Phân lâp và giám định vi khuẩn Streptococcus trên cá nước ngọt có vảy tại TP HCM và một số tình lân cận

Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập, định danh và kiểm tra độc lực của các gốc vi khuẩn Streptococcus phân lập được trên cá rô phi, điêu hồng, tai tượng và lia thia, tại TP. HCM và một số tỉnh lân cận. Kết quả cho thấy tỷ lệ phân lập được vi khuẩn Streptococcus là 40,32 %, trong đó tỷ lệ các loài lần lượt là S. agalactiae (84 %), S. difficilis (12 %), S. iniae (4 %), S. uberis (0 %). Kết quả thử độc lực cho thấy vi khuẩn gây chết cá rô phi ở liều công độc từ 1 – 2 x 107 cfu liều công cá, tỷ lệ chết từ 40 – 80 % qua 7 ngày theo dõi.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*********

PHẠM HÀO QUANG

PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN STREPTOCOCCUS

GÂY BỆNH TRÊN CÁ NƯỚC NGỌT CÓ VẢY

TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ MỘT SỐ TỈNH LÂN CẬN

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

TP Hồ Chí Minh, Tháng 9/ 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

*********

PHẠM HÀO QUANG

PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN STREPTOCOCCUS

GÂY BỆNH TRÊN CÁ NƯỚC NGỌT CÓ VẢY

TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ MỘT SỐ TỈNH LÂN CẬN

Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS TS NGUYỄN NGỌC HẢI

TS TRẦN XUÂN HẠNH

TP Hồ Chí Minh Tháng 9/ 2013

PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN STREPTOCOCCUS

GÂY BỆNH TRÊN CÁ NƯỚC NGỌT CÓ VẢY

TẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VÀ MỘT SỐ TỈNH LÂN CẬN

PHẠM HÀO QUANG

Hội đồng chấm luận văn

1 Chủ tịch: PGS TS NGUYỄN NGỌC TUÂN

Công ty UV Việt Nam

2 Thư ký: TS TRẦN THỊ BÍCH LIÊN

Hội Chăn nuôi Thú y

3 Phản biện 1: TS LÊ HỒNG PHƯỚC

Viện NC NTTS II

4 Phản biện 2: PGS TS TRẦN ĐÌNH TỪ

Hội Thú Y Việt Nam

5 Ủy viên: PGS TS NGUYỄN VĂN KHANH

Hội Chăn Nuôi Thú Y

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

HIỆU TRƯỞNG

LÝ LỊCH CÁ NHÂN

Họ và tên: Phạm Hào Quang

Ngày sinh: 07 / 04 / 1980

Nơi sinh: TP Hồ Chí Minh

Họ tên Cha: Phạm Văn Thọ

Họ tên Mẹ: Võ Thị Hoa

Quá trình học tập

- Năm 1998: Tốt nghiệp phổ thông trung học tại trường PTTH Bùi Thị Xuân, TP.Hồ Chí Minh

- Năm 2004: Tốt nghiệp ngành Bác sỹ thú y tại Đại học Nông Lâm TP Hồ ChíMinh

- Năm 2009: Học Cao học Thú y tại Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

Tình trạng gia đình: đã kết hôn

Địa chỉ liên lạc

Email: phamhaoquang74@yahoo.com

Điện thoại: 0983 024 854

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kếtquả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ côngtrình nào khác

Tác giả

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Ngọc Hải và TS Trần Xuân Hạnhđã tận tình hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này, cùng cảm ơn đến các cộng sự tại Bộmôn Nghiên cứu Vi trùng – Công ty Navetco đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gianqua

Gửi đến vợ và con những tình cảm trìu mến nhất!

Phạm Hào Quang

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện nhằm phân lập, định danh và kiểm tra độc lực

của các gốc vi khuẩn Streptococcus phân lập được trên cá rô phi, điêu hồng, tai

tượng và lia thia, tại TP HCM và một số tỉnh lân cận Kết quả cho thấy tỷ lệ phân

lập được vi khuẩn Streptococcus là 40,32 %, trong đó tỷ lệ các loài lần lượt là S agalactiae (84 %), S difficilis (12 %), S iniae (4 %), S uberis (0 %) Kết quả thử

độc lực cho thấy vi khuẩn gây chết cá rô phi ở liều công độc từ 1 – 2 x 107 cfu / liềucông cá, tỷ lệ chết từ 40 – 80 % qua 7 ngày theo dõi

This study was carried out to isolate, identify and test virulence of

Streptococcus isolates in Tilapia, Red tilapia and other fish species in HCM City and other neighboring provinces The result shows that the general Streptococcus

isolation rate was 40,32 %, in which each species shares in succession as following:

S agalactiae (84 %), S difficilis (12 %), S iniae (4 %), S uberis (0 %) After a 7

day monitoring, the collected virulent testing result shows that Tilapia

(Oreochromis niloticus) died at a challenge dose of 1 – 2 x 107 cfu, with mortalityvary from 40 % to 80 %

MỤC LỤC

Trang chuẩn y i

Lý lịch cá nhân ii

Lời cam đoan iii

Lời nói đầu iv

Tóm tắt v

Các từ viết tắt x

Danh sách các hình xi

Danh sách các sơ đồ và bảng xii

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu 2

3 Yêu cầu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vi khuẩn Streptococcus 3

1.1.1 Hình thái 3

1.1.2 Điều kiện nuôi cấy 3

1.1.3 Danh pháp và định danh 4

1.1.4 Yếu tố độc lực 5

1.1.4.1 Yếu tố bám dính 5

1.1.4.2 Yếu tố ngăn cản hiện tượng thực bào 5

1.1.4.3 Yếu tố phân hủy bổ thể 6

1.1.4.4 Enzyme ngoại bào 6

1.1.4.5 Yếu tố xâm lấn 7

1.1.4.6 Độc tố 7

1.1.4.7 Yếu tố kháng bổ thể 8

1.1.4.8 Protease 8

1.1.4.9 Yếu tố kháng phân hủy protein – GRAB 8

1.1.4.10 Yếu tố hoạt hóa plasminogen – streptokinase 8

1.1.5 Đặc tính sinh hóa 9

1.1.6 Một số loài Streptococcus thường gặp trên cá 10

1.1.6.1 Streptococcus iniae 10

1.1.6.2 Streptococcus agalactiae 11

1.1.7 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus 11

1.1.7.1 Nguồn truyền lây 11

1.1.7.2 Đường truyền lây 12

1.1.7.3 Triệu chứng và bệnh tích 12

1.2 Một số loài cá nước ngọt có vảy được nuôi phổ biến tại Việt Nam 12

1.2.1 Cá rô phi 12

1.2.2 Cá tai tượng 14

1.3 Các bệnh khác thường gặp trên cá 15

1.3.1 Bệnh do Aeromonas hydrophila 15

1.3.2 Bệnh do ký sinh trùng 16

1.3.2.1 Bệnh trùng bánh xe 16

1.3.2.2 Bệnh rận cá 16

1.4 Kỹ thuật PCR 16

1.5 Một số nghiên cứu về vi khuẩn Streptococcus và vaccine Streptococcus trên cá 18

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Thời gian và địa điểm 21

2.1.1 Thời gian thực hiện đề tài 21

2.1.2 Địa điểm thực hiện đề tài 21

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 21

2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 22

2.3.1 Phân lập vi khuẩn Streptococcus trên cá 22

2.3.1.1 Dụng cụ 22

2.3.1.2 Phương pháp tiến hành 22

2.3.2 Định danh vi khuẩn Streptococcus 25

2.3.2.1 Chọn và giữ gốc vi khuẩn phân lập được 25

2.3.2.2 Xác định giống và loài Streptococcus bằng kỹ thuật PCR 25

2.3.3 Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn phân lập được 30

2.3.3.1 Chủng vi khuẩn sử dụng để thử độc lực 31

2.3.3.2 Đối tượng gây nhiễm 31

2.3.3.3 Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn xác định độc lực 31

2.3.3.4 Bố trí thí nghiệm 32

2.3.3.5 Các chỉ tiêu theo dõi 32

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 32

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Nội dung 1: phân lập và giám định vi khuẩn Streptococcus trên cá 33

3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Streptococcus trên cá 33

3.1.2 Định danh các gốc vi khuẩn nghi Streptococcus bằng phản ứng PCR 35

3.2 Nội dung 2: Thử độc lực của 4 chủng vi khuẩn đã được phân lập nói trên 39

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

1 Kết luận 43

2 Đề nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 50

CÁC TỪ VIẾT TẮT

IdeS IgG degrading enzyme of Streptococcus pyogenes

PavA Pneumococcal adherence and virulence factor A

SIC Streptococcal inhibitor of complement mediated lysis

SpeB Streptoccocal pyrogenic exotoxin B

Spes Streptococcal pyrogenic exotoxins

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae 3

Hình 1.2 Các dạng dung huyết của vi khuẩn Streptococcus 4

Hình 1.3 Sơ đồ phân bố của Streptoccus iniae tại khu vực châu Á Thái Bình Dương 10

Hình 1.4 Cá điêu hồng bị bệnh do Streptococcus 12

Hình 1.5 Nguyên lý của phản ứng PCR 18

Hình 2.1 Các đường mổ não cá (lấy não) (a) và mổ xoang bụng cá (lấy gan hoặc thận) (b) 23

Hình 3.1 Lấy mẫu phân lập vi khuẩn trên cá bệnh 34

Hình 3.2 Các loài Streptococcus được phân lập trên môi trường thạch máu 34

Hình 3.3 Kết quả PCR định danh giống Streptococcus spp (sản phẩm 207 bp) 35

Hình 3.4 Kết quả PCR các chủng vi khuẩn chuẩn và 1 gốc phân lập 37

Hình 3.5 Kết quả PCR các gốc vi khuẩn phân lập 38

Hình 3.6., 3.7 Thí nghiệm thử độc lực các chủng phân lập và cá chết trong thí nghiệm thử độc lực 42

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ phân lập và định danh vi khuẩn Streptococcus 24

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR 26

Sơ đồ 2.3 Xác định độc lực của chủng vi khuẩn Streptococcus phân lập 30

Bảng 2.1 Địa điểm và số cá được lấy mẫu trong đề tài 22

Bảng 2.2 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR 29

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn trên cá rô phi 32

Bảng 3.1 Số gốc vi khuẩn phân lập được theo từng tỉnh 33

Bảng 3.2 Tỷ lệ các loài Streptococcus phân lập được trên cá 36

Bảng 3.3 Kết quả phân lập các loài Streptococcus theo từng tỉnh 38

Bảng 3.4 Kết quả thử độc lực trên cá 40

Bảng 3.5 Ghi chú cá chết theo từng ngày 40

Bảng 3.6 Kết quả phân lập và định danh loài vi khuẩn phân lập lại từ cá thí nghiệm 41

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Bệnh do vi khuẩn Streptococcus gây ra trên cá đã được báo cáo rộng rãi Ổ

dịch đầu tiên được ghi nhận trên cá hồi nuôi tại Nhật Bản vào năm 1957 Sau đó,bệnh cũng đã xảy ra lần lượt tại Mỹ (1966), Nam Phi (1979), Singapore (1985) vàmột số nước khác Bệnh xảy ra trên nhiều loài cá nước mặn (cá mú, cá song, cáheo), nước ngọt (cá rô phi, điêu hồng, tai tượng), cá tự nhiên hoặc nuôi, gây ra thiệthại nặng cho ngành công nghiệp nuôi cá với tỷ lệ chết lên đến 50 % (Fuller và ctv,2001)

Do những thiệt hại về kinh tế mà bệnh gây ra, nên nhiều công trình nghiên

cứu đã được thực hiện nhằm tìm hiểu về các loài Streptococcus Những nghiên cứu

đã được thực hiện tại Mỹ, Ả rập Saudi, Brasil và tại những nước gần Việt Nam nhưThái Lan, Trung Hoa, Nhật Bản, Philippine Kết quả cho thấy có nhiều loài

Streptococcus được xác định là tác nhân gây bệnh: Streptococcus iniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus difficilis.

Tại Việt Nam, đã có những nghiên cứu bước đầu về bệnh do Streptococcus

gây ra trên cá (Nguyễn Hữu Thịnh, 2005; Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn ThanhPhương, 2012) Cùng hướng nghiên cứu đó, để xác định được các loài

Streptococcus đang lưu hành trên đàn cá nuôi tại Việt Nam, nhằm đánh giá khả

năng gây bệnh của chúng, phục vụ cho nghiên cứu vaccine, chúng tôi tiến hành đề

tài “Phân lập và giám định vi khuẩn Streptococcus gây bệnh trên cá nước ngọt có

vảy tại Thành phố Hồ Chí Minh và một số tỉnh lân cận”

2 Mục tiêu

Phân lập gốc vi khuẩn Streptococcus trên cá có biểu hiện bệnh, định danh và

xác định độc lực của chúng

3 Yêu cầu

 Thu thập mẫu bệnh phẩm từ cá có biểu hiện bệnh

 Phân lập vi khuẩn Streptococcus

 Xác định giống Streptococcus bằng kỹ thuật PCR

 Xác định loài Streptococcus bằng kỹ thuật PCR

 Thử độc lực một số chủng vi khuẩn phân lập trên cá

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Streptococcus

1.1.1 Hình thái

Streptococcus là cầu khuẩn bao gồm nhiều loài, bắt màu Gram dương, có

dạng hình cầu hoặc hình oval với đường kính nhỏ hơn 2 µm, thường tập trung thànhdạng đôi hay chuỗi khi được nuôi cấy trên môi trường canh dinh dưỡng

Streptococcus không hình thành bào tử, phần lớn không di động, một vài

chủng có khả năng hình thành capsule Nhiều loài gây bệnh cho người và động vật

Hình 1.1 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae

(Nguồn: Kaggen, 2011)

1.1.2 Điều kiện nuôi cấy

Vi khuẩn dễ mọc trên thạch TSA được bổ sung 0,5 % glucose, thạch BHI,thạch máu ngựa, thạch máu cừu Khuẩn lạc phát triển sau 24 – 48 giờ ủ ở nhiệt độ

20 – 30oC Khuẩn lạc trên đĩa thạch thường nhỏ (đường kính 0,5 – 1,0 mm), hơi

vàng, mờ đục, tròn và hơi lồi lên Một số giống Streptococcus cho khuẩn lạc có

dạng nhày nhớt trên môi trường thạch máu cừu Vi khuẩn gây dung huyết theo 3dạng anpha, beta và gamma

1.1.3 Danh pháp và định danh

Việc định danh các loài Streptococcus chủ yếu được dựa trên khả năng dung

huyết và dựa vào cách phân nhóm Lancefield (Oie, 2005)

Có 3 dạng dung huyết anpha, beta và gamma Dạng gây dung huyết beta lygiải hoàn toàn hồng cầu chung quanh khuẩn lạc vi khuẩn Những vi khuẩn thuộcnhóm này có khuynh hướng gây bệnh cấp tính Dạng gây dung huyết alpha tạo vòngdung huyết nhỏ và mờ hơn dạng beta Còn vi khuẩn gây dung huyết gamma đôi khicòn được gọi là không dung huyết

Hình 1.2 Các dạng dung huyết của vi khuẩn Streptococcus

(Nguồn: Buxton, 2005)Việc phân loài theo nhóm Lancefield được dựa trên kháng nguyên thành tếbào vi khuẩn (đối với nhóm B là kháng nguyên capsule) Hệ thống Lancefield chophép nhận biết 20 nhóm huyết thanh, được gọi tên từ A đến H và từ K tới V Ngoài

ra, cũng có vài loài Streptococcus không nằm trong hệ thống Lancefield và 1 vài

loài mới được mô tả sau này Phân loài theo nhóm Lancefield không nhất thiết phù

hợp với loài Streptococcus Một chủng của cùng 1 loài có thể thuộc vài nhóm

Lancefield khác nhau và 1 chủng trong thuộc nhóm Lancefield này có thể thuộc

nhiều loài khác nhau Chỉ có 1 loài được biết tới là S agalactiae, nhóm B, là có thể được định danh chỉ bằng cách xác định nhóm Lancefield Trên người, vi khuẩn S pyogenes gây dung huyết beta nhóm A, thường được gọi là vi khuẩn Streptococcus

nhóm A

1.1.4 Yếu tố độc lực

1.1.4.1 Yếu tố bám dính

FbsA: protein trên bề mặt của Streptococcus, có chức năng kết dính với fibrinogen Yếu tố này có ở vi khuẩn S agalactiae

Lmb: điều hòa sự gắn kết lên protein laminin của người, protein này là thànhphần chính của màng nền, màng này có vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của vi

khuẩn S agalactiae

PavA: yếu tố độc lực của S pneumoniae và S agalactiae, có chức năng liên

kết với fibronectin

CBPs: protein bề mặt liên kết với cholin Bao gồm CbpD, CbpE, CbpG,

LytB và LytC giữ vai trò trong sự kết bám và khu trú của vi khuẩn S pneumoniae

trong đường hầu họng

CbpA: protein bề mặt liên kết với cholin, chức năng điều hòa sự gắn kết vi

khuẩn S pneumoniae lên tế bào biểu mô có chức năng hoạt hóa cytokine Gắn kết

đặc hiệu với yếu tố H, thành phần bổ thể C3 và thành phần phân tiết IgA trên người.Liên quan đến sự huy động tế bào miễn dịch bằng cách kích thích sản xuấtinterleukin – 8 từ tế bào biểu mô phổi

1.1.4.2 Yếu tố ngăn cản hiện tượng thực bào

Beta – C protein: protein bề mặt của S agalactiae, một phần liên kết với bộ

phận Fc của kháng thể IgA và một phần chứa yếu tố H là chất ức chế bổ thể Đóngvai trò ngăn cản hiện tượng thực bào

Capsule: vi khuẩn Streptococcus nhóm B có thể được chia thành những

serotype khác nhau dựa trên kháng nguyên capsule, có bản chất là polysaccharide

Có 9 serotype theo cách phân loại bằng kháng nguyên capsule, trong đó, các nhóm

Ia, Ib, II, III, V là có liên quan đến các bệnh trên người

Kháng nguyên capsule có chức năng ngăn cản sự bám dính của yếu tố bổ thể

được hoạt hóa C3b lên bề mặt của vi khuẩn S agalactiae, ngăn ngừa sự hoạt hóa

con đường bổ thể và ức chế hiện tượng opsonin hóa Theo Wessels (1991), nếu

kháng nguyên capsule mất đi, độc lực của Streptococcus nhóm A giảm 100 lần trên

chuột

Protein M: gồm 2 chuỗi polypeptide có cấu tạo phức tạp: xoắn cuộn tròn lạithành hình mỏ neo nằm trong màng, ngang qua thành tế bào Protein M được dùng

để phân lớp các chủng S pyogenes vào các serotype khác nhau.

Protein M liên kết với yếu tố kiểm soát bổ thể, C4 – binding protein – C4BPvà protein vật chủ nhằm ngăn ngừa sự hoạt hóa bổ thể và sự thực bào

Protein M được xem là có vai trò trong sự hình thành phản ứng viêm do liênkết với fibrinogen, kininogen hoặc plaminogen

SIC: liên kết với bổ thể C5b67 và ức chế sự ly giải tế bào vi khuẩn, tăngcường sức ống của vi khuẩn trong môi trường nội bào, ức chế hoạt động của menlysozyme, ức chế bạch cầu phân tiết proteinase, từ đó ức chế khả năng của cơ thể

chống lại vi khuẩn Streptococcus nhóm A

1.1.4.3 Yếu tố phân hủy bổ thể

C5a peptidase: các vi khuẩn Streptococcus nhóm A, B, C và G sản sinh ra

enzyme này, có chức năng tách rời yếu tố C5a, là protein hóa hướng động các bạchcầu trung tính, yếu tố C5a được sản xuất dưới sự kích hoạt của hệ thống bổ thể

1.1.4.4 Enzyme ngoại bào

Hyaluronate lyase: giúp vi khuẩn S agalactiae xuyên qua hàng rào sinh lý

của mô thông qua tác động tới lớp màng hyaluronan và tới phân tử chondroitinsulfate tại cầu nối beta – 1,4 glycosidic

DNase: yếu tố xâm lấn, là enzyme ngoại bào, có chức năng thủy phân DNA.Hyaluronidase: yếu tố xâm lấn, là enzyme ngoại bào, có khả năng làm thoái

hóa acid hyaluronic trong thành phần của mô liên kết, giúp vi khuẩn S pyogenes

xâm lấn vào tế bào

IdeS: enzyme ngoại bào, bảo vệ vi khuẩn S pyogenes tránh hiện tượng

opsonin hóa do IgG

SpeB (Streptococcal pyrogenic exotoxin B): enzyme ngoại bào, yếu tố xâm

lấn, giúp vi khuẩn S pyogenes tồn tại và phát triển

1.1.4.5 Yếu tố xâm lấn

Anpha – C protein: tương tác với glycosaminoglycan của tế bào vật chủ vàtrung hòa sự xâm nhập của vi khuẩn

1.1.4.6 Độc tố

Beta – haemolysin/ cytolysin: bản chất là protein, hình thành lỗ trên thành tếbào, tạo ra hiệu quả tiền viêm: gây ra hiện tượng tế bào tự hủy, đẩy mạnh xâm lấn,

phóng thích cytokine Độc tố này do vi khuẩn S agalactiae tiết ra

Yếu tố CAMP: hình thành lỗ trên màng tế bào, liên kết với thành phần Fc

của IgG và IgM của người, độc tố này có ở vi khuẩn S agalactiae

Pneumolysin: được xem như là 1 protein của tế bào chất, có chức năng hìnhthành lỗ trên bề mặt tế bào viêm, tạo hiệu ứng apoptosis (kích thích sản xuất nhữngchất điều hòa phản ứng viêm như TNF – α, IL – 1β, nitric oxide, IL – 8,prostaglandin và các leukotriene), cản trở thực bào và cản trở hoạt hóa bổ thể

SLO: ly giải tế bào chứa cholesterol trong màng tế bào, ngăn cản chức năngthực bào, tăng phân tiết cytokin và dẫn tới hiện tượng apoptosis Trung hòa sự dichuyển của NAD glycohydrolase vào trong tế bào da SLO, NAD glycohydrolase làloại độc tố hoạt động bên trong tế bào nhằm tăng cường sự tồn tại và nhân lên củamầm bệnh ngoại bào

SLS: đóng vai trò trong việc hình thành khuẩn lạc vi khuẩn dạng beta do khảnăng ly giải nhiều tế bào (tế bào cơ tim, tế bào thận, tiểu cầu, bạch cầu lympho,bạch cầu trung tính)

Spes: độc tố này được xem như là một siêu kháng nguyên, có khả năng kíchhoạt hệ thống tế bào lympho thông qua cầu nối giữa phức hợp hòa hợp mô chínhMHC lớp II trên tế bào trình diện kháng nguyên và thành phần khả biến của thụ thể

beta trên tế bào T Spes cũng liên quan đến hội chứng shock độc tố Streptococcus và bệnh sốt phát ban do Streptococcus Độc tố này có ở vi khuẩn S pyogenes.

1.1.4.7 Yếu tố kháng bổ thể

PspA: protein liên kết với cholin, ức chế sự hoạt hóa bổ thể và giảm hiệu quảcủa cơ chế điều hòa khoảng hở thụ thể của bổ thể Protein này có trên bề mặt của vi

khuẩn Pneumococcus

IgA1 protease: tách rời cầu nối peptide Pro227 – Thr228 trong cấu trúc của

IgA1, có thể giúp vi khuẩn Pneumococcus thay đổi cấu trúc kháng nguyên đặc hiệu

để tránh đáp ứng miễn dịch nhằm bám dính dễ hơn trên bề mặt màng nhày

Yếu tố hấp thu Mangan – PsaA: đây là protein bề mặt của vi khuẩn S pneumoniae, liên kết với lipid, nhiệm vụ chính là vận chuyển Mn2+ và Zn2+ vàotrong tế bào chất của vi khuẩn

1.1.4.8 Protease

Autolysin: protein bề mặt của vi khuẩn S pneumoniae, liên kết với cholin,

phá vỡ lớp sườn peptidoglucan của vi khuẩn, dẫn tới giải phóng những yếu tố độclực bên trong tế bào vi khuẩn như là pneumolysin

Neuraminidase: protein bề mặt của vi khuẩn S pneumoniae, gây ra thương

tổn đáng kể cho tế bào đích, làm thay đổi quá trình glycosyl hóa của ký chủ

1.1.4.9 Yếu tố kháng phân hủy protein – GRAB

Chiêu mộ chất ức chế protease α2 – macroglobulin tới bề mặt của tế bào vi

khuẩn Streptococcus nhóm A (S pyogenes) nhằm ức chế phân hủy protein, nhờ vậy

bảo vệ được protein M và những cấu trúc khác trên bề mặt tế bào vi khuẩn khỏi sựthoái biến

1.1.4.10 Yếu tố hoạt hóa plasminogen – streptokinase

Yếu tố xâm lấn mô, tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn S pyogenes xâm

nhập vào mô

1.1.5 Đặc tính sinh hóa

Đặc tính sinh hóa của các chủng Streptococcus thường gặp trên cá

Bảng 1.1 Đặc tính sinh hóa của một số chủng Streptococcus (Nguồn: ABIS encyclopedia)

Stt Phản ứng S parauberis S iniae

1 Dung huyết Anpha Beta Beta 18 Amygladin +

-3 Phát triển yếm khí + + + 20 Arbutin +

4 Phát triển ở 10 o C + V 21 Fructose +

6 Phát triển trong môi trường có 6.5% NaCl - 23 Inulin V -

-12 Alkaline phosphatase (PAL) V + + 29 Ribose V + +

13 Arginin dihydrolase (ADH) + + + 30 Sorbitol + -

-Ghi chú: V: variable

1.1.6 Một số loài Streptococcus thường gặp trên cá

1.1.6.1 Streptococcus iniae

Cầu khuẩn gây dung huyết dạng beta trên môi trường thạch máu được mô

tả lần đầu vào 1976 (Pier và Madin, 1976), được xem là 1 loài Streptococcus

mới, không thuộc nhóm phân loại Lancefield nào Vi khuẩn có thể gây bệnh trênngười thông qua tiếp xúc với các sản phẩm cá nhiễm khuẩn (Sun và ctv, 2007)

Theo nghiên cứu của Suanyuk và ctv (2010), vi khuẩn Streptococcus iniae

được phân lập trên cá mú và cá điêu hồng nuôi tại miền nam Thái Lan Triệu

chứng do S iniae gây ra trên cá bao gồm: mất cân bằng, lồi mắt, bỏ ăn, đờ đẫn và

di chuyển riêng rẽ, không theo đàn vv…Thí nghiệm công độc cá mú và cá điêu

hồng cũng cho thấy S iniae gây chết cá với tỷ lệ chết từ 0 – 60 % trong vòng 10

ngày Vi khuẩn thường lây nhiễm vào gan, tụy, tim, mắt và não cá

Hình 1.3 Sơ đồ phân bố của Streptoccus iniae tại khu vực châu Á

Thái Bình Dương, vùng màu xanh là khu vực có dịch gây ra do S iniae, vùng

màu trắng là khu vực nghi ngờ có sự hiện diện của S iniae

(Nguồn: http://aqua.intervet.com, 2003)

Theo Jafar và ctv (2009), Streptococcus agalactiae chiếm tỷ lệ cao (92,9

%) trong các vi khuẩn phân lập từ đợt dịch trên cá tại vịnh Kuwait năm 2001, qua

đó cho thấy vai trò gây bệnh của vi khuẩn này Ngoài ra, còn có các loài

Streptococcus khác cũng được ghi nhận là tác nhân gây bệnh trên cá, gồm có: Streptococcus difficilis, Streptococcus parauberis, Streptococcus dysagalactiae, Streptococcus garviae (Noga, 2010)

1.1.7 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus

Bệnh thường xảy ra rải rác hay thành dịch tại những vùng nuôi cá Khi xảy

ra, bệnh làm chết cá với tỷ lệ cao (Yanong và Floyd, 2002), gây thiệt hại kinh tếnặng cho nhà chăn nuôi Năm 1979, bệnh xảy ra tại Nhật, gây ra thiệt hại kinh tếlớn (Kitao và ctv, 1979) Các nhà khoa học nhận định đây là bệnh quan trọng, gâyhậu quả nặng nề đối với nghành chăn nuôi cá thâm canh (Maisak và ctv, 2008)

Tại Việt Nam, theo ghi nhận của tác giả Đặng Thị Hoàng Oanh (2011),bệnh thường xảy ra vào mùa mưa, nhất là vào lúc giao mùa, khi cá bị stress do sựthay đổi thời tiết, ngoài ra, bệnh còn xảy ra do mật độ nuôi cá cao, môi trườngnước xấu, do cá ăn thức ăn kém chất lượng

1.1.7.1 Nguồn truyền lây

Các loài Streptococcus thường tồn tại trong nguồn nước, trong bùn quanh

ao cá và trong thức ăn của cá (Minami và ctv, 1979) Cá mang mầm bệnh cũng lànguồn lây truyền vi khuẩn quan trọng (Kitao và ctv, 1979)

1.1.7.2 Đường truyền lây

Bệnh lây truyền qua tiếp xúc trực tiếp với cá bệnh hoặc qua thức ăn chocá Cá sống trong môi trường nước nhiễm khuẩn cũng có thể nhiễm bệnh qua cácvết thương trên da

1.1.7.3 Triệu chứng và bệnh tích

Triệu chứng bệnh thay đổi theo loài cá cảm nhiễm, các triệu chứng chunggồm: bơi không định hướng, da sậm màu, lồi một bên hay hai bên mắt, mắt mờđục, xuất huyết trên mang và gốc vây, loét trên da Trên nhiều loài cá, bệnh tíchtrên mắt thường thấy với tần suất cao Khi mổ cá bệnh thường quan sát thấy cóxuất huyết và viêm trên gan, lách, thận, tim, não, mắt và đường ruột Trong xoangbụng cá thường có dịch lẫn máu

Hình 1.4 Cá điêu hồng bị bệnh do Streptococcus

(Nguồn: thefishsite.com, 2012)

1.2 Một số loài cá nước ngọt có vảy được nuôi phổ biến tại Việt Nam

1.2.1 Cá rô phi

a Nguồn gốc và tên gọi

Cá rô phi hiện đang nuôi phổ biến ở Việt Nam thuộc:

Cá bị lồi mắt

Giống – Oreochromis

Loài – Cá rô phi vằn O niloticus

Hiện nay có 3 loài chính được phổ biến tại Việt Nam là:

Cá rô phi cỏ Oreochromis mossambicus, được nhập vào Việt Nam năm

1953 qua ngã Thái Lan

Cá rô phi vằn (Rô phi Đài Loan, O niloticus) được nhập vào Việt Nam

năm 1974 từ Đài Loan

Cá rô phi đỏ (Red Tilapia), có màu hồng được nhập vào Việt Nam năm

1985 từ Malaysia

b Đặc điểm hình thái

Cá rô có thân hình màu hơi tím, vảy sáng bóng, có 9 – 2 sọc đậm songsong nhau từ lưng xuống bụng Vi đuôi có màu sọc đen sậm song song từ phíatrên xuống phía dưới và phân bổ khắp vi đuôi Vi lưng có những sọc trắng chạysong song trên nền xám đen Viền vi lưng và vi đuôi có màu hồng nhạt

c Môi trường sống

Các loài cá rô phi hiện đang nuôi có đặc điểm sinh thái gần giống nhau Nhiệt độ: nhiệt độ cần thiết cho sự phát triển của cá rô phi từ 20 – 32oC,thích hợp nhất là 25 – 32oC Khả năng chịu đựng với biến đổi nhiệt độ cũng rấtcao từ 8 – 42oC, cá chết rét ở 5,5oC và bắt đầu chết nóng ở 42oC Nhiệt độ càngthấp thì cá càng giảm ăn, ức chế sự tăng trưởng và tăng rủi ro nhiễm bệnh

Độ mặn: cá rô phi là loài rộng muối, có khả năng sống được trong môitrường nước sông, suối, đập tràn, hồ ao nước ngọt, nước lợ và nước mặn có độmuối từ 0 – 40 % Trong môi trường nước lợ (độ mặn 10 – 25 ‰) cá tăng trưởngnhanh, mình dày, thịt thơm ngon

Độ pH: môi trường có độ pH từ 6,5 – 8,5 thích hợp cho cá rô phi, nhưngcá có thể chịu đựng trong môi trường nước có độ pH thấp bằng 4

Oxy hòa tan: cá rô phi có thể sống được trong ao, đìa có màu nước đậm,mật độ tảo dày, có hàm lượng chất hữu cơ cao, thiếu oxy Yêu cầu hàm lượng oxyhòa tan trong nước của cá rô phi ở mức thấp hơn 5 – 10 lần so với tôm sú

d Đặc điểm về dinh dưỡng và sinh trưởng

Tập tính ăn: khi còn nhỏ, cá rô phi ăn sinh vật phù du (tảo và động vậtnhỏ) là chủ yếu (cá 20 ngày tuổi, kích thước khoảng 18mm) Khi cá trưởng thành

ăn mùn bã hữu cơ lẫn các tảo lắng ở đáy ao, ăn ấu trùng, côn trùng, thực vật thủysinh Tuy nhiên, trong nuôi công nghiệp cá cũng ăn các loại thức ăn chế biến từcá tạp, cua, ghẹ, ốc, bột cá khô, bột bắp, bột khoai mì, khoai lang, bột lúa, cámmịn, bã đậu nành, bã đậu phộng Trong thiên nhiên, cá thường ăn từ tầng đáy cómức sâu từ 1– 2 m Sinh trưởng: khi nuôi trong ao, cá sử dụng thức ăn tự nhiênsẵn có kết hợp với thức ăn chế biến, cá rô phi vằn đơn tính lớn nhanh từ thángđầu đến tháng thứ 5 – 6

Loài: Osphronemus goramy

b Môi trường sống

Cá tai tượng sống ở ao hồ, đầm nước ngọt, cá có cơ quan hô hấp nên cá sống được ở nước tù, bẩn, thiếu oxy (hàm lượng oxy 3 mg / lit) Cá tai tượng sốngđược ở nước lợ, độ mặn 0,6 %, ngưỡng nhiệt độ 16 – 42oC, sinh trưởng tốt ở 25 –

30oC; pH = 5

c Đặc điểm về dinh dưỡng và sinh trưởng

hoàng, cá bắt đầu ăn thức ăn bên ngoài là luân trùng Cladocera, trùng chỉ (Tubifex) cung quăng (Chironomus), ấu trùng côn trùng khác Khi được 1 tháng

tuổi cá chuyển sang ăn tạp, nghiêng về động vật, sau đó chuyển dần sang ăn thựcvật Trong ao nuôi, cá ăn được những loài thực vật mềm ở dưới nước và trên cạn,các phụ phẩm từ nhà bếp, sản phẩm lò mổ và phân động vật

Sinh sản: cá tai tượng thành thục lần đầu sau 2 năm Cá nhỏ nhất tham giasinh sản là 300 – 400 g Cá đẻ có chất lượng tốt nhất từ 3 – 7 tuổi nặng 2 – 5 kg.Mùa vụ sinh sản, đẻ tập trung vào tháng 2 – 5, giảm đẻ từ tháng 6 trở đi Tuynhiên, nếu chăm sóc tốt, môi trường nước sạch, mật độ nuôi vừa phải, mùa sinhsản sẽ sớm hơn hay kéo dài hơn Sức sinh sản 1 lần đẻ khoảng 3.000 – 5.000trứng Khoảng cách giữa hai lần đẻ là 2 tháng Nếu ao nuôi có thức ăn đầy đủ,khoảng cách giữa hai lần đẻ là 25 – 40 ngày

Sinh trưởng: sau 1 năm nuôi ở ao cá dài 15 cm, nặng 120 – 450 g; 2 nămdài 25 cm nặng 450 – 680 g; 3 năm dài trên 30 cm nặng 2.400 g; 4 năm nặng3.800 g Ở ĐBSCL nuôi ở ao có thức ăn đủ, mật độ vừa phải sau 1 năm cá đạt

500 – 600 g / con

1.3 Các bệnh khác thường gặp trên cá

1.3.1 Bệnh do Aeromonas hydrophila

Bệnh do vi khuẩn bắt màu Gram âm Aeromonas hydrophilaria gây ra.

Theo Yanong và Floyd (2002), Aeromonas được xem là mầm bệnh cơ hội vì vikhuẩn này tồn tại trong môi trường chăn nuôi, không gây bệnh trên đàn cá khỏemạnh và được quản lý tốt

Bệnh tích tương tự như bệnh tích của bệnh gây ra do Streptococcus Ngoài

ra, theo nghiên cứu của Yambot (1998), khi gây bệnh thực nghiệm cho cá rô phithì thấy có hiện tượng thối rửa vây và đuôi cá

1.3.2 Bệnh do ký sinh trùng

1.3.2.1 Bệnh trùng bánh xe

Tác nhân gây bệnh: Ichthyophthyrius multifiliis

Dấu hiệu bệnh lý: da, mang, vây của cá bị nhiễm bệnh có nhiều trùng bámthành các hạt lấm tấm rất nhỏ, màu hơi trắng đục (đốm trắng), có thể thấy rõ bằngmắt thường Da, mang cá có nhiều nhớt, màu sắc nhợt nhạt nên bệnh còn đượcgọi là bệnh vảy nhớt hay bệnh đốm trắng

1.3.2.2 Bệnh rận cá

Tác nhân gây bệnh: rận cá Caligus sp

Dấu hiệu bệnh lý: rận cá Caligus thường ký sinh ở vây, mang cá rô phi Caligus dùng cơ quan miệng, các gai xếp ngược ở mặt bụng cào rách tổ chức da

cá làm cho da cá bị viêm loét tạo điều kiện cho vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng khác xâm nhập, vì vậy nên nó thường cùng lưu hành với bệnh đốm trắng, bệnh đốm

đỏ, lở loét nên dẫn đến làm cá chết hàng loạt Mặt khác, Caligus còn dùng tuyến độc qua ống miệng tiết chất độc phá hoại vật nuôi Cá bị Caligus ký sinh có cảm

giác ngứa ngáy, vận động mạnh trên mặt nước, bơi lội cuồng dại, cường độ bắt mồi giảm

Phân bố và lan truyền bệnh: rận cá Caligus phân bố ở vùng nước ngọt và

cửa sông (nước lợ) chúng ký sinh nhiều loài cá nuôi, cá rô phi nuôi mật độ dày, rận cá ký sinh và đã gây chết cá hàng loạt như ở các đầm nước lợ hoặc nước ngọt

ở Hải Phòng, Ninh Bình, Quảng Ninh, Bến Tre (Bùi Việt Hùng, 2007)

một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạchmới

Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm babước:

 Bước 1: trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cầnthiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ thấp hơn Tm củaphân tử, thường là 94oC – 95oC trong vòng 30 giây – 1 phút Đây là giai đoạnbiến tính (denaturation)

 Bước 2: nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phépcác mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trongkhoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây – 1phút Đây là giai đoạn lai (hybridization)

 Bước 3: nhiêt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerasesử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian tùythuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đếnnhiều phút Đây là giai đoạn tổng hợp, hay kéo dài (elongation)

Một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗilần lại làm tăng gấp đôi số lượng mẫu của lần trước đây là sự khuếch đại theo cấpsố nhân; theo tính toán, sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với số lượng bảnmẫu ban đầu

Hình 1.5 Nguyên lý của phản ứng PCR

(Một chu kỳ gồm 3 bước: 1 biến tính, tách rời 2 mạch của phân tử DNA, 2.lai, cặp mồi chuyên biệt cho một trình tự DNA xác định được cho bắt cặp vớikhuôn, 3 kéo dài, DNA polymerase tổng hợp mạch mới kể từ mồi đã bắt cặp.Chu kỳ này được lặp lại n lần)

(Nguồn: Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997)

 Các thành phần của phản ứng PCR:

 Mồi (primer)

 Cách thành phần khác: bốn loại nucleotide, ion Mg++, đệm, nước

 Các ứng dụng của phản ứng PCR: phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng,chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyếtthống

1.5 Một số nghiên cứu về vi khuẩn Streptococcus và vaccine Streptococcus

trên cá

Năm 2002, Klesius và cộng tác viên đã nghiên cứu vaccine Streptococcus

đạt tiêu chuẩn an toàn trên cá rô phi Thử nghiệm tiêm vaccine vào xoang bụng vàvào cơ của cá rô phi cho thấy vaccine tạo miễn dịch hiệu quả chống lại vi khuẩn

Streptococcus iniae cùng chủng và khác chủng đối với chủng vi khuẩn trong

Kết quả cho thấy sau 31 ngày tiêm, vaccine có kháng nguyên đã qua lưutrữ không bảo vệ được cá tiêm vaccine (cá này bị bệnh và chết) với tỷ lệ phầntrăm sống sót tương đối là 29 % Đáp ứng kháng thể của vaccine này thấp hơnmột cách có ý nghĩa so với kháng thể từ vaccine được tạo ra từ các kháng nguyêntươi Bằng phương pháp nhuộm bạc trong kỹ thuật SDS – PAGE và kỹ thuâtnhuộm miễn dịch Westenblot, đối với cá được tiêm vaccine mới, mẫu huyết thanhcá cho thấy có sự xuất hiện của những băng 54 và 55 kDa Trong khi đó, khôngthấy băng 55 kDa xuất hiện ở vaccine thành phần cũ, và có thêm những băng thấphơn 55 kDa xuất hiện trong kỹ thuật Western blot Kết quả nghiên cứu này chothấy có sự tương quan giữa khả năng bảo hộ bệnh đối với sự tạo ra kháng thểchống lại thành phần ngoại bào, ngoài ra cũng cho thấy tầm quan trọng của khángnguyên ngoại bào 55 kDa đối với hiệu quả của vaccine

Năm 2010, Abuselina và cộng tác viên đã tiến hành phân lập vi khuẩn

Streptococcus từ cá điêu hồng tại bang Selangor, Malaysia Thông qua quan sát

hình thái và định danh bằng bộ kit thương mại (Streptococcal grouping kit,RapIDTM STR System và BBL Crystal GP ID) đã xác định loài vi khuẩn này