PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ.

PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ thú y Giáo viên hướng dẫn TS.. iiXÁC NHẬN CỦ

BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y

*****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH

GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ

Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ HẠNH DUNG Lớp: DH07DY

Niên khóa: 2007-2012

Tháng 08/2012

PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH

GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN NÀY TRÊN GÀ

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ thú y

Giáo viên hướng dẫn

TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH

TS NGUYỄN TẤT TOÀN

Tháng 08/2012

ii

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ và tên sinh viên thực tập: Lê Thị Hạnh Dung

Tên luận văn: “Phân lập Escherichia coli và xác định đặc tính gây bệnh của vi

khuẩn này trên gà” Đã hoàn thành yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý kiến

nhận xét, đóng góp của Hội Đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa ngày…./…./2012

TS NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH TS NGUYỄN TẤT TOÀN

Xin cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm Khoa Cơ Bản, Ban Chủ Nhiệm Khoa Chăn Nuôi Thú Y và cùng toàn thể quý thầy cô khoa Chăn Nuôi Thú Y đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Bệnh Viện Thú Y trường Đại Học Nông Lâm cùng toàn thể cán bộ công nhân viên đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập

Cám ơn các bạn trong và ngoài lớp đã cùng tôi học tập giúp đỡ nhau trong suốt quãng đời sinh viên

Xin chân thành cảm ơn!

Lê Thị Hạnh Dung

TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài “Phân lập Escherichia coli và xác định đặc tính gây bệnh của vi

khuẩn này trên gà” được tiến hành tại Bệnh Viện Thú Y trường Đại Học Nông

Lâm Tp.HCM, thời gian từ ngày 25/11/2011 đến 4/05/2012

Phân lập vi khuẩn E coli trên 36 mẫu bệnh phẩm (túi khí) trên những gà có bệnh tích điển hình và gà không có bệnh tích điển hình do E coli được đem đến mổ khám tại Bệnh Viện Thú Y Kết quả ghi nhận tỉ lệ dương tính với E coli là 21/36

(58,33 %)

Sau đó thử kháng sinh đồ của 21 gốc E coli phân lập được với 13 loại kháng

sinh, đa số đề kháng cao với một số kháng sinh như trimethoprim/ sulfamethoxazone (85,72 %); ampicillin, amoxicillin và tetracycline (76,19 %); kanamycin và

doxycycline (71,43 %) và chỉ còn nhạy với một số kháng sinh như neltimicin (95,24

%), colistin (90,48 %), tobramycin (80,96 %), gentamycin (66,67 %), cephalexin (52,38 %) Vi khuẩn kháng trung bình với cefuroxine (66,67 %)

Tiến hành chọn ra 15 gốc E coli phân lập được tiêm truyền trên phôi trứng

12 - 13 ngày tuổi xác định độc lực Trong đó, có 10 gốc có độc lực cao chiếm tỉ lệ 66,67 %, 4 gốc độc lực trung bình 26,67 % và 1 gốc không có độc lực 6,66 % Tỉ lệ chết phôi trong khoảng từ 0 - 100 %

Xác định đặc tính gây bệnh trên gà con 1 ngày tuổi của 8 gốc E coli có độc

lực cao và 2 gốc có độc lực trung bình cho tỉ lệ gà con chết sau khi tiêm vi khuẩn dao động trong khoảng 20 - 100 %

Kết quả kiểm tra 2 gene liên quan đến độc lực của E coli gây bệnh gia cầm

là fimC và iucD trên 10 gốc có độc lực bằng PCR cho thấy tỉ lệ số gốc mang gene

fimC là 90 %, gene iucD là 60 % và tỉ lệ số gốc có mang cả 2 gene là 50 %

v

MỤC LỤC

TRANG TỰA i

XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ii

LỜI CẢM ƠN iii

TÓM TẮT LUẬN VĂN iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH – SƠ ĐỒ x

Chương 1MỞ ĐẦU 1

1.1Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Escherichia coli (E coli) 3

2.1.1 Đại cương 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học: 3

2.1.2.1 Đặc điểm hình dạng và sự nhuộm màu 3

2.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy 4

2.1.2.3 Đặc tính sinh hóa 4

2.1.2.4 Sức đề kháng 5

2.1.3 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố 5

2.1.3.1 Cấu trúc kháng nguyên 5

2.1.3.2 Độc tố 6

2.1.3.3 Tính chất gây bệnh 7

2.2 Bệnh do E coli trên gà 8

2.2.1 Truyền nhiễm học 8

2.2.1.1 Động vật cảm thụ 8

2.2.1.2 Chất chứa căn bệnh 8

2.2.1.3 Phương thức truyền lây 8

2.2.1.4 Đường xâm nhập 9

2.2.2 Cơ chế sinh bệnh 9

2.2.3 Triệu chứng và bệnh tích 9

2.2.3.1 Triệu chứng 9

2.2.3.2 Bệnh tích 10

2.2.4 Chẩn đoán 10

2.2.5 Phòng và điều trị bệnh 10

2.3 Giới thiệu phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 11

2.3.1 Giới thiệu 11

2.3.2 Nguyên tắc chung 12

2.3.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR 12

2.3.4 Thành phần phản ứng PCR 12

2.3.5 Kiểm tra kết quả PCR 13

2.3.6 Ứng dụng của phương pháp PCR 13

2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nước 13

2.4.1 Trong nước 13

2.4.2 Ngoài nước 15

Chương 3NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 17

3.1 Thời gian và địa điểm 17

3.1.1 Thời gian. 17

3.1.2 Địa điểm 17

3.2 Đối tượng nghiên cứu 17

3.3 Nội dung nghiên cứu 17

3.4 Phương pháp nghiên cứu 17

3.4.1 Phân lập vi khuẩn E coli trên gà bệnh 19

3.4.1.1 Phân lập vi khuẩn E coli trên gà bệnh 19

3.4.1.2 Thử kháng sinh đồ 21

3.4.2 Xác định độc lực của các gốc E coli phân lập được qua phôi trứng gà 22

3.4.3 Ghi nhận đặc tính gây bệnh trên gà con 1 ngày tuổi 25

3.4 Khảo sát các gene độc lực từ các gốc E coli phân lập bằng phương pháp PCR 28

3.5 Xử lý số liệu 30

Chương 4KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết quả phân lập các gốc E coli trên gà khảo sát và thử kháng sinh đồ 31

4.1.1 Tỷ lệ dương tính với E coli 31

4.1.2 Kết quả kháng sinh đồ của các gốc vi khuẩn E coli phân lập được. 33

4.2 Xác định độc lực của các gốc E coli phân lập được qua phôi trứng gà 38

4.2.1 Ghi nhận số phôi chết trong thời gian theo dõi ( 0 - 48 giờ) 38

4.2.2 Quan sát bệnh tích đại thể trên những phôi trứng đã chết 39

4.3 Điểm triệu chứng và bệnh tích trên gà 40

4.3.1 Tỉ lệ gà con chết sau khi tiêm huyễn dịch vi khuẩn 40

4.3.2 Triệu chứng lâm sàng của gà con trong thời gian theo dõi 40

4.3.3 Bệnh tích đại thể và vi thể 42

4.4 Kết quả kiểm tra một số gene độc lực của vi khuẩn E coli 45

Chương 5KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 51

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APEC: Avian pathogenic Escherichia coli

BA: Bool Agar

BHI: Brain Heart infusion Broth

CFU: Colony – forming units

CRD: Chronic Respiratory Disease

DNA: Deoxyribonucleic acid

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphat

EMB: Eosin Methylen Blue

EPEC: Enteropathogenic E coli

ETEC: Enterotoxigenic E coli

EIEC: Enteroinvasie E coli

IMViC: Indol, Methyl Red, Voges – Proskauer, Simon’s Citrate LT: Heat labile toxin

LPS: Lipopolysaccharide

MCK: Mac Con Key

NA: Nutrient agar

SLT: Shiga Like Toxin

ST: Heat stable toxin

KIA: Kligler iron agar

PCR: Polymerase chain reaction

TBE: Tris – borate EDTA

UV: Ultra violet

VTEC: Verotoxigenic E coli

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Số lượng mẫu gà đã mổ khám 20 

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 23 

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm 26 

Bảng 3.4 Bảng điểm triệu chứng của gà bị bệnh do vi khuẩn E coli 27 

Bảng 3.5 Bảng cho điểm bệnh tích đặc trưng do vi khuẩn E coli 28 

Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR 29 

Bảng 3.7 Trình tự các primer được sử dụng trong phản ứng PCR 30 

Bảng 3.8 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 30 

Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli 31 

Bảng 4.2 Kết quả kháng sinh đồ của E coli 34 

Bảng 4.3 Kết quả kháng sinh đồ của 17 gốc E coli 36 

Bảng 4.4 Kết quả kháng sinh đồ của 4 gốc E coli 37 

Bảng 4.5 Kết quả tỉ lệ phôi trứng chết sau 2 ngày theo dõi 38 

Bảng 4.6 Tỉ lệ chết của gà con thí nghiệm sau 7 ngày theo dõi 40 

Bảng 4.7 Điểm trung bình triệu chứng của gà trong thời gian theo dõi 41 

Bảng 4.8 Điểm bệnh tích trung bình ở một số cơ gan sau 7 ngày 42 

Bảng 4.9 Tỉ lệ phát hiện gene độc lực 45 

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH – SƠ ĐỒ

Hình 2.1 Hình vi khuẩn E coli 4

Hình 2.2 Cấu trúc kháng nguyên E coli 5

Hình 4.1 Khuẩn lạc E coli có màu tím ánh kim trên môi trường EMB 32

Hình 4.2 Kết quả kháng sinh đồ 35

Hình 4.3 Bệnh tích đại thể trên phôi gà 39

Hình 4.4 Gà có triệu chứng bệnh do E coli 41

Hình 4.5 Bệnh tích đại thể trên gà thí nghiệm 42

Hình 4.6 Tim xuất huyết nhiều 44

Hình 4.7 Viêm phổi lan rộng 44

Hình 4.8 Lách sung huyết 44

Hình 4.9 Túi khí dày tích casein 44

Hình 4.10 Thận sung huyết, xuất huyết Error! Bookmark not defined. Hình 4.11 Biểu mô ruột bong tróc 44

Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại của fimC và iucD 45

Sơ đồ 3.1 Các bước tiến hành thí nghiệm 188 

Sơ đồ 3.2 Qui trình phân lập vi khuẩn E coli 20 

Sơ đồ 3.3 Cách pha huyễn dịch vi khuẩn E coli 23 

Sơ đồ 3.4 Quy trình thử nghiệm độc lực vi khuẩn trên phôi trứng 24 

1

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Escherichia coli là một tác nhân gây bệnh chủ yếu trong chăn nuôi gia cầm,

được xem là một trong những nguyên nhân gây thiệt hại lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi gà công nghiệp trên toàn thế giới Bệnh xảy ra ở gà mọi lứa tuổi, làm giảm tỉ lệ ấp nở, giảm tỉ lệ đẻ, giảm tăng trọng, làm tăng tỉ lệ chết, tăng chi phí sản

xuất (Barnes & Gross, 1997) E coli có khả năng gây bệnh trên tất cả các cơ quan

như viêm túi khí, viêm màng bao quanh gan, tim, viêm phổi, nhiễm trùng huyết, túi lòng đỏ và thường hay kết hợp với nhiều bệnh khác làm cho bệnh trở nên trầm trọng

hơn nhất là kết hợp với Mycoplasma gallisepticum gây viêm khớp, sưng phù đầu,

viêm màng bụng…gây thiệt hại cho người chăn nuôi, chậm xuất chuồng Vì thế cần chẩn đoán chính xác bệnh để có biện pháp phòng và điều trị kịp thời

Khả năng gây bệnh của E coli còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố bên trong và

bên ngoài tác động như: điều kiện môi trường như chuồng nuôi không đủ tiêu chuẩn, thức ăn và nước uống bị ô nhiễm, tình trạng nuôi nhốt quá đông…và gia cầm

bị trong giai đoạn nhạy cảm (suy giảm miễn dịch, stress, chấn thương…) (Dho -

Moulin và Fairbother, 1999) Bản thân vi khuẩn E coli gây bệnh trên gia cầm tổng

hợp nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố và có yếu tố không phải là độc tố Nhưng chưa

có yếu tố độc lực cụ thể nào được xác định là chịu trách nhiệm gây bệnh E coli ở gia cầm (Antão và ctv, 2008) Đồng thời, do có nhiều chủng kháng nguyên E coli

gây bệnh và việc điều trị bằng kháng sinh hiện nay không đạt được hiệu quả cao Vì vậy, việc kiểm soát và phòng trị bệnh gặp rất nhiều khó khăn

Việc sử dụng phôi gà và gà con làm mô hình thử nghiệm để gây nhiễm với

E coli phân lập từ thực địa kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử PCR để xác định

2

gene độc lực giúp chúng ta hiểu rõ hơn cơ chế gây bệnh, các yếu tố độc lực liên

quan đến E coli trên gia cầm là điều rất cần thiết Đồng thời, kiểm tra tính nhạy cảm của E coli với một số loại kháng sinh giúp hiểu hơn về tình trạng sử dụng

kháng sinh hiện nay, từ đó nâng cao hiệu quả trong công tác phòng và điều trị bệnh nhằm bảo vệ sức khỏe con người và vật nuôi

Với những lý do trên, được sự chấp thuận của Khoa Chăn Nuôi - Thú Y, trường Đại Học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh và dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn

Thị Phước Ninh và TS Nguyễn Tất Toàn chúng tôi thực hiện đề tài: “ Phân lập

Escherichia coli và xác định đặc tính gây bệnh của vi khuẩn này trên gà.”

1.2 Mục đích và yêu cầu

Mục đích

Phân lập và xác định đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E coli làm cơ sở cho

công tác chẩn đoán và phòng trị bệnh có hiệu quả

Phân lập các gốc E coli trên gà có bệnh tích điển hình và không điển hình do

E coli gây ra

Xác định độc lực của các gốc E coli phân lập được qua phôi trứng gà 12-13

ngày tuổi và gà con 1 ngày tuổi Ghi nhận bệnh tích đại thể và vi thể trên gà sau khi

tiêm các gốc vi khuẩn E coli phân lập được

Xác định các gene độc lực của các gốc E coli có khả năng gây bệnh

3

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về vi khuẩn Escherichia coli (E coli)

2.1.1 Đại cương

Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), vi khuẩn Eschesrichia

coli (E coli) thuộc:

Loài: Escherichia coli

Escherichia coli được gọi tắt là E coli còn có tên là Bacterium coli commue

được ông Escherich phát hiện năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em

E coli là trực khuẩn ruột già, vi khuẩn này có mặt trong ruột hầu hết động

vật, ở phần cuối ruột non hay ruột già, ít khi có ở dạ dày hay phần trước ruột non của các loài động vật như: chó, mèo, heo, bò, ngựa, gia cầm và người

Vi khuẩn thường theo phân ra ngoài nên ta thường thấy vi khuẩn trong đất, nước, không khí Trong tự nhiên vi khuẩn sống được vài tuần đến vài tháng Động

vật non cảm nhiễm đặc biệt với E coli

2.1.2 Đặc điểm sinh học

2.1.2.1 Đặc điểm hình dạng và sự nhuộm màu

E coli là trực khuẩn Gram âm, bắt màu hồng, kích thước 1 - 3 x 0,5 hai đầu

tròn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn di động, không hình thành nha bào, có giáp mô thỉnh thoảng thấy bắt màu lưỡng cực ở hai đầu

4

Hình 2.1 Vi khuẩn E coli

(http://www.microbiologybook.org/Albanian/Albanian-chap10.htm)

2.1.2.2 Đặc điểm nuôi cấy

Vi khuẩn E.coli là trực khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi, có thể nuôi cấy ở

khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng đục hơi lồi, để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn Trên môi trường thạch máu có chủng dung huyết α, β và có chủng không gây dung huyết Trên thạch gelatin không tan chảy Môi trường canh dinh dưỡng làm đục đều môi trường, sau lắng xuống đáy có màu tro nhạt, đôi khi có màu xám, mùi trứng thối Trên môi trường chuyên biệt: môi trường Mac Conkey (MCK): tạo khóm đỏ hồng; trên môi trường Eosin methylen blue (EMB): tạo khuẩn lạc màu tím ánh kim; trên môi trường Kligler iron agar (KIA): lên men đường glucose và lactose (vàng/vàng),

xanh lá mạ

2.1.2.3 Đặc tính sinh hóa

E coli lên men sinh hơi đường glucose, lactose, manitol, galactose E coli

lên men không sinh hơi đường maltose, arabinose, lên men hay không lên men đường saccarose, không lên men dextrin, glycogen, salisin amidon, ít khi lên men inulin, pectin Phản ứng IMViC: ++ (indol +, methylred +, voges proskauer -, citrate -)

5

2.1.2.4 Sức đề kháng

E.coli bị tiêu diệt ở nhiệt độ 550C trong 1 giờ, 600C trong 15 - 30 phút, 95%

bị diệt ở nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ Trong tự nhiên có thể tồn tại từ vài tuần đến 1 tháng, chủng độc lực cao có thể tồn tại trên 4 tháng

Vi khuẩn này dễ dàng bị diệt bởi các chất sát trùng thông thường như: acid

cao hơn các vi khuẩn khác như Salmonella, Shigella (Tô Minh Châu và Trần Thị

Bích Liên, 2006)

2.1.3 Cấu trúc kháng nguyên và độc tố

2.1.3.1 Cấu trúc kháng nguyên

Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), cấu trúc kháng nguyên

của vi khuẩn E coli phức tạp, gồm 4 loại: O, H, K và F

Kháng nguyên thân O (Ohn)

Kháng nguyên thân O có bản chất là Lipopolysaccharide (LPS), có trên 160 loại phân bố trong vách tế bào Kháng nguyên này bền với nhiệt độ và cồn, không

được 20 giờ Đồng thời, kháng nguyên O cũng bị tiêu diệt bởi formol Kháng nguyên O được chia làm 4 nhóm: OI, OII, OIII, OIV

Vi khuẩn E coli gây bệnh ở gia cầm thường là 4 nhóm lớn gồm: nhóm OI

(O18, O15), nhóm OII (O18, O20, O86), nhóm OIII (O1), nhóm OIV (O121, O138, O149, O151: K88 (B)) Nhóm gây bệnh phổ biến nhất là O78: K80 (B), O2: K1 (L)

Hình 2.2 Cấu trúc kháng nguyên E coli

(http://www.microbiologybook.org/Albanian/Albanian-chap10.htm)

6

Trên gà bệnh do E coli thường thấy các type: O1, O2, O35, 078 (Nguyễn

Ngọc Hải, 2008)

Kháng nguyên giáp mô K (Kapsul)

Có bản chất là polysaccharide, có hơn 100 loại, chịu nhiệt kém bị phá hủy ở

1000C/ 1 giờ, có khi đến 1210C/ 2 giờ

Kháng nguyên K gồm 4 kháng nguyên: A, B, L và M Các kháng nguyên này

có khả năng ngưng kết huyết thanh của kháng nguyên O Nhiệm vụ của kháng nguyên này: hỗ trợ phản ứng ngưng kết cùng với kháng nguyên O trong cấu trúc kháng nguyên, tạo thành hàng rào bảo vệ giúp kháng nguyên chống lại các tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào

khả năng liên kết, kết tủa đều giữ nguyên

giữ được khả năng ngưng kết và kết tủa khác với kháng nguyên L Kháng nguyên

này thường thấy trong vi khuẩn E coli gây bệnh đường ruột

kết, kết tủa và tính kháng nguyên

Typ M: chưa được rõ

Kháng nguyên lông bám F (Focsman)

Kháng nguyên tiêm mao, bản chất là protein kết dính vào tế bào thành ruột,

có dạng hình sợi giúp kết dính vi khuẩn vào nhung mao ruột

Kháng nguyên H (Hauch)

chất kháng nguyên, phần lớn E coli có chung type kháng nguyên này

Theo Tô Minh Châu và Trần Thị Bích Liên (2006), ngày nay người ta chia

E coli gây bệnh ra làm nhiều nhóm và tùy thuộc vào độc lực của chúng

Gồm có 3 nhóm chính:

E coli độc tố ruột: enterotoxigenic E coli (ETEC), E coli gây bệnh tích ở

ruột: enteropathogenic E coli (EPEC), E coli xâm lấn ruột: enteroinvasive E coli

(EIEC)

Và một số nhóm khác như: Vasotoxin E coli hay verotoxin (VTEC), Avian panthogenic E coli (APEC)

Enterotoxigenic E coli (ETEC): đây là độc tố được nói đến nhiều nhất và nó

được xem là nguyên nhân gây tiêu chảy thông thường trên thú non (độc tố đường ruột), có 2 loại:

LT (heat labile enterotoxin): độc tố đường ruột không chịu nhiệt, gây tiêu chảy, mất nước, gây độc đối với tế bào thần kinh Trọng khối phân tử MW: 91,5 Kda chia làm 2 phần LTa và LTb, có tính chất kháng nguyên

ST (heat stable enterotoxin): là độc tố đường ruột chịu nhiệt, gây tiêu chảy,

Những động vật mang độc tố ETEC sản xuất LT và ST sẽ gây tiêu chảy trầm

trọng và kéo dài hơn những thú mà E coli chỉ tạo được LT hay ST Khả năng sinh

enterotoxin cũng có thể thay đổi nếu cấy chuyển nhiều, một số dòng sẽ mất khả năng sinh enterotoxin

Enteropathogenic E coli (EPEC): bao gồm một số type huyết thanh cổ điển,

cơ chế gây bệnh chưa rõ

8

Enteroinvasive E coli (EIEC): gồm nhiều type huyết thanh gây bệnh với những triệu chứng bệnh giống với Shigella, E coli xâm lấn màng niêm ruột gây đi

tiêu rặn, phân có lẫn máu khó phân biệt với lỵ, viêm trực tràng

Vasotoxin E coli hay Verotoxin (VTEC): có trọng khối phân tử 70 Kda có

tính chất kháng nguyên

Avian panthogenic E coli (APEC): biểu hiện chính là tích dịch túi khí, có

nhiều thanh dịch, gây bệnh đường ruột gia cầm và thường kết hợp với yếu tố ngoại cảnh và nhân tố mở đường Độc tố APEC phân lập được hầu như thuộc serotype: O1, O2, O78, và yếu tố độc lực gắn liền với chủng F (Fibriae: lông mềm) với giáp

mô K1 chịu nhiệt và dung huyết

2.2 Bệnh do E coli trên gà

2.2.1 Truyền nhiễm học

2.2.1.1 Động vật cảm thụ

Gia cầm, các loài chim, động vật hữu nhũ ở mọi lứa tuổi đều có thể mắc bệnh

do E coli gây ra, nhưng con non hoặc những con đang bị bệnh, suy yếu thì dễ mắc

bệnh hơn cả Trên gà, bệnh thường xảy ra ở giai đoạn 1 - 10 ngày tuổi, những con

gà ở giai đoạn chuẩn bị đẻ

Trong phòng thí nghiệm chuột lang, chuột bạch và thỏ đều mẫn cảm khi tiêm canh trùng dưới da gây viêm cục bộ, nếu tiêm liều lớn gây bại huyết và giết chết con vật

chuồng, trong điều kiện khô vi khuẩn tồn tại rất lâu

2.2.1.3 Phương thức truyền lây

Các con đường lây bệnh chủ yếu của vi khuẩn E coli là truyền lây qua trứng

do cơ thể mẹ bị nhiễm bệnh, qua vỏ trứng do bị nhiễm bẩn từ phân hoặc môi trường

9

chuồng trại bị nhiễm trùng, qua đường hô hấp do gà bị bệnh CRD làm cho niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua vết thương Truyền lây qua thức ăn và nước uống nhiễm trùng

2.2.1.4 Đường xâm nhập

Bệnh do E coli lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa do ăn phải thức ăn, nước

uống có chứa mầm bệnh Bệnh có thể lây nhiễm qua đường hô hấp, niêm mạc mắt

Bệnh có thể lây nhiễm qua đường hô hấp do gà bị nhiễm CRD (Chronic

Respirstory Disease) làm cho niêm mạc phế quản bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập

qua vết thương vào cơ thể

Bệnh truyền lây qua trứng do gà mẹ bị nhiễm bệnh Vi khuẩn xâm nhập qua

vỏ trứng do vỏ trứng bị nhiễm bẩn từ phân hoặc từ môi trường chuồng trại bị nhiễm trùng

2.2.2 Cơ chế sinh bệnh

Bệnh xảy ra do sức đề kháng của gia súc, gia cầm kém (bởi sự thay đổi khẩu phần ăn, nhiệt độ, stress,…) màng niêm ruột giảm chức năng bảo vệ tạo điều kiện

cho vi khuẩn xâm nhiễm Vi khuẩn E.coli gia tăng số lượng nhanh chóng tấn công

vào hệ thống mạch máu, hạch lâm ba, tủy xương gây nhiễm trùng huyết, viêm túi khí, viêm màng bao tim, viêm cơ tim Nếu vi khuẩn xâm nhiễm từ đường hô hấp

chúng sẽ định vị tại túi khí, sau đó vào máu gây nhiễm trùng huyết Vi khuẩn E.coli

sau khi vào máu sẽ định vị ở những vùng khác nhau: khớp, túi khí, màng hoạt dịch, màng bao tim, sau đó di chuyển đến gan, lách làm cho gan, lách bị viêm, tạo những khối u ở gan, lách sưng to sậm màu

2.2.3 Triệu chứng và bệnh tích

2.2.3.1 Triệu chứng

Theo Lê Văn Năm (2010), thời gian nung bệnh có thể từ vài ngày đến vài tuần tùy thuộc vào độc lực và số vi khuẩn gây nhiễm, sức đề kháng, điều kiện chuồng trại, thức ăn, nước uống Thường có 2 thể bệnh:

Cấp tính: phần lớn bệnh xảy ra ở thể này, bệnh diễn biến nhanh, con vật sốt, khát nước, bỏ ăn và chết

Mãn tính: gà tiêu chảy mạnh, phân xanh, trắng, có lẫn máu, gà suy yếu và chết

Gà bị bệnh do E.coli lông bị xù, khó thở, sưng phù đầu, sưng mắt, sưng

khớp, da mặt tái Ở gà con mới nở thì viêm rốn, lòng đỏ không tiêu Trong trường hợp kế phát bệnh trên đường hô hấp thì gà khò khè, chảy nước mũi, sưng mặt

2.2.3.2 Bệnh tích

Túi khí viêm dày lên, xuất hiện casein

Viêm màng bao tim, màng bao quanh gan, làm cho các màng này dày lên Tích dịch màng bao tim, tích nước xoang bụng, túi khí

Gan sưng dễ vỡ, có đốm hoại tử

Niêm mạc dày lên, sung huyết, xuất huyết

Khớp sưng, tích dịch

Lách, thận sưng chuyển màu sậm hay nhạt hơn

Theo Nguyễn Thị Phước Ninh (2010) trường hợp gà bị CRD kết hợp với E

coli thì sẽ gây viêm túi khí nặng, fibrin hoặc fibrin mủ, viêm màng bao tim và màng

bao quanh gan, trên gà đẻ có casein bao phủ lên buồng trứng

2.2.4 Chẩn đoán

Dựa trên đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng và đặc điểm bệnh tích quan sát được sau khi mổ khám gà bệnh sau đó lấy bệnh phẩm xét nghiệm và phân lập vi khuẩn

Chú ý cần phân biệt với các bệnh có triệu chứng lâm sàng gần giống như bệnh bạch lỵ, thương hàn, bệnh phó thương hàn và cần phân biệt với bệnh có bệnh

tích gần giống E coli như hô hấp mãn tính

dụng cụ chăn nuôi, vệ sinh chất độn chuồng, vệ sinh chuồng nuôi và thực hiện theo nguyên tắc cùng vào cùng ra Chuồng trại được sát trùng, tiêu độc định kỳ, để trống chuồng một thời gian thích hợp

Tăng cường sức đề kháng của cơ thể bằng cách cung cấp đủ vitamin, khoáng chất, giảm tối đa stress (như nhiệt độ cao, gió lùa, khí amoniac, mật độ nuôi quá đông, không đủ thông thoáng, ) Đồng thời hạn chế người ra vào nơi nuôi và người ra vào cần phải mặc quần áo bảo hộ để tránh làm phương tiện truyền vi khuẩn

Tiêm phòng vacin đầy đủ, chuồng trại thông thoáng và được sát trùng định

kỳ và được thay chất độn chuồng thường xuyên Cách ly và điều trị ngay lập tức đối với những con gà vừa nhiễm bệnh

Điều trị

Để có kết quả điều trị cao quan trọng là cần phát hiện bệnh sớm, điều trị kịp thời và sử dụng kháng sinh, thuốc trợ sức Trong quá trình điều trị phải cải thiện vệ sinh môi trường, thức ăn, nước uống, cung cấp vitamin nhằm tăng sức đề kháng cho gia cầm Để đạt kết quả tốt nhất nên kiểm tra kháng sinh đồ trước khi lựa chọn kháng sinh để có phác đồ điều trị thích hợp, điều này cũng làm giảm nguy cơ vi khuẩn kháng kháng sinh

Hiện nay một số kháng sinh được khuyến cáo trong quá trình điều trị gồm: cephalexin, gentamicin, norfloxacine,… Dùng trong 3 - 4 ngày liên tục

2.3 Giới thiệu phương pháp PCR (Polymerase chain reaction)

2.3.1 Giới thiệu

Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) được phát minh bởi K.Mullis và cộng sự vào năm 1985 Đây là kỹ thuật invitro cho phép nhân nhanh một gene mong muốn lên hàng triệu lần trong thời gian ngắn Đoạn DNA được khuyếch đại được nhận dạng nhờ cặp primer đặc hiệu thường có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide

2.3.2 Nguyên tắc chung

PCR là kỹ thuật khuyếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu

bổ sung ở hai đầu mạch đơn tương ứng

Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn mẫu điều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những

polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Mồi xuôi tác động lên sợi DNA theo chiều từ 3 ’ - 5 ’ Mồi ngược tác động theo chiều 5’- 3’

2.3.3 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Một phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu

kỳ gồm 3 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính

DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy các phân tử DNA mạch kép bị tách ra, tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới

 Giai đoạn 2: Giai đoạn bắt cặp

thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích

 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài

sợi mới Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA – polymerase và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại

2.3.4 Thành phần phản ứng PCR

Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm: khuôn mẫu (đoạn DNA cần khuếch đại, không cần độ tinh sạch cao), cặp primer (nhân tố khuếch đại, thường chứa 18–25 nucleotide), polymerase chịu nhiệt (Taq-polymerase) giúp chịu được

nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng,

2.3.5 Kiểm tra kết quả PCR

Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường

Acid nucleic là một phân tử tích điện âm, vì vậy chúng có thể dịch chuyển qua bản gel từ cực âm sang cực dương dưới tác dụng của điện trường Trên cùng một bản gel, có cùng một dòng điện những phân tử khác nhau về trọng lượng nên di chuyển được những quãng đường khác nhau sau một thời gian như nhau Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện phân tử DNA người ta dùng phương pháp làm hiện hình Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide Chất này sẽ gắn xen vào các base của phân tử DNA và phát quang dưới tia tử ngoại Như vậy dễ dàng cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel Đối với gel polyacrylamide, các phân tử được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phòng xạ tự ghi Tùy thuộc kích thước DNA mà người ta chọn loại gel, nồng độ gel, loại đệm (TBE hay TAE) (Lò Thanh Sơn, 2009)

2.3.6 Ứng dụng của phương pháp PCR

Phương pháp PCR có giá trị ứng dụng quan trọng trong nhiều lĩnh vực như: khảo cổ học, sinh học, pháp y, y học, nông nghiệp….Trong chăn nuôi, phương pháp PCR dùng phát hiện các gen có ưu thế về giống tốt, về năng suất sinh sản hoặc xác định giới tính khi tryền cấy phôi…Riêng trong lĩnh vực thú y, PCR được ứng dụng rất nhiều trong chẩn đoán xác định tác nhân gây bệnh là vi khuẩn, virus…và kỹ thuật PCR còn phục vụ lĩnh vực nghiên cứu điều chế vắcxin

2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.1 Trong nước

Nguyễn Văn Hạng (1988), khảo sát tỷ lệ nhiễm khuẩn E coli trên gia cầm ở

An Giang cho thấy tỉ lệ nhiễm tương đối thấp kết quả phân lập từ gan là 23,96 %

Mai Chí Cần (2002), khảo sát sự hiện diện của vi khuẩn E coli, Salmonella

và nấm phổi trên gà 1 ngày tuổi Tỉ lệ nhiễm E coli là 35,34 % (41/116) và kết quả

thử độc lực dựa trên chuột cho thấy tỷ gây chết chuột là 75 – 100 %

Trương Ngọc Tuyết (2002), phân lập vi khuẩn E coli từ gà bệnh 1 - 7 ngày

tuổi cho thấy dịch viêm là canh khuẩn nguyên thì type dung huyết (γ) gây chết chuột 100 %, còn α và β không gây chết chuột

Trần Đức Trung (2003), khảo sát tỉ lệ nhiễm E coli và sự kháng thuốc trên

gà bệnh từ 2-10 tuần tuổi mổ khám tại Bệnh viện Thú Y trường Đại học Nông Lâm, cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh chung là 69,44 % (50/72) và kết quả tiêm chuột các chủng

E coli được phân lập đều có khả năng gây chết chuột, tỉ lệ chết cao từ 75-100 %

Võ Thị Hồng Điệp (2004), định type kháng nguyên của vi khuẩn E coli

được phân lập từ gà bệnh, sử dụng phương pháp tiêm truyền qua phôi trứng và chuột bạch để đánh giá độc lực Kết quả độc lực trên phôi trứng cho thấy số phôi trứng chết có tỉ lệ biến động từ 66 – 88 % và gây chết chuột từ 14 – 20 %

Năm 2008 Võ Thành Thìn cho biết bốn phản ứng multiplex PCR đã được thiết lập để xác định các gen quy định thụ thể sắt (iron – receptor) có mang trong

các chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh ở gà: (1) fhuA/iutA/iron multiplex PCR phát hiện các gen iroN, iutA và fhuA; (2) fyuA/fepA multiplex PCR phát hiện gen fyuA và

fepA; (3) chuA/ireA/fecA multiplex PCR khuếch đại ba gen chuA,fecA và ireA: (4) fhuE/cir multiplex PCR phát hiện gen cir và fhuE Ứng dụng phản ứng này, 20

chủng APEC phân lập được từ gà bị bệnh do E coli tại tỉnh Phú Yên và Khánh Hòa

đã được phân tích khả năng cạnh tranh giành sắt thông qua việc phát hiện 10 gen quy định sinh tổng hợp 10 thụ thể sắt khác nhau Kết quả cho thấy tất cả các chủng

APEC đều có mang gen mã hóa iron – receptor Cụ thể là fepA (100%), fhuE (95%),

cir (95%), iutA (90%), iroN (75%), ireA (55%), fhuA (50%), fecA (45%), chuA

(45%) và fyuA (25%)

Hồ Thị Kim Cúc (2011), phân lập E coli và xác định đặc tính gây bệnh của

vi khuẩn này trên gà, sử dụng phương pháp tiêm truyền qua phôi trứng và trên gà

con 1 ngày tuổi để đánh giá độc lực Kết quả tỉ lệ nhiễm E coli 52 %, tỉ lệ gây chết

phôi từ 30 – 70 %, tỉ lệ gây chết gà từ 50 – 90 %

Phan Huỳnh Trung (2011), phân lập E coli và xác định đặc tính gây bệnh

của vi khuẩn này trên gà, sử dụng phương pháp tiêm truyền qua phôi trứng và trên

gà con 1 ngày tuổi để đánh giá độc lực Kết quả tỉ lệ nhiễm E coli 54,76 %,

Nguyễn Thị Mỹ Linh (2011), phân lập, thử kháng sinh đồ và xác định độc

lưc vi khuẩn Escherichia coli gây bệnh trên gà tại một số địa phương, sử dụng

phương pháp tiêm truyền qua phôi trứng và trên gà con 1 ngày tuổi để đánh giá độc

lực Kết quả tỉ lệ nhiễm E coli 83,3%, Bình Phước và Tiền Giang có tỷ lệ chết phôi

trung bình tương ứng 54,55% và 45,45% là mức rất độc Đồng Nai và Quận 9, TP HCM có tỷ lệ chết phôi trung bình từ 23% - 33,64% ở mức độc trung bình, tỉ lệ gà con chết sau khi tiêm vi khuẩn dao động trong khoảng 20% – 100% Xác định 2

gene độc lực iucD và fimC cho kết quả dương tính là 86,7% và 93,3%

2.4.2 Ngoài nước

Antão và ctv (2008) đã sử dụng gà 5 tuần tuổi như là một mô hình lây nhiễm

tự nhiên bệnh ngoài đường ruột gây ra bởi APEC Nghiên cứu cho thấy có sự khác

biệt giữa chủng E coli độc lực và không độc thông qua tỉ lệ chết gà thí nghiệm,

triệu chứng và bệnh tích quan sát

Janßen và ctv (2003) dùng phương pháp multiplex PCR để xác định gene

gây độc của E coli gây bệnh trên gà Phát hiện cùng lúc 6 gene gây bệnh astA, irp2,

iss, papC, iucD và tsh có trong 150 chủng phân lập Trong 150 chủng E coli phân

lập thì có 19 chủng chứa đồng thời cả 6 gene

Nabbut và Khatib (1978), đã đánh giá độc lực của 66 gốc E coli thông qua

việc tiêm vào xoang niệu mô của phôi gà 12 ngày tuổi

Wooley và ctv (2002) đã xác định độc lực của E coli phân lập được từ gia

cầm thông qua tỉ lệ chết phôi gà Kết quả cho thấy rằng, nếu tỉ lệ phôi gà 12 ngày tuổi >29% thì chủng rất độc, 10-29% độc lực trung bình, <10% không có độc lực trong 2 ngày sau khi tiêm 100CFU/trứng

Các công trình nghiên cứu trên đã xác định được tỉ lệ nhiễm E coli trên gà,

độc lực vi khuẩn qua tiêm truyền trên phôi trứng và gà thí nghiệm, phát hiện một số

gene liên quan độc lực của E coli gây bệnh trên gia cầm bằng Multiplex-PCR, và tỉ

lệ nhạy cảm với kháng sinh của các mẫu phân lập được Từ các công trình nghiên

cứu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định tỉ lệ nhiễm E coli từ thực địa, tìm

hiểu khả năng nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, xác định các mức độ độc lực

và gene độc lực để làm rõ đặc điểm gây bệnh của các vi khuẩn E coli gây bệnh tại

các trại gà ở Việt Nam

Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

3.1 Thời gian và địa điểm

3.1.1 Thời gian:

Thí nghiệm được tiến hành từ ngày 25/11/2011 đến 4/5/2012

3.1.2 Địa điểm:

Phòng vi sinh Bệnh Viện Thú Y trường Đại học Nông Lâm TP HCM

3.2 Đối tượng nghiên cứu

Gà bệnh được mổ khám tại Bệnh Viện Thú Y

Phôi trứng: 12 – 13 ngày tuổi

Gà con 1 ngày tuổi

3.3 Nội dung nghiên cứu

Phân lập các gốc E coli trên gà bệnh

Thử kháng sinh đồ các gốc E coli phân lập được

Đánh giá độc lực của các gốc E.coli phân lập được qua phôi trứng gà và gà

con 1 ngày tuổi

Xác định các gene độc lực của các gốc vi khuẩn E coli có khả năng gây

bệnh

3.4 Phương pháp nghiên cứu

Gà bệnh được mổ khám tại Bệnh Viện Thú Y trường Đại học Nông Lâm TP

Hồ Chí Minh, sau đó lấy túi khí từ những con gà có biểu bệnh nghi ngờ do E coli

để phân lập trên các môi trường chuyên biệt Sau khi phân lập được các gốc E coli,

tiến hành thử kháng sinh đồ, xác định độc lực các gốc qua tiêm truyền vi khuẩn vào phôi trứng và gà con, chạy PCR kiểm tra xem có gene độc lực trong các gốc đã phân lập (Sơ đồ 3.1)

Tái phân lập E coli

Tái phân lập E coli

Xác định gene gây bệnh gốc E coli phân lập được

19

3.4.1 Phân lập vi khuẩn E coli trên gà bệnh và thử kháng sinh đồ các gốc E coli phân lập được

Mục đích

Phân lập và đánh giá tình hình nhiễm vi khuẩn E coli gây bệnh tại

các địa phương khác nhau

Khảo sát tình trạng đề kháng kháng sinh của các gốc vi khuẩn E coli phân

lập được

3.4.1.1 Phân lập vi khuẩn E coli trên gà bệnh

 Môi trường và hóa chất

Môi trường: Mac Conkey (HiMedia, M082), Kliger Iron Agar (HiMedia,

M078) Eosin Methylen Blue (HiMedia, M022), Blood Agar (Merck, VM107855),

Nutrient Agar (Himedia, M001), Brain Heart Infusion (titan biotech, TM362)

Hóa chất: thuốc thử Kovac, NaOH 40 %, methyl red, α – napthol 5%, crystal violet, lugol iodine, fuchsin

 Dụng cụ mổ khám và dụng cụ dùng phân lập vi khuẩn E coli

Dụng cụ mổ khám: dao mổ, kéo, nhíp, khay, găng tay, túi ny-lon

Dụng cụ dùng trong phòng vi sinh: tủ lạnh bảo quản mẫu, ống nghiệm, đĩa petri tròn thủy tinh vô trùng, tâm bông, que cấy, kẹp, đèn cồn, tủ ấm

 Phương pháp lấy mẫu

Trên những gà có triệu chứng lâm sàng nghi ngờ do E coli (gà nhắm mắt,

lông xù, suy nhược, da tái xanh, sưng đầu,…), và có bệnh tích nghi ngờ như túi khí viêm dày đục, có fibrin, viêm phổi, viêm xoang bụng, xoang bụng tích casein, viêm màng bao quanh gan có fibrin, viêm màng bao quanh tim có phủ casein, thận sưng Chúng tôi tiến hành lấy mẫu túi khí để phân lập vi khuẩn

Bên cạnh đó cũng tiến hành lấy mẫu túi khí trên những gà có triệu chứng

bệnh tích không điển hình do E coli (gan hoại tử và sưng to, mảng peyer trên ruột

sưng và xuất huyết, fabricius sưng to và thủy thủng, sưng thận có tích nhiều urat)

Sau khi lấy mẫu, tiến hành phân lập vi khuẩn E coli theo quy trình của Bệnh

Viện Thú Y trường Đại học Nông Lâm TPHCM Đối với mẫu có bệnh tích điển

hình do E.coli được cấy trực tiếp trên môi trường chọn lọc EMB Những mẫu bệnh

phẩm có bệnh tích không điển hình do vi khuẩn E coli thì dùng môi trường tăng

khuẩn lạc đơn có màu tím ánh kim đặc trưng của vi khuẩn E coli trên môi trường

EMB Được thể hiện qua sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2 Qui trình phân lập vi khuẩn E coli

(Nguồn: Bệnh viện Thú Y – Trường ĐHNL.TPHCM, 2012)

Chọn ống cho kết quả dương tính (vàng/vàng, sinh hơi) Xét nghiệm IMViC (++ )

Nhuộm G

Định danh vi khuẩn

Giữ giống trên ống thạch

21

Chỉ tiêu theo dõi

Xác định tỷ lệ dương tính E coli trên gà

3.4.1.2 Thử kháng sinh đồ

Chúng tôi thực hiện kháng sinh đồ theo phương pháp đĩa giấy kháng sinh khuyếch tán trên môi trường thạch (Antibiotic Disc Difusion Method) của Kirby – Bauer, 1966

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và đĩa kháng sinh

Môi trường thạch dinh dưỡng (Nutrient – Agar: NA) là môi trường nuôi cấy được sử dụng để xác định tính nhạy của vi khuẩn đối với kháng sinh Đĩa kháng sinh (công ty Nam Khoa), gồm 13 loại đĩa kháng sinh: ampicillin (Am), amoxicillin (Ax), trimethoprim/ sulfamethoxazone (Bt), colistin (Co), cephalexin (Cp), cefuroxine (Cu), doxycyline (Dx), gentamicine (Ge), kanamycin (Kn), neomycin (Ne), norfloxacine (Nr), tobramycin (Tb), tetracycline (Te)

Chuẩn bị huyễn dịch vi khuẩn

Từ những gốc E coli phân lập được chúng tôi tiến hành tăng sinh qua thạch dinh

dưỡng (NA) Dùng que cấy vòng bằng thao tác vô trùng, lấy một ít vi khuẩn trên thạch dinh dưỡng NA cho vào ống nghiệm tiệt trùng có chứa khoảng 9 ml nước muối sinh lý (0,85%) vô trùng Trộn đều cho đến khi thu được huyễn dịch vi khuẩn tương ứng với độ

Cấy vi khuẩn theo phương pháp đổ láng đều bề mặt

Bằng thao tác vô trùng, đổ huyễn dịch vi khuẩn được chuẩn bị sẵn như ở phần trên lên bề mặt của đĩa môi trường Xoay nhẹ đĩa để huyễn dịch vi khuẩn láng đều khắp

bề mặt môi trường Sau đó nghiêng nhẹ đĩa để phần huyễn dịch vi khuẩn còn tụ lại ở một góc và dùng pipette vô trùng rút bỏ hết phần huyễn dịch còn dư này

Sau khi đã thực hiện xong việc cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường, để yên đĩa ở nhiệt độ phòng trước khi đặt những đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt môi trường

Đặt đĩa giấy tẩm kháng sinh lên bề mặt môi trường

Bằng thao tác vô trùng (đốt kẹp gắp trên ngọn lửa đèn cồn), dùng kẹp gắp lấy đĩa giấy tẩm kháng sinh đặt lên đĩa môi trường (NA) Trên mỗi đĩa môi trường đặt một đĩa

Để đĩa môi trường đã có đặt giấy tẩm kháng sinh ở nhiệt độ phòng 30 phút

giờ Sau đó đọc kết quả

Đánh giá kết quả

Đo đường kính vòng vô khuẩn (phạm vi vi khuẩn không mọc được xung quanh đĩa giấy tẩm kháng sinh) xuất hiện trên đĩa và đem so với đường kính vòng vô khuẩn chuẩn được qui định bởi nhà sản xuất đĩa giấy tẩm kháng sinh, để đánh giá khả năng nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh theo 3 mức độ: nhạy, trung gian, kháng

Chỉ tiêu theo dõi

Đánh giá mức độ nhạy, kháng, trung gian với các kháng sinh của các gốc E

coli phân lập được

3.4.2 Xác định độc lực của các gốc E coli phân lập được qua phôi trứng gà

Mục đích

Xác định độc lực của vi khuẩn E coli phân lập từ thực địa đối với phôi trứng

thí nghiệm

Phôi gà thử nghiệm và dụng cụ

Trứng gà có phôi 12 ngày tuổi: 176 trứng

Dụng cụ: ống tiêm có vạch 3 ml, bông thấm nước, cồn sát trùng, iod, sáp,…

Huyễn dịch vi khuẩn E coli phân lập được với liều 100 CFU/ 0,2 ml/ trứng

Bố trí thí nghiệm

Chọn ngẫu nhiên 15 gốc E coli từ những mẫu có bệnh tích điển hình và tiến

hành tiêm truyền qua phôi trứng gà để đánh giá độc lực

Thí nghiệm gồm 16 lô: 15 lô thí nghiệm (ký hiệu bằng chữ T và số) và 1 lô đối chứng Lô đối chứng (ĐC) được tiêm nước muối sinh lý 0,9 %

Tăng sinh E coli và pha huyễn dịch

Cách pha huyễn dịch vi khuẩn E coli tiêm trứng với liều 100 CFU/ 0,2 ml:

Từ ống giữ gốc cấy khuẩn lạc trên môi trường tăng sinh BHI, sau 24 giờ cấy lên môi trường thạch máu, sau 24 giờ tiếp theo chọn khuẩn lạc đặc trưng màu trắng sữa, tròn đường kính 1 - 2 mm cấy lên môi trường dinh dưỡng NA Sau 24 giờ tiếp theo chúng tôi lấy khuẩn lạc từ ống NA pha qua ống nước muối sinh lý 0,9% cho

ml)

dịch 500 CFU/1 ml (Sơ đồ 3.3)

Sơ đồ 3.3 Cách pha huyễn dịch vi khuẩn E coli (500 CFU/1 ml)

Từ huyễn dịch 500 CFU/1 ml ta hút 0,2 ml ta được huyễn dịch chứa 100 CFU vi khuẩn và đem đi tiêm trên phôi trứng Kiểm tra lại nồng độ của vi khuẩn trong huyễn dịch bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa (Sơ đồ 3.4)