PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ.

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y ***************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ HẠNH DUNG Lớp: DH07DY Ngành: Dược Thú Y Niên khóa: 2007-2012 Tháng 08/2012 BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CHĂN NI – THÚ Y **************** LÊ THỊ HẠNH DUNG PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp Bác sĩ thú y Giáo viên hướng dẫn TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH TS NGUYỄN TẤT TOÀN Tháng 08/2012 i XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Họ tên sinh viên thực tập: Lê Thị Hạnh Dung Tên luận văn: “Phân lập Escherichia coli xác định đặc tính gây bệnh vi khuẩn gà” Đã hoàn thành yêu cầu giáo viên hướng dẫn ý kiến nhận xét, đóng góp Hội Đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa ngày…./…./2012 Giáo viên hướng dẫn Giáo viên hướng dẫn TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH TS NGUYỄN TẤT TỒN ii LỜI CẢM ƠN Xin bày tỏ lòng biết ơn vơ hạn đến Cha Mẹ, gia đình, người thân u hết lòng dạy dỗ tơi, cho tơi ăn học nên người Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thị Phước Ninh, TS Nguyễn Tất Tồn tận tình dạy hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực đề tài Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Cơ Bản, Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Ni Thú Y tồn thể q thầy cô khoa Chăn Nuôi Thú Y tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh Viện Thú Y trường Đại Học Nơng Lâm tồn thể cán cơng nhân viên tận tình giúp đỡ tơi suốt thời gian thực tập Cám ơn bạn ngồi lớp tơi học tập giúp đỡ suốt quãng đời sinh viên Xin chân thành cảm ơn! Lê Thị Hạnh Dung iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Đề tài “Phân lập Escherichia coli xác định đặc tính gây bệnh vi khuẩn gà” tiến hành Bệnh Viện Thú Y trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM, thời gian từ ngày 25/11/2011 đến 4/05/2012 Phân lập vi khuẩn E coli 36 mẫu bệnh phẩm (túi khí) gà có bệnh tích điển hình gà khơng có bệnh tích điển hình E coli đem đến mổ khám Bệnh Viện Thú Y Kết ghi nhận tỉ lệ dương tính với E coli 21/36 (58,33 %) Sau thử kháng sinh đồ 21 gốc E coli phân lập với 13 loại kháng sinh, đa số đề kháng cao với số kháng sinh trimethoprim/ sulfamethoxazone (85,72 %); ampicillin, amoxicillin tetracycline (76,19 %); kanamycin doxycycline (71,43 %) nhạy với số kháng sinh neltimicin (95,24 %), colistin (90,48 %), tobramycin (80,96 %), gentamycin (66,67 %), cephalexin (52,38 %) Vi khuẩn kháng trung bình với cefuroxine (66,67 %) Tiến hành chọn 15 gốc E coli phân lập tiêm truyền phôi trứng 12 - 13 ngày tuổi xác định độc lực Trong đó, có 10 gốc có độc lực cao chiếm tỉ lệ 66,67 %, gốc độc lực trung bình 26,67 % gốc khơng có độc lực 6,66 % Tỉ lệ chết phôi khoảng từ - 100 % Xác định đặc tính gây bệnh gà ngày tuổi gốc E coli có độc lực cao gốc có độc lực trung bình cho tỉ lệ gà chết sau tiêm vi khuẩn dao động khoảng 20 - 100 % Kết kiểm tra gene liên quan đến độc lực E coli gây bệnh gia cầm fimC iucD 10 gốc có độc lực PCR cho thấy tỉ lệ số gốc mang gene fimC 90 %, gene iucD 60 % tỉ lệ số gốc có mang gene 50 % iv MỤC LỤC TRANG TỰA i XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT LUẬN VĂN iv MỤC LỤC v DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH SÁCH CÁC BẢNG ix DANH SÁCH CÁC HÌNH – SƠ ĐỒ x Chương MỞ ĐẦU 1.1Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 2.1.1 Đại cương 2.1.2 Đặc điểm sinh học: 2.1.2.1 Đặc điểm hình dạng nhuộm màu 2.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.2.3 Đặc tính sinh hóa 2.1.2.4 Sức đề kháng 2.1.3 Cấu trúc kháng nguyên độc tố 2.1.3.1 Cấu trúc kháng nguyên 2.1.3.2 Độc tố 2.1.3.3 Tính chất gây bệnh 2.2 Bệnh E coli gà 2.2.1 Truyền nhiễm học 2.2.1.1 Động vật cảm thụ 2.2.1.2 Chất chứa bệnh v 2.2.1.3 Phương thức truyền lây 2.2.1.4 Đường xâm nhập 2.2.2 Cơ chế sinh bệnh 2.2.3 Triệu chứng bệnh tích 2.2.3.1 Triệu chứng 2.2.3.2 Bệnh tích 10 2.2.4 Chẩn đoán 10 2.2.5 Phòng điều trị bệnh 10 2.3 Giới thiệu phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 11 2.3.1 Giới thiệu 11 2.3.2 Nguyên tắc chung 12 2.3.3 Các giai đoạn phản ứng PCR 12 2.3.4 Thành phần phản ứng PCR 12 2.3.5 Kiểm tra kết PCR 13 2.3.6 Ứng dụng phương pháp PCR 13 2.4 Nghiên cứu nước 13 2.4.1 Trong nước 13 2.4.2 Ngoài nước 15 Chương NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 17 3.1 Thời gian địa điểm 17 3.1.1 Thời gian 17 3.1.2 Địa điểm 17 3.2 Đối tượng nghiên cứu 17 3.3 Nội dung nghiên cứu 17 3.4 Phương pháp nghiên cứu 17 3.4.1 Phân lập vi khuẩn E coli gà bệnh 19 3.4.1.1 Phân lập vi khuẩn E coli gà bệnh 19 3.4.1.2 Thử kháng sinh đồ 21 3.4.2 Xác định độc lực gốc E coli phân lập qua phôi trứng gà 22 vi 3.4.3 Ghi nhận đặc tính gây bệnh gà ngày tuổi 25 3.4 Khảo sát gene độc lực từ gốc E coli phân lập phương pháp PCR 28 3.5 Xử lý số liệu 30 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Kết phân lập gốc E coli gà khảo sát thử kháng sinh đồ 31 4.1.1 Tỷ lệ dương tính với E coli 31 4.1.2 Kết kháng sinh đồ gốc vi khuẩn E coli phân lập 33 4.2 Xác định độc lực gốc E coli phân lập qua phôi trứng gà 38 4.2.1 Ghi nhận số phôi chết thời gian theo dõi ( - 48 giờ) 38 4.2.2 Quan sát bệnh tích đại thể phôi trứng chết 39 4.3 Điểm triệu chứng bệnh tích gà 40 4.3.1 Tỉ lệ gà chết sau tiêm huyễn dịch vi khuẩn 40 4.3.2 Triệu chứng lâm sàng gà thời gian theo dõi 40 4.3.3 Bệnh tích đại thể vi thể 42 4.4 Kết kiểm tra số gene độc lực vi khuẩn E coli 45 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47 5.1 Kết luận 47 5.2 Đề nghị 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 51 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT APEC: Avian pathogenic Escherichia coli BA: Bool Agar BHI: Brain Heart infusion Broth CFU: Colony – forming units CRD: Chronic Respiratory Disease DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphat EMB: Eosin Methylen Blue EPEC: Enteropathogenic E coli ETEC: Enterotoxigenic E coli EIEC: Enteroinvasie E coli IMViC: Indol, Methyl Red, Voges – Proskauer, Simon’s Citrate LT: Heat labile toxin LPS: Lipopolysaccharide MCK: Mac Con Key NA: Nutrient agar SLT: Shiga Like Toxin ST: Heat stable toxin KIA: Kligler iron agar PCR: Polymerase chain reaction TBE: Tris – borate EDTA UV: Ultra violet VTEC: Verotoxigenic E coli viii DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1 Số lượng mẫu gà mổ khám 20  Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 23  Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm 26  Bảng 3.4 Bảng điểm triệu chứng gà bị bệnh vi khuẩn E coli .27  Bảng 3.5 Bảng cho điểm bệnh tích đặc trưng vi khuẩn E coli 28  Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR 29  Bảng 3.7 Trình tự primer sử dụng phản ứng PCR 30  Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 30  Bảng 4.1 Kết phân lập vi khuẩn E coli 31  Bảng 4.2 Kết kháng sinh đồ E coli .34  Bảng 4.3 Kết kháng sinh đồ 17 gốc E coli 36  Bảng 4.4 Kết kháng sinh đồ gốc E coli 37  Bảng 4.5 Kết tỉ lệ phôi trứng chết sau ngày theo dõi 38  Bảng 4.6 Tỉ lệ chết gà thí nghiệm sau ngày theo dõi 40  Bảng 4.7 Điểm trung bình triệu chứng gà thời gian theo dõi 41  Bảng 4.8 Điểm bệnh tích trung bình số gan sau ngày 42  Bảng 4.9 Tỉ lệ phát gene độc lực .45  ix tương đối yếu thiếu diện thường xuyên đại thực bào (Antão ctv, 2008) Điểm bệnh tích trung bình gốc E coli có độc lực cao thấp so với gốc E coli có độc lực trung bình, gốc E coli độc lực cao gây chết nhanh nên mổ khám gà chết vào ngày thứ ngày thứ khơng cho thấy bệnh tích điển hình Kết thử nghiệm độc lực gốc E coli phân lập từ thực địa gà cần thử nghiệm lặp lại để có kết xác khả gây bệnh hai nhóm độc lực Bệnh tích vi thể số quan Các bệnh tích chủ yếu gặp tiêu là: Tim: có nhiều điểm sung huyết xuất huyết Viêm màng bao tim có nhiều bạch cầu Trong tim có mạch máu bị xung huyết Trên bề mặt màng bao tim bị sung huyết, có tích dịch Cơ tim nhiều chỗ bị teo nhỏ Lách: bị hư hại, thể lách khơng thấy rõ, có số điểm xuất huyết mơ lách Phổi: viêm phổi lan rộng có tương dịch, xuất huyết, vùng viêm lớn nên gà chỗ để thở, có tương dịch lòng phế nang Gan: xuất huyết, đặc biệt bị sung huyết nặng (xuất huyết vài điểm) khoảng liên tiểu thùy Túi khí: dày tích casein hóa sợi, có sợi huyết, viêm có nhiều bạch cầu, màng túi khí dày, xếp nếp nhiều so với bình thường Thận: sung huyết, xuất huyết nhiều nơi rải rác thận, có vùng tủy, ống lượn bị hư hại nặng, hoại tử đông đặc, thận bị viêm nặng Ruột: nhung mao ruột bị hủy hoại nhiều, biểu mô che bề mặt bong tróc, tuyến ruột biến mất, hư hại nặng, bạch cầu xuất rải rác niêm mạc Những bệnh tích phù hợp với bệnh tích E coli gây bệnh gây nhiễm trùng huyết Kết bệnh tích vi thể thí nghiệm tương đồng với kết bệnh tích vi thể Hồ Thị Kim Cúc (2011), Phan Huỳnh Trung (2011) 43 Hình 4.7 Viêm phổi lan rộng (100X) Hình 4.6 Tim xuất huyết nhiều (100X) Hình 4.8 Lách sung huyết (100X) Hình 4.9 Túi khí dày tích casein (100X) Hình 4.11 Biểu mơ ruột bong tróc(100X) Hình 4.10 Thận sung huyết, xuất huyết (100X) 44 4.4 Kết kiểm tra số gene độc lực vi khuẩn E coli Kết phát gene liên quan đến độc lực vi khuẩn E coli gây bệnh gia cầm fimC iucD gốc E coli phân lập thể bảng 4.9 Bảng 4.9 Tỉ lệ phát gene độc lực Tỉ lệ dương tính với gene độc lực fimC Số gốc E coli (n=10) iucD Số lượng Tỉ lệ (%) Số lượng Tỉ lệ (%) Độc lực cao (n=8) 100 62,5 Độc lực trung bình (n=2) 50 50 Kết kiểm tra diện gene liên quan đến yếu tố độc lực fimC iucD 10 gốc vi khuẩn E coli phân lập từ thực địa cho kết cao Trong đó, tỉ lệ phát gene fimC tổng số 10 gốc 90 % cao iucD 60 %, tỉ lệ số gốc có mang gene 50 % Các gốc có độc lực cao tỉ lệ phát gene fimC 100 % có gốc E coli không gây chết gà, gene iucD 62,5 % Các gốc có độc lực trung bình tỉ lệ phát gene fimC gene iucD 50% fim C ladder iucD 10 11 12 13 700bp 500bp Hình 4.12 Kết điện di sản phẩm khuếch đại fimC iucD fimC (496bp); iucD (714bp) (5,8) ĐC (+); (6) ĐC( -); (1, 9) T1; (2, 10) T3 ; (3, 11) T10;(4,12) T14;(13) T2; (7) 100bp DNA ladder 45 Theo kết nghiên cứu Won ctv (2009), có 112/118 mẫu E coli phân lập từ gà bệnh E coli có gene iucD 47,5 % so với kết chúng tơi đạt kết cao Kết theo Giovanardi ctv (2005) 100% mẫu có mang gene fimC iucD, Nguyễn Thị Mỹ Linh (2011) tỉ lệ số gốc E coli có mang gene fimC 86,7 %, gene iucD 93,3 %, tỉ lệ số gốc có mang gene 86,7 % kết thấp E coli vi khuẩn hội xâm nhiễm vào đường hô hấp vật chủ gene fimC gene mã hóa cho tiêm mao loại giúp cho vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu mơ đường hơ hấp (túi khí phổi) nhân lên đây, gene iucD gene tổng hợp hệ thống hấp thu sắt (hấp thu sắt từ vật chủ) Khi gà bị stress thay đổi thức ăn, vận chuyển, thời tiết thay đổi hay bị bệnh truyền nhiễm, không truyền nhiễm làm cho sức đề kháng giảm chúng nhân lên, di chuyển đến quan khác gây bệnh cho gà Cần xác định thêm gene liên quan đến yếu tố độc lực khác để khảo sát chi tiết đặc điểm chế gây bệnh gốc E coli 46 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Tỉ lệ phân lập gốc E coli dương tính từ gà bị bệnh 58,33 % Phần lớn gốc E coli phân lập đề kháng cao với kháng sinh trimethoprim/sulfamethoxazone, ampicillin, amoxicillin, tetracycline, kanamycin, doxycycline nhạy cảm với neltimicin, colistin, tobramycin, gentamycin, cephalexin Đa số gốc E coli phân lập có khả gây chết phơi trứng gà gây bệnh gà – ngày tuổi với triệu chứng bệnh tích điển hình Đa số gốc E coli có độc lực phân lập mang gene fimC iucD 5.2 Đề nghị Số lượng mẫu thí nghiệm nhiều hơn, nghiên cứu đầy đủ yếu tố gây bệnh vi khuẩn E coli gà có tính lặp lại thí nghiệm Xác định độc lực gốc lại, kiểm tra type kháng nguyên kiểm tra gene độc lực khác 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Xuân Bình ctv, 2002 109 Bệnh gia cầm cách phòng trị Nhà xuất nơng nghiệp Hà Nội, trang 41 - 46 Hồ Thị Kim Cúc, 2011 Phân lập E coli xác định đặc tính gây bệnh vi khuẩn gà Luận văn tốt nghiệp Bác sỹ Thú Y, Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, Việt Nam Tơ Minh Châu Trần Thị Bích Liên, 2006 Vi khuẩn nấm gây bệnh thú y Tủ sách trường Đai Học Nơng Lâm TP.HCM Trần Thị Bích Liên, 2006 Giáo trình thực hành vi khuẩn nấm thú y Tủ sách Đại Học Nông Lâm TP.HCM Nguyễn Ngọc Hải, 2005 Giáo trình thực hành vi sinh Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Kim Loan, 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật Nhà Xuất Bản Nông Nghiệp Nguyễn Thị Mỹ Linh, 2011 Phân lập, thử kháng sinh đồ xác định độc lực vi khuẩn Echerichia coli gà số địa phương Luận văn tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học Trường Đại Học Nông Lâm, Tp.HCM Nguyễn Hoàng Lộc, Lê Việt Dũng, Trần Quốc Dũng, 2009 Giáo trình cơng nghệ DNA tái tổ hợp Nhà xuất Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Lê Văn Năm, 2010 Bệnh gia cầm Việt Nam- Bí phòng trị bệnh đạt hiệu cao Nhà Xuất Bản Hà Nội 10 Nguyễn Thị Phước Ninh,2011 Bệnh truyền nhiễm gia cầm Tủ sách trường Đai Học Nơng Lâm TP.HCM 11 Nguyễn Vĩnh Phước, 1977 Giáo trình vi sinh vật học thú y Tủ sách trường Đại Học Nơng Lâm, TP.HCM 12 Lò Thanh Sơn 2009 Cơng nghệ di truyền Nhà xuất Đại Học Tây Bắc 48 13 Võ Thành Thìn, Ellen O., Nguyễn Viết Thơng, Bruno M., Goddeeris, 2008 Ứng dụng phương pháp multiplex PCR để phát khả giành sắt vi khuẩn E.coli gây bệnh gà Khoa học Kỹ thuật Thú Y, Tập XV, số 4, trang 60-65 14 Lâm Minh Thuận, 2002 Bài giảng chăn nuôi gia cầm Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm, Tp.HCM 15 Phan Huỳnh Trung, 2011 Phân lập E coli xác định đặc tính gây bệnh vi khuẩn gà Luận văn tốt nghiệp ngành Bác sĩ thú y Trường Đại Học Nơng Lâm, Tp.HCM 16 Nguyễn Ngọc Tn, 2002 Giáo trình vệ sinh thịt Tủ sách trường Đại Học Nông Lâm, Tp.HCM Tiếng Anh 17 Antão ME., Glodde S., Li G., Sharifi R., Homeier T., Laturnur C., Diehl I., Bethe A., Philipp HC., Preisinger R., Wieler LH., Ewers C 2008 The chicken as a natural model for extraintestinal infections caused by avian pathogenic Escherichia coli (APEC).Microbial pathogenesis 45: 361 – 369 18 Barnes, H.J and W.B Gross, 1997 Colibacillosis In: Diseases of Poultry Calnek, B.W., at al (Eds.) 10th Edition, Mosby-Wolf Publication Ltd., London, UK., pp: 131-139 ISBN: 0-7234-2955-3 19 Botteldoorn N., Heydrick M., Rijpens N., Herman L 2003 Detection and characterization of verotoxigenic Escherichia coli by a VTEC/EHEC multiplex – PCR in porcine faeces in pig carcass swabs Res Microbiol 154: 97 – 104 20 Cebula T A., Payne W L., and Fegn P 1995 Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype 0157:H7 and their Shiga-like toxin type by Mismatch amplification mutation assay multiplex – PCR J Clin Microbiol 33: 28 - 250 49 21 Cerna J F., Nataro J P, and Garcia T E 2003 Multiplex – PCR for detection of three plasmid borne genes of enteroaggregative Escherichia coli strains J Clin Microbiol 42: 2138 – 2140 22 Dho - Moulin M., Fairbrother J M., 1999 Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) Vet Res 30 (2 - 3): 299 – 316 23 Nabbut Nhvaf Khatib IH, 1978 Virulence of Escherichia coli strains of chicken embryo Avian Disease 22 (1) P 10 – 15 24 Giovanardi D., Campagnari E., Ruffoni L Sperati, Pesente P., Ortali G And Furlattini V 2005 Avian pathogenic Escherichia coli tranmission from broiler breeders to their progeny in an intergrated poultry production chain Avian Pathology.34: 4, 313 - 318 25 T Zahraei Salehi and S Farashi Bonab 2006 Antibiotics Susceptibility Pattern of Escherichia coli Strains Isolated from Chickens with Colisepticemia in Tabriz Province, Iran International Journal of Poultry Science (7): p 677-684 26 Wooley RE, Gibb PS, Brown TP, Maurer JJ, 2000 Chicken embryo lethality assay for determining the virulence of avian Escherichia coli isolates Avian Disease 44(2) P 318 – 324 27 http://www.microbiologybook.org/Albanian/Albanian-chap10.htm 50 PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG ĐỂ NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP VI KHUẨN BA (Blood agar) Peptone from casein 10 g Peptone from meat 5g Heart extract 3,6 Extract from yeast 5g Starch 1g Sodium chloride 5g Agar – agar 13 g Nước cất 1000 ml BHI (Brain Heart Infusion Broth) Beef heart infusion from 250 g Calf brain infusion from 200 g Proteose peptone 10 g Sodium chloride 5g Di – sodium phosphate 2,5 g Dextrose 2g Nước cất 1000 ml Peptone lactose 10 g Phosphate dipotassium (K2HPO4) 2g Eosin 10 g Methylen Blue 10 g Agar 15 g Nước cất 1000 ml EMB KIA (Kligler Iron Agar) Cao nấm men 3g Beef extract 3g 51 Peptone 20 g NaCl 5g Lactose 10 g FeSO4 0,2 g Na2S2O3 0,3 Glucose 1g Agar 15 g Nước cất 1000 ml Phenol red ml NA (Nutrient agar) Peptone 5g Sodium chloride 5g Beef Extract 1,5 g Yeast Extract 1,5 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 15 g pH = 7,4 ± 0,2 (250C) Idol Beef extract 3g Peptone 5g Nước cất 1000 ml SIMMON CITRAE Sodium citrate 2g NaCl 5g K2HPO4 1g NH4H2PO4 1g MgSO4 0,2 g Bromothymol blue 0,08 g Agar 15 g Nước cất vừa đủ 1000 ml 52 MR – VP Peptone 7g Glucose 5g K2HPO4 5g Nước cất vừa đủ 800 ml pH = 6,9 ± 0,2 Thuốc thử VP (Voges Proskauer) Dung dịch A: Alpha naphthol 5g Ethanol tuyệt đối 100 ml Dung dịch B: Potassium hydroxyde 40 g Nước cất 100 ml MR (Methyl red) Methyl red 0,1 g Alcohol 300 ml Nước cất vừa đủ 500ml Thuốc thử Kovác Para – dimethyl amino benzaldehyde: 5g Cồn butylic hay Isoamylic: 75 ml HCl đậm đặc : 25 ml 53 Bảng 1Các chuẩn mực biên luận đường kính vòng vơ khuẩn Enterobacteriaceae Đĩa kháng sinh Hàm lượng Ampicillin 10 µg Amoxicillin 10 µg Cephalexin 30 µg Cefuroxime acetil 30 µg Gentamicin 10 µg Kanamycin 30 µg Netilmicin 30 µg Tobramycin 10 µg Tetracycline 30 µg Doxycycline 30 µg Norfloxacin 10 µg Trimethoprim/ 23,75 µg sulfamethoxazole Colistin KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Đường kính vòng vơ khuẩn đo mm tròn Kháng Trung gian Nhạy ≤13 14-16 ≥17 ≤13 14-16 ≥17 ≤14 15-17 ≥18 ≤14 15-22 ≥23 ≤12 13-14 ≥15 ≤13 14-17 ≥18 ≤12 13-14 ≥15 ≤12 13-14 ≥15 ≤14 15-18 ≥19 ≤12 13-15 ≥16 ≤12 13-16 ≥17 ≤10 11-15 ≥16 ≤8 9-10 ≥11 Bảng Kết sau ngày tiêm phôi trứng Thời gian theo dõi Tổng số Tỉ lệ chết (%) Độc lực Ghi 45,45 Cao Tiêm gà 27,27 Trung bình Tiêm gà 11 100 Cao Tiêm gà T4 3 27,27 Trung bình Tiêm gà T5 2 36,36 Cao T6 1 9,09 Không T7 36,36 Cao Tiêm gà T8 54,54 Cao Tiêm gà T9 2 18,18 Trung bình T10 63,63 Cao Tiêm gà T11 72,72 Cao Tiêm gà T12 1 18,18 Trung bình T13 4 36,36 Cao T14 8 72,72 Cao Tiêm gà T15 36,36 Cao Tiêm gà Lô TN – 24h 24 – 48h phôi chết T1 T2 T3 54 Bảng Kết gây bệnh chết gà thí nghiệm Lơ Số gà ni Số gà có triệu Tỉ lệ gà có triệu Số gà Tỷ lệ chết TN (con) chứng bệnh chứng bệnh (%) chết (%) T1 10 60 50 50 T3 10 10 100 10 100 T7 10 60 0 T8 10 60 0 T10 10 60 60 T11 10 50 20 T14 10 60 80 T15 10 40 20 Trung T2 10 50 50 bình T4 10 30 20 Không ĐC 10 0 0 Độc lực Cao Bảng Điểm triệu trứng lơ thí nghiệm Mẫu Ngày Ngày Ngày 4 T1 1 1 0 T3 0 0 0 0 T7 0 5 0 0 T8 0 0 1 0 T10 4 0 0 0 T11 1 0 0 0 0 T14 2 1 0 T15 2 0 0 0 0 0 T2 0 0 0 T4 0 0 0 0 ĐC 10 0 0 10 0 10 0 0 55 Bảng Điểm bệnh tích lơ thí nghiệm Điểm bệnh tích (số con) Túi khí Phổi Gan Tim màng bao tim Lách Gốc Điểm Điểm E coli 3 2 T1 0 0 0 0 T3 0 0 0 T7 0 0 1 0 T8 1 0 0 T10 0 0 T11 0 1 0 T14 0 0 0 0 0 0 T15 0 0 1 0 T2 2 5 T4 0 3 0 ĐC 0 0 0 0 0 0 0 Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm Điểm 56 Bảng Kết xét nghiệm PCR Gốc E coli fimC iucD T1 + + T3 + + T7 + - T8 + - T10 + + T11 + + T14 + + T15 + - T2 - + T4 + - Chú thích: (+): Dương tính, (-): Âm tính 57 ... forming units CRD: Chronic Respiratory Disease DNA: Deoxyribonucleic acid dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphat EMB: Eosin Methylen Blue EPEC: Enteropathogenic E coli ETEC: Enterotoxigenic E coli... Proskauer, Simon’s Citrate LT: Heat labile toxin LPS: Lipopolysaccharide MCK: Mac Con Key NA: Nutrient agar SLT: Shiga Like Toxin ST: Heat stable toxin KIA: Kligler iron agar PCR: Polymerase chain... khuyến cáo trình điều trị gồm: cephalexin, gentamicin, norfloxacine,… Dùng - ngày liên tục 2.3 Giới thi u phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 2.3.1 Giới thi u Phương pháp PCR (Polymerase