cá sấu… [7] Streptocuccus sppphát triển tốt trên các môi trường thạch Tryptic Soy, Brain Heart Infusion,Muller-Hinton, Nutrien agar và thạch máu cừu Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp

25 - 28oC Sau 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo khuẩn lạc nhỏ (0,5 - 0,7mm) màutrắng đục, hình tròn, hơi lồi Một số chủng vi khuẩn tạo khuẩn lạc trong suốt

có tính nhầy sau 24 giờ nuôi cấy Vi khuẩn không phát triển ở điều kiện pH9,6, NaCl 6.5%, nhiệt độ 10oC và 45oC

Streptococcus spp là tác nhân chính của các bệnh nguy hiểm gây nên

thiệt hại lớn ở cá Rô phi nói riêng và cá nước ngọt nói chung, làm ảnh hưởngđến hiệu quả kinh tế của nghành nuôi trồng thủy sản thế giới [22]

Bệnh do vi khuẩn Streptococcus spp thường gây hoại tử gan, lá lách vàthận thành những đốm màu nhạt ở cá rô phi [15]

Những loài cá khác nhau khi bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus spp cho

một số dấu hiệu chung điển hình như: Màu sắc đen tối, bơi lội không bìnhthường, mắt cá lồi và đục, xuất huyết ở các vây và xương nắp mang Các vếtxuất huyết lan rộng thành lở loét, nhưng các vết loét thường nông hơn cácbệnh cá lở loét khác Cá bị bệnh vận động khó khăn, không định hướng, cábệnh có hình thức bơi xoắn, thận và lá lách tăng lên về thể tích do bị phù nề

1.1.3 Lá ổi

Cây ổi có tên khoa học là Psidium guyjava L (P pomiferum L.

Psidium Pyriferum L.) trong dân gian còn gọi là phan thạch lựu, thu quả, kê

thỉ quả, phan nhẫm, bạt tử, lãm bạt, phan quỷ tử

Quả và lá ổi đều chứa beta-sitosterol, quereetin, guaijaverin,leucocyanidin và avicularin; lá còn có tinh dầu dễ bay hơi eugenol Quả chínchứa nhiều vitamin C và các polysaccarit như fructoza, xyloza, glucoza,rhamnoza, galactoza Rễ có chứa axit arjunolic Vỏ rễ chứa tanin và các axithữu cơ

Trong lá và búp non chứa 7 - 10% một loại tannin pyrogalic, axitpsiditanic, chừng 3% nhựa và rất ít tinh dầu (0,36%) [7]

Hàm lượng dinh dưỡng trung bình trong 100 gam quả ổi: 1 gamprotein; 15 mg canxi; 1 mg sắt; 0,06 mg retinol (vitamin A); 0,05 mg thiamin(vitamin B1) và 200 mg axit ascorbic (vitamin C) Hàm lượng vitamin C caotrong quả ổi hơn đáng kể so với trong cam Quả ổi cũng giàu pectin.

Theo một tài liệu khác, quả ổi chứa 77,9% nước; 0,9% protein; 0,3%lipit; 15 % cacbohydrat; 0,3% axit hữu cơ; 0,5 % tro; 0,03 mg% vitamin B1;0,03 mg% vitamin B2; 0,2 mg% vitamin PP; 50 - 60 mg% vitamin C Cácloại đường trong quả ổi gồm 58,9 % fructoza; 35,7 % glucoza; 5,3 %saccaroza Các axit hữu cơ chính là axit citric và axit malic [35]

* Một số nghiên cứu về lá ổi

Theo kinh nghiệm dân gian nhiều nơi đã dùng lá ổi giã nát hoặc nướcsắc lá ổi để làm thuốc sát trùng, chống nấm, chữa các trường hợp lở loét lâulành, làm giảm sốt, chữa đau răng, chữa ho, viêm họng… và có thể dùngriêng lá ổi non hoặc phối hợp với chè, gừng…để chữa đau bụng đi ngoài.Theo nghiên cứu dược lý cho thấy dịch chiết các bộ phận của cây ổi đều cókhả năng kháng khuẩn, làm se niêm mạc… [39]

Nghiên cứu của Trần Thanh Lương và các cộng sự cho biết tác dụngchống nhiễm khuẩn và nhiễm nấm là do 2 hoạt chất Beta-caryophyllene vàAlpha-caryophyllene Ở Ấn Độ, người ta còn dùng nước sắc lá ổi để chữa

viêm thận, động kinh [3].

* Một số nghiên cứu khác trong phòng thí nghiệm:

Các trích tinh từ lá và vỏ thân có tác dụng sát khuẩn đối với các vi

khuẩn như Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Bacillus, E.coli, Clostridium và Pseudomonas Dịch chiết từ lá ổi pha với nước muối với tỷ lệ 1:40 có tác dụng diệt vi khuẩn Staphylococcus aureus Nước ép tươi từ lá ở nồng độ 66% có hoạt tính diệt siêu vi Tobacco mosaic Nước trích từ lá ngăn chặn được sự tăng trưởng của các nấm Trichophyton rubrum,

T.mentagrophytes và Microsporum gypseum [39].

Một nghiên cứu tại Jordan ghi nhận rằng dịch ép lá ổi có tác dụng ngăn

chặn sự phát triển của mụn trứng cá do các vi khuẩn loại Propioni bacterium

acnes gây ra Tuy không bằng các kháng sinh doxycyclin và clindamycin

nhưng có thể hiệu nghiệm trong các trường hợp mụn trứng cá lờn kháng sinh

và không dùng được kháng sinh [7]

Nghiên cứu tại Brazil cho thấy dịch chiết từ lá ổi có nhiều hoạt tính tácđộng lên hệ tim mạch và có thể dùng để điều trị trong các trường hợp tim loạnnhịp Lá ổi còn có tác dụng chống oxy hóa và rất có lợi cho tim, bảo vệ tim,cải thiện các chức năng của tim.[7]

Nghiên cứu tại Hàn Quốc chỉ ra rằng trong lá ổi có hoạt tính ức chế menprotein tyrosine hosphatase 1B Người ta đã thử nghiệm hoạt tính này trênchuột nuôi thí nghiệm thì thấy có tác dụng trị đái tháo đường type 2 Cũngnghiên cứu về vấn đề này, các nhà khoa học Đài Loan cũng cho rằng nước ép

từ quả ổi tươi trích qua màng phúc mạc với liều 1g/kg giúp làm hạ đườnghuyết tạo ra bởi alloxan Chính vì thế, một số nhà nghiên cứu đã kết luận: Ăn

Ổi tươi, chứa lượng cao các chất xơ hòa tan (pectin) và không hòa tan có thểgiúp hạ đường huyết một cách an toàn, điều này có ý nghĩa rất lớn đối với cácbệnh nhân bị bệnh đái tháo đường [39]

Như vậy, hầu như các nghiên cứu về tác dụng của dịch ép lá ổi chủ yếumới được tiến hành phòng trị bệnh ở người Còn trong nuôi trồng thủy sản thìcác nghiên cứu này rất ít Năm 2010, nghiên cứu của Nguyễn Thu Dung vềtính kháng khuẩn của một số loại thảo dược như nghệ, cỏ lào, cỏ mực, húngquế đối vi khuẩn Streptococcus spp kết quả cho thấy dịch ép lá ổi là một trongnhững loại có khả năng kháng khuẩn tốt, với đường kính vòng kháng khuẩnđạt 20,630,43mm

1.1.4 Tỏi Allium sativum L.

Thuộc họ Hành - Alliaceae

Hình 1.4 Tỏi Allium sativum L

- Đặc điểm:

Thuộc dạng cây thảo sống nhiều năm Thân thực hình trụ, phía dướimang nhiều rễ phụ, phía trên mang nhiều lá Lá cứng, hình dải, thẳng dài 15-50cm, rộng 1-2,5cm có rãnh khía, mép lá hơi ráp Ở mỗi nách lá phía gốc cómột chồi nhỏ sau này phát triển thành một tép Tỏi; các tép này nằm chungtrong một cái bao (do các bẹ lá trước tạo ra) thành một củ Tỏi tức là thân hành(giò) của Tỏi Hoa xếp thành tán ở ngọn thân trên một cán hoa dài 55cm hayhơn Bao hoa màu trắng hay hồng được bao bởi một cái mo dễ rụng, tận cùngthành mũi nhọn dài Hoa tháng 5-7, quả tháng 9-10.

- Bộ phận dùng: Thân hành (giò) - Bulbus Allii, thường có tên là Ðại toán

- Nơi sống và thu hái: Cây của miền Trung châu Á, được gây trồng ở nhiềunước ôn đới Ở nước ta, cũng trồng nhiều, có những vùng trồng Tỏi có tiếng ởQuảng Ngãi, Hà Bắc, Hải Hưng Tỏi là gia vị rất quen thuộc trong đời sốngcủa nhân dân ta Thường ta thu hoạch vào cuối đông, đầu xuân; có thể dùngtươi hay phơi khô dùng dần

- Tác dụng dược lý:

Trong các nghiên cứu và thử nghiệm các loại thuốc chiết xuất từ dịch

ép củ Tỏi trên người bệnh đã cho thấy Tỏi có tác dụng chữa trị nhiều cănbệnh khác nhau Trong tỏi tươi có chất allicin, nhờ tác dụng của men allinazachuyển hóa aliin có sẵn trong tỏi thành allicin, là chất chủ yếu gây tác dụngđối với vi khuẩn Allicin là chất kháng sinh tự nhiên có tác dụng mạnh hơn cảpenicillin Nước tỏi pha loãng 125.000 lần vẫn có dấu hiệu ức chế nhiều loại

vi khuẩn gram âm và gram dương như: Staphylococcus, Streptococcus,

samonella, V cholerae, B dysenteriae, Mycobacterium tuberculosis Tỏi

cũng ức chế sự phát triển của nhiều loại siêu vi như bại liệt, cúm và một sốloại nấm gây bệnh ở da hoặc bộ phận sinh dục nữ như candida Trong Tỏi còn

có liallyl sulfide, chất này tuy không mạnh bằng allicin nhưng có thể tồn tạilâu hơn và giữ nguyên được dược tính khi nấu [36] Data (1948) đã chiết xuất

từ Tỏi một chất gọi là allistalin, có tính chất giống như allicin; Machado(1948) cũng chiết xuất từ Tỏi chất garcin, nó là một chất kháng khuẩn màuvàng, không có mùi lưu huỳnh, không độc, có tác dụng đến cả vi khuẩn Gram(-) và Gram (+) Garcin có thể dễ dàng hấp thu qua thành ruột và có thể đi tớidịch não tủy, đã ứng dụng có kết quả trong nhiễm khuẩn Shigella hoặc do các

bệnh ký sinh trùng như giun kim, giun đũa và giun tóc Các nhà khoa học Mỹ

đã tìm thấy chất prostagladin A trong nước Tỏi có khả năng hạn chế bệnhnhồi máu cơ tim, hạ huyết áp, phòng bệnh xơ vữa động mạch Các bác sĩ NhậtBản lại nhận xét rằng do Tỏi chứa chất allixotine nên Tỏi có tác dụng chữađau lưng, viêm khớp Ngoài ra các nghiên cứu lâm sàng cũng cho thấy Tỏi cótác dụng chữa trị được nhiều căn bệnh như: các bệnh về tai, mũi, họng; bỏngnhiễm khuẩn và vết thương có mủ; dùng Tỏi để trị các loại giun; dùng nước

ép Tỏi để trị viêm âm đạo trùng roi; chữa các bệnh về tim mạch [37] Theokinh nghiệm của người dân, có thể dùng tỏi trộn vào thức ăn cho cá để trịbệnh viêm ruột ở cá Trắm cỏ

Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được côngdụng diệt vi khuẩn của tỏi Năm 1944, nhà hóa học Chester J Cavallito đãphân tích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh.Allicin chỉ có trong tỏi chưa nấu Kháng sinh này mạnh bằng 1/5 thuốcpenicillin, 1/10 thuốc tetraciline, có tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn, xuađuổi hoặc tiêu diệt nhiều sâu bọ, ký sinh trùng, nấm độc Năm 1948,Marchado cùng cộng sự đã chiết xuất từ tỏi được garcilin, chất này không cómùi lưu huỳnh, không độc, ứng dụng tốt trong bệnh nhiễm trùng Shigella,Salmonella hoặc các bệnh ký sinh trùng như giun kim, giun đũa, giun tóc

Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinhchất của tỏi có thể chữa được nhiều bệnh nhiễm độc bao tử, do thức ăn có lẫn

vi khuẩn [18]

Hiện nay, ở Trung Quốc sản phẩm có nguồn gốc từ tỏi (Alliumsativum)

dạng bột mịn trắng đã được người dân sử dụng rộng rãi, được xem như mộtloại kháng sinh phổ rộng để phòng và trị bệnh các bệnh nhiễm khuẩn choĐVTS nuôi [19]

Tại Việt Nam, nghiên cứu về tỏi cũng đã được triển khai khá lâu Côngtrình nghiên cứu đầu tiên được thực hiện từ giai đoạn năm 1990 – 1995 của

Hà Ký, Bùi Quang Tề và cộng sự đã cho ra đời Thuốc KN-04-12 Thành phầnthuốc bao gồm các cây thuốc có kháng sinh thực vật (tỏi, sài đất, nhọ nội, cỏsữa, chó đẻ răng cưa….), vitamin và một số vi lượng khác Thuốc đượcnghiền thành bột, có mùi đặc trưng của tỏi Thuốc có tác dụng phòng và trị

bệnh nhiễm khuẩn như đốm đỏ, thối mang, viêm ruột của ao nuôi lồng hoặcnuôi ao Bên cạnh đó một số tác giả cho rằng khi cá có dấu hiệu ban đầu củabệnh nhiễm khuẩn có thể trị bằng cách cho tỏi (0.5 kg tỏi/100 kg cá) và bổsung 0,3% muối ăn trong thức ăn viên cho cá ăn, hiệu quả đạt được rất tốt [8].

Năm 2005, Bùi Quang Tề và cộng sự đã sản xuất thành công sản phẩmvới tên VTS1 - C và VTS1 - T được phối chế từ các hoạt chất tách chiết từ

tỏi (Allium sativum), sài đất (Weledia calendulacea), nhọ nồi (Elista alba

Hassk) để phòng trị bệnh cho tôm Sú và cá tra nuôi ao và nuôi lồng để phòng

trị một số bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophyla, Edwardsiella tarda,

Hafnia alvei, Vibrio harveyi, Vibrio alginolyticus

Với VTS1 - C gồm 30% cao dầu tỏi và 70% cao dầu sài đất dùng cho

cá Tra và cá Basa Cách dùng: 0,1 - 0,2g/kg cá/ngày Trộn 100 g thuốc với 20

kg thức ăn tinh cho 500 - 1000 kg cá ăn/ngày, cho ăn 3 ngày liên tục để phòngbệnh và 6 - 10 ngày khi trị bệnh

Với VTS1 - T gồm 30% cao dầu tỏi và 70% cao dầu sài đất hoặc cao dầunhọ nồi dùng trị bệnh cho Tôm sú Cách dùng: 0,2g/kg tôm/ngày Trộn 100gthuốc với 10 kg thức ăn tinh cho 500 kg tôm ăn/ngày Có thể dùng dầu mực

để bao thức ăn và thuốc (10 kg/kg thức ăn) cho ăn 5 ngày liên tục để phòngbệnh và 6 - 10 ngày khi trị bệnh

Năm 2006, trung tâm quan trắc cảnh báo môi trường Thủy sản, dưới sự

hỗ trợ của dự án NORAD đã nghiên cứu và cho ra đời sản phẩm Thuốc

BecaNor 1 và BecaNor 2 là hai sản phẩm với thành phân chính là tỏi và gừng.Bước đầu thử nghiệm đã có hiệu quả rất tốt trong việc phòng và trị bệnh đốm

đỏ trên cá trắm cỏ ở qui mô phòng thí nghiệm Đồng thời kết quả cũng đãđược tiến hành ngoài thực địa tại 3 tỉnh Quảng Ninh, Nam Định, Hà Giangphòng bệnh cho cá trắm cỏ, hàng tháng cho cá ăn dược thảo với liều lượng7g/ kg thức ăn Kết quả thu được cho thấy tại 2 tỉnh Quảng Ninh và NamĐịnh, cá trắm cỏ cho ăn thuốc phòng đã không nhiễm bệnh trong khi đó ở các

lô đối chứng vẫn có hiện tượng cá chết do nhiễm bệnh vi khuẩn Tại tỉnh HàGiang, tỷ lệ chết giảm từ 100% xuống còn 40% khi cho cá ăn thuốc phòng[6] Tuy nhiên, việc thử nghiệm chưa được thực hiện trên diện rộng nên chưakhẳng định được hiệu quả của các dược thảo này đồng thời chưa được áp

dụng rộng rãi [24].

Nghiên cứu khác của Đại học Huế về tỏi trong việc chế tạo ra sản phẩmBokashi tỏi và chuối dùng để cải thiện môi trường các ao nuôi trồng thuỷ sản,khi nồng độ BOD và COD quá cao (ao sủi bọt, váng nổi nhiều) làm cho cá,tôm nổi đầu, dùng EM thứ cấp được té đều trên mặt ao, sau 1 đến 2 giờ tôm

cá khỏe mạnh bình thường, dùng Bokashi tỏi và chuối cho tôm ăn để trị bệnhđầu vàng cho tôm sú (kết quả này đã được kiểm chứng tại một số hộ nuôi ở xã

Đại Đồng, huyện Tứ Kỳ, tỉnh Hải Dương [1].

1.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong phòng, trị bệnh nhiễm khuẩn trên động vật thủy sản

1.2.1 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trên thế giới

Nghiên cứu về tác dụng của thảo dược trong điều trị và phòng bệnhtrong nuôi trồng thủy sản hiện nay vẫn còn khiêm tốn Với những lợi ích thiếtthực mà việc nghiên cứu này đem lại là rất lớn Với nguồn thảo dược luônxuất hiện trong thiên nhiên thì nó sẽ mang lại nhiều lợi ích nếu ta biết ứngdụng vào trong cuộc sống cũng như trong nuôi trồng thủy sản Các nghiêncứu trên Thế Giới chủ yếu là nghiên cứu về phần thô, dịch chiết, dịch ép…các loại thảo dược Và ở mỗi nước có những hướng nghiên cứu khác nhau

*Ở Trung quốc: Người ta đã nghiên cứu hiệu quả của 2 loại thảo dược

cây Hoàng kỳ (Astralagus radix) và rễ cây Hoàng cầm (Scutellavia radiis) lên tính miễn dịch đặc hiệu của cá Rô phi Kết quả cho thấy Astralagus radix cho

ăn với nồng độ 0,1% và 0,5% trong thời gian 3 tuần là có hiệu quả tối ưu

nhất; với Scutellavia radiis cần có thêm thí nghiệm để tìm ra nồng độ và thời

gian cho ăn thích hợp [29] Năm 2007 cũng tại Trung Quốc thêm một nghiêncứu khác về tính miễn dịch của cá Chép, trộn lẫn một số loại thảo mộc với

nhau như cây Hoàng kỳ (Astragalus mempranaceus) (phần rễ và thân), cây

Hà thủ ô (Poligonum multiflorum) (phần rễ), cây Bọ mẩy (Isatis tinctoria) (phần rễ) và cây Cam thảo (Glycyrrhida grabra) (phần thân) cho cá Chép ăn

0,5% và 1% trong thời gian 30 ngày, kết quả cho thấy thảo dược giúp tínhmiễn dịch của cá tăng lên đáng kể [27]

* Ở Ấn Độ

Đã tiến hành nghiên cứu trong quy mô phòng thí nghiệm với 3 loại thảo

mộc: Hương nhu tía (Ocimum sanctum), cây cọ lùn răng cưa (Withania

somnifera) và nhục đậu khấu (Myristica fragrans) kết quả cho thấy chúng có

khả năng kháng lại vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh trên cá Song (Epinephelus tauvina) Thí nghiệm được tiến hành với cá Song có khối lượng

30,0±0,5gram, các loại thảo mộc trên được ép lấy dịch và trộn vào thức ăncho cá ăn với các mức 100, 200, 400 và 800mg/kg thức ăn Kết quả cho thấy

ở các lô thí nghiệm đối chứng không sử dụng thức ăn trộn thảo dược tỷ lệ cáchết lên đến 100%, các lô thí nghiệm cho ăn với lượng 100, 200mg/kg thức

ăn tỷ lệ chết giảm 5%, các lô ăn với lượng 400 và 800mg/kg thức ăn tỷ lệ chếtgiảm 10 - 12% [31] Cũng tại Ấn Độ đã có nghiên cứu kết luận chất chiết từ

lá ổi và quả ổi (Allium sativum) có tác dụng chống lại các loài vi khuẩn

Staphylococcus, Shigella, Salmonella, Bacillus, E.coli, Clostridium và Pseudomonas [31]

Năm 2004, theo Hasna Banu, ông đã nghiên cứu cây Neem hay còn gọi

là xoan Ấn Độ (Azadirachta indica), lá Ổi (Allium sativum) và cây Răm nước (Polygonum hydropiper) kết quả chỉ ra rằng chúng có tác dụng kháng khuẩn đối với một số loài vi khuẩn như: Staphylococcus, Shigella, Salmonella,

E.coli và Pseudomonas đặc biệt khi sử dụng các loài cây này thì không gây ô

nhiễm môi trường [28] Một nghiên cứu khác cũng đề cập đến hiệu quả củathảo mộc đối với tính miễn dịch của động vật Thủy sản trên cá Chép Ấn độ.Thí nghiệm tiến hành với cỡ cá có khối lượng (200±17g) cho ăn thức ăn có

chứa 0,5% rễ cây Cỏ xước (Achyranthes aspera), sau 4 tuần cho ăn nhận thấy

cá có khả năng sản sinh ra kháng thể kháng lại độc lực của loài vi khuẩn này.[29]

* Thái Lan, Sataporn Direkbusarakom và cộng sự (1997) đã thử

nghiệm thành công khả năng kháng khuẩn của các loài thảo dược như: Cây

hương nhu tía (O.sanctum), cây Muồng trâu (C.alata), dây Thần nông

(Tinospora cordifolia), cỏ mực (Eclipa alba), ổi (Psidium guajava), cây Bìm

bịp hay Mảnh cộng, lá Cầm (Clinacanthus nutans), cây Xuyên tâm liên (Andrographic panniculata), cây Mướp đắng (Momordica charatina), cây Phèn đen (Phyllanthus reticulates), cây Diệp hạ châu đẹp (Phyllanthus

Pulcher), Chùm ruột (Phyllanthus Acidus), cây chó đẻ răng cưa xanh lá mạ

(Phyllantus Amarus) đối với vi khuẩn Vibrio spp Tuy nhiên, chỉ có hai cây ổi (P.guajava) và Mướp đắng (M.charantina) là có hiệu quả ức chế đối với

Vibrio spp Nồng độ ức chế tối thiểu của P guajava là 0,625mg/ml và M charantina là 1,25mg/ml.

* Ở Ai Cập, theo kết quả nghiên cứu của Muohan Thakare, 2004 Khi

ông tiến hành nghiên cứu tính kháng khuẩn của cây nghệ (Curcuma longa), gừng (Zingiber officinale), hạt tiêu đen (Piper nigrum), cây quế (Cinnamomum cassia), cây húng tây (Thymus vulgaris), cây nguyệt quế (Laurus nobilis), và cây đinh hương (Syzgium aromaticum) với một số loài vi khuẩn cụ thể như E.coli, S typhimurium, E faecium, và E faecalis bằng

phương pháp kháng sinh đồ Kết quả chỉ rõ dịch tách chiết từ nghệ có tính

kháng E coli, S typhimurium, và E faecalis với nồng độ 130 mg/khoanh,

cũng phương pháp tương tự húng tây có tính kháng khuẩn tại nồng độ đạt 30mg/khoanh, nhưng cả hai loại thảo mộc này lại không có hiệu quả đối với

E.faecium, các thảo mộc còn lại chỉ rõ không có hoạt tính kháng 4 loài vi

khuẩn được chọn đưa vào nghiên cứu các bước tiếp theo về thử tác dụng phụtrên nhiều loài động vật thuỷ sản thì định hương có ảnh hưởng đến sự tăngtrọng

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và sử dụng thảo dược trong nước

Việc sử dụng các loài cây quen thuộc trong vườn để trị các bệnh thôngthường như đường ruột, bệnh đường hô hấp, mụn nhọt, vết thương… chongười đã có từ xa xưa Nó đã khẳng định các loại cây có thể sử dụng trongphòng và trị bệnh nuôi trồng thủy sản

Theo y học cổ truyền, phần lớn những cây thuốc có tác dụng chữa bệnhnhiễm khuẩn đã được xếp trong nhóm thuốc thanh nhiệt giải độc, táo thấp,thuốc khử hàn, như alicin trong tỏi, odorin trong hẹ, [17]

Từ thế kỷ XIV, Đại y thiền sư Tuệ Tĩnh đã sử dụng nhiều thảo mộc nhưtỏi, hẹ, tô mộc, hạt cải, trầu không để trị một số bệnh viêm nhiễm [19]

Từ giữa thế kỉ XX, theo kết quả nghiên cứu của Phạm Văn Ngữ (1956)trên 500 loài cây thuốc, đã khẳng định rằng nhiều cây có tác dụng kháng

khuẩn rất lớn Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Hưởng và cộng sự(1959), trên 1000 cây thuốc, chỉ ra rằng kháng sinh thực vật sử dụng rất antoàn, có tác dụng mạnh, nhóm nghiên cứu đã đưa ra chế phẩm cây tô mộc trịbệnh tiêu chảy [7].

Trong công trình nghiên cứu của Bùi Quang Tề và Vũ Thị Tám có đềcập đến ý kiến của Nguyễn Ngọc Hạnh và cộng sự về nghiên cứu thử nghiệmthành công các hợp chất chiết xuất từ thảo dược, như Hepato và Alixin có tácdụng hỗ trợ tiêu hoá tốt, giúp tôm khoẻ mạnh, sinh trưởng bình thường, cókhả năng chống nhiễm bệnh đặc biệt các bệnh về gan Trong đó Hepato cócông dụng hỗ trợ và bảo vệ gan phòng và trị bệnh về gan như MBV và teogan [10]

Nghiên cứu khác của Phan Xuân Thanh và cộng tác viên (2002) đã xácđịnh được chất: 2-hydroxy-6-pentandecatrienilbenzoat có nguồn gốc từ thảodược, có tác dụng phòng trừ các bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra Nhằm mụcđích sử dụng các hoạt chất sinh học thay thế các hoá chất độc và kháng sinhtrong lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sản [17]

Trong báo cáo “Sử dụng kháng sinh thảo mộc phòng và chữa trị một

số bệnh nhiễm khuẩn trong nuôi động vật thuỷ sản”, Nguyễn Thị Vân Thái vàctv đã trình bày về khả năng sử dụng y dược y học cổ truyền trong phòng vàchữa trị một số bệnh nhiễm khuẩn cho tôm cá, động vật thân mềm… thay thếcác thuốc kháng sinh hiện đang phổ biến trên thị trường Các tác giả đã đưa raphương pháp phòng bệnh bằng thức ăn bổ trợ có tác dụng tăng cường sức đềkháng của động vật thuỷ sản

Trong một nghiên cứu vào năm 2006, Nguyễn Viết Khuê và ctv chothấy trong số những người được phỏng vấn có 41,33% người nuôi sử dụngthảo dược, phổ biến là tỏi và lá xoan, 15% dùng không hiệu quả, 85% đạt hiệuquả từ ít đến nhiều Việc nghiên cứu thành phần các hợp chất có trong thảomộc là cơ sở nghiên cứu cho ra các sản phẩm thuốc ứng dụng phòng trị bệnhđộng vật thuỷ sản nói riêng

Từ những nghiên cứu thử nghiệm trên, đã có một số loại thảo dược ứngdụng vào sản xuất và tiêu thụ trên thị trường, phục vụ nhu cầu phòng trị bệnh

cho các đối tượng thủy sản điển hình như: Thuốc KN-04-12 là sản phẩm phốichế của đề tài cấp nhà nước mã số KN-04-12 năm 1990-1995 Thành phầnthuốc bao gồm các cây thuốc có kháng sinh thực vật (tỏi, sài đất, nhọ nội, cỏsữa, chó đẻ răng cưa….), vitamin và một số vi lượng khác Thuốc có tác dụngphòng và trị bệnh nhiễm khuẩn như đốm đỏ, thối mang, viêm ruột của cá nuôilồng hoặc nuôi ao Khi cá có dấu hiệu ban đầu của bệnh nhiễm khuẩn có thểtrị bằng cách cho tỏi (0,5 kg tỏi/100 kg cá) và bổ sung 0,3% muối ăn trongthức ăn viên cho cá ăn, hiệu quả đạt được rất tốt [5]

Năm 2005, Bùi Quang Tề, Lê Xuân Thành và cộng tác viên đã nghiêncứu thành công hai loại chế phẩm thảo dược VTS1-C, VTS1-T phối chế từ

các hoạt chất chiết tách từ tỏi (Allium sativum), sài đất (Weledia

calendulacea) sử dụng phòng bệnh cho tôm cá, kết quả cho thấy tỏi, sài đất

đều có tác dụng với cả 6 loài vi khuẩn: Vibrio parahaemolyticus, V.harveyi,

V.alginolyticus, Aeromonas hydrophyla, Edwardsiella tarda và Hafnia alvei

gây bệnh ở nước ngọt, nước lợ mặn

Năm 2006, Thuốc BecaNor 1 và BecaNor 2 là 2 sản phẩm với thànhphân chính là tỏi và gừng bước đầu đã có hiệu quả rất tốt trong việc phòng vàtrị bệnh đốm đỏ ở qui mô phòng thí nghiệm và thử nghiệm ngoài thực địa tại

3 tỉnh Quảng Ninh, Nam Định, Hà Giang phòng bệnh cho cá trắm cỏ bướcđầu cho kết quả tốt Ở Quảng Ninh và Nam Định, cá trắm cỏ cho ăn thuốcphòng đã không nhiễm bệnh trong khi đó ở các lô đối chứng vẫn có hiệntượng cá chết do nhiễm bệnh vi khuẩn Tại tỉnh Hà Giang, tỷ lệ chết giảm từ100% xuống còn 40% khi cho cá ăn thuốc phòng Tuy nhiên, việc thử nghiệmchưa được thực hiện trên diện rộng nên chưa khẳng định được hiệu quả củacác dược thảo này đồng thời chưa được áp dụng rộng rãi [26]

Năm 2007, Nguyễn Ngọc Phước và ctv đã tiến hành nghiên cứu sửdụng lá trầu không để trị bệnh do nấm gây ra trên đối tượng nuôi động vậtthuỷ sản Bước đầu đã có kết quả tốt ở quy mô phòng thí nghiệm Nồng độ ứcchế tối thiểu của dịch chiết lá trầu với cả hai loại dung môi là nước cất và

ethanol đối với họ nấm Saproleginaceae và nấm Achlya sp là 2.500ppm; 1.250ppm đối với chủng Aphanomyces piscicida Ở nồng độ cao nhất

10.000ppm, dịch chiết lá trầu có thể tiêu diệt được 5 chủng nấm thí nghiệm

Saprolegnia dicilina; Saprolegnia diclina; Saprolenia parasitica; Achlya sp;

và Aphanomyces piscicida [13] Cũng tại đại học Huế mọt nhóm tác giả khác

có nghiên cứu và cho kết luận rằng tỏi và lá trầu không là hai loại thảo dược

có khả năng diệt khuẩn rất tốt đối với A.hydrophyla gây bệnh lở loét cho cá

trắm cỏ [11]

Năm 2008, Trương Thị Mỹ Hạnh và ctv đã nghiên cứu khả năng khángkhuẩn của dịch ép từ lá hẹ, trầu không và đinh lăng Kết quả cho thấy Hẹ có

tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila và Streptococcus sp gây bệnh

trướng bụng, xuất huyết trên cá rô phi nuôi với đường kính vòng vô khuẩn đạt

>25mm với lượng sử dụng 100µl/khoanh Hiệu quả tính kháng khuẩn của hẹgiảm mạnh khi có tác động của nhiệt độ ở 1500C, đường kính vòng vô khuẩn

chỉ đạt 5mm Kết quả phòng và trị bệnh cá rô phi nhiễm khuẩn Aeromonas

hydrophila và Streptococcus sp trong quy mô phòng thí nghiệm ướt khi sử

dụng nước ép lá hẹ trộn vào thức ăn viên đạt được tỷ lệ sống 50% so với lô thínghiệm đối chứng Ngoài ra, hẹ còn có tính diệt nấm ở nồng độ 15.000ppmtrong 6h và ở 13.000ppm ở 24h Riêng đối với đinh lăng, chè xanh kết quả

cho thấy chúng không có tính kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila và

Streptococcus sp gây bệnh trướng bụng, xuất huyết trên cá rô phi nuôi với

lượng sử dụng 250µl/khoanh, trầu không có tính kháng vi khuẩn Aeromonas

hydrophila và Streptococcus sp nhưng ở mức độ kém với đường kính vòng vô

khuẩn đạt 10mm ở lượng sử dụng 250µl/khoanh

Gần đây nhất, năm 2011 là nghiên cứu của Huỳnh Kim Diệu, Đại họcCần Thơ về khả năng kháng khuẩn của cỏ mực thu tại khu vực đồng bằngsông Cửu Long cho thấy chúng có khả năng kháng khuẩn tương đối tốt đốivới một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản, trong đó điển

hình nhất là Edwardsiella tarda, riêng đối với loài Streptococcus faecalis mức

độ kháng khuẩn chỉ ở mức trung bình

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP, THỜI GIAN

VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Cá trê lai Cá trê lai (Clarias macrocephalus female x Clarias

gariepinus male) giai đoạn nuôi thương phẩm.

2.2 Vật liệu nghiên cứu

- Lá ổi: Lá ổi (loại lá bánh tẻ) được thu ở xã Nghi Phong - Nghi Lộc - NghệAn

- Tỏi (Allium sativum L).

- Vi khuẩn Streptococcus spp được thu và lưu giữ bởi Phòng thí nghiệm Cơ

sở Thuỷ sản, Bệnh học thủy sản – Nông Lâm Ngư, Trung tâm THTN NôngLâm Ngư, Trường Đại học Vinh

- Dụng cụ phân tích vi khuẩn: Ống nghiệm vô trùng các loại, đĩa peptri, quecấy vô trùng, đèn cồn, lamen, lam, pipet, kẹp gắp, dầu soi kính, tủ lạnh, kínhhiển vi, nước muối sinh lý, nước cất, kim tiêm,…

- Hoá chất: Cồn, thuốc thử, thuốc nhuộm Gram

- Môi trường nuôi cấy cơ bản NA (Nutrient Agar)

- Dụng cụ lấy dịch chiết thảo dược: Máy xay, chai lọ, giấy lọc

- Đĩa giấy tẩm nước ép thảo dược đường kính 6mm

- Dao, kéo, panh, găng tay…

- Thùng xốp, máy sục khí, dây sục khí, đá bọt

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu:

Đánh giá khả năng khảng khuẩn Streptococcus spp của dịch ép củ tỏi và dịch

ép lá ổi

*Sơ đồ khối nghiên cứu:

Hình 2.1 Sơ đồ khối nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp lấy dịch ép thảo dược

- Đối với lá Ổi sử dụng bộ phận lá, ta lấy những lá bánh tẻ, tươi Sau đórửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng Rồi cân khối lượng lá rồicho vào máy xay thật nhuyễn, vắt lấy dịch ép và lọc qua lưới lọc Dịch épđược bảo quản ở nơi khô thoáng và ở nhiệt độ phòng

- Đối với Tỏi sử dụng bộ phận thường gọi là củ, ta lấy những củ chắc,đều, đẹp Sau đó bỏ vỏ và rửa sạch, để ráo nước tự nhiên ở nhiệt độ phòng.Tiến hành cân khối lượng củ rồi cho vào máy xay thật nhuyễn, vắt lấy dịch ép

-Nhiệt độ phù hợp

-Nồng độ phù hợp

Thử nghiệm khả năng

phòng trị bệnh của dịch ép

thảo dược đối với bệnh lở

loét Streptococcus spp trên

cá trê lai

Đánh giá ảnh hưởng của

nồng độ pha loãng dịch ép

với khả năng kháng khuẩn

Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng khảng khuẩn

Kết luận

Xác định khả năng phòng trị bệnh lở loét do vi khuẩn

Streptococcus spp gây ra trên cá trê lai (Clarias

macrocephalus female x Clarias gariepinus male) của dịch

ép lá ổi và dịch ép củ tỏi trong điều kiện thực nghiệm

Đánh giá tính khảng khuẩn Steptococcus spp của dịch ép thảo dược

và lọc qua lưới lọc Dịch ép được bảo quản ở nơi khô thoáng và ở nhiệt độphòng.

2.3.2 Phương pháp định lượng mật độ vi khuẩn

Chuẩn bị một số ống nghiệm vô trùng, mỗi ống chứa 9ml nước muối sinhlý

Lấy 1ml con cá nước cần nghiên cứu, đưa sang ống nghiệm thứ nhất làmđồng đều ta được độ pha loãng 10 lần (10-1)

Lấy 1ml nước ở ống nghiệm 10-1 cho vào ống nghiệm thứ 2, ta được độpha loãng 100 lần (10-2)

Cứ làm như vậy ta được độ pha loãng tiếp theo: 10-3, 10-4, …,10-n

Lấy 0,1ml nước nghiên cứu ở 2 – 3 độ pha loãng khác nhau, nuôi cấytrên đĩa thạch chứa môi trường cần thiết bằng que gạt Mỗi độ pha loãng nuôicấy trên 2 – 3 đĩa lồng

Nuôi cấy ở nhiệt độ 300C, sau 24 – 72 giờ, đem ra đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, lấy giá trị trung bình của các đĩa lồng có cùng nồng độ pha loãng

Hình 2.2 Sơ đồ các bước pha loãng nồng độ vi khuẩn

Mật độ vi khuẩn tính theo công thức: CFU/ml = V A.K

Trong đó:

A: Số lượng khuẩn lạc trung bình trong 1 độ pha loãngV: Thể tích dịch pha loãng được cấy gạt trên mặt đĩa thạchK: Hệ số pha loãng

Nước muối sinh lý

Vi khuẩn gốc

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

(CFU/ml: là đơn vị hình thành khuẩn lạc trong một đơn vị thể tích)

2.3.3 Phương pháp thử kháng sinh đồ

Thử kháng sinh đồ theo phương pháp của Bauer - Kirby (1997)

Kháng sinh đồ được thực hiện trên môi trường Nutrient agar, các đĩagiấy có kích thước 6 mm được tẩm dịch ép của các loại thảo dược đến no(mỗi nồng độ thảo dược thử nghiệm được lặp lại 4 lần)

Đọc kết quả , đo đường kính vòng kháng khuẩn sau 24h

- Đường kính vòng vô khuẩn > 20mm là vi khuẩn có tính mẫn cảm caovới thảo dược

- Đường kính vòng vô khuẩn từ 11-20mm là vi khuẩn có tính mẫn cảmtrung bình với thảo dược

- Đường kính vòng vô khuẩn < 11mm là vi khuẩn có tính mẫn cảm kémvới thảo dược

- Đường kính vòng vô khuẩn = 0mm là vi khuẩn không có tính mẫncảm với thảo dược

2.3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm

* Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus

spp của dịch ép các loại thảo dược.

- Thu lấy dịch ép các loại thảo dược

- Vi khuẩn được lưu giữ lấy ra nuôi cấy tăng sinh, sau đó xác định mật độ vikhuẩn, tiến hành thí nghiệm với mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml

- Thử kháng sinh đồ theo phương pháp của Bauer – Kirby (1997) và đốichứng với 2 loại kháng sinh

- Giữ các đĩa lồng ở trong tủ ấm ở nhiệt độ 300C trong 24h Sau đó lấy ra và

đo đường kính vòng kháng khuẩn

- Từ thí nghiệm này, ta so sánh được hiệu quả kháng khuẩn giữa dịch ép cácloại thảo dược và các thuốc kháng sinh thường dùng

* Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dịch ép thảo dược

tới khả năng kháng khuẩn ở các nồng độ khác nhau

- Thu lấy dịch ép các loại thảo dược

- Sau đó lấy một ít dịch ép pha loãng với nước cất với các tỷ lệ khác nhau lầnlượt ta được các dung dịch có nồng độ thảo dược là 100%, 50%, 25% và12,5%

- Vi khuẩn được lưu giữ lấy ra nuôi cấy tăng sinh, sau đó xác định mật độ vikhuẩn, tiến hành thí nghiệm với mật độ vi khuẩn 106 CFU/ml

- Thử kháng sinh đồ theo phương pháp của Bauer – Kirby (1997)

- Giữ các đĩa lồng ở trong tủ ấm ở nhiệt độ 30oC trong 24h Sau đó lấy ra và

đo đường kính vòng kháng khuẩn

- Từ thí nghiệm này, ta sẽ xác định được khả năng kháng vi khuẩnStreptococcus spp ở các nồng độ của từng loại thảo dược

*Thí nghiệm 3: Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả

năng kháng khuẩn của các loài thảo dược bằng cách: Đặt các khoanh giấy tẩm

no dịch ép nguyên chất của các loài thảo dược trong các đĩa petri đã đượctrang đều vi khuẩn ở mật độ 106CPU/ml và nuôi cấy ở các mức nhiệt độ:

20oC, 25oC, 30oC và 35oC Ở mỗi mức nhiệt độ được lặp lại 4 lần

Các kết quả nghiên cứu thăm dò tính kháng khuẩn, ảnh hưởng của nồng

độ và nhiệt độ đến khả năng kháng vi khuẩn Streptococcus spp được ghi nhận

bằng đường kính vòng vô khuẩn của các đĩa giấy tẩm dịch ép bằng phươngpháp thử kháng sinh đồ của Bauer - Kirby, 1997

Từ kết quả trên, tiến hành lựa chọn dịch ép của loài thảo dược có tínhkháng khuẩn tốt để thử nghiệm khả năng phòng và trị bệnh đối với vi khuẩn

Streptococcus spp gây ra trên cá trê lai (Clarias macrocephalus female x

Clarias gariepinus male)

* Thí nghiệm 4: Nghiên cứu khả năng phòng bệnh của dịch ép lá ổi và

củ tỏi đối với vi khuẩn Streptococcus spp gây ra trên cá trê lai

* Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Bổ sung thảo dược vào

trong thức ăn với 4 CT

Cá khỏe được nuôi thuần 7

ngày

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 4

Thí nghiệm được bố trí với 3 công thức, 3 lần lặp lại, theo kiểu ngẫunhiên hoàn toàn (CRD)

* Các bước tiến hành

- Bể có thể tích 60 lít Mỗi bể nuôi 10 cá thể, mỗi cá thể có trọng lượng

9 - 10g cá sẽ được nuôi thuần trong vòng 7 ngày

- Thu dịch ép thảo dược phun vào thức ăn cho ngấm đều, phơi ở nhiệt

độ phòng, tránh ánh nắng mặt trời Sau 6 tiếng cho cá ăn Các bể cho ăn thức

ăn trộn thảo dược trong 2 đợt/1 tháng (1 đợt/5 ngày), trước mỗi đợt cá bị bỏđói 1 ngày để kích thích tính thèm ăn, giữa 2 đợt (15 ngày) cho ăn thức ănthường Còn các bể đối chứng cho ăn thức ăn thường Lượng thức ăn cho cá

ăn giữa các bể ngang nhau (10% trọng lượng thân, khoảng 1g/con) Cho cá ăntheo một giờ nhất định 8h và 17h hàng ngày

- Theo dõi dấu hiệu bệnh lý

- Tỷ lệ cá nhiễm bệnh

- Tỷ lệ sống

Thu cá bệnh phẩm tái phân lập vi

khuẩn Kết luận

- Sau 1 tháng cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào cơ thể cá Vi khuẩnđược sử dụng phải có độc lực đủ mạnh Cảm nhiễm vi khuẩn cho cá: gây mêcho cá (ngâm trong nước 100C trong 1 phút), tiêm 0,1ml dd vi khuẩn mật độ

106 - 108CFU/ml vào cơ lưng cá Ta xác định mật độ vi khuẩn theo phươngpháp xác định mật độ vi khuẩn

- Theo dõi tình trạng bệnh lý của cá (6h/1 lần) và ghi chép hàng ngày.Các dấu hiệu bệnh lý (nếu có) sẽ được ghi chép lại cụ thể Sau khi cá chết sẽđược thu con cá, phân lập, định danh vi khuẩn để chắc chắn rằng vi khuẩn gây

chết cá là vi khuẩn Streptococcus spp So sánh sự biểu hiện bệnh lý và tỷ lệ

sống sót giữa các bể Từ đó rút ra kết luận về tác dụng phòng bệnh của dịch

ép lá ổi và củ tỏi

* Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

Tiến hành theo phương pháp nghiên cứu vi khuẩn ở cá và động vật thuỷsản của Millar và Frerichs (1993)

- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn

Cấy chọn khuẩn lạc: Phương pháp thường dùng là cấy ria, mục đíchlàm cho khuẩn lạc đứng riêng rẽ Ta tiến hành đốt nóng đỏ que cấy sau mỗivùng cấy để làm cho mật độ vi khuẩn giảm dần, mỗi tế bào vi khuẩn đứngriêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc sau khi nuôi cấy

Hình 2.4 Đường cấy vi khuẩn trên đĩa lồng

Bệnh phẩm được nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 290C, sau 24 - 48h chọn khuẩnlạc, cấy tăng sinh nhằm tăng lượng vi khuẩn lên

* Phương pháp nhuộm Gram xác định hình thái vi khuẩn

( 1 )

(2)(3)

(4)

Sau khi nuôi cấy tăng sinh giống vi khuẩn thuần, lấy mẫu phết lên lamkính, cho thêm 1 đến 2 giọt nước muối sinh lý vô trùng, dùng đầu que cấy dànmỏng lên lam kính.

+ Để mẫu khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng hoặc hơ cao lam kính trênngọn lửa đèn cồn để cố định và diệt vi khuẩn

+ Nhỏ tiếp dung dịch 1 (tím tinh thể) lên tiêu bản, để yên 30 - 60 giây

 Rửa nước nhanh, vẩy khô

+ Nhỏ dung dịch 2 (Lugol) để cố định trong 1 phút  Rửa nước nhanh,vẩy khô

+ Nhỏ dung dịch 3 (Alcohol) để nghiêng đầu một bên lam để cồn chảyqua chỗ phết vi khuẩn, nhằm tẩy màu  Rửa nước nhanh, vẩy khô

+ Nhỏ dung dịch 4 (Safranin) để cố định 1 đến 2 phút  Rửa nước, đểkhô hoặc dùng giấy thấm khô lam kính

+ Soi dưới kính hiển vi bằng vật kính dầu (độ phóng đại x1000) Dướikính hiển vi ta có thể xác định được vi khuẩn gram âm bắt màu hồng và gramdương bắt màu xanh tím

* Phương pháp định danh vi khuẩn

Dùng phương pháp thử phản ứng sinh hóa, thử khả năng sinh enzymcatalase: Phết vi khuẩn lên lam kính sạch rồi nhỏ H2O2 30%, quan sát sau 1 -

2 giây Thử nghiệm là (+) với những vi khuẩn hiếu khí, khi có hiện tượng sủibọt khí do O2 Streptococcus spp là vi khuẩn kị khí tùy tiện, có hệ enzym

catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2

Dựa vào kết quả nuôi cấy phân lập, nhuộm vi khuẩn kết hợp với kếtquả thực hiện các phản ứng sinh hóa để định danh vi khuẩn theo khoá phânlập của Bergey (1957), Nicky Buller (2004) và Nguyễn Lân Dũng (2006)

* Thí nghiệm 5: Nghiên cứu khả năng trị bệnh của dịch ép lá ổi và củ tỏi đối

với vi khuẩn Streptococcus spp gây ra trên cá trê lai

thuần 7 ngày CT1

(Cảm nhiễm vi khuẩn cho cá (Cảm nhiễm vi khuẩn cho cáCT2

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 5

Tương tự như thí nghiệm phòng bệnh cho cá Ở thí nghiệm trị bệnh cho

cá tiến hành với 2 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần, theo kiểu ngẫunhiên hoàn toàn

Tiến hành thí nghiệm:

- Cá được đem về và tiến hành nuôi thuần tương tự thí nghiệm 2

- Sau thời gian nuôi thuần thì ta tiến hành cảm nhiễm cho cả 2 lô thínghiệm: gây mê cho cá (ngâm trong nước 100C trong 1 phút), tiêm 0,1ml dd

vi khuẩn mật độ 106 - 108CFU/ml vào cơ lưng cá Ta xác định mật độ vi khuẩntheo phương pháp xác định mật độ vi khuẩn ở thí nghiệm 1

- Sau khi cảm nhiễm ta tiến hành cho cá ở NT 1 ăn thức ăn có thảodược và theo dõi tình trạng cá (6h/1lần) Lượng thảo dược có trong thức ănđược chọn là liều lượng tốt nhất ở thí nghiệm phòng bệnh Còn cá ở NT 2 tacho ăn thức ăn không có thảo dược

- Tiếp tục theo dõi (6h/1 lần) và so sánh biểu hiện bệnh lý và tỷ lệ sốnggiữa các bể Từ đó rút ra kết luận về tác dụng trị bệnh của dịch ép lá ổi và củtỏi

- Sau quá trình theo dõi thu con cá bệnh phẩm và phân lập lại để xácnhận tác nhân gây bệnh chính cho đối tượng theo phương pháp giống thínghiệm 2

Công thức tính:

Cho ăn thức ăn thường

Cho ăn thức ăn bổ sung dịch ép lá ổi hoặc củ tỏi

- Theo dõi dấu hiệu bệnh lý

- Theo dõi tỷ lệ nhiễm bệnh

- Theo dõi tỷ lệ chết Thu con cá bệnh phẩm tái phân

- Tỷ lệ sống (%)

100 N

Nt (%)  

Trong đó :

TLS = Tỷ lệ sống

Nt = Số lượng cá còn sống từ đầu kỳ đến thời điểm đánh giá

N = Số lượng cá đưa vào nuôi đầu kỳ thí nghiệm

2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu

Các số liệu được phân tích và xử lí bằng phần mềm EXCELL2007 vàSPSS 16.0 bằng phép kiểm định LSD

2.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ 2/2012 đến 8/2012

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Cơ sở Thuỷ sản và Bệnh học thủy sản,

Trung tâm THTN, Trường Đại học Vinh